專利名稱：用于甲硫氨酸生產(chǎn)的菌株和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用具有蘇氨酸的減弱轉(zhuǎn)化的修飾菌株用于甲硫氨酸生產(chǎn)的方法。這可以通過減少蘇氨酸降解成甘氨酸，和/或通過減少其轉(zhuǎn)化成a-酮丁酸來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明還涉及具有蘇氨酸的減弱轉(zhuǎn)化的修飾菌株。
背景技術(shù)：
含硫化合物例如半胱氨酸、高半胱氨酸、甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸對(duì)于細(xì)胞代謝是關(guān)鍵的，并且工業(yè)生產(chǎn)以用作食物或飼料添加劑和藥劑。特別地，不能由動(dòng)物合成的必需氨基酸甲硫氨酸在許多機(jī)體功能中起重要作用。除其在蛋白質(zhì)生物合成中的作用外，甲硫氨酸涉及轉(zhuǎn)甲基作用以及硒和鋅的生物利用度。甲硫氨酸還直接用作治療用于病癥如變態(tài)反應(yīng)和風(fēng)濕熱。然而，生產(chǎn)的大多數(shù)甲硫氨酸加入動(dòng)物飼料中。由于BSE和雞流感，動(dòng)物衍生的蛋白質(zhì)的使用減少，隨之而來的是對(duì)于純甲硫氨 酸的需求增加。在化學(xué)上，D，L-甲硫氨酸通常由丙烯醛、甲硫醇和氰化氫產(chǎn)生。然而，夕卜消旋混合物不如純L-甲硫氨酸一樣表現(xiàn)良好,如例如在雞飼料添加劑中(Saunderson,C. L. , (1985)British Journal of Nutrition 54,621-633)。純 L-甲硫氨酸可以例如通過N-乙酰-D，L-甲硫氨酸的酰基酶處理自外消旋甲硫氨酸產(chǎn)生，這急劇增加生產(chǎn)成本。對(duì)于與環(huán)境問題相關(guān)的純L-甲硫氨酸的漸增需求使甲硫氨酸的微生物生產(chǎn)變得有吸引力。甲硫氨酸生物合成依賴于高絲氨酸、半胱氨酸和Cl單位生產(chǎn)。高絲氨酸是天冬氨酸的衍生物并且提供用于甲硫氨酸的碳骨架。高絲氨酸還可以轉(zhuǎn)化成蘇氨酸，這繼而又是(i)異亮氨酸的前體且還可以轉(zhuǎn)化成甘氨酸(ii)。這兩個(gè)反應(yīng)消耗蘇氨酸且將更多高絲氨酸拉進(jìn)蘇氨酸途徑，從而減少進(jìn)入甲硫氨酸途徑的流量。(i)對(duì)于異亮氨酸的生產(chǎn)，蘇氨酸脫氨為a-酮丁酸，通過分別由基因ilvA(EC4. 3. I. 19, Ramakrishnan 等人，1965, J Bacteriol, 89:661)和 tdcB (EC 4. 3. I. 19, Goss 等人，1988，J Bacteriol，170:5352)編碼的蘇氨酸脫氨酶或蘇氨酸脫水酶催化的反應(yīng)。由sdaA (EC 4. 3. I. 17 ；Su 等人 1989，J Bacteriol, 171:5095)和 sdaB (EC 4. 3. I. 17，Su 和Newman, 1991，173:2473)編碼的絲氨酸脫氨酶也已知編碼某些蘇氨酸脫氨酶活性。(ii)兩種用于蘇氨酸甘氨酸轉(zhuǎn)化的途徑存在于大腸桿菌(E. coli.)中(A)蘇氨酸可以通過由蘇氨酸脫氫酶(Tdh ;E. C. I. I. I. 103)和2_氨基3_酮丁酸-coA-裂解酶(Kbl ;E. C. 2. 3. I. 29) (Boylan S. A.等人，1981，Journal of BiologicalChemistry, 256, 4,第 1809-1815 頁；Mukher jee J. J.等人，1987, Journal of BiologicalChemistry, 262, 30,第14441-14447頁)催化的兩個(gè)連續(xù)反應(yīng)轉(zhuǎn)化成甘氨酸。這些反應(yīng)各生成一分子的乙酸-coA和NADH。(Komatsubara S.等人，1978, Journal ofBacteriology, 1981，135，第 318-323 頁)。(B)蘇氨酸還可以經(jīng)由通過蘇氨酸醛縮酶催化的反醛醇(retooaldol)機(jī)制直接轉(zhuǎn)化成甘氨酸。這種反應(yīng)生成一個(gè)乙醒和一個(gè)甘氨酸(Plamann M. D.等人，1983, Gene, 22,1,第9_18頁)。在大腸桿菌中的蘇氨酸醛縮酶活性攜帶酶由下述基因編碼ltaE(Liu JL等人，1998，European Journal of Biochemistry, 255，1，第220-226頁)、kbl (Markus J. P.等人，1993，Biochemica et Biophysica Acta, 1164,第 299-304 頁)和gkyA (Schirch V.等人，1968，Journal of Biological Chemistry, 243,第 5561 頁；SchirchV.等人，1985, Journal of Bacteriology, 163, I,第 1-7 頁)。LtaE是低特異性蘇氨酸醛縮酶，其被認(rèn)為涉及蘇氨酸的降解，以形成乙醛和甘氨酸(Liu JL 等人，1998, European Journal of Biochemistry, 255, I,第 220_226 頁)。Kbl的主要活性是2-氨基-3-酮丁酸CoA連接酶(E. C 2. 3. I. 29)，其由2-氨基-3-酮丁酸的脫乙酰組成，以形成甘氨酸和乙酰-輔酶A(Mukherjee J.J.等人，1987, Journal of Biological Chemistry, 262, 30,第 14441-14447 頁)。它已顯不具有TAL活性,這使得其成為用于蘇氨酸降解的通用酶(Markus J. P.等人，1993，Biochemica etBiophysica Acta, 1164,第 299-304 頁)。GlyA的基本活性是絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(SHMT) (E. C. 2. I. 2. I)。它催化氨基酸絲氨酸和四氫葉酸(THF)轉(zhuǎn)化成甘氨酸和5，10亞甲基-THF(關(guān)于綜述Schirch V.等人，2005，Current opinion in Chemical biology, 9,第 482-487 頁)。在由 GlyA 催化的 其他次級(jí)活性中(關(guān)于綜述Schirch L. , 2006, Advances in enzymology and relatedareas of molecular biology, 53，第83-112頁)，僅蘇氨酸醒縮酶(TAL)看起來是生理學(xué)相關(guān)的。GlyA 是結(jié)晶的(Scarsdale 等人，2000，Journal of Molecular Biology, 296,第155-168頁)，并且已進(jìn)行了研究以闡明底物特異性的起源(Angelaccio S.等人，1992, Biochemistry, 31,第155-162頁)。Angelaccio等人將活性部位附近的所有蘇氨酸突變?yōu)楸彼?，并且注意到突變T226A使蘇氨酸的Km增加I. 8倍，并且使TAL活性減少至次于其定量限的水平，同時(shí)不修飾THF的Km也不修飾絲氨酸的Km。然而，該突變對(duì)SHMT活性具有強(qiáng)烈影響，因?yàn)镾HMT活性的kMt減少了 32倍。經(jīng)修飾用于改善得率的用于生產(chǎn)甲硫氨酸的菌株目前在本領(lǐng)域中廣泛公開。目前理解甲硫氨酸生物合成途徑特別地與涉及許多其他途徑的基因復(fù)合。因此，增強(qiáng)或減弱乍一看對(duì)促進(jìn)甲硫氨酸合成可能有利的基因可能以相反結(jié)果結(jié)束。已知涉及蘇氨酸消耗的基因也已知涉及Cl生產(chǎn)。涉及蘇氨酸降解的蛋白質(zhì)的活性抑制或表達(dá)減弱已在幾項(xiàng)工作中公開。Simic等人(Simic 等人，2002，Applied and Environmental microbiology, 68 (7),第 3321-3327頁)公開GlyA蛋白的蘇氨酸活性的醛醇(aldole)切割的減弱，以增強(qiáng)在谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)中的蘇氨酸生產(chǎn)。Martinez-Force 等人(Martinez-Force等人，1994，Biotechnology Progress, 10(4)，第 372-376 頁)公開了在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中缺失ilvl基因以增強(qiáng)蘇氨酸生產(chǎn)。此外,在這個(gè)研究中，作者顯示在蘇氨酸和甲硫氨酸累積與蘇氨酸脫氨酶活性的減少之間不存在關(guān)聯(lián)。Liu等人(Liu 等人，1998，European Journal of Biochemistry, 255 (I),第 220-226 頁)詳述了對(duì)來自大腸桿菌(Escherichia coli)的LtaE酶的表征及其在細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用。最后,Lee等人(Lee 等人,2007，Molecular Systems Biology, 3 (149),第 1-8 頁)公開了 tdh 的缺失和iIvA基因的突變，以增強(qiáng)蘇氨酸生產(chǎn)。所有這些研究專一地定向朝向蘇氨酸生產(chǎn)。在現(xiàn)有技術(shù)中從未考慮阻止蘇氨酸消耗作為改善甲硫氨酸生物合成的解決方案。盡管甲硫氨酸代謝途徑的復(fù)雜性，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)通過作用于蘇氨酸轉(zhuǎn)化增加甲硫氨酸生產(chǎn)的方法。發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于在發(fā)酵工藝中生產(chǎn)甲硫氨酸、其前體或衍生物的方法，其包括如下步驟-在包含碳源、硫源和氮源的合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)修飾的微生物，和-從所述培養(yǎng)基中回收甲硫氨酸和/或其衍生物，其中所述微生物是以減少在除甲硫氨酸外的其他化合物中的蘇氨酸轉(zhuǎn)化的方式修飾的。

特別地，蘇氨酸成為甘氨酸或異亮氨酸的轉(zhuǎn)化是減少的。本發(fā)明還涉及經(jīng)修飾用于改善的甲硫氨酸生產(chǎn)的微生物，其中在除甲硫氨酸外的其他化合物中的蘇氨酸轉(zhuǎn)化是減少的，與用于改善甲硫氨酸生產(chǎn)的其他遺傳修飾組合。自蘇氨酸的甘氨酸產(chǎn)生是特別通過減少將蘇氨酸轉(zhuǎn)化為甘氨酸的酶的活性減少的。在特定實(shí)施方案中，表達(dá)突變型GlyA酶，其具有減弱的蘇氨酸醛縮酶活性，同時(shí)維持所述酶GlyA的絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶活性。自蘇氨酸的異亮氨酸產(chǎn)生是特別通過減少蘇氨酸至a-酮丁酸的脫氨基和/或脫水減少的。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于在發(fā)酵工藝中生產(chǎn)甲硫氨酸、其前體或衍生物的方法，其包括如下步驟-在包含碳源、硫源和氮源的合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)修飾的微生物，和-從所述培養(yǎng)基中回收甲硫氨酸和/或其衍生物，其中所述微生物是以減少蘇氨酸轉(zhuǎn)化為除甲硫氨酸外的其他化合物的方式修飾的。根據(jù)本發(fā)明，甲硫氨酸的前體定義為其為甲硫氨酸特異性代謝途徑的部分的代謝產(chǎn)物或可以是這些代謝產(chǎn)物衍生的代謝產(chǎn)物。甲硫氨酸的衍生物源于甲硫氨酸轉(zhuǎn)化和/或降解途徑，例如S-酰基甲硫氨酸和N-酰基甲硫氨酸。特別地，這些產(chǎn)物是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和N-乙酰甲硫氨酸(NAM)。尤其地，NAM是可容易回收的甲硫氨酸衍生物，其可以進(jìn)行分離且通過脫?；D(zhuǎn)化成甲硫氨酸。短語“從培養(yǎng)基中回收甲硫氨酸”指回收甲硫氨酸和可能的SAM和NAM以及可能有用的所有其他衍生物的動(dòng)作。術(shù)語“發(fā)酵過程/工藝”、‘培養(yǎng)’、或‘發(fā)酵’可互換使用，以指在含有簡(jiǎn)單碳源、硫源和氮源的合適生長(zhǎng)培養(yǎng)基上的細(xì)菌生長(zhǎng)?！昂线m的培養(yǎng)基”是適合于微生物的培養(yǎng)和生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。此類培養(yǎng)基是微生物發(fā)酵領(lǐng)域中眾所周知的，取決于待培養(yǎng)的微生物。術(shù)語“微生物”指細(xì)菌、酵母或真菌。優(yōu)選地，微生物選自腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、芽抱桿菌科(Bacillaceae)、鏈霉菌科(Streptomycetaceae)和棒狀桿菌科(Corynebacteriaceae)。更優(yōu)選地,微生物是埃希氏菌屬(Escherichia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、泛菌屬(Pantoea)、沙門氏菌屬(Salmonella)或棒狀桿菌屬(Corynebacterium)的菌種。甚至更優(yōu)選地，微生物是菌種大腸桿菌或谷氨酸棒狀桿菌。
術(shù)語“經(jīng)修飾的微生物”是經(jīng)修飾用于改善的甲硫氨酸生產(chǎn)的微生物，并且指已經(jīng)遺傳修飾的微生物，目的是改善甲硫氨酸的生產(chǎn)得率。根據(jù)本發(fā)明，“改善的”或“改善”意指與相應(yīng)未經(jīng)修飾的微生物相比較，通過微生物生產(chǎn)的甲硫氨酸量，且特別是甲硫氨酸得率(每克/摩爾碳源生產(chǎn)的克/摩爾甲硫氨酸的比)在經(jīng)修飾的微生物中更高。通常的修飾包括通過轉(zhuǎn)化和重組將基因的缺失引入微生物內(nèi)、和用于表達(dá)異源基因的載體的引入。根據(jù)本發(fā)明，在這種方法中使用的經(jīng)修飾的微生物一方面包含用于改善的甲硫氨酸生產(chǎn)的修飾，并且另一方面包含與未經(jīng)修飾的微生物相比較，用于減少自蘇氨酸的除甲硫氨酸外的其他化合物生產(chǎn)的修飾。短語“除甲硫氨酸外的其他化合物”特別指甘氨酸和異亮氨酸。涉及微生物中的甲硫氨酸生產(chǎn)的基因是本領(lǐng)域已知的，并且包含涉及甲硫氨酸特異性生物合成途徑的基因以及涉及前體提供途徑的基因和涉及甲硫氨酸消耗途徑的基因。甲硫氨酸的有效生產(chǎn)要求甲硫氨酸特異性途徑和幾個(gè)前體提供途徑的最佳化。甲硫氨酸生產(chǎn)菌株已在專利申請(qǐng)WO 2005/111202.W02007/077041和W02009/043803中描述， 并且作為參考文獻(xiàn)引入本申請(qǐng)內(nèi)。過表達(dá)對(duì)于其抑制劑SAM和甲硫氨酸具有減少的反饋敏感性的高絲氨酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶等位基因的甲硫氨酸生產(chǎn)菌株在專利申請(qǐng)WO 2005/111202中描述。這個(gè)申請(qǐng)還描述了這些等位基因與甲硫氨酸阻遏物MetJ(GenBank 1790373)的缺失的組合,如專利申請(qǐng)JP 2000/157267中提出的，所述甲硫氨酸阻遏物MetJ負(fù)責(zé)甲硫氨酸調(diào)節(jié)子的下調(diào)。此外，兩種修飾與天冬氨酸激酶/高絲氨酸脫氫酶的過表達(dá)的組合在專利申請(qǐng)WO 2005/111202中描述。基因cysE、metH和metF的過表達(dá)已在WO 2007/077041中提出。為了改善甲硫氨酸的生產(chǎn)，微生物可以顯示出-選自下組的至少一種基因的表達(dá)增加 cysP，其編碼周質(zhì)硫酸鹽結(jié)合蛋白，如W02007/077041和W02009/043803中描述的， cysU，其編碼硫酸鹽ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的組分，如W02007/077041和W02009/043803中描述的， cysff,其編碼膜結(jié)合的硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如W02007/077041和W02009/043803中描述的， cysA，其編碼硫酸通透酶，如W02007/077041和W02009/043803中描述的，*cysM,其編碼 0-乙酰絲氨酸硫化氫解酶(0-acetyl serine sulfhydralase),如W02007/077041 和 W02009/043803 中描述的， cysl和cysj，分別編碼亞硫酸還原酶的a和P亞基，如W02007/077041和W02009/043803中描述的。優(yōu)選地，cysl和cysj是一起過表達(dá)的，.cysH，其編碼腺苷酰硫酸還原酶，如W02007/077041和W02009/043803中描述的， cysE，其編碼絲氨酸?；D(zhuǎn)移酶，如W02007/077041中描述的， gcvT,其編碼四氫葉酸依賴性氨甲基轉(zhuǎn)移酶，如W02007/077041和W02009/043803 中描述的， gcvH,其通過編碼氨乙基的載體涉及甘氨酸切害I]，如W02007/077041和W02009/043803 中描述的， gcvP，其編碼甘氨酸脫氫酶，如W02007/077041和W02009/043803中描述的， lpd，其編碼硫辛酰胺脫氫酶，如W02007/077041和W02009/043803中描述的，*serA，其編碼磷酸甘油酸脫氫酶，如W02007/077041和W02009/043803中描述的， serB,其編碼磷酸絲氨酸磷酸化酶，如W02007/077041和W02009/043803中描述的， serC,其編碼磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，如W02007/077041和W02009/043803中描述的， glyA,其編碼絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶，如W02007/077041和W02009/043803中描述的， .metF，其編碼5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶，如W02007/077041中描述的， metA等位基因，其編碼高絲氨酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶，對(duì)于S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸具有減少的反饋敏感性，如W02005/111202中描述的， thrA或thrA等位基因，其編碼天冬氨酸激酶/高絲氨酸脫氫酶，對(duì)于蘇氨酸具有減少的反饋抑制，如W02009/043803和W02005/111202中描述的， metH,其編碼B12依賴性高半胱氨酸_N5_甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)甲基酶，如W02007/077041 中描述的。-和/或下述基因中的至少一種的表達(dá)的抑制 pykA，其編碼丙酮酸激酶，如W02007/077041和W02009/043803中描述的， pykF，其編碼丙酮酸激酶，如W02007/077041和W02009/043803中描述的， purU，其編碼甲酰四氫葉酸脫甲酰酶，如TO2007/077041和TO2009/043803中描述的。根據(jù)本發(fā)明，微生物可以通過使用改變的metB等位基因進(jìn)一步修飾用于增加甲硫氨酸生產(chǎn)，所述metB等位基因優(yōu)選或?qū)Ｒ坏厥褂肏2S用于自0-琥拍酰高絲氨酸生產(chǎn)高半胱氨酸，如引入本文作為參考的專利申請(qǐng)W02004/076659中描述的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解其他基因可能需要修飾以最佳化甲硫氨酸生產(chǎn)。這些基因已在 W02007/077041 和 W02007/020295 中鑒定。上文引用的與甲硫氨酸生產(chǎn)有關(guān)的專利和專利申請(qǐng)的所有參考文獻(xiàn)引入本文作為參考。在本發(fā)明的第一個(gè)方面，自蘇氨酸的甘氨酸產(chǎn)生是通過減弱將蘇氨酸轉(zhuǎn)化為甘氨酸的酶的活性減少的。術(shù)語“減少的”、‘減弱的’在正文中可互換使用，并且具有相似含義。在這個(gè)正文中，該術(shù)語指酶活性或基因表達(dá)的部分或完全抑制，則稱其隨后說成是“減少的”或‘減弱的，。通過使酶在其氨基酸序列中突變、通過減少酶自相應(yīng)RNA的翻譯或通過減少相應(yīng)基因的表達(dá)，可以減少酶活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解用于減少翻譯的許多方法。酶表達(dá)可以是通過穩(wěn)定或去穩(wěn)定相應(yīng)信使RNA(Carrier和Keasling(1998)Biotechnol.Prog. 15, 58-64)或蛋白質(zhì)(例如GST標(biāo)簽,Amersham Biosciences)的元件減少的?；虮磉_(dá)可以是部分或完全減少的?；虮磉_(dá)的這種減少可以是基因表達(dá)的抑制、基因表達(dá)所需的啟動(dòng)子區(qū)全部或部分的缺失、基因編碼區(qū)中的缺失、或野生型啟動(dòng)子由更弱的天然或合成啟動(dòng)子的交換。優(yōu)選地，基因的減弱基本上是那種基因的完全缺失，其可以由選擇標(biāo)記基因替換，所述選擇標(biāo)記基因促進(jìn)菌株的鑒定、分離和純化。在本發(fā)明的第一個(gè)方面，自蘇氨酸的甘氨酸產(chǎn)生在經(jīng)修飾的微生物中是減少的。在一個(gè)具體方面，將蘇氨酸轉(zhuǎn)化成甘氨酸的酶的活性是減少的。在本發(fā)明的更具體的實(shí)施方案中，至少一種下述基因的表達(dá)在經(jīng)修飾的微生物中是減弱的ltaE、kbl、glyA、tdh。在本發(fā)明的另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，經(jīng)修飾的微生物表達(dá)突變型GlyA酶，其具有減弱的蘇氨酸醛縮酶(TAL)活性，同時(shí)維持所述酶GlyA的絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶活性。更確切地說，根據(jù)本發(fā)明，GlyA酶可以具有在其多肽序列中的至少一種下述氨基酸變化T128S、T224S、T225S、T226S、T227S、T230S、R235K。最優(yōu)選的氨基酸變化是 R235K。
在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，內(nèi)源基因glyA已從該微生物中缺失。在本發(fā)明的第二個(gè)方面，該微生物是以減少自蘇氨酸的異亮氨酸產(chǎn)生的方式修飾的。特別地，自蘇氨酸的異亮氨酸產(chǎn)生是通過減少蘇氨酸至a -酮丁酸的脫氨基和/或脫水減少的。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，至少一種下述酶活性是減弱的蘇氨酸脫氨酶、蘇氨酸脫水酶。在本發(fā)明的更特定的實(shí)施方案中，至少一種下述基因在經(jīng)修飾的微生物中是減弱白勺ilvA> tdcB、sdaA、sdaB、tdcG。根據(jù)本發(fā)明，除了自蘇氨酸的甘氨酸和/或異亮氨酸產(chǎn)生減少，在經(jīng)修飾的微生物中的絲氨酸可用度可以是增加的。短語‘絲氨酸可用度是增加的’指對(duì)于代謝途徑可用的絲氨酸的內(nèi)部庫(kù)與未經(jīng)修飾的微生物相比較是增加的事實(shí)。所述增加通過下述各種手段獲得內(nèi)部生產(chǎn)的增加、降解的減少、朝向外部的轉(zhuǎn)運(yùn)的減少、和由本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的所有其他方式。特別地,絲氨酸生產(chǎn)可以是通過增加serA、serB、serC中的至少一種基因的表達(dá)在微生物中增加的。此外，絲氨酸降解可以是通過減弱基因sdaA或sdaB中的至少一種的活性減少的，所述基因編碼具有絲氨酸脫氨酶活性的酶。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，sdaA基因具有代替鳥嘌呤在位置158上的胸苷核苷酸。在本發(fā)明的更特定的實(shí)施方案中，如上所述，具有減少的蘇氨酸醛縮酶活性的glyA等位基因的表達(dá)可以是增加的。在本發(fā)明的描述中，基因和蛋白質(zhì)使用相應(yīng)基因在大腸桿菌中的命名進(jìn)行鑒定。然而，且除非另有說明，這些命名的使用根據(jù)本發(fā)明具有更一般的含義，且覆蓋在其他生物更具體而言微生物中的所有相應(yīng)基因和蛋白質(zhì)。使用在GenBank中對(duì)于已知基因給出的參考,本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠測(cè)定在其他生物、細(xì)菌菌株、酵母、真菌、哺乳動(dòng)物、植物等中的等價(jià)基因。這個(gè)常規(guī)工作使用共有序列有利地完成，所述共有序列可以通過下述進(jìn)行測(cè)定進(jìn)行與衍生自其他微生物的基因的序列比對(duì)，并且指定簡(jiǎn)并探針以克隆另一種生物中的相應(yīng)基因。分子生物學(xué)的這些常規(guī)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，并且例如在Sambrook等人(1989 Molecular Cloning aLaboratory Manual.第 2 版 Cold Spring Harbor Lab. , Cold Spring Harbor,New York.)中請(qǐng)求保護(hù)。PFAM(比對(duì)和隱馬爾可夫模型(hidden Markov models)的蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫(kù)；http: //www. sanger. ac. uk/Software/Pfam/)呈現(xiàn)了蛋白質(zhì)序列 I匕對(duì)的大集合。每個(gè) PFAM使得能夠顯現(xiàn)多重比對(duì)，看見蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，評(píng)價(jià)在多種生物中的分布，獲得對(duì)于其他數(shù)據(jù)庫(kù)的訪問，且顯現(xiàn)已知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。COGs (蛋白質(zhì)的直向同源物組的簾http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/COG/)通過比較來自代表主要種系發(fā)生系的完全測(cè)序基因組的蛋白質(zhì)序列獲得。每個(gè)COG由至少3個(gè)系進(jìn)行定義，其允許鑒定以前保守的結(jié)構(gòu)域。鑒定同源序列及其同源性百分比的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，并且特別包括BLAST程序，其可以由網(wǎng)站http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/使用，使用在那個(gè)網(wǎng)站上指示的缺省參數(shù)。獲得的序列隨后可以使用例如程序CLUSTALff (http://www.ebi. ac. uk/clustalw/)或 MULTALIN(http://bioinfo, genotoul. fr/multalin/multalin.html)加以利用(例如比對(duì))，使用在那個(gè)網(wǎng)站上指示的缺省參數(shù)。 用于在發(fā)酵工藝中生產(chǎn)甲硫氨酸、其前體或衍生物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的?？梢哉{(diào)整發(fā)酵工藝的不同因素用于工藝的最佳化，例如硫源、碳源和氮源的選擇。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，加入培養(yǎng)基中的用于L-甲硫氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)的硫源是硫酸鹽、硫代硫酸鹽、硫化氫、連二硫酸鹽、連二亞硫酸鹽、亞硫酸鹽、甲硫醇、二甲基二硫化物及其他甲基封端硫化物或不同來源的組合。更優(yōu)選地，在培養(yǎng)基中的硫源是硫酸鹽或硫代硫酸鹽或其混合物。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語‘碳源’指可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用以支持微生物的正常生長(zhǎng)的任何碳的來源，其可以是己糖(例如葡萄糖、半乳糖或乳糖)、戊糖、單糖、二糖(例如蔗糖、纖維二糖或麥芽糖)、寡糖、糖蜜、淀粉或其衍生物、半纖維素、甘油及其組合。特別優(yōu)選的碳源是葡萄糖。另一種優(yōu)選的碳源是蔗糖。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，碳源衍生自可再生原料?？稍偕隙x為特定工業(yè)工藝所需的原始材料，其可以在短暫延遲內(nèi)和以足夠量再生，以允許其轉(zhuǎn)化成所需產(chǎn)物。術(shù)語氮源對(duì)應(yīng)于銨鹽或氨氣。氮源以銨或氨的形式供應(yīng)。發(fā)酵一般在具有適合于待使用的微生物的合適培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行，所述合適培養(yǎng)基含有至少一種簡(jiǎn)單碳源和需要時(shí)用于生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的協(xié)同底物。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠限定用于根據(jù)本發(fā)明的微生物的培養(yǎng)條件。特別地，細(xì)菌在200C _55°C之間的溫度發(fā)酵，優(yōu)選在25°C _40°C之間，并且更具體而言對(duì)于谷氨酸棒狀桿菌約30°C和對(duì)于大腸桿菌約37°C。作為用于大腸桿菌的已知培養(yǎng)基的例子，培養(yǎng)基可以具有與M9培養(yǎng)基(Anderson, 1946，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128)、M63 培養(yǎng)基(Miller, 1992 ；A Short Course in Bacterial Genetics:A Laboratory Manual and Handbook forEscherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, New York)或例如由 Schaefer 等人(1999，Anal. Biochem. 270:88-96)定義的培養(yǎng)基相同或相似的組成。作為用于谷氨酸棒狀桿菌的已知培養(yǎng)基的例子，培養(yǎng)基可以具有與BMCG培養(yǎng)基(Liebl 等人，1989, Appl. Microbiol. Biotechnol. 32:205-210)或例如由 Riedel 等人(2001, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3:573-583)描述的培養(yǎng)基相同或相似的組成。在本發(fā)明的具體方面，培養(yǎng)在此類條件下執(zhí)行，從而使得微生物對(duì)于無機(jī)底物特別是磷酸鹽和/或鉀是有限的或饑餓的。對(duì)生物實(shí)施無機(jī)底物的限制限定這樣的條件，在該條件下微生物的生長(zhǎng)由供應(yīng)的、仍允許弱生長(zhǎng)的無機(jī)化學(xué)制品的量控制。使微生物對(duì)于無機(jī)底物饑餓限定這樣的條件，在該條件下由于不存在無機(jī)底物， 微生物的生長(zhǎng)完全停止。本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)甲硫氨酸的方法，其包括分離發(fā)酵肉湯和/或生物質(zhì)的甲硫氨酸、其前體或衍生物的步驟，其任選地剩余在最終產(chǎn)物的部分或總量(0-100%)中。在發(fā)酵后，如果需要的話，回收且純化L-甲硫氨酸、其前體或其衍生的化合物。用于回收和純化在培養(yǎng)基中所生產(chǎn)的化合物例如甲硫氨酸和N-乙酰甲硫氨酸的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。任選地，0-100%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選95%、甚至更優(yōu)選至少99%的生物質(zhì)可以在
發(fā)酵產(chǎn)物的純化過程中得到保留。任選地，在回收甲硫氨酸前，通過脫酰基將甲硫氨酸衍生物N-乙酰甲硫氨酸轉(zhuǎn)化成甲硫氨酸。本發(fā)明還涉及經(jīng)修飾的微生物，其包含-MetJ基因的缺失，-對(duì)于甲硫氨酸具有減少的反饋敏感性的等位基因MetA的表達(dá)，和-例如如上所述的至少一種修飾。本發(fā)明還涉及例如在下文實(shí)施例中描述的經(jīng)修飾的微生物。附I顯示了涉及丙酮酸鹽、蘇氨酸、異亮氨酸和甲硫氨酸的代謝途徑。
實(shí)施例實(shí)施例I:菌株 MG1655 metA * 11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF A metJ ApykF A pykA (pME101-thrA *1-cysE-PgapA-metA * 11)的構(gòu)建甲硫氨酸生產(chǎn)菌株已在引入本申請(qǐng)作為參考的專利申請(qǐng)W02007/077041和W02009/043372 中描述。I 菌株 MG1655 metA*ll Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHPtc09-gcvTHP Ptc36_ARNmst17-metF A meJ ApykF ApykA(pME101-thrA*l-cysE_PgapA-metA*ll)的構(gòu)建通過電穿孔將在申請(qǐng)W02007/077041和PCT/FR2009/052520中描述的質(zhì)粒 pME101-thrA*l-cysE-PgapA_metA*ll 引入重組菌株 MG1655 metA*llPtrc-metHPtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09_gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metFA met J ApykF A pykA,得到菌株 MG1655 metA*ll Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF A metJ ApykF A pykA(pME101-thrA*I-cy sE-PgapA-me tA*11)。實(shí)施例II:菌株 MG1655 metA * 11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF A metJ ApykF A pykA A ItaEA tdh (pME101-thrA * l-cysE-PgapA-metA * 11)的構(gòu)建甲硫氨酸生產(chǎn)菌株已在引入本申請(qǐng)作為參考的專利申請(qǐng)W02007/077041和W02009/043372 中描述。I 菌株 MG1655 metA*ll Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst 17-metF A met J ApykF A pykA AltaE::Km 的構(gòu)建為了滅活I(lǐng)taE基因，使用由Datsenko & Wanner (2000)描述的同源重組策略。這個(gè)策略允許卡那霉素抗性盒的插入，同時(shí)缺失所涉及的大部分基因。為了這個(gè)目的，使用2種寡核苷酸，DltaEF和DltaER (在網(wǎng)站http: //ecogen. org/上的參考序列)。 DltaEF (SEQ ID NO I)ggacatgccatgattgatttacgcagtgataccgttacccgaccaagccgcgccatgctcgaagcgatgatggccgccccgTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG具有-與ItaE區(qū)域從908446到908526的序列同源的區(qū)域(小寫情況)，-用于擴(kuò)增卡那霉素抗性盒(在Datsenko,K. A. & Wanner,B. L.，2000，PNAS, 97:6640-6645中的參考序列)的區(qū)域(大寫情況)，DltaER (SEQ ID NO 2) gcgcaccagatgctgaccaatgtagccactggcaccgagaactaaaatgcgttgcggcacgtctctctccttaacgcgccCATATGAATATCCTCCTTAG具有-與ItaE區(qū)域從907446到907525的序列同源的區(qū)域(小寫情況)，-用于擴(kuò)增卡那霉素抗性盒的區(qū)域(大寫情況)。寡核苷酸DltaEF和DltaER用于PCR擴(kuò)增來自質(zhì)粒pKD4的卡那霉素抗性盒。隨后通過電穿孔將所得到的PCR產(chǎn)物引入菌株MG1655 metA*llPtrc-metH PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF A metJ ApykF A pykA (pKD46)內(nèi)，其中所表達(dá)的Red重組酶允許同源重組。隨后選擇卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化體，并且通過PCR分析用下文定義的寡核苷酸ItaEF和ItaER驗(yàn)證抗性盒的插入。將保留的菌株指定為 MG1655 metA*II Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst 17-metF A met J ApykF A pykA AltaE::Km。ItaEF (SEQ ID NO 3)GCCACCTGGCGCTCCTGAGCG (與 ItaE 區(qū)域從 907234 到 907254 的序列同源)。ItaER (SEQ ID NO 4)GCTGCGCGCAATCATCAGCGG (與 ItaE 區(qū)域從 9O86O3 到 9O8623 的序列同源)。2 菌株 MG1655 metA*ll Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF A metJ ApykF A pykA A ItaE::KmAtdh::Cm的
構(gòu)建為了滅活tdh基因，使用由Datsenko & Wanner (2000)描述的同源重組策略。這個(gè)策略允許氯霉素抗性盒的插入，同時(shí)缺失所涉及的大部分基因。為了這個(gè)目的，使用2種寡核苷酸，DtdhF和DtdhR (在網(wǎng)站http://ecogen. org/上的參考序列)。DtdhF (SEQ ID NO 5)gaaagcgttatccaaactgaaagcggaagagggcatctggatgaccgacgttcctgtaccggaactcgggcataacgatcCATATGAATATCCTCCTTAG具有-與tdh區(qū)域從3789287到3789366的序列同源的區(qū)域(小寫情況)，-用于擴(kuò)增氯霉素抗性盒(在Datsenko,K. A. & Wanner, B.L.，2000，PNAS, 97:6640-6645中的參考序列)的區(qū)域(大寫情況)， DtdhR (SEQ ID NO 6)cccagctcagaataactttcccggactggcccgaacgcatagcgtcaaagcccttctggaaatcatcgatagagaaacgatgggTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG具有-與tdh區(qū)域從3788348到3788431的序列同源的區(qū)域(小寫情況)，-用于擴(kuò)增氯霉素抗性盒的區(qū)域(大寫情況)。寡核苷酸DtdhF和DtdhR用于PCR擴(kuò)增來自質(zhì)粒pKD3的氯霉素抗性盒。隨后通過電穿孔將所得到的PCR產(chǎn)物引入菌株MG1655 metA*llPtrc-metH PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36_ARNmst17-metF A metJ ApykF A pykAA ItaE: :Km(pKD46)內(nèi)，其中所表達(dá)的Red重組酶允許同源重組。隨后選擇氯霉素抗性轉(zhuǎn)化體，并且通過PCR分析用下文定義的寡核苷酸t(yī)dhF和tdhR驗(yàn)證抗性盒的插入。將保留的菌株指定為 MG1655 metA*l lPtrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metF A metJ ApykF A pykA A ItaE::KmAtdh::Cm。tdhF (SEQ ID NO 7)GGGTAGAGAGATAATGAGAGCAGC (與 tdh 區(qū)域從 3788210 到 3788233 的序列同源)。tdhR (SEQ ID NO 8)GCCCAGCCAAAACTGTACAG (與 tdh 區(qū)域從 3790719 到 3790738 的序列同源)。3 .菌株 M G I 6 5 5 m e t A * I I Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF A metJ ApykF A pykA AltaEA tdh的構(gòu)建隨后將卡那霉素和氯霉素抗性盒消除。通過電穿孔將攜帶作用于卡那霉素或氯霉素抗性盒的FRT位點(diǎn)的重組酶FLP的pCP20質(zhì)粒引入重組菌株MG1655 metA*11 Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metF A metJ ApykFApykA A ItaE::Km A tdh: :Cm。在42°C的一系列培養(yǎng)后，通過PCR分析用與先前使用那些相同的寡核苷酸ItaEF/ltaER和tdhF/tdhR,驗(yàn)證卡那霉素和氯霉素抗性盒的喪失。將保留的菌株指定為 MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst 17-metF A met J ApykF A pykA AltaE A tdh。4 .菌株 M G I 6 5 5 m e t A * I I Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst 17-metF AmetJ ApykF A pykA AltaE Atdh (pME 101 - thrA* I -cy sE-PgapA-me t A* 11)的構(gòu)建
通過電穿孔將申請(qǐng)W02007/077041和PCT/FR2009/052520中描述的質(zhì)粒 pME101-thrA*l-cysE-PgapA_metA*ll 引入重組菌株 MG1655 metA*llPtrc_metHPtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metF A metJApykF A pykA A ItaE A tdh，得到菌株 MG1655metA*ll Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst 17-metF AmetJ ApykF A pykA A ItaE Atdh(pME101-thrA*l-cysE-PgapA_metA*ll)。實(shí)施例III:生產(chǎn)菌株的評(píng)價(jià)生產(chǎn)菌株在小錐形瓶中進(jìn)行評(píng)價(jià)。將5. 5mL預(yù)培養(yǎng)物在37°C在混合培養(yǎng)基(10%具有2. 5g.L—1葡萄糖的LB培養(yǎng)基(Sigma 25%)和90%基本培養(yǎng)基PCI)中生長(zhǎng)16小 時(shí)。將它用于接種50mL培養(yǎng)物至在培養(yǎng)基PCl中0. 2的0D_。將壯觀霉素加入至50mg. L—1的終濃度。培養(yǎng)物的溫度是37°C。當(dāng)培養(yǎng)物已達(dá)到5-7的0D_時(shí)，在OPA/Fmoc衍生化后通過HPLC定量細(xì)胞外氨基酸，并且使用HPLC伴隨折射計(jì)檢測(cè)(有機(jī)酸和葡萄糖)和在硅烷基化之后的GC-MS，來分析其他相關(guān)代謝產(chǎn)物。對(duì)于每種菌株，進(jìn)行3次重復(fù)。菌株1MG1655 metA*ll Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst 17-metF AmetJ ApykF ApykA(pME101-thrA*l-cysE-PgapA_metA*ll)。菌株2MG1655metA*ll Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst 17-metF AmetJ ApykF ApykA A ItaE A tdh (pME101-thrA*l-cysE_PgapA_metA*ll)。復(fù)I :基本培養(yǎng)基組成(PCl)
權(quán)利要求
1.一種用于在發(fā)酵工藝中生產(chǎn)甲硫氨酸、其前體或衍生物的方法，其包括如下步驟 -在包含碳源、硫源和氮源的合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)修飾的微生物，和 -從所述培養(yǎng)基中回收甲硫氨酸和/或其衍生物， 其中所述微生物是以減少蘇氨酸轉(zhuǎn)化為除甲硫氨酸外的其他化合物的方式修飾的。
2.權(quán)利要求I的方法，其中自蘇氨酸的甘氨酸產(chǎn)生是減少的。
3.權(quán)利要求2的方法，其中將蘇氨酸轉(zhuǎn)化為甘氨酸的酶的活性是減少的。
4.權(quán)利要求3的方法,其中至少一種下述基因的表達(dá)是減弱的ltaE、kbl、glyA、tdh。
5.權(quán)利要求4的方法，其中表達(dá)突變型GlyA酶，其具有減弱的蘇氨酸醛縮酶活性，同時(shí)維持所述酶GlyA的絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶活性。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述GlyA酶具有在其多肽序列中的至少一種下述氨基酸變化T128S、T224S、T225S、T226S、T227S、T230S、R235K。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述內(nèi)源基因glyA已從所述微生物中缺失。
8.權(quán)利要求I的方法，其中所述微生物是以減少自蘇氨酸的異亮氨酸產(chǎn)生的方式修飾的。
9.權(quán)利要求8的方法，其中蘇氨酸至a-酮丁酸的脫氨基和/或脫水是減少的。
10.權(quán)利要求9的方法，其中至少一種下述酶活性是減弱的蘇氨酸脫氨酶、蘇氨酸脫水酶。
11.權(quán)利要求10的方法，其中至少一種下述基因的表達(dá)是減弱的ilvA、tdcB、sdaA、sdaB、tdcGo
12.權(quán)利要求1-11的方法，其中所述微生物中的絲氨酸可用度是增加的。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述微生物中的絲氨酸產(chǎn)生是通過增加基因serA、serB、serC中的至少一種的表達(dá)增加的。
14.權(quán)利要求12或13的方法，其中絲氨酸降解是通過減弱基因sdaA或sdaB中的至少一種的活性減少的，所述基因編碼具有絲氨酸脫氨酶活性的酶。
15.權(quán)利要求11或14的方法，其中sdaA基因在其核酸序列中具有T158G核苷酸變化。
16.一種經(jīng)修飾的微生物，其包含 -metJ基因的缺失， -對(duì)于甲硫氨酸具有減少的反饋敏感性的等位基因metA的表達(dá)，和 -例如權(quán)利要求I - 15中任一項(xiàng)中所述的至少一種修飾。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用具有蘇氨酸的減弱轉(zhuǎn)化的修飾菌株用于甲硫氨酸生產(chǎn)的方法。這可以通過減少蘇氨酸轉(zhuǎn)化成甘氨酸和/或通過減少其轉(zhuǎn)化至α-酮丁酸來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明還涉及具有蘇氨酸的減弱轉(zhuǎn)化的修飾菌株。
文檔編號(hào)C12P13/12GK102782137SQ201080064983
公開日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2010年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月30日
發(fā)明者C.波伊薩特, G.巴比爾, G.貝斯特爾-科爾, R.菲格 申請(qǐng)人:代謝探索者公司