專(zhuān)利名稱(chēng)：在包含木薯渣或菠蘿蜜種子作為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中利用谷氨酸棒桿菌atcc 21831或谷 ...的制作方法
在包含木薯渣或菠蘿蜜種子作為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中利用谷氨酸棒桿菌ATCC 21831或谷氨酸棒桿菌ATCC 21493生產(chǎn)精氨酸的方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨酸的生物過(guò)程。實(shí)施方案包括通過(guò)酶促淀粉水解從廉價(jià)的、含淀粉農(nóng)業(yè)廢棄物(例如亞洲和非洲國(guó)家盛產(chǎn)的木薯渣和菠蘿蜜種子粉)中得到的還原糖。所述方法通過(guò)使用非精制糖源取代昂貴的合成碳源例如右旋糖或蔗糖，可以經(jīng)濟(jì)地放大以生產(chǎn)精氨酸。對(duì)于氨基酸日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求使得學(xué)術(shù)界和工業(yè)家研制高效、經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)氨基酸的新方法。推動(dòng)氨基酸生產(chǎn)的技術(shù)競(jìng)爭(zhēng)主要涉及四種方法——從蛋白水解產(chǎn)物中提取、化學(xué)合成、酶水解和發(fā)酵。從經(jīng)濟(jì)角度考慮，除了幾種情形沒(méi)有達(dá)到高產(chǎn)率外，發(fā)酵在工業(yè)上是可行的，并得到了廣泛應(yīng)用。該方法的節(jié)省主要取決于碳源成本、發(fā)酵產(chǎn)率、純化產(chǎn)率和整個(gè)過(guò)程的生產(chǎn)率。棒桿菌產(chǎn)生的氨基酸的市值不斷增加使得生物過(guò)程和下游處理技術(shù)發(fā)展迅速。這推動(dòng)了生產(chǎn)率和降低生產(chǎn)成本的成果(Thomas Hermann, " Industrialproduction of amino acids by coryneform bacteria, " Journal of Biotechnology104 155-172(2003))。因此，需要在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用影響L-精氨酸產(chǎn)量的任何自然過(guò)程。L-精氨酸是一種條件必需氨基酸，所謂的取決于個(gè)體發(fā)育階段和健康狀況。精氨酸通過(guò)增加T-細(xì)胞產(chǎn)量激活免疫系統(tǒng)；有助于血管舒張、維持肌肉健康、清除機(jī)體氨和釋放激素。通常來(lái)講，L-精氨酸通過(guò)三種方法生產(chǎn)(i)從蛋白水解產(chǎn)物中提?。?br> (ii)化學(xué)合成；和(iii)酶水解(Takishi Utagawa, " Production of Arginine byfermentation, " J. Nutr. 134 :2854S_2857S (2004))。后來(lái)發(fā)現(xiàn) L-精氨酸可以通過(guò)棒桿菌(Corynebacterium)和短桿菌(Brevibacterium)的烴同化野生型菌株進(jìn)行小量生產(chǎn)(美國(guó)專(zhuān)利NO. 3，222，258和3，440，141)，其突變株利用碳水化合物產(chǎn)生甚至更高的量(英國(guó)專(zhuān)利No. I, 278，917)。在各種微生物的調(diào)控突變體(regulatory mutant)中，谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)顯不出較高的 L-精氨酸產(chǎn)量(Hajime Yoshida, KazumiAraki and Kiyoshi Nakayama," Arginine Production by Arginine Analog-resistantMutants of Microorganisms, " Agric，Biol. Chem.，45 (4)，959-963 (1981))。某些典型的產(chǎn)精氨酸突變體是對(duì)2-噻唑丙氨酸(美國(guó)專(zhuān)利No. 3，723，249和美國(guó)專(zhuān)利No. 3，878，044)和刀豆氨酸(美國(guó)專(zhuān)利No. 3849250 ;英國(guó)專(zhuān)利No. 1，351，518)具有抗性的棒桿菌屬。桿菌屬(Bacillus)(美國(guó)專(zhuān)利No. 3，734，829和美國(guó)專(zhuān)利4086137、美國(guó)專(zhuān)利4430430)和埃希氏菌屬(Escherichia)(美國(guó)專(zhuān)利4430430，美國(guó)專(zhuān)利6897048)突變體也已被發(fā)現(xiàn)能夠大量生產(chǎn)精氨酸。Kisumi等首次報(bào)道了通過(guò)微生物發(fā)酵以可觀的量生產(chǎn)L-精氨酸，"Productionof L-Argroine by Arginine Hydroxamate-Resistant Mutants of Bacillussubtilis，" Appl. Microbiol. 22,987 (1971) 眾所周知，氧氣供應(yīng)對(duì)于微生物的好氧氨基酸生產(chǎn)具有重要影響(Takishi Utagawa, " Production of Arginine byfermentation, " J. Nutr. 134 :2854S_2857S(2004))。厭氧條件下生長(zhǎng)常常導(dǎo)致有毒副產(chǎn)物例如乙酸和乙醇的形成，其繼而強(qiáng)烈抑制L-精氨酸的產(chǎn)生(J.Gong，J.Ding，H. Huang, Q. Chen, Kinetic study and modeling on L—arginine fermentation，Chin.J. Biotech. 9 (I) 9-18 (1993))。木薯(Manihotesculenta)漁已被用于由干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)和德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)生產(chǎn) L_(+)_ 乳酸(Rojan P. John，K. MadhavanNampoothiri and Ashok Pandey, Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol 34，p263_272(2006) ；Rojan P.John，K. Madhavan Nampoothiri and Ashok Pandey, " Solidstate fermentation for L-Iactic acid production from agro wastes usingLactobacillus delbrueckii，" Process Biochemistry，Voi. 41p :759-763(2006))。其還被用于通過(guò)固態(tài)發(fā)酵(SSF)生產(chǎn)赤霉酸(A. Tomasinil，C Fajardo and J. Barrios-Gonzar lez，" Gibberellic acid production using different solid-state fermentationsystems, " Vol I. p203_206 (1997)和梓樣酸(Flavera Camargo Prado, Luciana Portode Souza Vandenberghe and Carlos Ricardo Soccol，" Relation between Citric AcidProduction by Solid-State Fermentation from Cassava Bagasse and Respirationof Aspergillus niger LPBSemi-Pilot Scale，，，Brazilian archives of Biology andTechnology，Vol. 48，Special η. :pp. 29-36 (2005)) 最近，Ubaid 等報(bào)道了其在 Y-亞麻酸生產(chǎn)中的應(yīng)用(Syed Ubaid et al.，" Enrichment of Y -Iinolenic acid in the Iipdextracted from Mucor zychaeMTCC5420, " Food Research International, Volume 42，issue 4，May 2009，Pages449_453)。相似地，菠蘿蜜種子粉已被用于生產(chǎn)色素(Sumathy Babitha, Carlos R. Soccoland Ashok Pandey, " Jackfruit Seed-A Novel Substrate for the Productionof Monascus Pigments through Solid-State Fermentation， " Food T chnol.Biotechnol，44 (4) 465-471 (2006))和生產(chǎn)聚輕基丁酸酯(Ramadas NV，Soccol CR，PandeyA Appl Biochem Biotechnol， " A Statistical Approach for Optimization ofPolyhydroxybutyrate Production by Bacillus sphaericus NCIM 5149 under SubmergedFermentation Using Central Composite Design，" Appl. Biochem. Biotechnol. (2009))。現(xiàn)存的精氨酸發(fā)酵方法存在某些弊端，包括例如缺少能生產(chǎn)精氨酸的野生型培養(yǎng)物(culture)，這與谷氨酸不同，野生型谷氨酸棒桿菌能大量生產(chǎn)谷氨酸。也難以制備能生產(chǎn)精氨酸的營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變體，因此需要通過(guò)遺傳工程改進(jìn)菌株使之適于生產(chǎn)精氨酸。此外，由于使用純葡萄糖作為唯一碳源，制備精氨酸的生產(chǎn)成本相對(duì)較高。因此，需要一種利用現(xiàn)有菌株、能提高產(chǎn)量的廉價(jià)替代方法。發(fā)明概述下面的說(shuō)明具體描述并確定了本發(fā)明的特點(diǎn)及其實(shí)施方式?！袄煤修r(nóng)業(yè)殘余底物(菠蘿蜜種子粉或木薯渣一類(lèi)的天然淀粉)的水解產(chǎn)物作為主要碳源的生產(chǎn)培養(yǎng)基進(jìn)行微生物生產(chǎn)L-精氨酸，所述水解產(chǎn)物之前未曾被嘗試用于利用谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)氨基酸例如精氨酸”。本發(fā)明實(shí)施方案的一個(gè)特征是利用由當(dāng)?shù)乜梢垣@得的農(nóng)業(yè)廢棄物材料制作的水解產(chǎn)物替代純糖類(lèi)來(lái)培養(yǎng)能產(chǎn)氨基酸的谷氨酸棒桿菌菌株。本發(fā)明實(shí)施方案的另一特征是開(kāi)發(fā)適合用農(nóng)業(yè)廢棄物材料水解產(chǎn)物作為主要碳源生產(chǎn)L-精氨酸以及在谷氨酸棒桿菌存在下發(fā)酵碳源的生物方法。本發(fā)明實(shí)施方案的另一特征是從發(fā)酵后的發(fā)酵液中純化精氨酸。根據(jù)實(shí)施方案的一個(gè)特征，提供了一種通過(guò)農(nóng)業(yè)廢棄物發(fā)酵制備精氨酸的方法，包括將農(nóng)業(yè)廢棄物在谷氨酸棒桿菌ATCC 21831或谷氨酸棒桿菌ATCC21493中的至少一種存在的條件下進(jìn)行發(fā)酵以產(chǎn)生含有精氨酸的發(fā)酵液，并從所述發(fā)酵液中回收精氨酸。根據(jù)實(shí)施方案的另一特征，提供了一種從選自木薯渣、菠蘿蜜種子粉及它們混合物的含淀粉農(nóng)業(yè)廢棄物材料制備L-精氨酸的方法，包括酶水解農(nóng)業(yè)廢棄物材料，優(yōu)選使55-85 %，優(yōu)選60-75 %，甚至更優(yōu)選65-68 %的農(nóng)業(yè)廢棄物底物轉(zhuǎn)化成還原糖，在谷氨酸棒桿菌ATCC 21831或谷氨酸棒桿菌ATCC 21493中的至少一種存在的條件下發(fā)酵還原糖(優(yōu)選作為唯一碳源)產(chǎn)生含有精氨酸的發(fā)酵液，并且從發(fā)酵液中回收精氨酸。從下面的詳細(xì)描述容易看出本發(fā)明的這些和其它特征和優(yōu)點(diǎn)是顯而易見(jiàn)的。發(fā)明詳述在閱讀本文所述的本發(fā)明說(shuō)明書(shū)時(shí)必須考慮下列定義和非限制性指南。本文使用的標(biāo)題(如“背景”和“概述”)和副標(biāo)題(如“組合物”和“方法”)在本發(fā)明公開(kāi)的范圍內(nèi)僅用作一般的標(biāo)題結(jié)構(gòu)，不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容或其任何方面的限制。尤其是，“背景技術(shù)”中披露的主題可以包括本發(fā)明范圍內(nèi)的技術(shù)特征，不是對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的敘述。“概述”中所公開(kāi)的主題不是本發(fā)明全部范圍或其任何實(shí)施方案的窮舉或完整披露。為了方便起見(jiàn)，在說(shuō)明書(shū)的章節(jié)中將材料分類(lèi)或論述為具有特定的效用(例如作為“活性”或“載體”成分)，但不能由此斷定，當(dāng)所述材料用于任何既定組合物時(shí)該材料必須或者唯獨(dú)根據(jù)本文對(duì)其所作的分類(lèi)來(lái)起作用。本文引用參考文獻(xiàn)不應(yīng)構(gòu)成所述參考文獻(xiàn)是現(xiàn)有技術(shù)或與本文所公開(kāi)發(fā)明的專(zhuān)利性有任何關(guān)聯(lián)的認(rèn)可。導(dǎo)言部分對(duì)于引用的參考文獻(xiàn)內(nèi)容的討論僅旨在提供參考文獻(xiàn)作者斷言的概述，不構(gòu)成對(duì)所述參考文獻(xiàn)內(nèi)容準(zhǔn)確性的認(rèn)可。表示本發(fā)明實(shí)施方案的詳細(xì)說(shuō)明和具體實(shí)施例僅用作說(shuō)明目的，不作為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。此外，具有所述特征的多個(gè)技術(shù)方案的表述并不排除具有另外特征的其它實(shí)施方案或整合了所述特征不同組合的其它實(shí)施方案。提供了具體的實(shí)施例用來(lái)說(shuō)明如何制備和使用所述組合物并應(yīng)用本發(fā)明方法，除非有明確指示，否則不應(yīng)視為代表本發(fā)明的既定實(shí)施方案經(jīng)過(guò)或未經(jīng)過(guò)實(shí)施或測(cè)試。本文所用的術(shù)語(yǔ)“優(yōu)選”指在一定條件下具有某些優(yōu)點(diǎn)的本發(fā)明實(shí)施方案。然而，在相同或其它情況下，也可能優(yōu)選其它實(shí)施方案。而且，對(duì)一個(gè)或多個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案的描述并不意味著其它實(shí)施方案沒(méi)用，也不排除本發(fā)明范圍內(nèi)的其它實(shí)施方案。此外，所述組合物和所述方法可能包括其中所述的要素、主要由所述要素組成或由所述要素組成。通篇使用的“范圍”這一簡(jiǎn)寫(xiě)描述所述范圍內(nèi)的每一個(gè)值。所述范圍內(nèi)的任何值均可被選擇作為范圍的終點(diǎn)。此外，本文引用的所有對(duì)比文件整體上以參考的方式引入本文中。當(dāng)本申請(qǐng)公開(kāi)內(nèi)容中的定義與引用文件中的定義沖突時(shí)，以本申請(qǐng)的公開(kāi)內(nèi)容為準(zhǔn)。除非另外指出，此處以及說(shuō)明書(shū)別處表述的所有百分?jǐn)?shù)和數(shù)量應(yīng)被理解為重量百分比。給出的數(shù)量基于材料的有效重量。本文對(duì)于特定值的表述，不論是指組分各自的量還是實(shí)施方案的其它特征，表示數(shù)值加上或者減去測(cè)量中的誤差變異程度。例如，在測(cè)量誤差的程度被本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)可和理解的前提下，數(shù)量10%可以包括9. 5%或10. 5%。術(shù)語(yǔ)“農(nóng)業(yè)廢棄物”指來(lái)自農(nóng)產(chǎn)品加工的任何廢棄物。例如PRODUCTS FROMWASTEdNDUSTRIAL AND AGRO WASTE), National institute of Industrial Research,(2003) ；Garcia-Reyes Refugio, et al. , " Contribution of agro-waste materialmain components (hemicelluloses, cellulose, and hgnin)to the removal ofchromium(III)from aqueous solution, " J. of Chem. Tech. &Biotech. , Vol. 84, No. 10,1522-1538 (Oct. 10,2009)中描述了農(nóng)業(yè)廢棄物的各種形式。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，農(nóng)業(yè)廢棄物包括甘蔗渣、纖維素、木質(zhì)素、半纖維素、種子粉、木薯渣或菠蘿蜜種子粉。本發(fā)明包括通過(guò)農(nóng)業(yè)廢棄物發(fā)酵制備精氨酸的方法，包括在谷氨酸棒桿菌ATCC21831或谷氨酸棒桿菌ATCC 21493中的至少一種存在的條件下使農(nóng)業(yè)廢棄物發(fā)酵，優(yōu)選在200C -500C的溫度范圍內(nèi)以及5-8的pH范圍內(nèi)反應(yīng)12小時(shí)_2周，產(chǎn)生含精氨酸的發(fā)酵液；并且從所述發(fā)酵液中回收精氨酸。已經(jīng)報(bào)道了利用農(nóng)業(yè)廢棄物原料作為主要碳源進(jìn)行微生物的各種代謝生產(chǎn)，例如酶、有機(jī)酸如乳酸、色素。不受任何理論限制，本申請(qǐng)發(fā)明人認(rèn)為利用廉價(jià)原料生產(chǎn)氨基酸的生物技術(shù)過(guò)程可以進(jìn)一步改進(jìn)，以使它們能夠與化學(xué)方法相競(jìng)爭(zhēng)。例如，發(fā)明人考慮到它們淀粉含量高和之前在各種生物過(guò)程中的成功應(yīng)用，選擇了兩種底物-菠蘿蜜和木薯渣。菠蘿蜜(木波羅(Artocarpus heterophyllus))是生長(zhǎng)于亞洲的、最流行的熱帶水果之一。作為所有樹(shù)上生長(zhǎng)的水果中最大的一種，菠蘿蜜的單個(gè)果實(shí)含有100-300顆種子。種子占果實(shí)總重量的大約10-15%，糖和蛋白質(zhì)含量高(S. Kumar，A. B. Singh，A. B.Abidi, R. G. Upadhyay, A. Singh,, " Proximate composition of jackfruitseeds, " J. FoodScL Tecknol. 25. 141-152(1988))。種子通常被丟棄或者蒸熟后作為零食食用或用于地方菜式。種子經(jīng)曬干并磨成粉得到菠蘿蜜種子粉或末。淀粉水解后從粉末(flour)中獲得的糖可有效用于發(fā)酵生產(chǎn)有機(jī)化合物。菠蘿蜜種子淀粉的糊化溫度(gelatinization temperature)范圍較窄，因此跟改良淀粉相比需要的糊化能量較少，從而降低淀粉水解成本。下面的表I描述了菠蘿蜜種子的物理-化學(xué)性質(zhì)。表I :菠蘿蜜種子的物理-化學(xué)組成
權(quán)利要求
1.通過(guò)發(fā)酵農(nóng)業(yè)廢棄物制備精氨酸的方法，包括在谷氨酸棒桿菌ATCC 21831或谷氨酸棒桿菌ATCC 21493中的至少一種存在的條件下 使農(nóng)業(yè)廢棄物發(fā)酵，以產(chǎn)生含精氨酸的發(fā)酵液；和 從所述發(fā)酵液中回收精氨酸。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述農(nóng)業(yè)廢棄物包含選自以下的碳源木薯渣、菠蘿 蜜種子粉和它們的混合物。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述農(nóng)業(yè)廢棄物是通過(guò)利用淀粉糖化酶水解含淀粉 材料產(chǎn)生的碳源。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述碳源通過(guò)使用淀粉糖化酶水解木薯渣、菠蘿蜜 種子粉及它們的混合物中的至少一種產(chǎn)生。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述發(fā)酵是好氧發(fā)酵。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述發(fā)酵在20°C-50°C的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述溫度是30°C-32°C。
8.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述發(fā)酵在5-8的pH范圍內(nèi)進(jìn)行。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述pH是6-7。
10.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述發(fā)酵進(jìn)行的時(shí)間為12小時(shí)-2周。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述時(shí)間為2天-6天。
12.如權(quán)利要求I所述的方法，進(jìn)一步包含在發(fā)酵過(guò)程中添加內(nèi)酰胺抗生素。
13.利用選自木薯渣、菠蘿蜜種子粉和它們的混合物的含淀粉農(nóng)業(yè)廢棄物材料制備 L-精氨酸的方法，包括酶促水解所述農(nóng)業(yè)廢棄物材料以將所述廢棄物轉(zhuǎn)化為還原糖；在谷氨酸棒桿菌ATCC 21831或谷氨酸棒桿菌ATCC 21493中的至少一種存在的條件下 發(fā)酵還原糖，以產(chǎn)生含精氨酸的發(fā)酵液；和 從所述發(fā)酵液中回收所述精氨酸。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中酶促水解所述農(nóng)業(yè)廢棄物將55-85%的農(nóng)業(yè)廢棄 物轉(zhuǎn)化為還原糖。
15.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述發(fā)酵在20°C-50°C的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述溫度是30°C-32°C。
17.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述發(fā)酵在5-8的pH范圍內(nèi)進(jìn)行。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述pH是6-7。
19.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述發(fā)酵在12小時(shí)-2周時(shí)間內(nèi)進(jìn)行。
20.如權(quán)利要求13所述的方法，進(jìn)一步包含在發(fā)酵過(guò)程中添加內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)精氨酸的方法，其中通過(guò)酶促淀粉水解從廉價(jià)的、含淀粉農(nóng)業(yè)廢棄物例如木薯渣和菠蘿蜜種子粉中獲得的糖在微生物存在條件下發(fā)酵產(chǎn)生含精氨酸的發(fā)酵液，并從所述發(fā)酵液中回收精氨酸。該方法可以經(jīng)濟(jì)地放大以利用非精制糖源生產(chǎn)精氨酸，因?yàn)槠渑c較昂貴的合成碳源例如右旋糖或蔗糖相比，能以更高產(chǎn)率生產(chǎn)精氨酸。
文檔編號(hào)C12P13/10GK102947459SQ201080064824
公開(kāi)日2013年2月27日 申請(qǐng)日期2010年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月25日
發(fā)明者A·潘迪, M·納姆普蒂里, R·蘇布拉曼亞姆 申請(qǐng)人:高露潔-棕欖公司, 科學(xué)及工業(yè)研究委員會(huì)