專利名稱：調(diào)控一級分枝數(shù)的基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及調(diào)控與植物種子和莖葉的產(chǎn)量增加相關(guān)的一級分枝數(shù)的基因的分離、 鑒定以及利用該基因改善植物的產(chǎn)量的方法等。
背景技術(shù)：
隨著人口的不斷增加，由于環(huán)境污染和變暖等，全球規(guī)模的糧食危機(jī)逐漸成為問題。其中，作為主食的谷物的產(chǎn)量增加的必要性逐漸提高。因此，豐產(chǎn)性稻的育種和普及正成為重要的課題。
稻的栽培品種等的遺傳特性由各種突變基因位點(diǎn)的總和決定。這種對特定的性狀產(chǎn)生相加的影響的基因位點(diǎn)稱為數(shù)量性狀基因位點(diǎn)(QTL)。因此，可以說某一品種著粒數(shù)多的遺傳特性也由數(shù)量性狀基因位點(diǎn)決定。就稻而言，與谷粒粒數(shù)的增減相關(guān)的基因已經(jīng)得到分離和鑒定(專利文獻(xiàn)1)。
現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn)1 日本特開2007-49994號公報(bào)發(fā)明內(nèi)容
產(chǎn)量多的稻還存在其他各種品種，根據(jù)各品種中何種性狀對豐產(chǎn)性有貢獻(xiàn)，所要鑒定的QTL也不同。通過將對豐產(chǎn)性有貢獻(xiàn)的不同性狀進(jìn)行組合，還可以期待產(chǎn)量的進(jìn)一步增加。
因此，本發(fā)明的目的在于對調(diào)控植物的一級分枝數(shù)的基因進(jìn)行分離和鑒定，并將該基因加以利用。
為了分離鑒定調(diào)控稻的一級分枝數(shù)的基因，本發(fā)明人嘗試了組合進(jìn)行定位克隆的 QTL分析。龐大的實(shí)驗(yàn)和分析的結(jié)果，本發(fā)明人首次成功地分離鑒定了調(diào)控一級分枝數(shù)的基因。即，可知若該基因的表達(dá)受到抑制則一級分枝數(shù)具有減少的傾向，若該基因的表達(dá)增強(qiáng)則一級分枝數(shù)具有增加的傾向。進(jìn)而，通過將所鑒定的基因?qū)朐摲N以外的品種、使該基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)而得到了獲得一級分枝數(shù)增加能力的轉(zhuǎn)化植物。根據(jù)本說明書的公開內(nèi)容，基于這些發(fā)現(xiàn)，提供下述技術(shù)方案。
根據(jù)本說明書的公開內(nèi)容，提供一種轉(zhuǎn)化植物體，其中，編碼下述(a) (f)中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)增強(qiáng)，
(a)包含序列號2表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；
(b)具有序列號2表示的氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代、缺失、添加和/ 或插入后的氨基酸序列、且具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)；
(c)具有與序列號2表示的氨基酸序列有70%以上的同一性的氨基酸序列、且具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)；
(d)由包含序列號1表示的堿基序列的DNA編碼的蛋白質(zhì)；
(e)由在嚴(yán)格條件下與包含序列號1表示的堿基序列的多核苷酸的互補(bǔ)鏈雜交的 DNA編碼、且具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)；
(f)由與序列號1表示的堿基序列具有70%以上的同一性的DNA編碼、且具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)。
本說明書中公開的轉(zhuǎn)化植物體中，上述蛋白質(zhì)優(yōu)選來源于稻科植物。另外，上述轉(zhuǎn)化植物體優(yōu)選為稻科植物。
根據(jù)本說明書的公開內(nèi)容，還提供一種載體，其中，為了增強(qiáng)編碼上述(a) ⑴ 中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)而保有上述基因的至少一部分。另外，根據(jù)上述公開內(nèi)容，還提供導(dǎo)入了上述載體的植物細(xì)胞。此外，根據(jù)上述公開內(nèi)容，還提供含有上述植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化植物體。此外，根據(jù)上述公開內(nèi)容，還提供作為上述轉(zhuǎn)化植物體的后代或克隆的轉(zhuǎn)化植物體。根據(jù)上述公開內(nèi)容，還提供上述轉(zhuǎn)化植物體的繁殖材料。
根據(jù)本說明書的公開內(nèi)容，提供一種轉(zhuǎn)化植物體的制造方法，其中，包括下述工序使用上述載體將上述基因?qū)胫参锛?xì)胞中，由該植物細(xì)胞使植物體再生。
根據(jù)本說明書的公開內(nèi)容，還提供一種有用作物的生產(chǎn)方法，其中，包括下述工序栽培上述轉(zhuǎn)化植物體的工序；和收獲上述轉(zhuǎn)化植物體或其一部分的工序。
根據(jù)本說明書的公開內(nèi)容，還提供一種植物體或其一部分的產(chǎn)量的調(diào)節(jié)方法，其特征在于，在植物體中，對編碼上述(a) (f)中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)。根據(jù)本說明書的公開內(nèi)容，提供一種改變植物體或其一部分的產(chǎn)量的藥劑，其以編碼上述(a) (f)中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)的基因作為有效成分。
根據(jù)本說明書的公開內(nèi)容，提供一種植物體，其中，在第一 DNA本來所位于的基因位點(diǎn)或與該基因位點(diǎn)相當(dāng)?shù)奈恢蒙媳Ｓ邢率鯠NA區(qū)域，所述DNA區(qū)域包含編碼上述(a) (f)中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)的第一 DNA和位于該第一 DNA的上游的下述(g)或(h)所述的第二 DNA，
(g)包含序列號3表示的堿基序列的DNA ；
(h)具有序列號3表示的堿基序列中一個(gè)或多個(gè)堿基被取代、缺失、添加和/或插入后的堿基序列、且具有使具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)的表達(dá)增強(qiáng)的活性的DNA。
該植物體優(yōu)選為單子葉植物，更優(yōu)選為稻科植物。該植物體可以為通過雜交而得到的植物體。該植物體可以在上述基因位點(diǎn)上以同源的方式具備上述DNA區(qū)域。
根據(jù)本說明書的公開內(nèi)容，提供一種植物體的制作方法，其中，包括下述工序使原品種植物體與其他植物體雜交，所述原品種植物體在第一 DNA本來所位于的基因位點(diǎn)或與該基因位點(diǎn)相當(dāng)?shù)奈恢蒙媳Ｓ邢率鯠NA區(qū)域，所述DNA區(qū)域包含編碼上述(a) (f)中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)的第一 DNA和位于該第一 DNA的上游的上述(g)或(h)所述的第二 DNA， 從而制作在上述第一 DNA本來所位于的基因位點(diǎn)或與該基因位點(diǎn)相當(dāng)?shù)奈恢蒙媳Ｓ猩鲜?DNA區(qū)域的新品種植物體。
根據(jù)該植物體的制作方法，能夠?qū)鲜龅诙?DNA的至少一部分的DNA作為標(biāo)記來挑選新品種植物體。
根據(jù)本說明書的公開內(nèi)容，提供包含上述第二 DNA的至少一部分的育種標(biāo)記。
根據(jù)本說明書的公開內(nèi)容，提供一種育種用的DNA片段，其具備包含上述第一 DNA 和位于該第一 DNA的上游的上述第二 DNA的DNA區(qū)域。
根據(jù)本說明書的公開內(nèi)容，提供具備上述第二 DNA的育種用的DNA片段。


圖1是對NP-12和日本晴的穗進(jìn)行對比的圖。
圖2是表示NP-12和日本晴的一級分枝數(shù)的QTL分析結(jié)果的圖。在第一染色體短臂和第8染色體長臂中檢測出QTL。
圖3是表示作為調(diào)控一級分枝數(shù)的基因的WFP基因的克隆結(jié)果的圖。顯示出能夠確定在OsSPLH基因的啟動(dòng)子區(qū)域。
圖4是表示OsSPLH基因的表達(dá)分析結(jié)果的圖。
圖5是表示通過SPL14基因的導(dǎo)入而使一級分枝數(shù)增加的圖。
圖6是表示由日本晴和NP-12得到的4種BC2F2的基因型的圖。
圖7是表示4種BC2F2的平均每個(gè)主穗的一級分枝數(shù)的測定結(jié)果的圖。
圖8是表示4種BC2F2的平均每個(gè)主穗的粒數(shù)的圖。
圖9是表示4種BC2F2的平均每個(gè)植物體的粒數(shù)的圖。
圖10是表示針對8號染色體上的QTL，對日本晴與NP-12的雜合體和純合體中平均每個(gè)主穗的一級分枝數(shù)進(jìn)行評價(jià)的結(jié)果的圖。
圖11是表示對日本晴和NP-12中2. 6kb區(qū)域的甲基化水平進(jìn)行評價(jià)的結(jié)果的圖。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明涉及調(diào)控一級分枝數(shù)的基因及其用途。本發(fā)明人如下所述首次成功地分離鑒定了對一級分枝數(shù)的增加有貢獻(xiàn)、結(jié)果能夠使著粒數(shù)增加和產(chǎn)量增加的基因，并基于此而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明人著眼于豐產(chǎn)性的印度型稻系統(tǒng)NP-12。例如，日本晴平均每穗有約150 粒的種子，與之相對，國立大學(xué)法人名古屋大學(xué)的保藏系統(tǒng)NP-12 (該植物體的種子可以從國立大學(xué)法人名古屋大學(xué)生物功能開發(fā)利用研究中心獲得)平均每穗有多達(dá)約240粒的種子，而且，一級分枝(從穗軸伸出的枝的數(shù)量)為日本晴的約3倍(參見圖1)。本發(fā)明人推測該保藏系統(tǒng)的著粒數(shù)多和豐產(chǎn)性是由一級分枝數(shù)多這一形態(tài)所產(chǎn)生的，從而嘗試了對調(diào)控一級分枝數(shù)的基因進(jìn)行分離并獲得了成功。
根據(jù)本發(fā)明，通過對植物進(jìn)行改變以使本發(fā)明人新分離和鑒定的基因的表達(dá)增強(qiáng)，能夠得到一級分枝數(shù)多、且種子和莖葉的產(chǎn)量提高的轉(zhuǎn)化植物。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的基因是稻科植物的內(nèi)源基因，其在NP-12中表達(dá)，與之相對，日本晴中雖然也保有同樣的內(nèi)源性基因，但并不表達(dá)。可知該內(nèi)源性基因的失活或表達(dá)的抑制使一級分枝數(shù)減少，相反地，該內(nèi)源性基因的表達(dá)的增強(qiáng)有助于一級分枝數(shù)的增加。
該基因特別是在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域、以生物質(zhì)為原料的能源領(lǐng)域和化學(xué)工業(yè)領(lǐng)域中有用。 例如，一級分枝數(shù)的增加所引起的種子的著粒數(shù)的增加能夠使谷類的產(chǎn)量提高。
在利用本發(fā)明人分離和鑒定的基因創(chuàng)造植物時(shí)，優(yōu)選利用轉(zhuǎn)化來創(chuàng)造。與利用雜交而進(jìn)行的基因?qū)胂啾龋D(zhuǎn)化所需要的期間極短，能夠在不伴有其他性狀變化的情況下賦予或提高一級分枝數(shù)增加能力。另外，由于谷類中極其良好地保存了基因組同線性(基因的同源性)，因此可以期待本發(fā)明人分離的基因在小麥、大麥、玉米等谷物育種中的應(yīng)用。
本發(fā)明人所發(fā)現(xiàn)的基因不僅可用于稻，還可以用于包含稻以外的其他稻科植物 (例如，小麥、大麥、玉米、甘蔗、蜀黍等)在內(nèi)的植物，能夠廣泛用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域、能源領(lǐng)域和化學(xué)工業(yè)領(lǐng)域。
另外，根據(jù)本說明書的公開內(nèi)容，還提供包含名古屋大學(xué)保藏系統(tǒng)稻NP-12的8號染色體中的、本發(fā)明人分離和鑒定的基因的上游區(qū)域在內(nèi)的該鑒定基因的DNA區(qū)域在一級分枝數(shù)的增加或產(chǎn)量增加的植物體的制作中的應(yīng)用。
上述DNA區(qū)域中，上述鑒定基因的上游區(qū)域在染色體上的本來的位置上有助于連接在其下游的、與一級分枝數(shù)的增加有關(guān)的鑒定基因的表達(dá)的增強(qiáng)。因此，通過將上述DNA 區(qū)域(可以包含上述鑒定基因的上游區(qū)域在內(nèi)而稱為等位基因)或上述鑒定基因的上游區(qū)域?qū)氲缴鲜鲨b定基因本來所位于的染色體上的位置或其上游，能夠增強(qiáng)該鑒定基因的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)一級分枝數(shù)或產(chǎn)量的增加。與使用所謂的基因工程技術(shù)的基因重組相比，通過雜交更容易實(shí)現(xiàn)這種染色體上的特定DNA的導(dǎo)入。
以下，關(guān)于本說明書的公開內(nèi)容，對調(diào)控一級分枝數(shù)的基因、表達(dá)載體、轉(zhuǎn)化植物體、有用作物的生產(chǎn)方法等依次進(jìn)行說明。
(調(diào)控一級分枝數(shù)的基因)
調(diào)控一級分枝數(shù)的基因(以下也簡稱為本基因)編碼誘導(dǎo)一級分枝數(shù)的蛋白質(zhì)(以下也簡稱為本蛋白質(zhì))。通過使用印度尼西亞原產(chǎn)品種、名古屋大學(xué)的保藏系統(tǒng) NP-12而進(jìn)行的與一級分枝數(shù)有關(guān)的QTL分析和定位克隆，本發(fā)明人首次鑒定出稻(Oriza sativa)的 0sSPL14 基因(NM_001068739 REGION 124. . 1377)作為與一級分枝數(shù)調(diào)控相關(guān)的基因。迄今為止，還沒有與OsSPLH基因編碼的蛋白質(zhì)的功能相關(guān)的報(bào)道。只要能夠編碼上述那樣的具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)，則本基因既可以是由天然產(chǎn)物制備的基因，也可以是人工制備的基因。例如，可列舉0sSPL14基因的直系同源基因、同源基因、人工導(dǎo)入突變后的基因。另外，作為基因，除了基因組DNA之外，還可以為cDNA等。本基因和由該基因編碼的蛋白質(zhì)主要可以來源于植物界、特別是來源于稻科植物。雖然本基因是由稻分離得到的，但認(rèn)為只要是同樣的一級分枝數(shù)多的植物，則均存在本基因。本基因優(yōu)選來源于單子葉植物，更優(yōu)選來源于稻科。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過登錄NCBI (National Center for Biotechnology Information ；http://www. ncbi. nlm. nih. gov)等的主頁適當(dāng)?shù)孬@得與這樣的基因和蛋白質(zhì)相關(guān)的信息。以下，對本蛋白質(zhì)進(jìn)行說明。
(本蛋白質(zhì))
作為本蛋白質(zhì)的一個(gè)方式，可列舉包含序列號2表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。另外，就本蛋白質(zhì)的其他方式而言，只要具有一級分枝數(shù)增加活性，則可以是與序列號1、2等公知的序列信息具有一定關(guān)系的蛋白質(zhì)。
作為本蛋白質(zhì)的其他方式，可列舉具有序列號2表示的氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入后的氨基酸序列、且具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)。另外，一級分枝數(shù)增加活性是指以下特性通過本蛋白質(zhì)的表達(dá)或促進(jìn)，與之前相比使一級分枝數(shù)增加。只要一級分枝數(shù)增加，則其程度不限。具體而言，栽培編碼該蛋白質(zhì)的 DNA的表達(dá)增強(qiáng)的轉(zhuǎn)化植物體，在一級分枝數(shù)增加時(shí)，可以說該蛋白質(zhì)和DNA具有一級分枝數(shù)增加活性。在一級分枝數(shù)不變或基本相同時(shí)，不能說該蛋白質(zhì)和DNA具有一級分枝數(shù)增加活性。一級分枝數(shù)的評價(jià)例如可以通過實(shí)施例中記載的方法來實(shí)施。
序列號2表示的氨基酸序列的氨基酸突變可以為缺失、取代、添加和插入中的任意一種，也可以組合兩種以上。另外，這些突變的總數(shù)沒有特別限定，優(yōu)選為約1個(gè)以上且 10個(gè)以下。更優(yōu)選為約1個(gè)以上且5個(gè)以下。
作為氨基酸取代的例子，優(yōu)選保守取代，具體可以舉出以下組內(nèi)的取代。(甘氨酸、 丙氨酸)(纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸)(天冬氨酸、谷氨酸)(天冬酰胺、谷氨酰胺)(絲氨酸、 蘇氨酸)(賴氨酸、精氨酸)(苯丙氨酸、酪氨酸)。
作為本蛋白質(zhì)的另一方式，可列舉具有與序列號2表示的氨基酸序列有60%以上的同一性的氨基酸序列、且具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)。同一性優(yōu)選為70%以上， 更優(yōu)選為80%以上，進(jìn)一步優(yōu)選為85%以上，更進(jìn)一步優(yōu)選為90%以上，更進(jìn)一步優(yōu)選為 95%以上，進(jìn)一步優(yōu)選為98%以上。
如本技術(shù)領(lǐng)域中已知的那樣，本說明書中，同一性或類似性是指通過對序列進(jìn)行比較而確定的2種以上蛋白質(zhì)或2種以上多核苷酸之間的關(guān)系。本技術(shù)領(lǐng)域中，“同一性”是指通過蛋白質(zhì)或多核苷酸序列之間的比對、或者根據(jù)情況通過一系列這樣的序列間的比對而確定的蛋白質(zhì)或多核苷酸序列之間的序列不變性的程度。另外，類似性是指通過蛋白質(zhì)或多核苷酸序列之間的比對、或者根據(jù)情況通過一系列的部分序列間的比對而確定的蛋白質(zhì)或多核苷酸序列之間的相關(guān)性的程度。更具體而言，通過序列的同一性和保守性(維持序列中的特定氨基酸或序列的物理化學(xué)特性的取代)來確定。需要說明的是，類似性在后述的BLAST的序列相同性檢索結(jié)果中被稱為Similarity。確定同一性和類似性的方法優(yōu)選為以在要對比的序列間進(jìn)行最長比對的方式而設(shè)計(jì)的方法。用于確定同一性和類似性的方法可以以公眾可利用的程序的形式提供。例如，可以利用Altschul等開發(fā)的BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)程序(例如，Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers Eff, Lipman DJ. ，J. Mol.Biol. ,215 :p403-410(1990) ；Altschyl SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ.，Nucleic Acids Res. 25 :p3389_3402 (1997))來確定。使用BLAST等軟件時(shí)的條件沒有特別限定，優(yōu)選使用默認(rèn)值。
另外，對于編碼序列號2表示的氨基酸序列或如上所述與該氨基酸序列具有一定關(guān)聯(lián)性的氨基酸序列的堿基序列，可以根據(jù)遺傳密碼的簡并，在不改變蛋白質(zhì)的氨基酸序列的情況下將編碼預(yù)定氨基酸序列的堿基序列的至少1個(gè)堿基取代為其他種類的堿基。因此，本基因也包含編碼通過基于遺傳密碼的簡并的取代而變換后的堿基序列的基因。
另外，本蛋白質(zhì)還可以是由包含序列號1表示的堿基序列的DNA編碼的蛋白質(zhì)。作為又一方式，可列舉由在嚴(yán)格條件下與包含序列號1表示的堿基序列的DNA的互補(bǔ)堿基序列構(gòu)成的DNA雜交的DNA編碼、且具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)。
嚴(yán)格條件例如是指形成所謂的特異性雜交、而不形成非特異性雜交的條件。例如，可列舉下述條件堿基序列的同一性高的核酸，即包含與序列號1表示的堿基序列具有 60%以上、優(yōu)選為70%以上、更優(yōu)選為80%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為85%以上、更進(jìn)一步優(yōu)選為 90%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為95%以上、最優(yōu)選為98%以上的同一性的堿基序列的DNA的互補(bǔ)鏈發(fā)生雜交，而與其相比相同性低的核酸的互補(bǔ)鏈不發(fā)生雜交。更具體而言，指下述條件 鈉鹽濃度為15 750mM、優(yōu)選為50 750mM、更優(yōu)選為300 750mM ；溫度為25 70°C、優(yōu)選為50 70°C、更優(yōu)選為55 65°C;甲酰胺濃度為0 50%、優(yōu)選為20 50%、更優(yōu)選為 35 45%。此外，嚴(yán)格條件中，雜交后的濾器的清洗條件為通常鈉鹽濃度為15 600mM、優(yōu)選為50 600mM、更優(yōu)選為300 600mM ；溫度為50 70°C、優(yōu)選為55 70°C、更優(yōu)選為60 65°C。另外，根據(jù)上述內(nèi)容，作為另一方式，可列舉由具有與序列號1表示的堿基序列有70%以上、優(yōu)選為80%以上、更優(yōu)選為85%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為90%以上、更進(jìn)一步優(yōu)選為95%以上、最優(yōu)選為98%以上的同一性的堿基序列的DNA編碼、且具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)。
編碼上述各種方式的蛋白質(zhì)的本基因可以通過下述方式獲得例如，使用基于序列號1等的序列而設(shè)計(jì)的引物，以從稻科植物等提取的DNA、各種cDNA文庫或基因組DNA文庫等來源的核酸作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由此以核酸片段的形式獲得。另外，可以將上述文庫等來源的核酸作為模板，將作為本基因的一部分的DNA片段作為探針來進(jìn)行雜交，由此以核酸片段的形式獲得?；蛘?，也可以通過化學(xué)合成法等本技術(shù)領(lǐng)域中公知的各種核酸序列合成法，以核酸片段的形式合成本基因。
另外，編碼上述各種方式的蛋白質(zhì)的本基因可以通過下述方式獲得例如，通過慣用的誘變法、定點(diǎn)突變法、使用易錯(cuò)PCR的分子進(jìn)化的手法等改變編碼序列號2表示的氨基酸序列的DNA(例如，包含序列號1表示的堿基序列)，從而獲得本基因。作為這樣的手法， 可列舉Kunkel法或缺口雙鏈體(Gapped duplex)法等公知手法或基于上述公知手法的方法，使用例如利用定點(diǎn)誘變法的突變導(dǎo)入用試劑盒(例如Mutant-KCTAKARA公司制造)或 Mutant-G(TAKARA 公司制造))等，或者使用 TAKARA 公司的 LA PCR in vitro Mutagenesis 系列試劑盒來導(dǎo)入突變。
除此之外，本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以參照分子克隆(Molecular Cloning) (Sambrook, J. et al.，Molecular Cloning -.a Laboratory Manual 2nded.，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 10 Skyline Drive Plainview,NY(1989))等,基于例如序列號 1或2等公知序列來獲得編碼各種方式的蛋白質(zhì)的本基因。
(表達(dá)載體)
本發(fā)明的表達(dá)載體可以采用用于在植物細(xì)胞內(nèi)增強(qiáng)本基因的表達(dá)的載體。本發(fā)明的載體能夠保有本基因。本載體的意圖在于，以外源性DNA的形式導(dǎo)入本基因而無論宿主細(xì)胞(植物細(xì)胞)內(nèi)的染色體上是否存在內(nèi)源性的本基因，結(jié)果使本基因的表達(dá)增強(qiáng)。需要說明的是，本載體并不排除通過同源重組等使植物細(xì)胞內(nèi)的染色體上的內(nèi)源性的本基因的表達(dá)增強(qiáng)的意圖。
作為植物細(xì)胞，沒有特別限制，可列舉例如擬南芥、稻、玉米、馬鈴薯、煙草等的細(xì)胞，優(yōu)選為雙子葉植物，進(jìn)一步優(yōu)選為稻科植物。作為稻科植物，可列舉稻、小麥、大麥、玉米、蜀黍等。另外，植物細(xì)胞中除了包含懸浮培養(yǎng)細(xì)胞等培養(yǎng)細(xì)胞以外，還包含原生質(zhì)體、愈傷組織。另外，植物細(xì)胞中除了包含苗條原基、多芽體、毛狀根等以外，還包含葉的切片等植物體中的細(xì)胞。
當(dāng)本載體的意圖在于將本基因以外源性DNA的形式導(dǎo)入到植物細(xì)胞中并使其表達(dá)時(shí)，可以具備能夠在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子和以能夠在該啟動(dòng)子的調(diào)控下工作的方式連接的本基因。此外，還可以包含含有多聚A的終止子。作為這樣的啟動(dòng)子，可列舉例如用于穩(wěn)定表達(dá)或誘導(dǎo)表達(dá)本基因的啟動(dòng)子。作為用于穩(wěn)定表達(dá)的啟動(dòng)子，可列舉例如花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子(Odell et al. 1985 Nature 313 :810)、稻的肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(Zhang et al. 1991 Plant Cell 3 :1155)、玉米的泛素啟動(dòng)子(Cornejo et al. 1993 Plant Mol.Biol. 23 567)等。另外，作為用于誘導(dǎo)表達(dá)本基因的啟動(dòng)子等，可列舉例如已知在絲狀真菌、細(xì)菌、病毒的感染或侵入、低溫、高溫、干燥、紫外線的照射、特定化合物的散布等外因作用下表達(dá)的啟動(dòng)子等。作為這樣的啟動(dòng)子，可列舉例如稻幾丁質(zhì)酶基因的啟動(dòng)子(Xu et al. 1996 Plant Mol. Biol. 30 :387)或煙草的PR蛋白質(zhì)基因的啟動(dòng)子(Ohshima et al. 1990 Plant Cell 2 :95)、稻的 “l(fā)ipl9” 基因的啟動(dòng)子(Aguan et al. 1993 Mol. GenGenet. 240 1)、稻的 “hsp80” 基因和 “hsp72” 基因的啟動(dòng)子(Van Breusegem et al. 1994 Plantal93 57)、擬南芥的“rabl6” 基因的啟動(dòng)子(Nundy et al. 1990Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1406)、歐芹的查爾酮合成酶基因的啟動(dòng)子(Schulze-Lefert et al. 1989 EMBO J. 8 :651)、 玉米的乙醇脫氫酶基因的啟動(dòng)子(Walker et al. 1987 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 6624)等。
另外，本載體也可以是意圖在于在大腸桿菌、酵母、動(dòng)植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞等細(xì)胞的宿主細(xì)胞中以重組蛋白的形式生產(chǎn)本蛋白質(zhì)的載體。該情況下，本載體可以在能夠在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中工作的啟動(dòng)子的調(diào)控下具備本基因。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用例如本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的各種質(zhì)粒等商業(yè)上能獲得的材料來構(gòu)建本載體。例如，除了可以利用質(zhì)?！唉薛ⅵ?21”、“ρΒΙ221”、“ρΒΙ10Γ，(均為 Clontech公司制造)等之外，還可以利用用于制作轉(zhuǎn)化植物體的在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)本基因的載體來構(gòu)建。
根據(jù)本說明書的公開內(nèi)容，還提供導(dǎo)入了這樣的表達(dá)載體的植物細(xì)胞等宿主細(xì)胞。另外，提供以本基因作為有效成分的、改變植物體或其一部分的產(chǎn)量的藥劑，更具體而言，提供改變植物的一級分枝數(shù)和/或著粒數(shù)的藥劑。本藥劑中，作為本基因，可以含有本載體作為有效成分。
(轉(zhuǎn)化植物體)
本說明書中公開的轉(zhuǎn)化植物體中，調(diào)控一級分枝數(shù)的基因的表達(dá)增強(qiáng)。增強(qiáng)的調(diào)控一級分枝數(shù)的基因可以是植物體的內(nèi)源基因，也可以是外源性基因。還可以是上述兩者。 另外，基因的表達(dá)增強(qiáng)是指，本基因的表達(dá)量(除本基因的一次轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的量以外，還有本基因編碼的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)量)與轉(zhuǎn)化前相比增加，或者該蛋白質(zhì)的活性與轉(zhuǎn)化前相比增強(qiáng)。本基因表達(dá)增強(qiáng)的結(jié)果是，本基因的表達(dá)量增加，同時(shí)本蛋白質(zhì)自身的活性增強(qiáng)。
本基因的表達(dá)增強(qiáng)的方式?jīng)]有特別限定。例如，可列舉以下方式能夠在植物細(xì)胞中工作的啟動(dòng)子和以能夠在該啟動(dòng)子的作用下工作的方式結(jié)合的本基因，以外源性DNA的形式保有在植物細(xì)胞的染色體中或染色體外。與啟動(dòng)子連接的本基因可以是植物細(xì)胞的內(nèi)源性基因，也可以是外源性基因。另外，還可列舉以下方式為了提高內(nèi)源性本基因的啟動(dòng)子的活性，對染色體上的整個(gè)該啟動(dòng)子區(qū)域或其一部分進(jìn)行取代等的方式；同時(shí)對內(nèi)源基因和啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行取代的方式。
典型地，本轉(zhuǎn)化植物體含有導(dǎo)入了本說明書中公開的載體的植物細(xì)胞，所述載體的意圖在于將本基因?qū)氲街参锛?xì)胞中并使其表達(dá)。
本轉(zhuǎn)化植物體可以通過由導(dǎo)入了本說明書中公開的載體而進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞使植物體再生來獲得。
植物細(xì)胞中的載體的導(dǎo)入可以使用聚乙二醇法、電穿孔法(electroporation)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法等本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的各種方法。例如，可列舉利用聚乙二醇向原生質(zhì)體中導(dǎo)入基因(Datta, S. K. (1995) In Gene Transfer To Plants (Potrykus I and Spangenberg Eds.)pp66_74)、利用電脈沖向原生質(zhì)體中導(dǎo)入基因(Toki et al. (1992) Plant Physiol. 100，1503-1507)、利用基因槍法向細(xì)胞中直接導(dǎo)入基因(Christou et al. (1991) Bio/technology, 9 :957-962.)以及借助農(nóng)桿菌而導(dǎo)入基因(Hiei et al. (1994) Plant J. 6 :271-282.)等各種方法。另外，由轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞再生植物體可以根據(jù)植物細(xì)胞的種類，利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行(參照iToki et al. (1995)Plant Physiol. 100 1503-1507)。例如，稻的情況下，可列舉 Fujimura 等(Plant Tissue Culture Lett. 2 74(1995))的方法；玉米的情況下，可列舉 Shillito 等(Bio/Technology 7:581(1989)) 的方法和Gorden-Kamm等(Plant Cell 2:603(1990))的方法；馬鈴薯的情況下，可列舉 Visser 等(Theor. Appl. Genet 78:594(1989))的方法；煙草的情況下，可列舉 Nagata 和 Takebe (Planta 99 :12(1971))的方法；擬南芥的情況下，可列舉Akama等(Plant Cell R印ortsl2 :7-11 (1992))的方法。
由轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞再生植物體，可以根據(jù)植物細(xì)胞的種類，利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行(參照 iToki et al. (1995)Plant Physiol. 100 1503-1507)。例如，對于稻而言，關(guān)于制作轉(zhuǎn)化植物體的手法，已經(jīng)建立了以下若干種技術(shù)利用聚乙二醇向原生質(zhì)體中導(dǎo)入基因，使植物體(適于印度型稻品種)再生的方法(Datta，S. K. (1995) In Gene Transfer To Plants (Potrykus I and Spangenberg Eds.) pp66~74)；禾1J用電脈7中向原生質(zhì)體中導(dǎo)入基因，使植物體(適于日本型稻品種)再生的方法(Toki et al. (1992)Plant Physiol. 100,1503-1507)；利用基因槍法向細(xì)胞中直接導(dǎo)入基因，使植物體再生的方法 (Christou et al. (1991)Bio/technology, 9 :957-962.)；以及借助農(nóng)桿菌導(dǎo)入基因，使植物體再生的方法(Hiei et al. (1994)Plant J. 6 :271-282.)；等，上述技術(shù)在本申請發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域中廣泛使用。本發(fā)明中，可以適當(dāng)?shù)厥褂眠@些方法。
如果獲得了基因組上重組有本基因的轉(zhuǎn)化植物體，則能夠由該植物體通過有性生殖或無性生殖而獲得后代。另外，還可以由該植物體或其后代或者克隆得到繁殖材料(例如，種子、果實(shí)、切穗、塊莖、塊根、根株、愈傷組織、原生質(zhì)體等)，基于上述繁殖材料批量生產(chǎn)該植物體。本說明書的公開內(nèi)容中包含已說明過的(1)導(dǎo)入了本基因的植物細(xì)胞、(2)含有該細(xì)胞的植物體，此外還包含C3)該植物體的后代和克隆、以及(4)該植物體、其后代和克隆的繁殖材料。
這樣制作出的植物體，賦予或提高了一級分枝數(shù)增加能力，著粒數(shù)和莖葉產(chǎn)量提尚ο
根據(jù)本說明書的公開內(nèi)容，提供包含序列號1所示的堿基序列或與其互補(bǔ)序列互補(bǔ)的至少15個(gè)連續(xù)堿基的多核苷酸。這里，“互補(bǔ)序列”是指與由A:T、G:C的堿基對構(gòu)成的雙鏈DNA的一個(gè)鏈的序列相對的另一個(gè)鏈的序列。另外，“互補(bǔ)的”并不限于在至少15個(gè)連續(xù)的核苷酸區(qū)域中完全為互補(bǔ)序列的情況，只要至少70%、優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選90%、 進(jìn)一步優(yōu)選95%以上的堿基序列具有同一性即可。這樣的DNA作為用于檢測和分離本基因的探針、或者作為用于進(jìn)行擴(kuò)增的弓I物是有用的。
(植物的一級分枝數(shù)的判斷方法)
根據(jù)本說明書的公開內(nèi)容，提供判斷植物的一級分枝數(shù)的增減的方法。即，提供一種植物的一級分枝數(shù)的判斷方法，其特征在于，包括在被測植物體或其一部分中實(shí)施本基因的表達(dá)分析的工序。本基因的表達(dá)分析可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法實(shí)施。例如，可以由被測植物體或其繁殖材料制備含有RNA的RNA試樣，利用逆轉(zhuǎn)錄酶由該試樣中的 RNA合成cDNA，基于其合成量評價(jià)表達(dá)量。例如，當(dāng)由表達(dá)分析得到的本基因的表達(dá)量少于看家基因或NP-12中的OsSPLH基因時(shí)，可以判斷該被測植物體的一級分枝數(shù)少、或者一級分枝數(shù)受到抑制。另外，當(dāng)上述表達(dá)量與看家基因或NP-12中的OsSPLH基因相同或更多時(shí)，可以判斷該被測植物體的一級分枝數(shù)多、或者一級分枝數(shù)增強(qiáng)。
表達(dá)分析中可以適當(dāng)使用例如利用上述探針或引物的DNA微陣列和實(shí)時(shí)PCR等公知的表達(dá)分析手法。本基因特別在穗中具有特異性表達(dá)的傾向，其中，在比較小的穗(典型地，小于10毫米、更優(yōu)選小于5毫米、進(jìn)一步優(yōu)選小于2毫米)中，具有表達(dá)量增大的傾向。 因此，通過對該部分進(jìn)行表達(dá)分析，也能夠判斷一級分枝數(shù)的增減。
需要說明的是，本發(fā)明中“判斷植物的著粒數(shù)的增減”不僅包含迄今所栽培的品種中的著粒數(shù)的增減的判斷，而且也包含通過雜交或基因重組技術(shù)得到的新品種中的著粒數(shù)的增減的判斷。
根據(jù)本判斷方法，例如在利用植物的雜交進(jìn)行品種改良時(shí)具有優(yōu)點(diǎn)。例如，在想要減少著粒數(shù)時(shí)等不希望導(dǎo)入使一級分枝數(shù)增加的性狀的情況下，可以避免與具有使一級分枝數(shù)增加的性質(zhì)的品種雜交，相反地，在想要增加著粒數(shù)時(shí)等希望導(dǎo)入使一級分枝數(shù)增加的性狀的情況下，可以與具有使一級分枝數(shù)增加的性質(zhì)的品種進(jìn)行雜交。另外，在從雜交后代個(gè)體中挑選所期望的個(gè)體時(shí)也有效。與通過其表型進(jìn)行判斷相比，在基因水平上判斷一級分枝數(shù)的增減更為簡便且可靠，因此本判斷方法在植物的品種改良方面能夠做出很大貢獻(xiàn)。
(有用作物的生產(chǎn)方法)
本說明書公開的有用作物的生產(chǎn)方法，包括下述工序栽培本轉(zhuǎn)化植物體的工序； 和收獲上述轉(zhuǎn)化植物體或其一部分的工序。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法，能夠得到著粒數(shù)和莖葉產(chǎn)量多的作物，能夠更多地收獲種子和莖葉。栽培工序和收獲工序均可以根據(jù)轉(zhuǎn)化植物體的種類而適當(dāng)設(shè)定。本生產(chǎn)方法中，轉(zhuǎn)化植物體為使種子著粒的稻科植物等以種子作為有用部分的植物時(shí)，能夠收獲更多的種子。另外，同時(shí)還能夠收獲稻秸。另外，轉(zhuǎn)化植物體以莖葉作為有用部分時(shí)，能夠收獲更多的莖葉。
(產(chǎn)量的調(diào)節(jié)方法)
根據(jù)本說明書的公開內(nèi)容，提供一種調(diào)節(jié)植物體或其一部分的產(chǎn)量的方法，其特征在于，在植物體中調(diào)節(jié)本基因的表達(dá)。根據(jù)本說明書所公開的調(diào)節(jié)方法，通過增強(qiáng)本基因的表達(dá)，能夠增加一級分枝數(shù)，增加種子或莖葉的產(chǎn)量。另外，通過抑制本基因的表達(dá)，能夠減少一級分枝數(shù)。為了在植物體中增強(qiáng)本基因的表達(dá)，如前所述，可列舉使用本說明書中公開的載體制作來轉(zhuǎn)化植物體。另外，為了在植物體中抑制本基因的表達(dá)，例如，可列舉對植物體的內(nèi)源本基因使用反義法、核酶法、共抑制、顯性失活等本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的植物體中的基因表達(dá)抑制方法。
(其他方式)
(植物體)
本說明書中公開的植物體的其他方式為下述植物體，其中，在第一 DNA本來的染色體上的基因位點(diǎn)或與該基因位點(diǎn)相當(dāng)?shù)奈恢蒙媳Ｓ邢率鯠NA區(qū)域，所述DNA區(qū)域包含編碼本蛋白質(zhì)的第一 DNA和位于該第一 DNA的上游的(g) (j)所述的第二 DNA，
(g)包含序列號3表示的堿基序列的DNA ；
(h)具有序列號3表示的堿基序列中一個(gè)或多個(gè)堿基被取代、缺失、添加和/或插入后的堿基序列、且具有使具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)的表達(dá)增強(qiáng)的活性的DNA ；
(i)在嚴(yán)格條件下與包含序列號3表示的堿基序列的DNA的互補(bǔ)鏈雜交、且具有使具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)的表達(dá)增強(qiáng)的活性的DNA ；
(j)具有與序列號3表示的堿基序列有70%以上的同一性(優(yōu)選為75%以上、更優(yōu)選為80%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為85%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為90%以上、更進(jìn)一步優(yōu)選為95% 以上、再進(jìn)一步優(yōu)選為98%以上、最優(yōu)選為99%以上)的堿基序列、且具有使具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)的表達(dá)增強(qiáng)的活性的DNA。
上述(h)的DNA中，堿基的突變(取代、缺失、添加和/或插入)的個(gè)數(shù)和種類沒有特別限定。另外，關(guān)于上述(j)的DNA中的同一性，已經(jīng)進(jìn)行了說明。另外，具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)是指已說明過的本蛋白質(zhì)。關(guān)于上述(h) (j)的DNA，可列舉在 NP-12那樣一級分枝數(shù)多的稻等植物體的發(fā)育階段中觀察到本蛋白質(zhì)的表達(dá)量增加時(shí)，在該植物體的染色體上的本蛋白質(zhì)的上游側(cè)存在的DNA。另外，上述(h) (j)中，關(guān)于序列號3表示的堿基序列中含有的后述的單核苷酸多態(tài)性部點(diǎn)，優(yōu)選不具有取代等突變。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)本基因與NP-12中的一級分枝數(shù)的增加有關(guān)。此外，還發(fā)現(xiàn)位于其上游區(qū)域的2. 6kb的區(qū)域與本基因的表達(dá)的增強(qiáng)有關(guān)。NP-12中的該2. 6kb區(qū)域本身與日本型稻“日本晴”相同。但是，NP-12中，在該2. 6kb區(qū)域的上游側(cè)和其下游側(cè)共計(jì)具有5個(gè)單堿基取代(單核苷酸多態(tài)性)。NP-12中，一級分枝數(shù)的增加被認(rèn)為是由于該基因的表達(dá)量在植物體的生長期高表達(dá)。因此，通過在NP-12以外的稻科植物等植物體的染色體上的本基因的上游側(cè)具備來源于NP-12的該上游區(qū)域、即至少包含2. 6kb區(qū)域和與其兩端鄰接的含有2個(gè)單堿基取代的區(qū)域的區(qū)域，能夠?qū)崿F(xiàn)NP-12那樣的一級分枝數(shù)的增加或產(chǎn)量的增加。另外，也可以在本基因的上游區(qū)域具備在上述2. 6kb區(qū)域前后的上述2個(gè)單堿基取代的基礎(chǔ)上還含有3個(gè)單堿基取代的共計(jì)含有5個(gè)單堿基取代的區(qū)域。
用于規(guī)定第二 DNA的序列號3表示的堿基序列來源于NP-12，是包含上述2. 6kb區(qū)域、且包含與其5’末端鄰接的1個(gè)堿基和與其3’末端鄰接的1個(gè)堿基的區(qū)域。該堿基序列是包含序列號4表示的2591bp的堿基序列即上述2. 6kb的區(qū)域的5’末端的第2個(gè)單堿基取代(C — T)和第3個(gè)單堿基取代(G — A)的、由2593bp構(gòu)成的堿基序列。
此外，第二 DNA也可以是由包含上述2. 61Λ在內(nèi)的、含有全部單核苷酸多態(tài)性的約 41Λ的堿基序列(序列號5)構(gòu)成的DNA。需要說明的是，2. 61Λ區(qū)域相當(dāng)于序列號5表示的堿基序列的第30位至第沈20位。雖然5個(gè)單堿基取代對該2. 6kb區(qū)域有何種影響還未必明確，但認(rèn)為與2. 6kb區(qū)域最近的第2個(gè)和第3個(gè)單核苷酸多態(tài)性與NP-12中的一級分枝數(shù)增加有關(guān)。
另外，序列號5表示的堿基序列中的單堿基取代位點(diǎn)如下所述。需要說明的是，取代前的喊基根據(jù)將 Oryza sativa、Japonica Group DNA、chromosome 8、complete sequence，cultivar，Nipponbare (稻、日本型品種組DNA、8號染色體、完整序列、栽培品種、 日本晴)(登記號:NC_008401. 2)中公開的序列和來源于NP-12的序列利用Blast進(jìn)行比對的結(jié)果而得到。
(1)1 —T
(2)29 :C ^ T
(3)2621 —A
(4)3474 —T
(5)3827 —T
另外，作為第二 DNA，也可以為下述的DNA。需要說明的是，下述(1) (η)的DNA 中，關(guān)于序列號5表示的堿基序列中所含的上述5個(gè)單核苷酸多態(tài)性部點(diǎn)，優(yōu)選不具有取代等突變。
(k)包含序列號5表示的堿基序列的DNA ；
(1)具有序列號5表示的堿基序列中一個(gè)或多個(gè)堿基被取代、缺失、添加和/或插入后的堿基序列、且具有使具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)的表達(dá)增強(qiáng)的活性的DNA ；
(m)在嚴(yán)格條件下與包含序列號5表示的堿基序列的DNA的互補(bǔ)鏈雜交、且具有使具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)的表達(dá)增強(qiáng)的活性的DNA ；
(η)具有與序列號5表示的堿基序列有70%以上的同一性(優(yōu)選為75%以上、更優(yōu)選為80%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為85%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為90%以上、更進(jìn)一步優(yōu)選為95% 以上、再進(jìn)一步優(yōu)選為98%以上、最優(yōu)選為99%以上)的堿基序列、且具有使具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)的表達(dá)增強(qiáng)的活性的DNA。
作為包含第二 DNA、并且還包含第一 DNA的DNA區(qū)域，可列舉例如包含序列號6和序列號7表示的堿基序列的DNA。
本植物體在植物體中本基因的本來的染色體上的基因位點(diǎn)或與該基因位點(diǎn)相當(dāng)?shù)奈恢蒙媳Ｓ羞@樣的DNA區(qū)域。此處，本基因的本來的染色體上的基因位點(diǎn)是指，在植物體原本具有本基因或其同源基因的情況下，該基因固有的染色體上的基因位點(diǎn)。另外，與本來的染色體上的基因位點(diǎn)相當(dāng)?shù)奈恢孟喈?dāng)于下述情況雖然與基因位點(diǎn)不完全一致，但位于從該DNA區(qū)域前后的堿基序列到基因位點(diǎn)的附近的、不妨礙第二 DNA的本基因表達(dá)增強(qiáng)活性的位置上。本植物體優(yōu)選為染色體上預(yù)先具備內(nèi)源性的本基因的植物體。例如，在稻的情況下，OsSPLH基因及其同源基因的基因位點(diǎn)在8號染色體上。需要說明的是，已知本基因、即稻中的Os SPL14共同存在于蜀黍、小麥、玉米和擬南芥中。
本植物體是否具備這樣的DNA區(qū)域可以通過對包含第二 DNA的堿基序列的DNA區(qū)域進(jìn)行PCR并檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的有無及其長度等來確認(rèn)。另外，這樣的DNA區(qū)域是否位于該基因位點(diǎn)上可以通過公知的堿基序列確定法來確認(rèn)。
本植物體例如可以是ΝΡ-12那樣的已經(jīng)作為固定種而存在的植物體，也可以是 ΝΡ-12以外的植物體，可以是與ΝΡ-12雜交得到的雜交種或其后代。后代可以是通過雜交育種而建立的固定種。另外，本植物體可以是通過基因操作進(jìn)行育種而得到的轉(zhuǎn)化體，也可以是該轉(zhuǎn)化體的后代。該后代可以是由轉(zhuǎn)化體通過雜交育種而得到的植物體。
本植物體除了可以通過基因重組和基因打靶的方法獲取之外，還可以通過雜交來獲取。利用雜交，例如，通過ΝΡ-12與其他植物體的受精時(shí)的同源重組，能夠得到在本基因的本來的染色體上的位置或與該位置相當(dāng)?shù)奈恢蒙媳Ｓ猩鲜鯠NA區(qū)域的Fl代。通過利用 F2代、回交等，能夠得到本DNA區(qū)域(等位基因)的純合體。就包含本DNA區(qū)域的等位基因而言，本植物體在本基因的基因位點(diǎn)上也可以為雜合體，但優(yōu)選為純合體。
本植物體可以是稻所屬的單子葉植物，但優(yōu)選為稻和稻以外的其他稻科植物(例如，小麥、大麥、玉米、甘蔗、蜀黍等)。
本植物體本身作為一級分枝數(shù)多的植物體、或者包括植物體或其種子在內(nèi)的產(chǎn)量多的植物體有用。另外，本植物體作為用于育種的親代品種也是有用的。
(植物體的制作方法)
本說明書中公開的植物體的制作方法可以包括下述工序使原品種植物體與其他植物體雜交，所述原品種植物體在第一 DNA本來的染色體上的基因位點(diǎn)上保有下述DNA區(qū)域，所述DNA區(qū)域包含編碼上述(a) (f)中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)的第一DNA和位于該第一 DNA的上游的上述(g) (j)所述的第二 DNA，從而制作在上述第一 DNA本來所位于的基因位點(diǎn)或與該基因位點(diǎn)相當(dāng)?shù)奈恢蒙媳Ｓ猩鲜鯠NA區(qū)域的新品種植物體。根據(jù)本制作方法， 能夠得到一級分枝數(shù)增加、或產(chǎn)量增加的植物體。原品種植物體除了可以為NP-12之外，還可以為表現(xiàn)同樣方式的其他植物體。另外，作為其他植物體，優(yōu)選為不具有上述第二DNA、但具有上述第一 DNA即本基因的植物體。其他植物體優(yōu)選為單子葉植物，更優(yōu)選為稻科植物。 進(jìn)一步優(yōu)選為稻。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)已經(jīng)公知的技術(shù)實(shí)施原品種植物體與其他植物體的雜交。雜交所得到的植物體的挑選可以通過對選自上述第二 DNA中所含的5個(gè)單核苷酸多態(tài)性中的1種或2種以上進(jìn)行檢測來實(shí)施。即，可以將第二 DNA的堿基序列的至少一部分、更具體而言將包含選自該堿基序列中所含的5個(gè)單核苷酸多態(tài)性中的1種或2種以上的區(qū)域作為一級分枝數(shù)多、著粒數(shù)多的植物體的育種的良好標(biāo)記來使用。該區(qū)域可以是序列號3、 序列號5、序列號6和序列號7表示的堿基序列中的、包含5個(gè)單核苷酸多態(tài)性中的1個(gè)以上的堿基序列所構(gòu)成的DNA。
單核苷酸多態(tài)性的檢出可以通過例如PCR、雜交、序列分析等、以及它們的組合來適當(dāng)?shù)貙?shí)現(xiàn)。引物和探針可以根據(jù)序列號3 7中任一項(xiàng)所示的序列適當(dāng)?shù)卦O(shè)計(jì)。
另外，根據(jù)本說明書的公開內(nèi)容，提供一種育種用的DNA片段，其具備包含上述第一 DNA和位于該第一 DNA的上游的上述第二 DNA的DNA區(qū)域。這樣的DNA片段、即具有 NP-12中的堿基序列上的特征的OsSPLH等位基因是與一級分枝數(shù)和著粒數(shù)的增加相關(guān)的重要的育種用等位基因(DNA片段)。
根據(jù)本說明書的公開內(nèi)容，提供一種育種用的DNA片段，其具備上述第二 DNA。上述第二DNA本身作用于與日本晴的堿基序列相同的NP-12的0sSPL14，有助于一級分枝數(shù)和著粒數(shù)的增加。因此，可以說該DNA片段本身是對于育種有用的DNA片段。
根據(jù)本說明書的公開內(nèi)容，提供上述DNA區(qū)域、例如名古屋大學(xué)保藏系統(tǒng)稻NP-12 的8號染色體中的上述DNA區(qū)域在一級分枝數(shù)增加或產(chǎn)量增加的其他方式的植物體的制作中的應(yīng)用。因此，根據(jù)本說明書的公開內(nèi)容，提供一種植物體的生產(chǎn)方法，其中，包括下述工序栽培這種其他方式的植物體的工序；和收獲上述其他方式的植物體或其一部分的工序。
實(shí)施例
以下，舉出實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行具體說明，但這些實(shí)施例并不用于限定本發(fā)明。
實(shí)施例1
(調(diào)控一級分枝數(shù)的基因的鑒定)
作為要進(jìn)行QTL分析的雜種群體的親代，將一級分枝數(shù)之差明確的日本型稻“日本晴”作為栽培種，選擇印度型稻“NP-12” (國立大學(xué)法人名古屋大學(xué)的保藏系統(tǒng))作為豐產(chǎn)性種(圖1)。另外，將植物體在皮氏(《卜U )培養(yǎng)皿內(nèi)的水中在30°C下處理72小時(shí)， 使其發(fā)芽后，移植到直徑10cm、高度13cm的罐中。籽粒充實(shí)后，測定一級分枝數(shù)。
對“日本晴”和“NP-12”雜交而成的Fl個(gè)體的自交所得到的3200個(gè)體的F2群體進(jìn)行QTL分析。結(jié)果如圖2所示，在第一染色體短臂和第8染色體長臂中檢測出調(diào)控一級分枝數(shù)的基因位點(diǎn)。這些QTL中，第8染色體長臂中的一級分枝增加效果更強(qiáng)。
為了確定第8染色體上的QTL，使用F2群體的后代F3代進(jìn)行定位克隆法。結(jié)果示于圖3。
如圖3所示，可以將NP-12所具有的使一級分枝數(shù)增加的基因、Wealthy farmer's panicle (WFP)基因的候選區(qū)域確定在0sSPL14基因的基因上游區(qū)域2. 61Λ。由于WFP基因的候選區(qū)域確定在0sSPL14基因上游區(qū)域，因此推測NP-12中的該區(qū)域的突變會使0sSPL14 基因的表達(dá)量發(fā)生變化。
如圖1所示，在上述2. 6kb的上游和下游，與日本晴中的同樣的堿基序列相比具有 5個(gè)單堿基取代。各個(gè)取代位點(diǎn)所附的數(shù)值表示距離日本晴的0s08g0509600的mRNA (登記號ΝΜ_001068739)的最開始的堿基的位置。
接著，在穗的不同發(fā)育階段，對日本晴和NP-12中的OsSPLH基因的表達(dá)量進(jìn)行比較。結(jié)果示于圖4。另外，關(guān)于表達(dá)分析，使用Trizol (irwitrogen)提取RNA，使用 Omniscript(QIAGEN)合成 cDNA。使用 CYBR Green RT-PCR試劑盒 ^jIAGEN)作為熒光試劑， 使用Light Cycler ( 口制造)作為檢測裝置，對該cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，以O(shè)sUbiquitin 作為內(nèi)標(biāo)基因來對表達(dá)量進(jìn)行定量。
如圖4所示，可知與日本晴相比，NP-12中穗的發(fā)育階段初期的表達(dá)量顯著提高。 由該結(jié)果推測在豐產(chǎn)稻NP-12的使一級分枝數(shù)增加的基因、WFP基因中，因OsSPLH基因上游區(qū)域的突變而產(chǎn)生的OsSPLH基因的高表達(dá)等位基因是原因基因。
實(shí)施例2
為了對其進(jìn)行證明，嘗試了將來源于NP-12的OsSPLH基因?qū)氲饺毡厩缰?。艮口?以下述方式構(gòu)建轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒并進(jìn)行轉(zhuǎn)化。對所得到的轉(zhuǎn)化植物體的一級分枝數(shù)進(jìn)行評價(jià)。 結(jié)果示于圖5。
(質(zhì)粒的構(gòu)建和植物體的轉(zhuǎn)化)
為了制作導(dǎo)入有NP-12的0sSPL14基因的轉(zhuǎn)化體，分離出0sSPL14并導(dǎo)入到雙元載體pYLTAC7(理化學(xué)研究所提供)中。通過電穿孔將該雙元載體導(dǎo)入到農(nóng)桿菌EHA105株中° 根據(jù)文獻(xiàn)(Hiei, Y. , Ohta, S. , Komari, T. &Kumashiro, Τ. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant J. 6，271-282 (1994).)記載的方法對稻進(jìn)行轉(zhuǎn)化。簡要地來說明，使導(dǎo)入有DNA片段的農(nóng)桿菌EHA105株感染日本晴的愈傷組織從而將其導(dǎo)入，利用含有50mg/l潮霉素的培養(yǎng)基來挑選轉(zhuǎn)化植物體。將抗潮霉素的植物體移植到土壤中，在 30°C、16小時(shí)明期/8小時(shí)暗期的條件下進(jìn)行栽培。
如圖5所示，僅轉(zhuǎn)化了 TAC7載體的個(gè)體形成了約10條一級分枝，與此相對，導(dǎo)入有來源于NP-12的0sSPL14基因的個(gè)體(NP-12 SPL14)形成了約17條一級分枝。由該結(jié)果可作出如下結(jié)論0sSPL14基因?yàn)槭挂患壏种?shù)增加的基因WFP。另外，在導(dǎo)入有來源于日本晴的OsSPLH基因的個(gè)體(Nip: :SPL14)中，一級分枝數(shù)也增加。由該結(jié)果可以認(rèn)為， OsSPLH基因通過增加基因的拷貝數(shù)也可增強(qiáng)該基因的效果。
實(shí)施例3
本實(shí)施例中，就收獲粒量來評價(jià)8號染色體上的QTL (2. 61Λ區(qū)域)和1號染色體上的QTL的效果。將日本晴和NP-12雜交后，進(jìn)而與日本晴回交兩次，所得到的4種BC2F2 的基因型示于圖6。用紅線的圈表示來源于NP-12的1號染色體上的QTL和8號染色體上的QTL。需要說明的是，本實(shí)施例中，8號染色體上的QTL含有52. 6kb區(qū)域，其中，使用包含 5個(gè)單堿基取代的區(qū)域作為標(biāo)記。對于這四種植物體，測定每個(gè)主穗的一級分枝數(shù)，其結(jié)果， 將平均每個(gè)主穗的粒數(shù)和平均每個(gè)植物體的粒數(shù)分別示于圖7、圖8和圖9。另外，4種植物體分別使用40個(gè)個(gè)體。
如圖7 圖9所示，8號染色體上的0sSPL14與一級分枝數(shù)和粒數(shù)的約40%的增加有關(guān)。此外，具有來源于NP-12的1號染色體上的QTL和8號染色體上的OsSPLH的植物體中，每個(gè)主穗的一級分枝數(shù)為23. 8，相同地每個(gè)主穗的粒數(shù)為272. 2，而且每個(gè)植物體的總粒數(shù)為3396。即，與兩種QTL均來源于日本晴的植物體的上述分枝數(shù)為11. 8的情況相比，增加了 12.2。另外，與兩種QTL均來源于日本晴的植物體的上述總粒數(shù)為2232的情況相比，增加了 1164(54% )0
由此可見，來源于NP-12的8號染色體上的OsSPLH等位基因具有很強(qiáng)的粒數(shù)增加效果。另外，由以上結(jié)果可知，包含2. 6kb區(qū)域和與該2. 6kb的末端鄰接的2個(gè)單堿基取代的堿基序列(序列號幻具有很強(qiáng)的粒數(shù)增加效果，確定了對育種有用的等位基因，同時(shí)是有用的標(biāo)記。
另外，如圖10所示，關(guān)于8號染色體上的QTL，對日本晴與NP-12的雜合體評價(jià)了每個(gè)主穗的一級分枝數(shù)，結(jié)果該雜合體的一級分枝數(shù)顯示出與8號染色體上的QTL相關(guān)的2 種純合體的中間值，由此可知來源于NP-12的8號染色體上的QTL(0sSPL14等位基因)為半顯性。
實(shí)施例4
對日本晴和NP12中的該2. 6kb的序列進(jìn)行了比較，結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)任何不同點(diǎn)。并且進(jìn)行了該區(qū)域的表達(dá)分析，但在日本晴和NP-12中均沒有檢測出表達(dá)。另外，在數(shù)據(jù)庫中，也沒能發(fā)現(xiàn)它們在兩種植物中的轉(zhuǎn)錄的根據(jù)。
不依賴于DNA序列的變化的基因表達(dá)中的遺傳性差異被定義為表觀遺傳等位基因。在擬南芥和稻中報(bào)道了表觀遺傳等位基因。為了確認(rèn)內(nèi)源性的OsSPLH啟動(dòng)子中的遺傳性的表觀遺傳標(biāo)記是否與OsSPLH的表達(dá)水平的差異相關(guān)，通過該區(qū)域的亞硫酸氫鹽 (亞硫酸氫鈉)序列分析評價(jià)了甲基化水平。單鏈DNA上的胞嘧啶通過亞硫酸氫鈉而發(fā)生磺化、水解脫氨基化反應(yīng)，接著進(jìn)行脫磺化，由此轉(zhuǎn)變成尿嘧啶(U)。另一方面，甲基化胞嘧啶保持甲基化胞嘧啶的狀態(tài)而不發(fā)生轉(zhuǎn)變。因此，如果使用亞硫酸氫鹽處理后的DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增并讀取堿基序列，則可以將甲基化胞嘧啶位點(diǎn)讀為C，將非甲基化胞嘧啶位點(diǎn)讀為T，從而區(qū)別開來。
關(guān)于亞硫酸氫鹽序列分析，利用EpiTect亞硫酸氫鹽試劑盒OjIAGEN 59104)，對由日本晴和NP-12提取出的基因組DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理。使用亞硫酸氫鹽化的引物擴(kuò)增2. 6kb區(qū)域，并克隆到pCr-4載體中。至少對M個(gè)克隆進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基序列的分析。 所使用的亞硫酸氫鹽化引物的序列如下所示。
表 1
結(jié)果，在整個(gè)2. 6kb區(qū)域中，日本晴和NP-12的DNA甲基化水平?jīng)]有大的差異。另一方面，如圖11所示，2. 6kb區(qū)域中1070位堿基附近的若干胞嘧啶，在兩者之間存在甲基化水平的差異。即，NP-12的甲基化水平為0 對％，與此相對，在日本晴中觀察到更高水平、即68 79%的甲基化水平。
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)化植物體，其中，編碼下述(a) (f)中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)增強(qiáng)，(a)包含序列號2表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(b)具有序列號2表示的氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入后的氨基酸序列、且具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)；(c)具有與序列號2表示的氨基酸序列有70%以上的同一性的氨基酸序列、且具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)；(d)由包含序列號1表示的堿基序列的DNA編碼的蛋白質(zhì)；(e)由在嚴(yán)格條件下與包含序列號1表示的堿基序列的多核苷酸的互補(bǔ)鏈雜交的DNA 編碼、且具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)；(f)由與序列號1表示的堿基序列具有70%以上的同一性的DNA編碼、且具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)化植物體，其中，所述蛋白質(zhì)來源于稻科植物。
3.如權(quán)利要求1或2所述的轉(zhuǎn)化植物體，其中，所述轉(zhuǎn)化植物體為稻科植物。
4.一種載體，其中，為了增強(qiáng)編碼下述(a) (f)中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)而保有所述基因的至少一部分，(a)包含序列號2表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(b)具有序列號2表示的氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入后的氨基酸序列、且具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)；(c)具有與序列號2表示的氨基酸序列有70%以上的同一性的氨基酸序列、且具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)；(d)由包含序列號1表示的堿基序列的DNA編碼的蛋白質(zhì)；(e)由在嚴(yán)格條件下與包含序列號1表示的堿基序列的多核苷酸的互補(bǔ)鏈雜交的DNA 編碼、且具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)；(f)由與序列號1表示的堿基序列具有70%以上的同一性的DNA編碼、且具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)。
5.一種植物細(xì)胞，其導(dǎo)入了權(quán)利要求4所述的載體。
6.一種轉(zhuǎn)化植物體，其含有權(quán)利要求5所述的植物細(xì)胞。
7.一種轉(zhuǎn)化植物體，其為權(quán)利要求1 3或6所述的轉(zhuǎn)化植物體的后代或克隆。
8.權(quán)利要求1 3、6或7所述的轉(zhuǎn)化植物體的繁殖材料。
9.一種轉(zhuǎn)化植物體的制作方法，其中，包括下述工序使用權(quán)利要求4所述的載體將所述基因?qū)胫参锛?xì)胞中，由該植物細(xì)胞使植物體再生。
10.一種有用作物的生產(chǎn)方法，其中，包括下述工序栽培權(quán)利要求1 3、6或7所述的轉(zhuǎn)化植物體的工序；和收獲所述轉(zhuǎn)化植物體或其一部分的工序。
11.一種植物體或其一部分的產(chǎn)量的調(diào)節(jié)方法，其特征在于，在植物體中，對編碼下述 (a) (f)中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)量進(jìn)行調(diào)節(jié)，(a)包含序列號2表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(b)具有序列號2表示的氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入后的氨基酸序列、且具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)；(c)具有與序列號2表示的氨基酸序列有70%以上的同一性的氨基酸序列、且具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)；(d)由包含序列號1表示的堿基序列的DNA編碼的蛋白質(zhì)；(e)由在嚴(yán)格條件下與包含序列號1表示的堿基序列的多核苷酸的互補(bǔ)鏈雜交的DNA 編碼、且具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)；(f)由與序列號1表示的堿基序列具有70%以上的同一性的DNA編碼、且具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)。
12.一種改變植物體或其一部分的產(chǎn)量的藥劑，其以編碼下述(a) (f)中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)的基因作為有效成分，(a)包含序列號2表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(b)具有序列號2表示的氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入后的氨基酸序列、且具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)；(c)具有與序列號2表示的氨基酸序列有70%以上的同一性的氨基酸序列、且具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)；(d)由包含序列號1表示的堿基序列的DNA編碼的蛋白質(zhì)；(e)由在嚴(yán)格條件下與包含序列號1表示的堿基序列的多核苷酸的互補(bǔ)鏈雜交的DNA 編碼、且具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)；(f)由與序列號1表示的堿基序列具有70%以上的同一性的DNA編碼、且具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)。
13.一種植物體，其中，在第一 DNA本來所位于的基因位點(diǎn)或與該基因位點(diǎn)相當(dāng)?shù)奈恢蒙媳Ｓ邢率鯠NA區(qū)域，所述DNA區(qū)域包含編碼下述(a) (f)中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)的第一 DNA和位于該第一 DNA的上游的下述(g)或(h)所述的第二 DNA，(a)包含序列號2表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(b)具有序列號2表示的氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入后的氨基酸序列、且具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)；(c)具有與序列號2表示的氨基酸序列有70%以上的同一性的氨基酸序列、且具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)；(d)由包含序列號1表示的堿基序列的DNA編碼的蛋白質(zhì)；(e)由在嚴(yán)格條件下與包含序列號1表示的堿基序列的多核苷酸的互補(bǔ)鏈雜交的DNA 編碼、且具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)；(f)由與序列號1表示的堿基序列具有70%以上的同一性的DNA編碼、且具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)；(g)包含序列號3表示的堿基序列的DNA；(h)具有序列號3表示的堿基序列中一個(gè)或多個(gè)堿基被取代、缺失、添加和/或插入后的堿基序列、且具有使具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)的表達(dá)增強(qiáng)的活性的DNA。
14.如權(quán)利要求13所述的植物體，其中，所述植物體為單子葉植物。
15.如權(quán)利要求14所述的植物體，其中，所述單子葉植物為稻科植物。
16.一種植物體的制作方法，其中，包括下述工序使原品種植物體與其他植物體雜交，所述原品種植物體在第一 DNA本來所位于的基因位點(diǎn)或與該基因位點(diǎn)相當(dāng)?shù)奈恢蒙媳Ｓ邢率鯠NA區(qū)域，所述DNA區(qū)域包含編碼下述(a) (f)中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)的第一 DNA 和位于該第一 DNA的上游的下述(g)或(h)所述的第二 DNA，從而制作在所述第一 DNA本來所位于的基因位點(diǎn)或與該基因位點(diǎn)相當(dāng)?shù)奈恢蒙媳Ｓ兴鯠NA區(qū)域的新品種植物體，(a)包含序列號2表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(b)具有序列號2表示的氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入后的氨基酸序列、且具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)；(c)具有與序列號2表示的氨基酸序列有70%以上的同一性的氨基酸序列、且具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)；(d)由包含序列號1表示的堿基序列的DNA編碼的蛋白質(zhì)；(e)由在嚴(yán)格條件下與包含序列號1表示的堿基序列的多核苷酸的互補(bǔ)鏈雜交的DNA 編碼、且具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)；(f)由與序列號1表示的堿基序列具有70%以上的同一性的DNA編碼、且具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)；(g)包含序列號3表示的堿基序列的DNA；(h)具有序列號3表示的堿基序列中一個(gè)或多個(gè)堿基被取代、缺失、添加和/或插入后的堿基序列、且具有使具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)的表達(dá)增強(qiáng)的活性的DNA。
17.如權(quán)利要求16所述的制作方法，其中，將包含所述第二DNA的至少一部分的DNA作為標(biāo)記來挑選所述新品種植物體。
18.一種育種標(biāo)記，其包含下述(g)或(h)所述的DNA的至少一部分，(g)包含序列號3表示的堿基序列的DNA；(h)具有序列號3表示的堿基序列中一個(gè)或多個(gè)堿基被取代、缺失、添加和/或插入后的堿基序列、且具有使具有一級分枝數(shù)增加活性的蛋白質(zhì)的表達(dá)增強(qiáng)的活性的DNA。
全文摘要
本說明書的公開的目的在于與植物體的一級分枝數(shù)相關(guān)的基因的分離和鑒定以及該基因的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)該目的，本發(fā)明分離出了編碼包含序列號2表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因作為與植物體的一級分枝數(shù)相關(guān)的基因。通過利用該基因，能夠容易地創(chuàng)造出一級分枝數(shù)多、著粒數(shù)多的植物。
文檔編號C12N15/00GK102498208SQ20108004146
公開日2012年6月13日 申請日期2010年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月16日
發(fā)明者三浦孝太郎, 北野英己, 蘆苅基行 申請人:國立大學(xué)法人名古屋大學(xué)