專利名稱：脂質(zhì)體的兩相制備方法及其在制造診斷試劑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及脂質(zhì)體的兩相制備方法，在其過程中，使用技術(shù)上簡(jiǎn)單的機(jī)械方法混合包含天然磷脂和合成磷脂的單獨(dú)混合物的非極性有機(jī)相和與其不混溶的極性水(緩沖液)相。當(dāng)活性組分錨定到脂質(zhì)體膜的表面時(shí)，用本方法制備的具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體乳劑優(yōu)選體外應(yīng)用。
此外，本發(fā)明可能的實(shí)施方式涉及體外血液凝固診斷試劑的制備。在本發(fā)明的一組實(shí)施方式中，所述試劑由我們的提供用于活性組分和蛋白類型的活性組分的膜表面的具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體乳劑，即天然或重組組織因子，組成。在這個(gè)組的可能的實(shí)施方式中， 在初步制備的脂質(zhì)體上實(shí)現(xiàn)將蛋白錨定到膜表面。在這個(gè)組進(jìn)一步可能的實(shí)施方式中，蛋白的錨定與脂質(zhì)體膜表面的組裝同時(shí)進(jìn)行。在另一組實(shí)施方式中，所述試劑由我們的具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體乳劑和與所述乳劑通過簡(jiǎn)單的機(jī)械混合混合的非蛋白類型的可溶活性組分組成。非蛋白類型的可溶活性組分可為有機(jī)酸或無機(jī)化合物(例如，鞣花酸、鞣酸、蕓香苷、槲皮苷或無機(jī)二氧化硅)。
本發(fā)明的主題為方法，作為其中可能的實(shí)施方式，制備了體外血液凝固診斷試劑。 通過我們的方法制備的所述體外血液凝固診斷試劑適于測(cè)量凝血酶原時(shí)間和激活部分促凝血酶原激酶時(shí)間。本說明書的進(jìn)一步的主題為上述方法可能的商業(yè)實(shí)現(xiàn)。
背景技術(shù)：
血液凝固診斷中最常用的進(jìn)行的測(cè)量目的為測(cè)定凝血酶原時(shí)間(PT)和激活部分促凝血酶原激酶時(shí)間(APTT)。兩種診斷方法監(jiān)控血液凝固系統(tǒng)的酶過程，以顯示檢測(cè)的有機(jī)體的止血狀態(tài)。
血液凝固是一個(gè)由復(fù)雜的增多和減少的生化步驟組成的級(jí)聯(lián)型酶鏈反應(yīng)。血液凝固系統(tǒng)的酶反應(yīng)中決定性的多數(shù)為包括蛋白和非蛋白類型分子(酶和輔因子)和膜組分的膜結(jié)合過程。膜組分的主要構(gòu)成為起基本結(jié)構(gòu)(錨定)和功能(例如酶活性輔因子)作用的極性和非極 性脂質(zhì)。為在體外系統(tǒng)中模擬體內(nèi)膜結(jié)合過程，膜功能可被脂質(zhì)化的特定過程支持，為體內(nèi)系統(tǒng)提供合適的脂質(zhì)成分。
根據(jù)本發(fā)明，體外血液凝固診斷試劑中含脂質(zhì)的組分為脂質(zhì)體，即具有小于微米范圍的直徑的脂囊泡，其與合適組成的水溶液形成穩(wěn)定的乳劑。所述脂質(zhì)體提供體外血液凝固診斷反應(yīng)所必需環(huán)境的膜表面，即它們適于錨定有機(jī)化合物(例如具有合適氨基酸序列的天然或重組蛋白)并適于與具有合適結(jié)構(gòu)的有機(jī)或無機(jī)化合物結(jié)合。此外，脂質(zhì)體膜的表面在錨定的活性蛋白或可溶活性無機(jī)化合物的表面活性反應(yīng)中起到輔因子的作用。
PT和APTT測(cè)量旨在確定作為血液凝固系統(tǒng)的中心步驟的血漿纖維蛋白原的聚合時(shí)間，即非活性凝血素變化為活性凝血酶時(shí)間。
PT測(cè)量利用所謂的促凝血酶原激酶的凝血啟動(dòng)效應(yīng)，即所謂外在凝血途徑的起始 [Mackman N.等，(2007) =Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 27 :1687 至 1693]。促凝血酶原激酶包括含在磷脂膜中的組織因子(TF，凝血因子III)。組織因子為與膜重疊的跨膜糖蛋白[Bazan J. F. (1990) :PNAS 87,6934-6938.]。雖然健康個(gè)體的循環(huán)血液中的組織因子的可檢測(cè)水平有爭(zhēng)議[Monroe D. Μ.，Key N. S. (2007) :J. Thromb. Haemost. 5:1097-1105.]， 當(dāng)血管床損傷時(shí)，膜結(jié)合的組織因子由沿?fù)p傷的細(xì)胞(例如內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞)釋放，從而啟動(dòng)血液凝固級(jí)聯(lián)反應(yīng)。釋放的膜結(jié)合組織因子結(jié)合并激活凝血因子VII，因此膜結(jié)合組織因子起到激活的凝血因子Vila的輔因子和受體的作用。膜結(jié)合組織因子和激活的凝血因子VIIa在Ca2+離子存在下促進(jìn)凝血因子X的激活。由凝血酶原酶復(fù)合體觸發(fā)凝血素轉(zhuǎn)變?yōu)槟?，凝血酶原酶?fù)合體由激活的凝血因子X (即因子Xa)和激活的凝血因子V (即因子Va)組裝，后者起到調(diào)節(jié)蛋白的作用。凝血酶將纖維蛋白原蛋白鏈裂解成纖維蛋白單體。 凝血酶還激活因子XIII ;激活的因子XIIIa形成轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶家族的連接酶，起到纖維蛋白的穩(wěn)定因子的作用。在激活的纖維蛋白穩(wěn)定因子XIIIa的影響下，通過共價(jià)交聯(lián)由纖維蛋白單體產(chǎn)生纖維蛋白聚合物，即穩(wěn)定的纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)(Edgington T. S.等，(1991):組織因子的表達(dá)和功能的結(jié)構(gòu)生物學(xué)，Thrombosis and Haemostasis,66 :67_79)。
如上述，促凝血酶原激酶為包含錨定到合適組成的脂質(zhì)膜的組織因子的膜復(fù)合體。此外，與環(huán)繞脂質(zhì)膜結(jié)合的蛋白的存在是在時(shí)間和空間上血液凝固級(jí)聯(lián)反應(yīng)的啟動(dòng)中的關(guān)鍵。通過動(dòng)物 或人富含脂質(zhì)的內(nèi)皮組織與水溶液的均勻化，產(chǎn)生絕對(duì)多數(shù)現(xiàn)有的PT試劑。然而，在一些先進(jìn)的產(chǎn)品中，應(yīng)用與人造脂質(zhì)結(jié)構(gòu)結(jié)合的含重組組織因子的促凝血酶原激酶。
在APTT測(cè)定中，激活級(jí)聯(lián)反應(yīng)的啟動(dòng)不需要任何組織因子組分(部分促凝血酶原激酶)，但是由具有凈負(fù)電荷的活性成分(二氧化硅，有機(jī)酸)和脂質(zhì)膜觸發(fā)。
已知用于生產(chǎn)血液凝固診斷試劑的方法在制備膜組分，即脂質(zhì)體，的方法方面彼此不同。在所有用于生產(chǎn)PT試劑的方法中，通過混合在表面活性劑物質(zhì)(洗滌劑)的幫助下保存于溶液中的組織因子和預(yù)制的脂質(zhì)體分散體制備促凝血酶原激酶[該方法在美國(guó)專利5625036、美國(guó)專利5314695、美國(guó)專利6124110、美國(guó)專利6733985、美國(guó)專利7049087 和美國(guó)專利7148067中說明]。由于存在的比例大于0. 05%的洗滌劑抑制血液凝固反應(yīng)， 通過合適的分離方法即透析[參考例如美國(guó)專利5314695 ;美國(guó)專利4622188 ;美國(guó)專利 6124110 ;和美國(guó)專利6733985]、超濾[美國(guó)專利5625036 ;和美國(guó)專利5314695]或吸附方法[如在美國(guó)專利7049087 ;和美國(guó)專利7148067中說明]，從體系中去除表面活性劑。去除洗滌劑的過程，即當(dāng)洗滌劑的濃度達(dá)到其最終值時(shí)，應(yīng)通過進(jìn)行幾個(gè)生產(chǎn)中測(cè)定檢查。除了增加程序的步驟之外，使用洗滌劑一個(gè)很大的缺點(diǎn)為洗滌劑自身和/或用于去除其的步驟的高成本。
已知的方法中，用于生產(chǎn)脂質(zhì)體的方法[例如在美國(guó)專利4622188中]基于這樣的現(xiàn)象，即在合適極性的溶液中，根據(jù)物理化學(xué)環(huán)境，同時(shí)具有極性和非極性分子部分的表面活性物質(zhì)形成單層或多層囊泡。
“A” 一最常使用的用于生產(chǎn)脂質(zhì)體經(jīng)典方法為所謂的干膜方法[在美國(guó)專利 4438052 ;美國(guó)專利5556637 ;和美國(guó)專利7169410中說明]。在這個(gè)方法中，第一個(gè)步驟為將脂質(zhì)溶于有機(jī)溶劑。然后，用真空或惰性氣體流將溶劑從溶液中完全蒸發(fā)。最終將在容器壁上形成的干脂質(zhì)膜分散于合適的水溶液中。通過充分混合[例如在美國(guó)專利6296870 中說明的方法]和/或超聲粉碎[參考美國(guó)專利5234634]制備來自該分散體的最終脂質(zhì)體乳劑。這些已知的方法基本上形成具有相當(dāng)寬的尺寸分布的多層脂質(zhì)體。通過在提供窄的粒徑分布和單片層或雙片層囊泡的高壓裝置上擠壓所述未加工的分散體，可實(shí)現(xiàn)合適尺寸分布和優(yōu)選的迭片結(jié)構(gòu)。擠壓方法在九十年代廣泛使用[這種方法的實(shí)例在美國(guó)專利 4529561 ;美國(guó)專利5204112 ;和美國(guó)專利6926905中說明]。
根據(jù)所含脂質(zhì)的溶劑的水混溶性，混合溶劑的方法可分成兩類。
在使用可與水混溶的溶劑的情況下，所述方法被稱為單相方法[一個(gè)實(shí)例為美國(guó)專利 6261792]。
“B” 一在單相方法中，脂質(zhì)溶于極性有機(jī)溶劑，通常在乙醇中，并將脂質(zhì)溶液與水溶劑混合。獲得的脂質(zhì)體通常包括兩層或更多層，脂質(zhì)體的內(nèi)腔包含水溶液和乙醇的混合物。為了減小脂質(zhì)體的迭片結(jié)構(gòu)并使尺寸分布變窄，使用在干膜技術(shù)中列出的方法。
“C” 一單相方法的一個(gè)特殊實(shí)例為，當(dāng)用加入相對(duì)高濃度(I至2%)的洗滌劑分子將脂質(zhì)混合物溶于水溶液時(shí)。通過超濾、透析或在吸收包裝的幫助下去除洗滌劑。通過該已知方法可形成單層或多層脂質(zhì)體，理論上通過洗滌劑去除的速度和水溶液的合適的離子組成可將其產(chǎn)物的比例控制到特定的范圍。
在使用不與水混溶的溶劑的情況下，所述方法稱為兩相方法[例如參考美國(guó)專利 5723147]。在雙相方法的情況下，根據(jù)溶劑的體積比，可進(jìn)行進(jìn)一步分類。
“D” 一傳統(tǒng)上，由溶于小量的非極性有機(jī)溶劑并在充分較大量的水性(極性)溶劑中混合的脂質(zhì)生產(chǎn)的脂質(zhì)體被稱為“水包油”乳劑。
“E” -由溶于大量的非極性溶劑并在小量的水中混合的脂質(zhì)生產(chǎn)的脂質(zhì)體被稱為 “油包水”乳劑。
在多數(shù)已知的雙相方法中，具有較小體積的相注入具有較大量的相，并在整個(gè)過程中，使用充 分的湍流混合。為了使脂質(zhì)體尺寸分布變窄，這些方法后還可擠壓，或者在相同的裝置上在單個(gè)步驟中實(shí)現(xiàn)注入和擠壓。
在“水包油”的乳劑的情況下，假定生產(chǎn)單層，由脂質(zhì)分子的極性端(頭部)形成脂質(zhì)體的表面，而分子的非極性端(尾部)指向包含在囊泡內(nèi)的非極性溶齊U。在“油包水”的乳劑的情況下，情況相反。根據(jù)理論的考慮，在完全去除溶劑的情況下，脂質(zhì)體以假六方晶格排列，該狀態(tài)在“水包油”的乳劑的情況下稱為六I(H1)排列，在“油包水”的乳劑的情況下稱為六II (H11)排列。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在基于錨定活性分子到其中活性分子(例如蛋白質(zhì))對(duì)水相(例如診斷試劑)發(fā)揮其作用的脂質(zhì)膜上的應(yīng)用中，所組裝的單層應(yīng)只以H1排列。即，“水包油”乳劑可被用作細(xì)胞膜模型。此外，在多層脂質(zhì)體的情況下，只有其中脂質(zhì)的頭部指向水相的最外表面層的囊泡能夠具有上述功能。
在對(duì)考慮的已知方法的批判性分析中，我們僅處理適用于生產(chǎn)診斷試劑的那些， 因此組“E”中的方法不是比較的主題。
通常，屬于組和“C”的方法產(chǎn)生具有寬尺寸范圍的多層脂質(zhì)體乳劑，需要進(jìn)一步的物理處理。組“D”的方法主要產(chǎn)生較窄的尺寸分布和單層脂質(zhì)體。
組“A”中包含的干膜方法的進(jìn)一步的缺點(diǎn)為用相對(duì)多的步驟(脂質(zhì)溶解、干燥、在水溶液中混合、充分混合/超聲粉碎)完成脂質(zhì)體的制備。雖然這些步驟可用可商購(gòu)和相對(duì)簡(jiǎn)單的裝置進(jìn)行，但是實(shí)際的尺寸分布只有可用擠壓控制，這需要昂貴的裝置。在診斷試劑的市場(chǎng)上，沒有專門以這種方法生產(chǎn)的產(chǎn)品。
方法“B”可用最簡(jiǎn)單的工具在兩個(gè)主要步驟中完成(脂質(zhì)溶解，混合入水溶液)但是與組“A”中的方法類似，需要進(jìn)一步物理加工以這種方式生產(chǎn)的脂質(zhì)體。即，建議使用擠出機(jī)調(diào)節(jié)尺寸。產(chǎn)品乳劑和脂質(zhì)體的腔中包含非極性有機(jī)溶劑，如果應(yīng)用需要，可能必須去除該有機(jī)溶劑。在診斷試劑的市場(chǎng)上，沒有以這種方法生產(chǎn)的產(chǎn)品。
方法“C”也可在兩個(gè)步驟中完成(脂質(zhì)溶解于洗滌劑溶液，洗滌劑的去除)，但是用任何已知的方法(吸收填充材料、超濾或透析膜)去除洗滌劑都是一個(gè)長(zhǎng)時(shí)間和花費(fèi)高的過程，并且需要昂貴和獨(dú)特的裝置(透析器、超濾裝置、過濾裝置/離心機(jī)、色譜柱和系統(tǒng))。 生產(chǎn)的脂質(zhì)體為單層或多層囊泡，盡管通過調(diào)節(jié)所述溶劑的合適的化學(xué)組成可控制迭片結(jié)構(gòu)。最終產(chǎn)品的脂質(zhì)體在它們的腔中可包含一些洗滌劑，如果應(yīng)用時(shí)需要，可能必需進(jìn)一步的去除步驟。建議應(yīng)用擠出機(jī)調(diào)節(jié)尺寸分布。在診斷試劑的市場(chǎng)上，沒有專門以這種方法生產(chǎn)的產(chǎn)品[Morrissey和Smith，根據(jù)美國(guó)專利7148067的促凝血酶原激酶試劑]。
方法“D”可在兩個(gè)步驟中實(shí)現(xiàn)(脂質(zhì)溶解，混合入水溶液)。然而，為混合相，應(yīng)用特別設(shè)計(jì)的注入和混合裝置，使得該方法昂貴。制造的脂質(zhì)體通常為單層囊泡，它們的大小在相對(duì)窄的范圍，但是在脂質(zhì)體的腔中有有機(jī)溶劑，如果應(yīng)用時(shí)需要，可能必需進(jìn)一步的去除步驟。建議使用擠出機(jī)以調(diào)節(jié)尺寸分布。在診斷試劑市場(chǎng)上，沒有以這種方式生產(chǎn)的產(chǎn)品O
在得到了很好的證明并被專門用于制造診斷試劑的脂質(zhì)體的方法“C”中，所用的添加劑(洗滌劑)自身昂貴，其去除需要一些長(zhǎng)時(shí)間和復(fù)雜的過程，使這個(gè)方法更加昂貴。由于任何殘留的洗滌劑可干擾診斷反應(yīng)，在去除洗滌劑的過程中，洗滌劑濃度必須通過進(jìn)行幾個(gè)生產(chǎn)中測(cè)定檢查。雖然在某種程度上可控制制造的產(chǎn)品的尺寸分布，使用擠出機(jī)(均化器)來生產(chǎn)最終的產(chǎn)品，這使該方法更昂貴。
已知的方法中，組和“D”不需要昂貴的添加劑，但是方法“A”、和“B”產(chǎn)生具有寬尺寸分布的多層脂質(zhì)體，使后續(xù)的均勻化不可避免，因此它們使最終制造的產(chǎn)品 曰蟲印貝。發(fā)明內(nèi)容
我們開發(fā)的方法的目的為去除已知方法的缺點(diǎn)，并設(shè)計(jì)一種技術(shù)上簡(jiǎn)化脂質(zhì)體乳劑的生產(chǎn)并使它們的制造更便宜的方法。
應(yīng)用方法“D”不需要昂貴的注入/混合裝置，甚至不需要任何進(jìn)一步的加工操作， 可獲得優(yōu)選組成的脂質(zhì)乳劑。由于脂質(zhì)體的內(nèi)容物很少進(jìn)入診斷應(yīng)用中的反應(yīng)空間，囊泡中包裝的有機(jī)溶劑不會(huì)引起問題，因而不必去除溶劑。本發(fā)明的普通方案適合方法“D”。
已知的方法根據(jù)它們的物理實(shí)施方式產(chǎn)生具有寬的尺寸分布和迭片結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體。具有50至IOOnm的外徑和由一層或兩層膜(單層或雙層)組裝的適用于診斷試劑的脂質(zhì)體通過完成具有高設(shè)備需求(超聲粉碎、過濾、擠出、離心)和/或需要表面活性物質(zhì)的后續(xù)昂貴的加工步驟而生產(chǎn)。在這種情況下，由于伴隨這個(gè)附加步驟的所有缺點(diǎn)也必須去除洗滌劑。
我們的方法基于這樣的現(xiàn)象，即彼此不混溶的相的邊界在單分子層(單層)，如在我們的情況下的磷脂層，中起到布置表面活性物質(zhì)的表面的作用。由于我們的目的為生產(chǎn)脂質(zhì)體的水性乳劑，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解溶于非極性有機(jī)溶劑的脂質(zhì)將其極性頭端指向水相，而其非極性尾端指向有機(jī)相。通過混合相，至此以具有零曲率為特征的分子層，閉合形成球(囊泡)。在大體積的水溶液中，脂質(zhì)的極性頭部指向水相，并且脂質(zhì)分子的非極性尾部指向被包在囊泡內(nèi)的非極性溶劑。在合適的溶劑比例和脂質(zhì)合適的組成和濃度的情況下，在脂質(zhì)體內(nèi)部可獲得全部量的有機(jī)溶劑的包埋?？紤]到當(dāng)進(jìn)行診斷測(cè)量時(shí)，脂質(zhì)體的內(nèi)容物很少進(jìn)入反應(yīng)空間，在實(shí)現(xiàn)診斷測(cè)量時(shí)，包在囊泡內(nèi)的有機(jī)溶劑不會(huì)引起任何問題，因此不必去除溶劑。如果應(yīng)用時(shí)需要，包在脂質(zhì)體中的有機(jī)溶劑可通過真空蒸發(fā)或脂質(zhì)體乳劑的凍干被完全去除，并且被干燥的乳劑可再次溶于水溶液[參考根據(jù)美國(guó)專利4880635 ； 美國(guó)專利5578320 ;和美國(guó)專利5922350的Janoff等的方法]。
基于我們的經(jīng)驗(yàn)，我們認(rèn)識(shí)到通過簡(jiǎn)單混合(通過振蕩器、渦流混合器和攪拌器) 相，發(fā)生脂質(zhì)體的組裝，即較小體積的具有合適脂質(zhì)組分的非極性有機(jī)相在較大體積的上層極性水(緩沖液)相下分層，因此不需要特定的注入混合器。
我們認(rèn)識(shí)到為了生產(chǎn)具有優(yōu)化尺寸分布的單層脂質(zhì)體，呈現(xiàn)正或零曲率的脂質(zhì)分子的特定混合物是必需的。此外，通過改變呈現(xiàn)正或零曲率的脂質(zhì)分子的比例，在特定的限制內(nèi)可選地調(diào)節(jié)脂質(zhì)體直徑，因而，確保合適的脂質(zhì)組成，以可再生產(chǎn)的方式產(chǎn)生具有必需的尺寸分布的穩(wěn)定的乳劑。
我們觀察到用上述方法生產(chǎn)的具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體乳劑的膜表面，適于通過使活性成分錨定或簡(jiǎn)單地通過在溶液中與活性分子結(jié)合來監(jiān)測(cè)表面活性過程(例如血液凝固反應(yīng))。
我們的經(jīng)驗(yàn)顯示錨定活性分子到具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體乳劑的膜表面不需要任何的添加劑分子(例如洗滌劑)或物理處理。因此，通過上述方法生產(chǎn)的我們的具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體乳劑提供了合適的用于體外血液凝固診斷試劑的膜組分，而我們的方法通過包含其它可選擇活性組分還可延伸到其它專業(yè)領(lǐng)域。
我們還認(rèn)識(shí)到在合成PT試劑的過程中，具有合適非極性膜錨定分子部分的組織因子分子整合進(jìn)我們的具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體乳劑的膜中，因此在與脂質(zhì)體制備相同的過程中，可在單一步驟中生產(chǎn)最終試劑產(chǎn)品。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解用于單步驟生產(chǎn)首要條件是在生成具有零曲率的脂質(zhì)單層時(shí)，具有非極性膜錨定分子部分的活性分子在過程開始時(shí)被包含于水相中。這樣，適合期望定位(即其錨定端指向膜，并且其活性頭部指向水相)的活性分子在相的邊界整合進(jìn)生成的脂質(zhì)單層。如果活性分子溶于有機(jī)相，在脂質(zhì)體組裝時(shí)， 所述活性頭部將大部分位于所述脂質(zhì)體內(nèi)部，因此所述活性成分將不能發(fā)揮其效果。
根據(jù)我們的觀測(cè)，不需要洗滌劑以提供將組織因子錨定到脂質(zhì)體膜的表面所需的組織因子的合適的濃度。根據(jù)我們經(jīng)驗(yàn)，通過將合適組成的組織因子溶液混合到預(yù)先制備的脂質(zhì)體或到同時(shí)組裝的脂質(zhì)體的膜表面上，而實(shí)現(xiàn)錨定。此外，我們認(rèn)識(shí)到在需要激活的膜表面的診斷檢測(cè)系統(tǒng)中，可通過將具有合適的組成的活性成分[例如有機(jī)酸、無機(jī)酸]的水溶液混合到我們的具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體乳劑來簡(jiǎn)單地制造診斷試劑。
本發(fā)明涉及制備脂質(zhì)體的雙相方法。我們的發(fā)明中描述的雙相方法包含技術(shù)上簡(jiǎn)單和廉價(jià)的機(jī)械混合方法混合包含天然和合成磷脂的單獨(dú)混合物的非極性有機(jī)相和與前者不混溶的極性水(緩沖液)相，從而合成具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體乳劑。為將被錨定的活性成分提供膜表面 的我們的具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體乳劑，可優(yōu)選用于體外應(yīng)用，以檢測(cè)表面活性反應(yīng)。
在本發(fā)明可能的實(shí)施方式中，強(qiáng)調(diào)了體外血液凝固診斷試劑的制備。在本發(fā)明的一組的實(shí)施方式中，提到的試劑由我們的具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體乳劑和蛋白型的活性成分，即天然或重組組織因子，組成。在初步制備的具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體上，或與脂質(zhì)體膜表面的組裝同時(shí)進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)將蛋白錨定到膜的表面。在本發(fā)明的另一組的實(shí)施方式中，所述試劑由我們的具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體乳劑和非蛋白類型可溶活性成分組成；通過簡(jiǎn)單的機(jī)械混合使它們結(jié)合。上述非蛋白類型可溶活性成分可為，例如鞣花酸、鞣酸、蕓香苷、槲皮苷或無機(jī)二氧化硅。
本發(fā)明中說明的方法制備的體外診斷試劑的共同特征為具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定脂質(zhì)體乳劑的顆粒(囊泡)大小為50至lOOnm。在我們的方法中的非極性有機(jī)相為呈現(xiàn)正曲率或零曲率的脂質(zhì)分子的單獨(dú)混合物，例如卵磷脂、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酸、溶血磷脂酰膽堿和更少量的天然來源的其它磷脂，所述脂質(zhì)分子溶解在有機(jī)相中，濃度為O. 5至1. 5g/ml，包括55°C的溫度和pH=2的反應(yīng)條件。
在我們的方法中的上述極性水(緩沖液)相包含適當(dāng)?shù)蜐舛鹊臒o機(jī)離子和優(yōu)選緩沖在6. O和7. 4之間的pH，最優(yōu)選ρΗ=6· 6，具有有機(jī)化合物，例如O. 025Μ三(羥甲基)甲基甘氨酸，并補(bǔ)充抗細(xì)菌防腐劑，例如O. 05Μ NaN30用5Μ NaOH溶液調(diào)節(jié)水相的最終pH。
通過上述兩相的簡(jiǎn)單的機(jī)械混合產(chǎn)生具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體乳劑，其中，將較小體積的非極性有機(jī)相添加到較大體積的極性水(緩沖液)相。相的體積比為5至50，最優(yōu)選 20。
可在室溫(25°C )通過簡(jiǎn)單共同振蕩簡(jiǎn)單機(jī)械混合極性水(緩沖液)相和非極性有機(jī)相，后者在前者下面分層。其還可這樣進(jìn)行，由于攪動(dòng)器件的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)或混合容器的偏離心旋轉(zhuǎn)，較大體積的相被帶入渦旋運(yùn)動(dòng)，然后在室溫將較小體積的相注入、噴射或最優(yōu)選地滴入漩渦。
在我們的凝血酶原時(shí)間(PT)試劑的脂質(zhì)體組分的雙相生產(chǎn)過程中，如上述機(jī)械地混合包含磷脂的單獨(dú)混合物的非極性有機(jī)相和極性水(緩沖液)相，然后，將PT試劑的活性成分、天然或重組的組織因子錨定到生產(chǎn)的脂質(zhì)體膜的表面。例如，可將優(yōu)選O. 5至1.O μ M濃度，最優(yōu)選O. 8 μ M的活性組分(天然或重組組織因子)混合到通過簡(jiǎn)單和廉價(jià)的機(jī)械混合獲得的脂質(zhì)體膜表面上，然后讓包含錨定的組織因子的脂質(zhì)體體系靜置。在不同的實(shí)施方式中，將合適濃度的組織因子溶液加到在脂質(zhì)體組裝時(shí)使用的極性水(緩沖液)相，其結(jié)果是在脂質(zhì)體膜的組裝的同時(shí)進(jìn)行了蛋白的錨定。
在雙相生產(chǎn)我們的激活部分促凝血酶原激酶時(shí)間(APTT)試劑的脂質(zhì)體成分時(shí)， 如上述機(jī)械地混合包含磷脂的單獨(dú)混合物的非極性有機(jī)相和極性水(緩沖液)相。通過簡(jiǎn)單和廉價(jià)的機(jī)械混合，將合適濃度的APTT試劑的活性組分-有機(jī)酸、無機(jī)化合物-的水溶液混合到我們的具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體乳劑中，然后讓包含活性化合物的脂質(zhì)體體系靜置。 在本方法中，所述活性組分可為，例如優(yōu)選的濃度(例如鞣花酸0. 5至ImM，鞣酸1至2%， SiO2 :2至4g/l)下的鞣花酸、鞣酸、蕓香苷、槲皮苷、Si02。
為了最終配制PT和APTT試劑，將上述生產(chǎn)并讓其靜置的產(chǎn)品用適合各個(gè)血液凝固檢測(cè)的組成和濃度的具有優(yōu)選PH值的緩沖液以3 I的比例稀釋。在PT試劑的情況下， 一種可能的用于稀釋的溶液為包含O. 025M三(羥甲基)甲基甘氨酸、O. 25M甘氨酸、O.1lM NaCl、0. 02M CaCl2、0. 025M NaN3'16g/lPEG 4000 和 O. 0024M 聚凝胺的緩沖液，所述緩沖液優(yōu)選7. O至7. 8的pH值，在本實(shí)施例中pH=7. 4。在APTT試劑的情況下，一個(gè)可能的實(shí)例為包含O. 25M甘氨酸、O. OlM 4-羥乙基哌嗪乙磺酸、O. OOlM NiSO4和O. 2mM硫汞撒的緩沖液， 所述緩沖液優(yōu)選6. 8至7. 8的pH值，在本實(shí)施例中pH=7. O。
我們的兩個(gè)方法的特征為可以通過冷凍-干燥(凍干)進(jìn)一步穩(wěn)定試劑。在凍干前，使用基質(zhì)形成添加劑，例如以下面的濃度甘露醇I至3%、蔗糖I至3%、牛血清O.1mM0 在使用前，凍干試劑必須用水重建。
具體實(shí)施方式
下面詳細(xì)說明根據(jù)本發(fā)明的方法。
1.生產(chǎn)具有在預(yù)制階段中制備的脂質(zhì)體的試劑
脂質(zhì)體制備
脂質(zhì)溶液的組成和濃度
脂質(zhì)組成本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解可通過改變根據(jù)它們分子形狀呈現(xiàn)負(fù)的、零或正的表面曲率的磷脂的比例影響脂質(zhì)體的性狀和迭片結(jié)構(gòu)。顯而易見的是，占大部分的呈現(xiàn)零或負(fù)的表面曲率的磷脂支持大的平的表面的形成，其中，在水溶液中，通過折疊成層， 實(shí)現(xiàn)了表面能的最小化，因而，這樣組合物的磷脂混合物導(dǎo)致大的多層脂質(zhì)體或沒有被包含的內(nèi)部空間的分層片狀脂質(zhì)聚集體。易于理解這樣的脂質(zhì)體的有用的表面，即能使活性分子根據(jù)需要包埋的表面(指向水溶液)，與集合的脂質(zhì)的量相比較小。因此，具有正的或零的表面曲率的磷脂最適于制備用作診斷試劑目的的·脂質(zhì)體，因?yàn)樗鼈兪怪|(zhì)體囊泡的大小和形狀(球形)在期望的范圍內(nèi)。因此，脂質(zhì)混合物的決定部分優(yōu)選應(yīng)由呈現(xiàn)零表面曲率的卵磷脂和呈現(xiàn)小的正的曲率的磷脂酰絲氨酸構(gòu)成?？蓛?yōu)選加入小量的溶解形式的分子影響脂質(zhì)體的大小，即僅包含具有甘油骨架的單個(gè)脂肪酸酯的分子，優(yōu)選呈現(xiàn)正曲率的溶血磷脂酰膽堿和/或溶血磷脂酸。避免高濃度的呈現(xiàn)負(fù)的表面曲率的膽固醇或磷脂酰乙醇胺。 由合成或天然來源分離的磷脂可用于制備脂質(zhì)體。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解細(xì)胞膜分離物的磷脂組合物確保期望的比例，但是植物和動(dòng)物來源的磷脂組合物可在非常寬的范圍內(nèi)變化。雖然可將兔腦膜脂質(zhì)分離物用于制備重組診斷試劑而無需改變或添加，但只有在以合適的質(zhì)量和數(shù)量加入溶血脂質(zhì)之后，來自大豆的提取物才可被用于制備這樣的脂質(zhì)體。
有機(jī)溶劑組成和濃度在兩相方法中，關(guān)于用于制備脂質(zhì)體的有機(jī)溶劑的基本的要求為其必須與水不混溶，并且其必須溶解期望的組合物的脂質(zhì)。實(shí)踐中，可使用合適比例的氯仿和甲醇的混合物，將溶劑的相對(duì)量在5 :1至1:1的比例內(nèi)改變，優(yōu)選地選擇比例為2 I的氯仿-甲醇。溶解度以及配置包含不可分離頭基(例如磷脂酰絲氨酸)的磷脂的特定的表面曲率的特性很大程度上依賴于頭基的質(zhì)子化，因此在過程中，保持脂質(zhì)溶液合適的PH水平很重要。優(yōu)選地，用有機(jī)酸將所述脂質(zhì)溶液的pH值調(diào)節(jié)到合適的值。蟻酸、乙酸、三氯乙酸或三氟乙酸可用于此目的。由于其揮發(fā)性，特別優(yōu)選使用三氟乙酸。在脂質(zhì)的溶解期間，優(yōu)選調(diào)節(jié)PH值在2和4之間，最合適的值為2. 5。三氟乙酸的濃度為O. 5%。
脂質(zhì)溶液的濃度由于在水溶液中，磷脂非常易于在H11取向中聯(lián)合，而這從活性產(chǎn)物的低收率的觀點(diǎn)看是不利的，所以優(yōu)選使用高脂質(zhì)濃度。根據(jù)機(jī)械混合的方法，優(yōu)選脂質(zhì)濃度為O. 2g/ml至2g/ml,最優(yōu)選濃度為lg/ml。在這個(gè)濃度范圍中,所述氯仿-甲醇-磷脂溶液在凝膠狀態(tài)而非液態(tài)。
脂質(zhì)溶液的溫度為達(dá)到合適的脂質(zhì)濃度，當(dāng)溶解脂質(zhì)時(shí)，必須確保高于室溫 (250C )的溫度?？蓱?yīng)用的溫度范圍由溶劑的沸點(diǎn)(氯仿61. 2°C，甲醇64. 5°C)和磷脂的熱穩(wěn)定性決定。合適的溫度范圍為30°C至55°C，優(yōu)選使用較高的溫度。
水性緩沖液的組成和濃度
溶液的組成本領(lǐng)域技術(shù)人員易于理解磷脂的頭基的凈電荷顯著地影響它們的表面曲率特性，因此溶液的離子組成和離子強(qiáng)度決定了脂質(zhì)體組裝的質(zhì)量。離子強(qiáng)度，即粗略地為水相的鹽濃度應(yīng)優(yōu)選保持在最低水平，大約為零。溶液的PH必須用有機(jī)鹽而不是無機(jī)鹽調(diào)節(jié)至期望的值，優(yōu)選在pH=6. O和pH=7. 4之間，最優(yōu)選pH=6. 6，用5M的NaOH溶液調(diào)節(jié)。 適用的具有緩沖效果的有機(jī)物優(yōu)選為M0PS、CHAPS、三(羥甲基)甲基甘氨酸、甘氨酸。由于脂質(zhì)體乳劑易受細(xì)菌感染，優(yōu)選地所述溶液應(yīng)包含抗菌劑。這樣的試劑可為硫汞撒或NaN3, 并且由于其Na+含量后者的濃度必須保持在最低水平。
濃度使用的水溶液的緩沖液組分的濃度必須足以達(dá)到必需的pH和緩沖容量，即在三(羥甲基)甲基甘氨酸的情況下，優(yōu)選濃度范圍在O. 05至O. 1M，最佳濃度為0.07M。在使用NaN3作為抗菌試劑的情況下，濃度不可高于O. 1M，優(yōu)選應(yīng)為O. 05M?？赡艿乃芤航M合物示于下面說明的實(shí)施例。
根據(jù)混合方法，有機(jī)相和水相的比例優(yōu)選為在1: 5和1: 100之間。
凝血酶原時(shí)間試劑制備
水溶液組成和濃度
組織因子(TF)溶液水性緩沖溶液的組成和濃度與在描述在脂質(zhì)體制備中使用的水性緩沖溶液時(shí)確定的組成與濃度相同。在三(羥甲基)甲基甘氨酸的情況下，優(yōu)選的濃度范圍為O. 05至O. 1M，最佳濃度為O. 07M，并且所述溶液包含O. 5至1. O μ Μ、最優(yōu)選 O. 8 μ M的組織因子。在抗菌劑NaN3的情況下，濃度可不超過O. 1Μ，優(yōu)選應(yīng)為O. 05Μ?？赡艿乃芤航M合物可見于下面說明的實(shí)施例。
包含活性分子的脂質(zhì)體乳劑的稀釋緩沖液本領(lǐng)域技術(shù)人員易于理解對(duì)于血液凝固試劑，血液凝固反應(yīng)和產(chǎn) 生的凝結(jié)物的質(zhì)量，以及產(chǎn)品的最終質(zhì)量和保質(zhì)期受離子環(huán)境、 添加劑數(shù)量和質(zhì)量的關(guān)系的很大的影響。優(yōu)選最終組合物通過稀釋包含脂質(zhì)體和活性分子的溶液來調(diào)節(jié)。從稀釋溶液中的離子環(huán)境的方面看，Na+和Ca2+離子的濃度，陽(yáng)離子的反離子的質(zhì)量，即Cl—和/或OH—離子的存在具有顯著的重要性。在影響凝固反應(yīng)和凝結(jié)物質(zhì)量的添加劑中，Ni2+離子的濃度及添加劑聚乙二醇的質(zhì)量和數(shù)量具有顯著的作用。從離子環(huán)境的方面看，負(fù)責(zé)保持優(yōu)選的PH范圍，即pH=7. O至7. 8的有機(jī)緩沖液組分的質(zhì)量和濃度非常重要。為將Na濃度保持在合適的水平，優(yōu)選用5M NaOH溶液調(diào)節(jié)最終pH值。此外，添加劑聚乙二醇的質(zhì)量和數(shù)量也影響試劑的凝固能力。由于最終產(chǎn)品包含易受氧化和微生物降解影響的脂質(zhì)組分，所述產(chǎn)品還應(yīng)包含抗氧化劑和抗微生物劑。優(yōu)選地，抗微生物劑應(yīng)為 NaN3,因而當(dāng)調(diào)節(jié)離子環(huán)境時(shí)，應(yīng)考慮其Na+離子含量。如果脂質(zhì)體制備期間使用的水溶液不包含凝固添加劑聚凝胺，那么優(yōu)選地應(yīng)將其加入稀釋緩沖液中?？赡艿娜芤航M合物可見于下面說明的實(shí)施例。
在稀釋具有包含活性分子的獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體乳劑時(shí)的混合比例
由最終產(chǎn)品期望的特性確定稀釋溶液的混合比例。優(yōu)選地稀釋范圍應(yīng)在2倍至6 倍之間，4倍稀釋最合適。
激活部分促凝血酶原激酶時(shí)間試劑制備
水溶液組成和濃度
激活溶液本領(lǐng)域技術(shù)人員了解在制備APTT試劑期間，可考慮幾種不同的活性分子(例如鞣花酸、鞣酸、蕓香苷、槲皮苷、SiO2),且溶液實(shí)際的組成和濃度比例由它們物理和化學(xué)特性確定。對(duì)于鞣酸，優(yōu)選地用根據(jù)“水性緩沖溶液的組成和濃度”部分中所述而確定的組成和濃度的溶液稀釋2%的水溶液I至2倍，最合適地1. 2倍?？赡艿乃芤航M成見下面的實(shí)施例。
包含活性分子的脂質(zhì)體乳劑的稀釋緩沖液本領(lǐng)域技術(shù)人員易于理解對(duì)于血液凝固試劑，血液凝固反應(yīng)和產(chǎn)生的凝結(jié)物的質(zhì)量，以及產(chǎn)品的最終質(zhì)量和保質(zhì)期都受離子環(huán)境、添加劑的數(shù)量和質(zhì)量關(guān)系的高度影響。優(yōu)選通過稀釋包含脂質(zhì)體和活性分子的溶液實(shí)現(xiàn)最終的組合物。對(duì)于APTT試劑，重要的是稀釋溶液不可包含Ca2+離子。從該稀釋溶液的離子環(huán)境的方面看，Na+離子的濃度、陽(yáng)離子的反離子的質(zhì)量，即Cr和/或OF離子的存在， 具有顯著的重要性。從離子環(huán)境的方面看，負(fù)責(zé)保持優(yōu)選的PH范圍，即pH=6. 8至7. 8的有機(jī)緩沖液組分的質(zhì)量和濃度非常重要。為將Na濃度保持在合適的水平，優(yōu)選地用5M NaOH 溶液調(diào)整最終PH值。在影響凝固反應(yīng)和凝結(jié)物質(zhì)量的添加劑中，Ni2+離子的濃度具有顯著的作用。由于最終產(chǎn)品包含易受氧化和微生物降解影響的脂質(zhì)組分，所述產(chǎn)品還應(yīng)包含抗氧化劑和抗微生物劑。優(yōu)選地，抗微生物劑應(yīng)為硫汞撒?？赡艿娜芤航M合物可見于下面說明的實(shí)施例。
在稀釋具有包含活性分子的獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體乳劑時(shí)的混合比例
通過最終產(chǎn)品的期望特性確定稀釋溶液的混合比例。優(yōu)選的稀釋范圍應(yīng)在2至6 倍之間，最合適的為4倍稀釋。
2.在相同過程中脂質(zhì)體和凝血酶原時(shí)間試劑的制備
脂質(zhì)溶液的組成和濃度與對(duì)脂質(zhì)體制備中使用的脂質(zhì)溶液的脂質(zhì)組成的說明中確定的相同。
水性緩沖溶液的組成和濃度與對(duì)脂質(zhì)體制劑中使用的水性緩沖溶液的組成的說明中確定的相同，補(bǔ)充為在這個(gè)過 程中，應(yīng)優(yōu)選地添加凝固添加劑聚凝胺到該溶液中，優(yōu)選以O(shè). 024M的濃度。
有機(jī)相和水相的比例與對(duì)脂質(zhì)體制備的說明中確定的相同。
脂質(zhì)體乳劑稀釋緩沖液的組分和濃度與對(duì)凝血酶原時(shí)間試劑的脂質(zhì)體乳劑稀釋緩沖液中確定的相同。
包含活性分子的脂質(zhì)體乳劑的稀釋溶液的混合比例與對(duì)凝血酶原時(shí)間試劑的說明中確定的相同。
實(shí)現(xiàn)所述試劑的詳細(xì)的實(shí)施例.
1.通過分層和振蕩相組裝脂質(zhì)體
a.將從兔腦粉中分離的Ig的磷脂混合物溶于Iml的包含O. 5%的三氟乙酸的 2 I比例的氯仿-甲醇混合物中。獲得的凝膠混合物在55°C保持液態(tài)。
b.在室溫(25°0，在玻璃注射器的幫助下，將5(^1的磷脂溶液小心地Iml的 0.07M三(羥甲基)甲基甘氨酸和0.05M NaN3的溶液的下面分層。用5M NaOH調(diào)節(jié)所述水溶液的pH至6. 6。
c.高速將所述相振蕩到一起。
d.去除沉淀的脂質(zhì)顆粒。
e.所述清澈的脂質(zhì)體乳劑與O. 5ml的O. SM溶于水的重組組織因子混合。靜置 10分鐘后，用O. 025M三(羥甲基)甲基甘氨酸、O. 25M甘氨酸、O.1lM NaCl、0.02M CaCl2, O. 025M NaN3> 16g/lPEG 4000和O. 0024M聚凝胺的溶液稀釋4倍。用5M NaOH調(diào)節(jié)所述稀釋溶液的pH至7. 4。
通過進(jìn)行凝血酶原時(shí)間測(cè)試檢驗(yàn)產(chǎn)品的質(zhì)量。測(cè)得的正常對(duì)照血漿的凝固時(shí)間是 11. 9s，病理對(duì)照血漿為17. 2s。
2.當(dāng)通過用磁力攪拌器和旋轉(zhuǎn)攪拌元件產(chǎn)生渦流時(shí)，通過將脂質(zhì)溶液滴到渦旋運(yùn)動(dòng)中的液相來組裝脂質(zhì)體。
a.將從兔腦粉中分離的O. 5g的磷脂混合物溶于Iml的包含O. 5%的三氟乙酸的 2 I比例的氯仿-甲醇混合物中。獲得的凝膠混合物在55°C保持液態(tài)。
b.用注射器將100 μ I的磷脂溶液滴入IOml的在室溫(25°C )下快速渦旋運(yùn)動(dòng)中的O. 07M三(羥甲基)甲基甘氨酸和O. 05M NaN3的溶液中。用5M NaOH調(diào)節(jié)所述水溶液的pH至6. 6。
c.去除沉淀的脂質(zhì)顆粒。
d.將所述清澈的脂質(zhì)體乳劑與O. 5ml的O. SM重組組織因子混合。靜置10分鐘后，用 O. 025M 三(羥甲基)甲基甘氨酸、O. 25M 甘氨酸、O.1lM NaCl、0.02M CaCl2、0. 025M NaN3、16g/lPEG 4000和O. 0024M聚凝胺的溶液稀釋4倍。用5M NaOH調(diào)節(jié)所述稀釋溶液的 pH 至 7. 4。
通過進(jìn)行凝血酶原時(shí)間測(cè)試檢驗(yàn)產(chǎn)品的質(zhì)量。測(cè)得的正常對(duì)照血漿的凝固時(shí)間是 11. 7s，病理對(duì)照血漿為16. 9s。
3.當(dāng)通過混合容器的離心旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生渦流時(shí)，通過將脂質(zhì)溶液滴到渦旋運(yùn)動(dòng)中的液相而組裝脂質(zhì)體。
a.將從兔腦粉中分離的O. 5g的磷脂混合物溶于Iml的包含O. 5%的三氟乙酸的 2 I比例的氯仿-甲醇混合物中。獲得的凝膠混合物在55°C保持液態(tài)。
b.用注射器將100 μ I的磷脂溶液滴入IOml的在室溫(25°C )下快速渦旋運(yùn)動(dòng)中的O. 07M三(羥甲基)甲基甘氨酸和O. 05M NaN3的溶液中。用5M NaOH調(diào)節(jié)所述水溶液的pH至6. 6。
c.去除沉淀的脂質(zhì)顆粒。
d.將所述清澈的脂質(zhì)體乳劑與O. 5ml的O. SM重組組織因子混合。靜置10分鐘后，用 O. 025M 三(羥甲基)甲基甘氨酸、O. 25M 甘氨酸、O.1lM NaCl、0.02M CaCl2、0. 025M NaN3、16g/lPEG 4000和O. 0024M聚凝胺的溶液稀釋4倍。用5M NaOH調(diào)節(jié)所述稀釋溶液的 pH 至 7. 4。
通過進(jìn)行凝血酶原時(shí)間測(cè)試檢驗(yàn)產(chǎn)品的質(zhì)量。測(cè)得的正常對(duì)照血漿的凝固時(shí)間是 11. 7s，病理對(duì)照血漿為16. 9s。
4.使用通過分層和振蕩相預(yù)先生產(chǎn)的脂質(zhì)體制備凝血酶原時(shí)間試劑。
a.將從兔腦粉中分離的Ig的磷脂混合物溶于Iml的包含O. 5%的三氟乙酸的 2 I比例的氯仿-甲醇混合物中。獲得的凝膠混合物在55°C保持液態(tài)。
b.在室溫(25°C)，在玻璃注射器的幫助下，將50 μ I的磷脂溶液小心地在Iml的 0.07Μ三(羥甲基)甲基甘氨酸和0.05Μ NaN3的溶液的下面分層。用5Μ NaOH調(diào)節(jié)所述水溶液的pH至6. 6。
c.高速將所述相振蕩到一起。
d.去除沉淀的脂質(zhì)顆粒。
e.制備O. 8M的重組組織因子的水溶液。
f.由所述脂質(zhì)體乳劑和如e階段中所述獲得的溶液制備2 I比例的混合物，并讓混合物靜置10分鐘。
g.用包含O. 025M三(羥甲基)甲基甘氨酸、O. 25M甘氨酸、O.1lM NaCl, O. 02MCaCl2、0. 025M NaN3、16g/lPEG 4000和O. 0024M聚凝胺的溶液將包含加入組織因子的脂質(zhì)體乳劑稀釋3倍。用5M NaOH調(diào)節(jié)所述稀釋溶液的pH至7. 4。
通過進(jìn)行凝血酶原時(shí)間測(cè)試檢驗(yàn)產(chǎn)品的質(zhì)量。測(cè)得的正常對(duì)照血漿的凝固時(shí)間是11.9s，病理對(duì)照血漿為17. 2s。
5.當(dāng)通過用磁力攪拌器和旋轉(zhuǎn)攪拌元件產(chǎn)生渦流時(shí)，用通過將脂質(zhì)溶液滴到渦旋運(yùn)動(dòng)中的液相而預(yù)先生產(chǎn)的脂質(zhì)體制備凝血酶原時(shí)間試劑。
a.將從兔腦粉中分離的Ig的磷脂混合物溶于Iml的包含O. 5%的三氟乙酸的 2 I比例的氯仿-甲醇混合物中。獲得的凝膠混合物在55°C保持液態(tài)。
b.用注射器將100 μ I的磷脂溶液滴入IOml的在室溫(25°C )下快速渦旋運(yùn)動(dòng)中的0.07M三(羥甲基) 甲基甘氨酸和0.05M NaN3的溶液。用5M NaOH調(diào)節(jié)所述水溶液的 pH 至 6. 6。
c.去除沉淀的脂質(zhì)顆粒。
d.制備O. 8M的重組組織因子的水溶液。
e.由所述脂質(zhì)體乳劑和如d階段中所述獲得的溶液制備2 I比例的混合物，并讓混合物靜置10分鐘。
f.用包含O. 025M三(羥甲基)甲基甘氨酸、O. 25M甘氨酸、O.1lM NaCl, O. 02MCaCl2、0. 025M NaN3、16g/lPEG 4000和O. 0024M聚凝胺的溶液將包含加入組織因子的脂質(zhì)體乳劑稀釋3倍。用5M NaOH調(diào)節(jié)所述稀釋溶液的pH至7. 4。
通過進(jìn)行凝血酶原時(shí)間測(cè)試檢驗(yàn)產(chǎn)品的質(zhì)量。測(cè)得的正常對(duì)照血漿的凝固時(shí)間是11.7s，病理對(duì)照血漿為16. 9s。
6.當(dāng)通過混合容器的離心旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生渦流時(shí)，用通過將脂質(zhì)溶液滴到渦旋運(yùn)動(dòng)中的液相而預(yù)先生產(chǎn)的脂質(zhì)體制備凝血酶原時(shí)間試劑。
a.將從兔腦粉中分離的Ig的磷脂混合物溶于Iml的包含O. 5%的三氟乙酸的 2 I比例的氯仿-甲醇混合物中。獲得的凝膠混合物在55°C保持液態(tài)。
b.用注射器將100 μ I的磷脂溶液滴入IOml的在室溫(25°C )下快速渦旋運(yùn)動(dòng)中的0.07M三(羥甲基)甲基甘氨酸和0.05M NaN3的溶液。用5M NaOH調(diào)節(jié)所述水溶液的 pH 至 6. 6。
c.去除沉淀的脂質(zhì)顆粒。
d.制備O. 8M的重組組織因子的水溶液。
e.由所述脂質(zhì)體乳劑和如d階段中所述獲得的溶液制備2 I比例的混合物，并讓混合物靜置10分鐘。
f.用包含O. 025M三(羥甲基)甲基甘氨酸、O. 25M甘氨酸、O.1lM NaCl, O. 02MCaCl2、0. 025M NaN3、16g/lPEG 4000和O. 0024M聚凝胺的溶液將包含加入組織因子的脂質(zhì)體乳劑稀釋3倍。用5M NaOH調(diào)節(jié)所述稀釋溶液的pH至7. 4。
通過進(jìn)行凝血酶原時(shí)間測(cè)試檢驗(yàn)產(chǎn)品的質(zhì)量。測(cè)得的正常對(duì)照血漿的凝固時(shí)間是11.7s，病理對(duì)照血漿為16. 9s。
7.通過原位脂質(zhì)體組裝和活性成分(組織因子)整合，在單個(gè)步驟中制備凝血酶原時(shí)間試劑。
a.將從兔腦粉中分離的Ig的磷脂混合物溶于Iml的包含O. 5%的三氟乙酸的 2 I比例的氯仿-甲醇混合物中。獲得凝膠混合物在55°C保持液態(tài)。
b.制備比例為1:1的用5M NaOH將pH調(diào)節(jié)為6. 6的O. 07M三(羥甲基)甲基甘氨酸和O. 05M NaN3溶液與O. 8M的重組組織因子水溶液的混合物。
c.在室溫(25°C)，在玻璃注射器的幫助下，將50 μ I的磷脂溶液小心地在Iml的 b階段中所述的溶液的下面分層。
d.高速將所述相振蕩到一起。
e.去除沉淀的脂質(zhì)顆粒。
f.用包含O. 025M三(羥甲基)甲基甘氨酸、O. 25M甘氨酸、O.1lM NaCl, O. 02MCaCl2、0. 025M NaN3、16g/lPEG 4000和O. 0024M聚凝胺的溶液將包含加入組織因子的脂質(zhì)體乳劑稀釋，其中所述溶液體積為所述脂質(zhì)體乳劑的3倍。用5M NaOH調(diào)節(jié)所述稀釋溶液的pH至7. 4。
通過進(jìn)行凝血酶原時(shí)間測(cè)試檢驗(yàn)產(chǎn)品的質(zhì)量。測(cè)得的正常對(duì)照血漿的凝固時(shí)間是11.7s，病理對(duì)照血漿為17. Os。8.當(dāng)形成基質(zhì)的添加劑為牛血清時(shí)，通過凍干進(jìn)一步穩(wěn)定通過原位脂質(zhì)體組裝和活性成分(組織因子)整合生產(chǎn)的凝血酶原時(shí)間試劑。
a.將從兔腦粉中分離的Ig的磷脂混合物溶于Iml的包含O. 5%的三氟乙酸的 2 I比例的氯仿-甲醇混合物。獲得的凝膠混合物在55°C保持液態(tài)。
b.制備比例為1:1的用5M NaOH將pH調(diào)節(jié)為6.6的O. 07M三(羥甲基)甲基甘氨酸和O. 05M NaN3溶液和O. 8M的重組組織因子水溶液的混合物。
c.在室溫(25°C)，在玻璃注射器的幫助下，將50 μ I的磷脂溶液小心地在Iml的階段b中所述的溶液的下面分層。
d.高速將所述相振蕩到一起。
e.去除沉淀的脂質(zhì)顆粒。
f.作為形成基質(zhì)的添加劑，優(yōu)選以O(shè).1mM的濃度將牛血清(BSA)加入所述產(chǎn)物。
g.將階段f中獲得的乳劑填入凍干小瓶。
h.凍干上述小瓶的內(nèi)容物。
1.使用前，將凍干的物質(zhì)溶于4ml的O. 025M三(羥甲基)甲基甘氨酸、0.25M甘氨酸、O.1lM NaCl、0. 02M CaCl2、0. 025M NaN3、16g/lPEG 4000 和 0. 0024M 的聚凝胺的溶液中。用5M NaOH調(diào)節(jié)所述水溶液的pH至7. 4。
通過進(jìn)行凝血酶原時(shí)間測(cè)試檢驗(yàn)產(chǎn)品的質(zhì)量。測(cè)得的正常對(duì)照血漿的凝固時(shí)間是12.4s，病理對(duì)照血漿為19. 8s。
9.當(dāng)形成基質(zhì)的添加劑為甘露醇時(shí)，通過凍干進(jìn)一步穩(wěn)定通過原位脂質(zhì)體組裝和活性成分(組織因子)整合生產(chǎn)的凝血酶原時(shí)間試劑。
a.將從兔腦粉中分離的Ig的磷脂混合物溶于Iml的包含O. 5%的三氟乙酸的 2 I比例的氯仿-甲醇混合物中。獲得的凝膠混合物在55°C保持液態(tài)。
b.制備比例為1:1的用5M NaOH將pH調(diào)節(jié)為6.6的O. 07M三(羥甲基)甲基甘氨酸和O. 05M NaN3溶液和O. 8M的重組組織因子水溶液的混合物。
c.在室溫(25°C)，在玻璃注射器的幫助下，將50 μ I的磷脂溶液小心地在Iml的階段b中所述的溶液的下面分層。
d.高速將所述相振蕩到一起。
e.去除沉淀的脂質(zhì)顆粒。
f.作為形成基質(zhì)的添加劑，優(yōu)選以I至3%的濃度將甘露醇加入所述產(chǎn)物。
g.將f中獲得的乳劑填入凍干小瓶。
h.凍干上述小瓶的內(nèi)容物。
1.使用前，將凍干的物質(zhì)溶于4ml的O. 025M三(羥甲基)甲基甘氨酸、0.25M甘氨酸、O.1lM NaCl、0. 02M CaCl2、0. 025M NaN3、16g/lPEG 4000 和 0. 0024M 的聚凝胺的溶液中。用5M NaOH調(diào)節(jié)所述水溶液的pH至7. 4。
通過進(jìn)行凝血酶原時(shí)間測(cè)試檢驗(yàn)產(chǎn)品的質(zhì)量。測(cè)得的正常對(duì)照血漿的凝固時(shí)間是·12.7s，病理對(duì)照血漿為17. 7s。
10.當(dāng)形成基質(zhì)的添加劑為蔗糖時(shí)，通過凍干進(jìn)一步穩(wěn)定通過原位脂質(zhì)體組裝和活性成分(組織因子)整合生產(chǎn)的凝血酶原時(shí)間試劑。
a.將從兔腦粉中分離的Ig的磷脂混合物溶于Iml的包含O. 5%的三氟乙酸的 2 I比例的氯仿-甲醇混合物中。獲得的凝膠混合物在55°C保持液態(tài)。
b.制備比例為1:1的用5M NaOH將pH調(diào)節(jié)為6.6的O. 07M三(羥甲基)甲基甘氨酸和O. 05M NaN3溶液和O. 8M的重組組織因子水溶液的混合物。
c.在室溫(25°C)，在玻璃注射器的幫助下，將50 μ I的磷脂溶液小心地在Iml的階段b中所述的溶液的下面分層。
d.高速將所述相振蕩到一起。
e.去除沉淀的脂質(zhì)顆粒。
f.作為形成基質(zhì)的添加劑，優(yōu)選以I至3%的濃度將蔗糖加入所述產(chǎn)物中。
g.將f中獲得的乳劑填入凍干小瓶。
h.凍干上述小瓶的內(nèi)容物。
1.使用前，將凍干的物質(zhì)溶于4ml的O. 025M三(羥甲基)甲基甘氨酸、0.25M甘氨酸、O.1lM NaCl、0. 02M CaCl2、0. 025M NaN3、16g/lPEG 4000 和 0. 0024M 的聚凝胺的溶液。 用5M NaOH調(diào)節(jié)所述水溶液的pH至7. 4。
通過進(jìn)行凝血酶原時(shí)間測(cè)試檢驗(yàn)產(chǎn)品的質(zhì)量。測(cè)得的正常對(duì)照血漿的凝固時(shí)間是12.7s，病理對(duì)照血漿為17. 7s。
11.使用通過分層和振蕩相預(yù)先生產(chǎn)的脂質(zhì)體制備激活部分促凝血酶原激酶時(shí)間試劑
a.將從兔腦粉中分離的Ig的磷脂混合物溶于Iml的包含O. 5%的三氟乙酸的 2 I比例的氯仿-甲醇混合物中。獲得的凝膠混合物在55°C保持液態(tài)。
b.制備比例為1:1的用5M NaOH將pH調(diào)節(jié)為6.6的O. 07M三(羥甲基)甲基甘氨酸和O. 05M NaN3溶液和O. 8M的重組組織因子水溶液的混合物。
c.在室溫(25°C)，在玻璃注射器的幫助下，將50 μ I的磷脂溶液小心地在Iml的階段b中所述的溶液的下面分層。
d.高速將所述相振蕩到一起。
e.去除沉淀的脂質(zhì)顆粒。
f.制備2%的鞣酸水性儲(chǔ)備溶液。
g.用O. 07M三(羥甲基)甲基甘氨酸和O. 05M NaN3的溶液將2%的鞣酸儲(chǔ)備溶液稀釋1. 2倍。
h.由e階段獲得的脂質(zhì)體乳劑和在g中獲得的溶液制備1:1比例的混合物，并讓混合物靜置10分鐘。
1.用包含O. 07M甘露醇，O. 25M甘氨酸、O. OlM 4_羥乙基哌嗪乙磺酸、 O. OOlMNiSO4, O. 2mM硫汞撒的溶液將包含鞣酸的脂質(zhì)體乳劑稀釋3倍。用5M NaOH調(diào)節(jié)所述水溶液的pH至7. O。
通過進(jìn)行激活部分促凝血酶原激酶時(shí)間測(cè)試檢驗(yàn)產(chǎn)品的質(zhì)量。測(cè)得的正常對(duì)照血漿的凝固時(shí)間是40. ls，病理對(duì)照血漿為76. 9s。
12.使用通過當(dāng)用磁力攪拌器和旋轉(zhuǎn)攪拌元件產(chǎn)生渦流時(shí)，將脂質(zhì)溶液滴入渦旋運(yùn)動(dòng)中的水相而預(yù)先生產(chǎn)的脂質(zhì)體制備激活部分促凝血酶原激酶時(shí)間試劑。
a.將從兔腦粉中分離的Ig的磷脂混合物溶于Iml的包含O. 5%的三氟乙酸的 2 I比例的氯仿-甲醇混合物中。獲得的凝膠混合物在55°C保持液態(tài)。
b.用注射器將100 μ I的磷脂溶液滴入IOml的在室溫(25°C )下快速渦旋運(yùn)動(dòng)中的0.07M三(羥甲基)甲基甘氨酸和0.05M NaN3的溶液。用5M NaOH調(diào)節(jié)所述水溶液的 pH 至 6. 6。
c.去除沉淀的脂質(zhì)顆粒。
d.制備2%的鞣酸水性儲(chǔ)備溶液。
e.用O. 07M三(羥甲基)甲基甘氨酸和O. 05M NaN3的溶液將2%的鞣酸儲(chǔ)備溶液稀釋1. 2倍。
f.由所述脂質(zhì)體乳劑和如e階段中所述獲得的溶液制備1:1比例的混合物，并讓混合物靜置10分鐘。
g.用包含O. 07M甘露醇、O. 25M甘氨酸、O. OlM 4_羥乙基哌嗪乙磺酸、 0.001MNiS04、0. 2mM硫汞撒的溶液將包含鞣酸的脂質(zhì)體乳劑稀釋3倍。用5M NaOH調(diào)節(jié)所述稀釋溶液的pH至7. O。
通過進(jìn)行激活部分促凝血酶原激酶時(shí)間測(cè)試檢驗(yàn)產(chǎn)品的質(zhì)量。測(cè)得的正常對(duì)照血漿的凝固時(shí)間是36. 2s，病理對(duì)照血漿為60. 5s。
13.使用通過當(dāng)由混合容器的偏離心旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生渦流時(shí)，將脂質(zhì)溶液滴入渦旋運(yùn)動(dòng)中的水相而預(yù)先生產(chǎn)的脂質(zhì)體制備激活部分促凝血酶原激酶時(shí)間試劑
a.將從兔腦粉中分離的Ig的磷脂混合物溶于Iml的包含O. 5%的三氟乙酸的2 I比例的氯仿-甲醇混合物中。獲得的凝膠混合物在55°C保持液態(tài)。
b.用注射器將100 μ I的磷脂溶液滴入IOml的在室溫(25°C )下快速渦旋運(yùn)動(dòng)中的0.07M三(羥甲基)甲基甘氨酸和0.05M NaN3的溶液。用5M NaOH調(diào)節(jié)所述水溶液的 pH 至 6. 6。
c.去除沉淀的脂質(zhì)顆粒。
d.制備2%的鞣酸水性儲(chǔ)備溶液。
e.用O. 07M三(羥甲基)甲基甘氨酸和O. 05M NaN3的溶液將2%的鞣酸儲(chǔ)備溶液稀釋1. 2倍。
f.由所述脂質(zhì)體乳劑和e階段中獲得的溶液制備1:1比例的混合物，并讓混合物靜置10分鐘。
g.用包含O. 07M甘露醇、O. 25M甘氨酸、O. OlM 4_羥乙基哌嗪乙磺酸、O.OOlMNiSO4^O. 2mM硫汞撒的溶液將包含鞣酸的脂質(zhì)體乳劑稀釋3倍。用5MNa0H調(diào)節(jié)所述稀釋溶液的PH至7. O。
通過進(jìn)行激活部分促凝血酶原激酶時(shí)間測(cè)試檢驗(yàn)產(chǎn)品的質(zhì)量。測(cè)得的正常對(duì)照血漿的凝固時(shí)間是36. 2s，病理對(duì)照血漿為60. 5s。
上面說明的用于制造血液凝固試劑的方法的最重要的技術(shù)優(yōu)勢(shì)為它們可通過使用簡(jiǎn)單和廉價(jià)的裝置(混合器)和試劑實(shí)現(xiàn)。不使用洗滌劑，因而不需要去除洗滌劑，并且不需要對(duì)生產(chǎn)的脂質(zhì)體的任何進(jìn)一步加工(例如擠出)。
本發(fā)明最重要的經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)為其不需要用于脂質(zhì)體制備的昂貴的試劑和方法，其不需要使用洗滌劑以溶解組 織因子，并且獲得的脂質(zhì)體直接適于生產(chǎn)血液凝固試劑，而不需要任何后續(xù)步驟。另一個(gè)經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)為本發(fā)明可以在單一的步驟中發(fā)生脂質(zhì)體組裝和試劑生產(chǎn)這樣的方式實(shí)現(xiàn)，因此節(jié)省了進(jìn)一步的費(fèi)用。使用本發(fā)明中所述的方法制造的PT試劑呈現(xiàn)與從天然來源分離的促凝血酶原激酶相同的生化性質(zhì)。CN 103003441 A按照條約第19條修改的權(quán)利要求書_ι^_1.一種脂質(zhì)體的兩相制備方法，在所述方法的過程中，混合包含天然和合成磷脂混合物的非極性有機(jī)相和與所述非極性有機(jī)相不混溶的極性水(緩沖液)相，并產(chǎn)生具有50至 IOOnm粒徑的脂質(zhì)體乳劑，其特征在于用簡(jiǎn)單的機(jī)械混合方法生產(chǎn)所述脂質(zhì)體乳劑，其中，用溶于所述非極性有機(jī)相中并呈現(xiàn)正曲率或零曲率的O. 5至1. 5g/ml濃度的脂質(zhì)分子的單獨(dú)混合物產(chǎn)生完全包圍所述有機(jī)相的單層或雙層脂質(zhì)體膜的結(jié)構(gòu)，所述脂質(zhì)分子為例如卵磷脂、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酸、溶血磷脂酰膽堿和更少量的天然來源的其它磷脂，且這種方式制備的具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的所述脂質(zhì)體乳劑的所述膜表面適于錨定活性成分。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于將2 I比例的氯仿-甲醇混合物用作非極性有機(jī)相。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于在所述非極性有機(jī)相中，為生產(chǎn)呈現(xiàn)正曲率或零曲率的脂質(zhì)分子的所述單獨(dú)混合物，優(yōu)選提供55°C的溫度和pH=2的環(huán)境。4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于在所述極性水相中，用有機(jī)化合物，優(yōu)選 0.025M三(羥甲基)甲基甘氨酸，提供所述緩沖效果。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于用5MNaOH將所述極性水(緩沖液)相的pH 值調(diào)節(jié)在pH=6和pH=7之間、優(yōu)選pH=6. 6，并以O(shè). 05M的濃度補(bǔ)充抗菌NaN3防腐劑。6.如權(quán)利要求1至5的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于在制備所述具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體乳劑的過程中，將較小 體積的所述非極性有機(jī)相加入到較大體積的所述極性水(緩沖液)相中，所述較大體積為所述較小體積的5至50倍大,最優(yōu)選20倍。7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于在室溫(25°C)下將相簡(jiǎn)單搖動(dòng)到一起，所述相為在所述極性水(緩沖液)相下分層的所述非極性有機(jī)相。8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于由于攪拌元件的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)，較大體積的所述相在室溫被帶入渦旋運(yùn)動(dòng)，然后將較小體積的所述相注入、噴射或最優(yōu)選滴入所述渦旋中。9.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于通過離心旋轉(zhuǎn)所述混合容器將較大體積的所述相在室溫帶入渦旋運(yùn)動(dòng)，然后將較小體積的所述相注入、噴射或最優(yōu)選滴入所述渦旋。10.如權(quán)利要求7至9的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于通過沉降、過濾或離心去除與不與水混溶的所述制造的成品的組分。11.制備體外凝固診斷凝血酶原時(shí)間(PT)的試劑的方法，所述試劑的一種成分為用根據(jù)權(quán)利要求1至10的任一項(xiàng)所述的方法制造的脂質(zhì)體，其特征在于在制備所述PT試劑的過程中，不使用任何洗滌劑，將蛋白類型的活性組分組織因子錨定到所述具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體的所述膜表面。12.如權(quán)利要求1至11的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體組分在預(yù)備生產(chǎn)步驟中生產(chǎn)。13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于所述活性成分為從天然來源分離的組織因子。14.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于所述活性成分為通過發(fā)酵生產(chǎn)的重組組織因子。15.如權(quán)利要求13或14所述的方法，其特征在于所述天然或重組組織因子(活性成分)優(yōu)選使用O. 5至1. O μ M的濃度。CN 103003441 A按照條約第19條修改的權(quán)利要求書_2^_16.如權(quán)利要求1至15的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于包含所述具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體乳劑的所述溶液與所述天然或重組組織因子(活性成分)混合到一起，并靜置優(yōu)選10 分鐘。17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于所述脂質(zhì)體乳劑與所述組織因子以2 I 的比例混合。18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于通過用合適組成的緩沖液稀釋來調(diào)節(jié)通過混合具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體乳劑和組織因子并靜置而生產(chǎn)的產(chǎn)品的最終血液凝固特性。19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于具有合適組成的緩沖液優(yōu)選使用包含 0.025M 三(羥甲基)甲基甘氨酸、O. 25M 甘氨酸、O.1lM NaCl、0.02M CaCl2、0. 025M NaN3> 16g/lPEG4000和O. 0024M聚凝胺的溶液。20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于用5MNaOH將所述具有合適組成的緩沖液pH值調(diào)節(jié)在pH=7. O和pH=7. 8之間、優(yōu)選pH=7. 4。21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于所述通過混合具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體乳劑和組織因子并靜置而生產(chǎn)的產(chǎn)品與具有7. 4的pH值的所述合適組成的緩沖液的混合比例為3 I。22.如權(quán)利要求1至11的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于在同一生產(chǎn)步驟中，在制備所述具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體組分的同時(shí)生產(chǎn)所述PT試劑，以使所述極性水相包含優(yōu)選O. 5 至1. 0μ M濃度的所述活性組分(組織因子)。23.如權(quán)利要求1至22的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于在所述進(jìn)一步穩(wěn)定(凍干) 的步驟前，將基質(zhì)形成添加劑加 入到所述體外診斷試劑產(chǎn)品中。24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于優(yōu)選O.1mM濃度的牛血清白蛋白(BSA)用作基質(zhì)形成添加劑。25.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于將甘露醇用作基質(zhì)形成添加劑，優(yōu)選濃度為I至3%。26.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于將蔗糖用作基質(zhì)形成添加劑，優(yōu)選濃度為I至 3% ο27.如權(quán)利要求1至26的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于通過冷凍干燥(凍干)穩(wěn)定生產(chǎn)的所述診斷試劑。28.制備體外凝固診斷激活部分促凝血酶原激酶時(shí)間(APTT)的試劑的方法，其中，一種組分為優(yōu)選用根據(jù)權(quán)利要求1至10的任一項(xiàng)所述的方法制造的脂質(zhì)體，其特征在于在制備所述激活部分促凝血酶原激酶時(shí)間(APTT)的試劑的過程中，添加非蛋白類型的活性成分[例如有機(jī)酸和無機(jī)酸]到所述具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體乳劑中。29.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于所述具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體組分在預(yù)先生產(chǎn)步驟中生產(chǎn)。30.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于所述活性成分為鞣酸。31.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于鞣酸組分優(yōu)選以1.66%的濃度使用。32.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于所述具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體乳劑與所述鞣酸溶液以1:1的比例混合。33.如權(quán)利要求28或29所述的方法，其特征在于所述活性成分為鞣花酸。
34.如權(quán)利要求28或29所述的方法，其特征在于所述活性成分為蕓香苷。
35.如權(quán)利要求28或29所述的方法，其特征在于所述活性成分為槲皮苷。
36.如權(quán)利要求28或29所述的方法，其特征在于所述活性成分為Si02。
37.如權(quán)利要求28至36的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于將所述具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體乳劑的和包含所述活性組分的溶液混合到一起，并靜置優(yōu)選10分鐘。
38.如權(quán)利要求28至36的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于通過用合適組成的緩沖液稀釋來調(diào)節(jié)由混合包含所述具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體乳劑的溶液和所述活性組分并靜置而生產(chǎn)的所述產(chǎn)品的所述最終血液凝固特性。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于具有合適組成的緩沖液優(yōu)選使用包含 O. 25M甘氨酸、O. 01M4-羥乙基哌嗪乙磺酸、O. OOlM NiSO4和O. 2mM硫汞撒的溶液。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于用5MNaOH將具有合適組成的所述緩沖液pH值調(diào)節(jié)在pH=6. 8和pH=7. 8之間、優(yōu)選pH=7. O。
41.如權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于通過混合具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體乳劑和活性成分并靜置而生產(chǎn)的所述產(chǎn)品與具有7. O的pH值的合適組成的所述緩沖液的混合比例為3 I。
權(quán)利要求
1.一種脂質(zhì)體的兩相制備方法，在所述方法的過程中，混合包含天然和合成磷脂混合物的非極性有機(jī)相和與所述非極性有機(jī)相不混溶的極性水(緩沖液)相，并產(chǎn)生具有50至IOOnm粒徑的脂質(zhì)體乳劑，其特征在于用一種簡(jiǎn)單的機(jī)械方法生產(chǎn)所述脂質(zhì)體乳劑，其中，用溶于所述非極性有機(jī)相中并呈現(xiàn)正曲率或零曲率的O. 5至1. 5g/ml濃度的脂質(zhì)分子的單獨(dú)混合物產(chǎn)生完全包圍所述有機(jī)相的單層或雙層脂質(zhì)體膜的結(jié)構(gòu)，所述脂質(zhì)分子為例如卵磷脂、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酸、溶血磷脂酰膽堿和更少量的天然來源的其它磷脂，這樣，以這種方式制備的具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的所述脂質(zhì)體乳劑的所述膜表面優(yōu)選適于錨定活性成分。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于將2 I比例的氯仿-甲醇混合物用作非極性有機(jī)相。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于在所述非極性有機(jī)相中，為生產(chǎn)呈現(xiàn)正曲率或零曲率的脂質(zhì)分子的所述單獨(dú)混合物，優(yōu)選提供55°C的溫度和pH=2的環(huán)境。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于在所述極性水相中，用有機(jī)化合物，優(yōu)選0.025M三(羥甲基)甲基甘氨酸，提供所述緩沖效果。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于用5MNaOH將所述極性水(緩沖液)相的pH值調(diào)節(jié)在pH=6和pH=7之間、優(yōu)選pH=6. 6，并以O(shè). 05M的濃度補(bǔ)充抗菌NaN3防腐劑。
6.如權(quán)利要求1至5的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于在制備所述具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體乳劑的過程中，將較小體積的所述非極性有機(jī)相加入到較大體積的所述極性水(緩沖液)相中，所述較大體積為所述較小體積的5至50倍大,最優(yōu)選20倍。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于在室溫(25°C)下將相簡(jiǎn)單搖動(dòng)到一起，所述相為在所述極性水(緩沖液)相下分層的所述非極性有機(jī)相。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于由于攪拌元件的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)，較大體積的所述相在室溫被帶入渦旋運(yùn)動(dòng)，然后將較小體積的所述相注入、噴射或最優(yōu)選滴入所述渦旋中。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于通過離心旋轉(zhuǎn)所述混合容器將較大體積的所述相在室溫帶入渦旋運(yùn)動(dòng)，然后將較小體積的所述相注入、噴射或最優(yōu)選滴入所述渦旋。
10.如權(quán)利要求7至9的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于通過沉降、過濾或離心去除與不與水混溶的所述制造的成品的組分。
11.制備體外凝固診斷凝血酶原時(shí)間(PT)的試劑的方法，所述試劑的一種成分為用根據(jù)權(quán)利要求1至10的任一項(xiàng)所述的方法制造的脂質(zhì)體，其特征在于在制備所述PT試劑的過程中，不使用任何洗滌劑，將蛋白類型的活性組分組織因子錨定到所述具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體的所述膜表面。
12.如權(quán)利要求1至11的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體組分在預(yù)備生產(chǎn)步驟中生產(chǎn)。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于所述活性成分為從天然來源分離的組織因子。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于所述活性成分為通過發(fā)酵生產(chǎn)的重組組織因子。
15.如權(quán)利要求13或14所述的方法，其特征在于所述天然或重組組織因子(活性成分)優(yōu)選使用O. 5至1. O μ M的濃度。
16.如權(quán)利要求1至15的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于包含所述具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體乳劑的所述溶液與所述天然或重組組織因子(活性成分)混合到一起，并靜置優(yōu)選10分鐘。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于所述脂質(zhì)體乳劑與所述組織因子以2 I的比例混合。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于通過用合適組成的緩沖液稀釋來調(diào)節(jié)通過混合具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體乳劑和組織因子并靜置而生產(chǎn)的產(chǎn)品的最終血液凝固特性。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于具有合適組成的緩沖液優(yōu)選使用包含0.025M 三(羥甲基)甲基甘氨酸、O. 25M 甘氨酸、O.1lM NaCl、0.02M CaCl2、0. 025M NaN3>16g/lPEG 4000和O. 0024M聚凝胺的溶液。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于用5MNaOH將所述具有合適組成的緩沖液PH值調(diào)節(jié)在ρΗ=7· O和ρΗ=7· 8之間、優(yōu)選ρΗ=7· 4。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于所述通過混合具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體乳劑和組織因子并靜置而生產(chǎn)的產(chǎn)品與具有7. 4的pH值的所述合適組成的緩沖液的混合比例為3 I。
22.如權(quán)利要求1至11的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于在同一生產(chǎn)步驟中，在制備所述具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體組分的同時(shí)生產(chǎn)所述PT試劑，以使所述極性水相包含優(yōu)選O. 5至1. 0μ M濃度的所述活性組分(組織因子)。
23.如權(quán)利要求1至22的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于在所述進(jìn)一步穩(wěn)定(凍干)的步驟前，將基質(zhì)形成添加劑加入到所述體外診斷試劑產(chǎn)品中。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于優(yōu)選O.1mM濃度的牛血清白蛋白(BSA)用作基質(zhì)形成添加劑。
25.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于將甘露醇用作基質(zhì)形成添加劑，優(yōu)選濃度為I至3%。
26.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于將蔗糖用作基質(zhì)形成添加劑，優(yōu)選濃度為I 至 3% ο
27.如權(quán)利要求1至26的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于通過冷凍干燥(凍干)穩(wěn)定生產(chǎn)的所述診斷試劑。
28.制備體外凝固診斷激活部分促凝血酶原激酶時(shí)間(APTT)的試劑的方法，其中，一種組分為優(yōu)選用根據(jù)權(quán)利要求1至10的任一項(xiàng)所述的方法制造的脂質(zhì)體，其特征在于在制備所述激活部分促凝血酶原激酶時(shí)間(APTT)的試劑的過程中，添加非蛋白類型的活性成分[例如有機(jī)酸和無機(jī)酸]到所述具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體乳劑中。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于所述具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體組分在預(yù)先生產(chǎn)步驟中生產(chǎn)。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于所述活性成分為鞣酸。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于鞣酸組分優(yōu)選以1.66%的濃度使用。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于所述具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體乳劑與所述鞣酸溶液以1:1的比例混合。
33.如權(quán)利要求28或29所述的方法，其特征在于所述活性成分為鞣花酸。
34.如權(quán)利要求28或29所述的方法，其特征在于所述活性成分為蕓香苷。
35.如權(quán)利要求28或29所述的方法，其特征在于所述活性成分為槲皮苷。
36.如權(quán)利要求28或29所述的方法，其特征在于所述活性成分為Si02。
37.如權(quán)利要求28至36的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于將所述具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體乳劑的和包含所述活性組分的溶液混合到一起，并靜置優(yōu)選10分鐘。
38.如權(quán)利要求28至36的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于通過用合適組成的緩沖液稀釋來調(diào)節(jié)由混合包含所述具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體乳劑的溶液和所述活性組分并靜置而生產(chǎn)的所述產(chǎn)品的所述最終血液凝固特性。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于具有合適組成的緩沖液優(yōu)選使用包含O.25M甘氨酸、O. OlM 4-羥乙基哌嗪乙磺酸、O. OOlM NiSO4和O. 2mM硫汞撒的溶液。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于用5MNaOH將具有合適組成的所述緩沖液PH值調(diào)節(jié)在ρΗ=6· 8和ρΗ=7· 8之間、優(yōu)選ρΗ=7· O。
41.如權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于通過混合具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體乳劑和活性成分并靜置而生產(chǎn)的所述產(chǎn)品與具有7. O的pH值的合適組成的所述緩沖液的混合比例為3 I。
全文摘要
本發(fā)明涉及脂質(zhì)體的兩相制備方法，在其過程中，使用技術(shù)上簡(jiǎn)單和廉價(jià)的機(jī)械混合方法混合包含天然磷脂和合成磷脂的單獨(dú)混合物的非極性有機(jī)相和與其不混溶的極性水(緩沖液)相，合成具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體乳劑。此外，本發(fā)明包括關(guān)于當(dāng)不使用任何洗滌劑將蛋白類型活性成分錨定到脂質(zhì)體膜的表面，并且非蛋白類型活性成分與具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體乳劑簡(jiǎn)單混合時(shí)，以這種方式制備的脂質(zhì)體的體外診斷用途的方法的實(shí)施方式。在一個(gè)可能的方法的實(shí)施方式中，制備凝血酶原時(shí)間(PT)試劑。在另一個(gè)可能的方法的實(shí)施方式中，制備激活部分促凝血酶原激酶時(shí)間(APTT)試劑。
文檔編號(hào)C12Q1/56GK103003441SQ201080066965
公開日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2010年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月28日
發(fā)明者約瑟夫·安托, 佐爾坦·瓦伊達(dá), 舒茲桑納·陶卡奇, 貝亞塔·納吉 申請(qǐng)人:戴阿岡有限公司