專(zhuān)利名稱(chēng)：核酸擴(kuò)增方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸擴(kuò)增方法，特別是使用經(jīng)化學(xué)修飾的引物和環(huán)狀單鏈DNA的組合的核酸擴(kuò)增方法、利用上述方法檢測(cè)是否存在目標(biāo)基因的方法以及在上述方法中使用的檢測(cè)用試劑盒。
背景技術(shù)：
現(xiàn)在，在研究機(jī)構(gòu)、醫(yī)療機(jī)構(gòu)、檢查機(jī)構(gòu)及其它各種現(xiàn)場(chǎng)，基于目標(biāo)基因的特異性堿基序列的分析方法和檢測(cè)方法被廣泛使用。例如，在分析和檢測(cè)人和動(dòng)物等生物體來(lái)源的試樣(體液或細(xì)胞片)或來(lái)源于環(huán)境的試樣中所含的病原菌、霉菌、螨等過(guò)敏原等病原性的微生物和微小動(dòng)物、病毒和花粉等的存在時(shí)，也采用了檢測(cè)這些檢測(cè)對(duì)象所具有的目標(biāo)基因的特異性堿基序列的方法。檢測(cè)這些核酸(DNA、RNA)的方法與檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法相比，能夠在短時(shí)間內(nèi)以高靈敏度進(jìn)行。而且，即使試樣中原本所含的核酸量在檢出限 (detection limit)以下，也可以使用無(wú)細(xì)胞系較為簡(jiǎn)單且特異性地?cái)U(kuò)增。由于這些優(yōu)點(diǎn)， 利用擴(kuò)增核酸的方法或與擴(kuò)增核酸的方法組合來(lái)檢測(cè)目標(biāo)基因中的特異性堿基序列的方法被廣泛開(kāi)發(fā)。目前，作為最常用的核酸擴(kuò)增方法，可以列舉利用溫度循環(huán)進(jìn)行數(shù)十次的模板的變性、引物與模板的退火、DNA聚合酶延伸反應(yīng)的循環(huán)，從而擴(kuò)增夾在引物對(duì)之間區(qū)域的核酸的PCR法。但是，在利用溫度循環(huán)擴(kuò)增核酸的方法中，存在用于控制溫度循環(huán)的機(jī)器(熱循環(huán)儀等)價(jià)格高、需要對(duì)核酸擴(kuò)增的最佳溫度循環(huán)進(jìn)行研究和設(shè)定等問(wèn)題，因此近年來(lái)開(kāi)始考慮不利用溫度循環(huán)而在一定溫度條件下進(jìn)行DNA聚合酶延伸反應(yīng)的核酸擴(kuò)增方法。其代表性的方法可列舉LAMP(環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，Loop-Mediated Isothermal Amplification)法(專(zhuān)利文獻(xiàn)1)，除此之外，為了克服成本、檢測(cè)方法的設(shè)計(jì)和操作、檢測(cè)靈敏度等問(wèn)題，還正在開(kāi)發(fā)利用與環(huán)狀單鏈DNA的組合的核酸擴(kuò)增方法(專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。但是，即使利用上述方法，在試樣中所含有的檢測(cè)對(duì)象核酸為微量的情況下，也存在檢測(cè)靈敏度未必充分的情況。因此，需要擴(kuò)增效率和檢測(cè)靈敏度進(jìn)一步提高的新的核酸擴(kuò)增方法和檢測(cè)方法。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)1 國(guó)際公開(kāi)第2000/28082號(hào)小冊(cè)子專(zhuān)利文獻(xiàn)2 國(guó)際公開(kāi)第2008/(^6719號(hào)小冊(cè)子

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問(wèn)題本發(fā)明的目的在于提供一種基于新原理的核酸擴(kuò)增方法，該方法能夠簡(jiǎn)便地且在短時(shí)間內(nèi)高效擴(kuò)增具有特定堿基序列的核酸；另外提供利用了該方法的核酸檢測(cè)方法。用于解決問(wèn)題的方案
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，對(duì)具有特異性堿基序列的模板核酸分子，通過(guò)使用具有與上述堿基序列的3’端側(cè)相鄰的區(qū)域的互補(bǔ)堿基序列且3’端經(jīng)化學(xué)修飾的引物以及含有上述特異性堿基序列的環(huán)狀單鏈DNA的組合，連鎖地進(jìn)行DNA聚合酶延伸反應(yīng)，能夠解決上述課題， 由此完成了本申請(qǐng)發(fā)明。S卩，本發(fā)明提供一種核酸擴(kuò)增方法，其特征在于，包括(a)使用含有擴(kuò)增對(duì)象堿基序列的模板DNA、和包含具有與上述堿基序列的3’端側(cè)相鄰的區(qū)域的互補(bǔ)堿基序列且3’端經(jīng)化學(xué)修飾的引物的引物對(duì)來(lái)進(jìn)行DNA聚合酶延伸反應(yīng)，得到直鏈狀DNA片段；和(b)以含有擴(kuò)增對(duì)象堿基序列的環(huán)狀單鏈DNA作為模板，以由(a)得到的直鏈狀 DNA片段的3’端作為復(fù)制起點(diǎn)，進(jìn)行鏈取代型DNA聚合酶延伸反應(yīng)。另外，本發(fā)明提供一種核酸擴(kuò)增用試劑盒，其含有(i)包含具有與擴(kuò)增對(duì)象堿基序列的3’端側(cè)相鄰的區(qū)域的互補(bǔ)堿基序列且3’端經(jīng)化學(xué)修飾的引物的引物對(duì)；(ii)含有擴(kuò)增對(duì)象堿基序列的環(huán)狀單鏈DNA ；(iii)鏈取代型DNA聚合酶；(iv)dNTP。另外，本發(fā)明提供一種檢測(cè)雙鏈的目標(biāo)核酸分子的方法，其包括(a)在檢測(cè)對(duì)象試樣中添加包含具有與目標(biāo)核酸分子的目標(biāo)堿基序列的3’端側(cè)相鄰的區(qū)域的互補(bǔ)堿基序列且3’端經(jīng)化學(xué)修飾的引物的引物對(duì)、含有目標(biāo)堿基序列的環(huán)狀單鏈DNA、鏈取代型DNA聚合酶和dNTP，在上述鏈取代型DNA聚合酶具有活性的溫度下進(jìn)行酶反應(yīng)；(b)確認(rèn)在進(jìn)行了酶反應(yīng)的試樣中核酸是否被擴(kuò)增；和(c)在核酸被擴(kuò)增時(shí)，確定檢測(cè)對(duì)象試樣中存在雙鏈的目標(biāo)核酸分子。另外，本發(fā)明提供一種檢測(cè)單鏈的目標(biāo)核酸分子的方法，其包括(a)在檢測(cè)對(duì)象試樣中添加具有與目標(biāo)核酸分子的目標(biāo)堿基序列的3’端側(cè)相鄰的區(qū)域的互補(bǔ)堿基序列且3’端經(jīng)化學(xué)修飾的引物、具有與目標(biāo)核酸分子的上述目標(biāo)堿基序列的區(qū)域不同區(qū)域的目標(biāo)堿基序列的3’端側(cè)相鄰的區(qū)域的堿基序列且3’端經(jīng)化學(xué)修飾的引物、含有上述目標(biāo)堿基序列的環(huán)狀單鏈DNA、鏈取代型DNA聚合酶和dNTP，在上述鏈取代型DNA聚合酶具有活性的溫度下進(jìn)行酶反應(yīng)；(b)確認(rèn)在進(jìn)行了酶反應(yīng)的試樣中核酸是否被擴(kuò)增；和(d)在核酸被擴(kuò)增時(shí)，確定檢測(cè)對(duì)象試樣中存在單鏈的目標(biāo)核酸分子。另外，本發(fā)明提供一種雙鏈的目標(biāo)核酸分子的檢測(cè)用試劑盒，其含有(i)包含具有與雙鏈的目標(biāo)核酸分子的目標(biāo)堿基序列的3’端側(cè)相鄰的區(qū)域的互補(bǔ)堿基序列且3’端經(jīng)化學(xué)修飾的引物的引物對(duì)；(ii)含有目標(biāo)堿基序列的環(huán)狀單鏈DNA ；(iii)鏈取代型DNA聚合酶；和(iν) dNTP。另外，本發(fā)明提供一種單鏈的目標(biāo)核酸分子的檢測(cè)用試劑盒，其含有(i)具有與單鏈的目標(biāo)核酸分子的目標(biāo)堿基序列的3’端側(cè)相鄰的區(qū)域的互補(bǔ)堿基序列且3’端經(jīng)化學(xué)修飾的引物；(ii)具有與目標(biāo)核酸分子的上述目標(biāo)堿基序列的區(qū)域不同區(qū)域的3’端側(cè)相鄰的區(qū)域的堿基序列且3’端經(jīng)化學(xué)修飾的引物；(iii)含有目標(biāo)堿基序列的環(huán)狀單鏈DNA ；(iv)鏈取代型DNA聚合酶；和(v)dNTP。發(fā)明的效果通過(guò)本發(fā)明，得到能夠在短時(shí)間內(nèi)且特異性地?cái)U(kuò)增核酸的核酸擴(kuò)增方法，通過(guò)利用該方法，能夠提高核酸的檢測(cè)靈敏度。


圖1示出本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法的原理(第一階段)。圖2示出由第一階段生成的直鏈狀單鏈DNA和環(huán)狀單鏈DNA的對(duì)應(yīng)。圖3示出本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法的原理(第二階段)。圖4示出以λ DNA作為模板時(shí)的引物F_in、R_in、F_out、R-out的對(duì)應(yīng)區(qū)域和目標(biāo)序列的區(qū)域A和B。圖5示出實(shí)驗(yàn)1 實(shí)驗(yàn)3的結(jié)果。圖6示出實(shí)驗(yàn)4 實(shí)驗(yàn)6的結(jié)果。圖7示出實(shí)驗(yàn)7 實(shí)驗(yàn)9的結(jié)果。圖8示出實(shí)驗(yàn)10 實(shí)驗(yàn)13的結(jié)果。圖9示出比較實(shí)驗(yàn)1 比較實(shí)驗(yàn)4的結(jié)果。圖10示出實(shí)驗(yàn)14 實(shí)驗(yàn)15的結(jié)果。圖11示出實(shí)驗(yàn)16 實(shí)驗(yàn)17的結(jié)果。圖12示出實(shí)驗(yàn)18 實(shí)驗(yàn)21的結(jié)果。圖13示出實(shí)驗(yàn)22 實(shí)驗(yàn)25的結(jié)果。圖14示出表5的實(shí)驗(yàn)3的樣品的電泳結(jié)果。
具體實(shí)施例方式在本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法中，通過(guò)DNA聚合酶延伸反應(yīng)，可獲得含有一個(gè)作為擴(kuò)增對(duì)象的堿基序列或含有作為擴(kuò)增對(duì)象的堿基序列多次重復(fù)而成的多種鏈長(zhǎng)的擴(kuò)增產(chǎn)物， 連鎖進(jìn)行這些擴(kuò)增產(chǎn)物發(fā)揮模板或復(fù)制起點(diǎn)作用的進(jìn)一步的DNA聚合酶延伸反應(yīng)，能夠高效擴(kuò)增作為擴(kuò)增對(duì)象的堿基序列。本發(fā)明的含有擴(kuò)增對(duì)象堿基序列(本說(shuō)明書(shū)中也稱(chēng)為“目標(biāo)堿基序列”)的模板 DNA為單鏈或雙鏈的直鏈狀或環(huán)狀的DNA，包含于該模板DNA中的擴(kuò)增對(duì)象堿基序列是模板 DNA中特異性區(qū)域中的堿基序列。而且，本發(fā)明的方法還可以使用cDNA作為模板DNA而進(jìn)行，所述cDNA是采用逆轉(zhuǎn)錄酶合成的與RNA分子互補(bǔ)的堿基序列。此時(shí)，本發(fā)明的擴(kuò)增對(duì)象堿基序列是RNA分子中的尿嘧啶(U)堿基換成胸腺嘧啶(T)的堿基序列。在本發(fā)明的擴(kuò)增方法中使用的引物對(duì)包含具有與模板DNA中的作為擴(kuò)增對(duì)象的目標(biāo)堿基序列的3’端側(cè)相鄰的區(qū)域的互補(bǔ)堿基序列的引物，只要是能夠基于模板DNA獲得作為直鏈狀DNA片段的夾在引物對(duì)之間的區(qū)域即可。因此，模板DNA為雙鏈DNA時(shí)，引物對(duì)的各引物具有各個(gè)鏈上的目標(biāo)堿基序列。模板DNA為單鏈DNA時(shí)，引物對(duì)中的一條引物具有與存在于模板DNA鏈上的擴(kuò)增對(duì)象堿基序列不同區(qū)域的目標(biāo)堿基序列。這里，本發(fā)明的上述引物對(duì)包含3’端經(jīng)化學(xué)修飾的引物。在以3’端經(jīng)化學(xué)修飾的引物作為起點(diǎn)進(jìn)行DNA聚合酶延伸反應(yīng)時(shí)，生成在途中含有經(jīng)化學(xué)修飾的堿基殘基的DNA 片段。若以上述DNA片段作為模板進(jìn)一步進(jìn)行DNA聚合酶延伸反應(yīng)，則DNA聚合酶無(wú)法追加與上述經(jīng)化學(xué)修飾的堿基的部分對(duì)應(yīng)的堿基，因此DNA的延伸在即將到經(jīng)化學(xué)修飾的堿基之前停止(參照附圖，在后文中說(shuō)明)。如上所述，本發(fā)明中能夠使用的化學(xué)修飾只要能夠使以包含其的DNA片段作為模板的DNA聚合酶延伸反應(yīng)停止則沒(méi)有特別限定，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)選擇。本發(fā)明中， 通過(guò)將引物上的3’端的堿基變更為RNA殘基、LNA(鎖核酸=Locked Nucleic Acid)殘基或ENAQ' -0,4' -C-Ethylene Bridged Nucleic Acid，乙烯橋接核酸)殘基，或者變更為肌苷殘基，從而能夠進(jìn)行上述化學(xué)修飾。進(jìn)行化學(xué)修飾的3’端的堿基數(shù)目沒(méi)有特別制限， 從3’端起例如能夠?qū)?個(gè)、2個(gè)或3個(gè)堿基進(jìn)行化學(xué)修飾，通常只要僅對(duì)3’端的最末端的 1個(gè)堿基進(jìn)行化學(xué)修飾即能夠?qū)嵤┍景l(fā)明。本發(fā)明中使用的引物對(duì)中只要對(duì)構(gòu)成引物對(duì)的2種引物中的至少一種進(jìn)行了化學(xué)修飾即可，但優(yōu)選對(duì)2種引物均進(jìn)行了化學(xué)修飾。本發(fā)明的方法可以使用至少一個(gè)引物對(duì)進(jìn)行，使用多個(gè)引物對(duì)時(shí)，其數(shù)目并沒(méi)有上限，例如還可以設(shè)計(jì)為嵌套式來(lái)使用。例如為1 5對(duì)，優(yōu)選為1 3對(duì)，更優(yōu)選為2 3對(duì)，特別優(yōu)選為2對(duì)。各引物與配對(duì)的引物和其它引物對(duì)的引物間優(yōu)選不具有相同的序列或互補(bǔ)序列。配對(duì)的引物所結(jié)合的區(qū)域之間的相對(duì)距離(堿基數(shù))只要能夠進(jìn)行本發(fā)明的反應(yīng)即可，沒(méi)有特別限制，但優(yōu)選最內(nèi)側(cè)引物對(duì)的引物所結(jié)合的區(qū)域間的相對(duì)距離更小者，并且優(yōu)選其外側(cè)的引物對(duì)與鄰接的內(nèi)側(cè)引物對(duì)所結(jié)合的區(qū)域間的相對(duì)距離更小者。上述相對(duì)距離(堿基數(shù))優(yōu)選為釙 11Λ，更優(yōu)選為10 100b。作為本發(fā)明中使用的引物，只要能夠形成與模板DNA互補(bǔ)的雙鏈即可，沒(méi)有特別限制，優(yōu)選8 40mer的引物，更優(yōu)選16 25mer的引物。而且，模板DNA(目標(biāo)堿基序列) 或引物的GC含量、二級(jí)結(jié)構(gòu)形成的容易程度等以及其它在引物設(shè)計(jì)中一般考慮的性質(zhì)也都包含在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)常識(shí)范圍之內(nèi)。這種引物的設(shè)計(jì)和合成可以使用本技術(shù)領(lǐng)域中通常使用的設(shè)計(jì)程序等手法來(lái)進(jìn)行。以采用逆轉(zhuǎn)錄酶合成RNA分子中的堿基序列而得的cDNA作為模板DNA使用時(shí)，同樣，可以根據(jù)該RNA分子是雙鏈還是單鏈而如上述那樣設(shè)計(jì)引物對(duì)。在本發(fā)明的方法中使用的環(huán)狀單鏈DNA含有上述擴(kuò)增對(duì)象堿基序列。環(huán)狀單鏈DNA可以設(shè)計(jì)為以一定間隔反復(fù)含有多個(gè)上述擴(kuò)增對(duì)象堿基序列(即目標(biāo)堿基序列)，另外在對(duì)引物對(duì)的兩個(gè)引物均進(jìn)行了化學(xué)修飾時(shí)，還可以含有一個(gè)各自的擴(kuò)增對(duì)象堿基序列或反復(fù)含有多個(gè)各自的擴(kuò)增對(duì)象堿基序列。環(huán)狀單鏈DNA中，目標(biāo)序列以外的區(qū)域的堿基序列只要是本發(fā)明特異性反應(yīng)即可，沒(méi)有特別限定，但優(yōu)選較小者。另外，使用不具有3’ 一5’核酸外切酶活性的鏈取代型 DNA聚合酶時(shí)，優(yōu)選在與引物相同的堿基序列的5’側(cè)上添加1個(gè)胸腺嘧啶(T)。
關(guān)于環(huán)狀單鏈DNA的鏈長(zhǎng)，只要使本發(fā)明特異性反應(yīng)即可，沒(méi)有特別限定，但優(yōu)選為16b 1001Λ，更優(yōu)選為20 100b。這種環(huán)狀單鏈DNA的設(shè)計(jì)和合成可以使用本技術(shù)領(lǐng)域中通常使用的設(shè)計(jì)程序等手法而進(jìn)行。而且，環(huán)狀單鏈DNA還可以通過(guò)國(guó)際公開(kāi)第 2008/026719號(hào)小冊(cè)子的圖6中所示的環(huán)狀單鏈DNA的制造方法來(lái)制造。本發(fā)明的方法中使用的DNA聚合酶優(yōu)選具有鏈取代型5’ 一 3’ DNA聚合酶活性， 正確合成堿基對(duì)的互補(bǔ)鏈。而且，所述DNA聚合酶可以具有3’ 一5’核酸外切酶活性，但優(yōu)選不具有此活性，而且也優(yōu)選不具有5’ 一3’核酸外切酶活性。DNA聚合酶的最適溫度優(yōu)選為50 90°C，更優(yōu)選為60 72°C。作為這種DNA聚合酶，例如可以單獨(dú)或以試劑盒的形式獲得嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)來(lái)源的Bst DNA聚合酶大片段、火球菌(Pyrococcus)屬細(xì)菌來(lái)源的De印VentK (exo-)DNA聚合酶、嗜熱球菌(Thermococcus)屬細(xì)菌來(lái)源的 9degrees North DNA 聚合酶(New England Biolabs Incorporation 制)、HerculasewII Fusion DNA 聚合酶(STRATAGENE 公司制)、嗜熱球菌(Thermococcus)屬來(lái)源的 VentK (exo-) DNA 聚合酶、Therminator DNA 聚合酶、 Therminator II DNA M^B (New England Biolabs Incorporation M ) > KOD Dash DNA 聚合酶(東洋紡公司制)等。只要不抑制相互的酶活性，還可以同時(shí)使用兩種以上DNA聚合酶。利用DNA聚合酶進(jìn)行的延伸反應(yīng)還可以使用在一般的核酸擴(kuò)增中使用的緩沖液 (含有Tris-HCl、KC1、(NH4) 2SO4、MgSO4等鹽類(lèi))，例如所使用的DNA聚合酶附帶的優(yōu)化組成的緩沖液。在上述這種合適的緩沖液中添加模板DNA、本發(fā)明的引物對(duì)、本發(fā)明的環(huán)狀單鏈 DNA、鏈取代型DNA聚合酶和作為底物的4種脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP :dATP、dCTP、dGTP、 dTTP)，將該反應(yīng)溶液保持在鏈取代型DNA聚合酶具有該酶活性的溫度例如50 90°C、優(yōu)選60 72°C，則不用進(jìn)行溫度循環(huán)控制即可在同一容器中通過(guò)1次操作來(lái)高效擴(kuò)增核酸。 而且，使用多個(gè)引物對(duì)時(shí)，能夠?qū)⒈景l(fā)明的反應(yīng)溫度條件進(jìn)一步設(shè)定在更低的條件，例如 30 50°C。DNA聚合酶延伸反應(yīng)的溫度條件依賴(lài)于使用的鏈取代型DNA聚合酶具有活性的溫度。只要在使用的鏈取代型DNA聚合酶具有該酶活性的溫度范圍內(nèi)即可，擴(kuò)增反應(yīng)整個(gè)過(guò)程不必都保持在相同溫度(等溫)亦可，但優(yōu)選擴(kuò)增反應(yīng)整個(gè)過(guò)程保持在相同溫度(等溫)(同一溫度條件下)。核酸的擴(kuò)增可以通過(guò)DNA聚合酶延伸反應(yīng)中核酸被擴(kuò)增時(shí)反應(yīng)溶液中生成的焦磷酸鎂的沉淀來(lái)確認(rèn)(國(guó)際公開(kāi)第2001/083817號(hào)小冊(cè)子)。另外，還可以使用本技術(shù)領(lǐng)域中通常使用的核酸染色熒光染料等例如溴化乙錠、STOR Green I (Lonza公司制)等，按照常規(guī)方法根據(jù)熒光的有無(wú)和強(qiáng)度來(lái)確認(rèn)核酸擴(kuò)增。接著，用附圖具體說(shuō)明本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法的方式。首先，在第一階段，通過(guò)含作為擴(kuò)增對(duì)象的特異性堿基序列的模板DNA與引物對(duì)的DNA聚合酶延伸反應(yīng)，獲得直鏈狀DNA片段(圖1)。以雙鏈的模板DNA中的兩個(gè)特異性堿基序列區(qū)域A、B作為擴(kuò)增對(duì)象時(shí)，將各區(qū)域在其中一條鏈上的序列設(shè)定為Al和Bi，另一條鏈上的序列設(shè)定為A2和B2 (圖1、(i))。引物對(duì)中，將一條引物Pl設(shè)計(jì)為具有與Al的3’端側(cè)相鄰的區(qū)域的互補(bǔ)堿基序列，另一條引物P2設(shè)計(jì)為具有與B2的3’端側(cè)相鄰的區(qū)域的互補(bǔ)堿基序列。圖1中，引物Pl和P2的3’端經(jīng)修飾的情況以圓形符號(hào)表示。使用該引物對(duì)與上述模板DNA來(lái)進(jìn)行DNA聚合酶延伸反應(yīng)。以下，為了簡(jiǎn)化說(shuō)明， 僅著眼于包含區(qū)域Al和Bl的鏈(圖1的雙鏈的模板DNA的上側(cè)的鏈)上的反應(yīng)進(jìn)行說(shuō)明。 首先，引物Pl與序列Al的3端側(cè)的區(qū)域結(jié)合(圖1、(ii))。然后，通過(guò)延伸反應(yīng)，生成片段Cl，該片段Cl接著Pl的序列合成與A2相同的堿基序列，然后隔開(kāi)間隔合成與B2相同的堿基序列(圖1、(iii))。所生成的片段還可以通過(guò)酶的作用而在延伸反應(yīng)條件下自然地從模板DNA離開(kāi)，解離成雙鏈(參照例如國(guó)際公開(kāi)第2008/(^6719號(hào)小冊(cè)子的例1)，但通過(guò)在引物Pl的外側(cè)(5’端側(cè))進(jìn)一步設(shè)計(jì)引物Pl-out并使其退火而同樣地進(jìn)行延伸，從而將由引物Pl合成的DNA片段從模板DNA剝離，能夠高效地解離成單鏈(圖1、(iv))。接著，將如上擴(kuò)增的片段Cl作為模板，引物P2退火而進(jìn)行反向的DNA延伸反應(yīng) (圖l、(v))。這里，作為模板的DNA片段在A2的序列的5’端側(cè)含有化學(xué)修飾，因此該部分的延伸不進(jìn)行，DNA的延伸在即將到含有化學(xué)修飾的堿基之前停止(圖1、(vi))，生成DNA 片段C2。如對(duì)圖1的(iv)所說(shuō)明的那樣，所生成的DNA片段C2還可以在延伸反應(yīng)條件下自然地從模板DNA離開(kāi)，解離成雙鏈，但與(iv)同樣地通過(guò)在反應(yīng)中同時(shí)加入外側(cè)的引物 P2-out，從而將由引物P2合成的DNA片段從模板DNA剝離，能夠高效地解離成單鏈(圖1、 (vii))ο通過(guò)上述反應(yīng)，得到5’端具有引物P2的序列、連續(xù)地具有與Bl相同的序列、然后隔開(kāi)間隔具有與Al相同的序列、且延伸在此中斷的直鏈狀DNA片段。如上所述，這示出了將圖1的(i)的上側(cè)的鏈作為模板的情況，對(duì)于將下側(cè)的鏈作為模板的情況，也同樣地首先將引物P2作為模板而生成片段Dl (未圖示)，以該片段Dl作為模板，得到DNA延伸在途中停止而生成的直鏈狀DNA片段D2。由作為模板的雙鏈DNA的兩個(gè)鏈生成直鏈狀DNA片段C2 和D2，其在后述的第二階段與環(huán)狀單鏈DNA結(jié)合，該情況示于圖2。該所獲得的直鏈狀DNA 片段C2和D2成為第二階段的擴(kuò)增反應(yīng)開(kāi)始時(shí)的復(fù)制起點(diǎn)。在第二階段作為模板的環(huán)狀單鏈DNA被設(shè)計(jì)為含有目標(biāo)堿基序列A2和/或Bl (圖 3、(i))。若使用這樣的環(huán)狀單鏈DNA，則在第一階段得到的直鏈狀DNA片段C2和D2均在環(huán)狀DNA上退火(參照?qǐng)D2)，能夠進(jìn)行以環(huán)狀單鏈DNA為起點(diǎn)的連鎖擴(kuò)增反應(yīng)。以下，為了簡(jiǎn)化說(shuō)明，僅對(duì)將直鏈狀DNA片段C2作為復(fù)制起點(diǎn)的情況進(jìn)行說(shuō)明。圖3中示出了含有與 A2、Bl和P2分別相同的堿基序列的環(huán)狀單鏈DNA。如上所述，由于在第一階段獲得的直鏈狀DNA片段C2在3’端各自具有與目標(biāo)序列互補(bǔ)的堿基序列(Al)，因此該直鏈狀DNA片段的3’端區(qū)域(Al)與環(huán)狀單鏈DNA中的3’端部分的堿基序列(A2)區(qū)域退火，成為復(fù)制起點(diǎn)，以環(huán)狀單鏈DNA作為模板發(fā)生DNA聚合酶延伸反應(yīng)(圖3、(i))。合成的DNA鏈通過(guò)鏈取代型DNA聚合酶而剝離，與此同時(shí)呈滾環(huán)式延伸(圖3、(ii))。存在于反應(yīng)溶液中的引物P2與該剝離延伸的DNA鏈發(fā)生退火，從而成為復(fù)制起點(diǎn)，發(fā)生DNA聚合酶延伸反應(yīng)，以上述引物作為復(fù)制起點(diǎn)進(jìn)行合成并剝離的DNA鏈與存在于反應(yīng)溶液中的引物或環(huán)狀單鏈DNA 發(fā)生退火，從而發(fā)生DNA聚合酶延伸反應(yīng)(圖3、(iii))。一旦作為第二階段開(kāi)始的誘因的直鏈狀DNA片段被合成后，以上說(shuō)明的第一階段的過(guò)程和第二階段的過(guò)程就平行地同時(shí)進(jìn)行。而且，這樣進(jìn)行連鎖的擴(kuò)增反應(yīng)，其結(jié)果是合成了含有1個(gè)作為擴(kuò)增對(duì)象的特異性堿基序列或含有作為擴(kuò)增對(duì)象的特異性堿基序列多次重復(fù)而成的多種鏈長(zhǎng)的DNA鏈。
本發(fā)明的另一種方式是利用上述核酸擴(kuò)增方法的原理的目標(biāo)基因的檢測(cè)方法。本檢測(cè)方法可以根據(jù)檢測(cè)目標(biāo)、檢測(cè)對(duì)象試樣的來(lái)源、目標(biāo)基因等，在多種產(chǎn)業(yè)中的各種情況下進(jìn)行。作為檢測(cè)目標(biāo)基因的試樣，例如可以從人以及動(dòng)物來(lái)源的體液或組織片來(lái)制備， 也可以從環(huán)境來(lái)源的土壤、海水、植物來(lái)制備，還可以是在工廠制造加工的飲料或食品、藥品等。它們直接或根據(jù)需要采用適當(dāng)?shù)牟僮髦苽涑龊怂?DNA、RNA)提取液，這種提取液可作為檢測(cè)對(duì)象試樣用于本發(fā)明的檢測(cè)方法中。這種試樣的制備可以按照一般的核酸檢測(cè)方法中使用的常規(guī)方法進(jìn)行。目標(biāo)基因可以為微生物(細(xì)菌、霉菌等)、過(guò)敏原(例如螨、花粉等)、病毒中特異性的遺傳物質(zhì)，而且也可以是人以及其它動(dòng)物的基因組中的野生型或突變型基因。本檢測(cè)方法中，將上述核酸擴(kuò)增方法的“模板DNA”和“擴(kuò)增對(duì)象堿基序列”分別替換為本檢測(cè)方法的“目標(biāo)核酸分子(即目標(biāo)基因)”和“目標(biāo)基因中的目標(biāo)堿基序列”，該方法利用的是試樣中存在目標(biāo)核酸分子(即目標(biāo)基因)時(shí)，根據(jù)與上述核酸擴(kuò)增方法相同的原理來(lái)擴(kuò)增目標(biāo)基因中的目標(biāo)堿基序列的核酸。在目標(biāo)核酸分子為RNA時(shí)，通過(guò)在本發(fā)明的檢測(cè)方法的工序(a)的酶反應(yīng)的工序中，在試樣中進(jìn)一步添加逆轉(zhuǎn)錄酶(RNA依賴(lài)性DNA聚合酶)進(jìn)行酶反應(yīng)，可與上述核酸擴(kuò)增方法同樣確認(rèn)是否發(fā)生了以基于試樣中的RNA分子合成的cDNA鏈作為模板的核酸擴(kuò)增， 在核酸被擴(kuò)增時(shí)，確定為存在目標(biāo)RNA分子，由此可以檢測(cè)目標(biāo)RNA分子的存在。核酸擴(kuò)增可與上述同樣地采用焦磷酸鎂的沉淀、或本技術(shù)領(lǐng)域中通常使用的核酸染色熒光染料等，以沉淀或熒光的有無(wú)作為指標(biāo)進(jìn)行確認(rèn)。而且，還可以以焦磷酸鎂的生成量或熒光的強(qiáng)度作為指標(biāo)，來(lái)比較作為檢測(cè)對(duì)象的試樣中存在的目標(biāo)基因的核酸量的多少。這樣一來(lái)，通過(guò)使用本檢測(cè)方法，即使試樣中存在的目標(biāo)基因的核酸極為微量，也可以在同一反應(yīng)容器中通過(guò)一次操作高效擴(kuò)增并檢測(cè)出目標(biāo)基因中的特異性堿基序列。本檢測(cè)方法還可以在例如微管、微孔板、微芯片(microchip)等反應(yīng)容器中進(jìn)行，而且還可以使用 HTS (高通量篩選，High-Throughput Screening)等技術(shù)。以下，通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體的說(shuō)明。實(shí)施例以下，通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體的說(shuō)明。需要說(shuō)明的是，藥品名稱(chēng)后沒(méi)有注明公司名的物質(zhì)均為和光純藥工業(yè)公司制造。而且，只要沒(méi)有特別的說(shuō)明，則溶劑為水。TE緩沖液^imol/Wris-HCl (三羥甲基氨基甲烷)鹽酸lmmol/1乙二胺四乙酸二鈉二水合物(EDTA)調(diào)整到pH8. 01.5% TAE 電泳用膠1.5% 瓊脂糖4mmol/lTris-HClImmol/IEDTAlmmol/1 醋酸
LB培養(yǎng)基蛋白胨1.0%酵母浸膏0.5%氯化鈉1.0%溶解后將pH調(diào)整到7.0[環(huán)狀單鏈DNA的合成]以下示出的酶制品、試劑盒制品只要沒(méi)有特別說(shuō)明均按照使用說(shuō)明書(shū)。將環(huán)狀單鏈DNA的合成中使用的引物記于下述表1和2。表1 環(huán)狀單鏈DNA的合成中使用的引物序列
權(quán)利要求
1.一種核酸擴(kuò)增方法，其特征在于，包括(a)使用含有擴(kuò)增對(duì)象堿基序列的模板DNA、和包含具有與上述堿基序列的3’端側(cè)相鄰的區(qū)域的互補(bǔ)堿基序列且3’端經(jīng)化學(xué)修飾的引物的引物對(duì)來(lái)進(jìn)行DNA聚合酶延伸反應(yīng)， 得到直鏈狀DNA片段；和(b)以含有擴(kuò)增對(duì)象堿基序列的環(huán)狀單鏈DNA作為模板，以由(a)得到的直鏈狀DNA片段的3’端作為復(fù)制起點(diǎn)，進(jìn)行鏈取代型DNA聚合酶延伸反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，化學(xué)修飾為向RNA殘基、LNA殘基或ENA殘基的變更或者向肌苷殘基的變更。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，對(duì)構(gòu)成引物對(duì)的2種引物均進(jìn)行了化學(xué)修飾。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，進(jìn)一步添加第二引物對(duì)來(lái)進(jìn)行工序(a)，該第二引物對(duì)由在構(gòu)成工序(a)中使用的引物對(duì)的各引物的5’端側(cè)分別進(jìn)行了設(shè)計(jì)的2種引物構(gòu)成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在同一溫度條件下進(jìn)行(a)和(b)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的方法，其中，含有擴(kuò)增對(duì)象堿基序列的模板DNA 含有由以RNA為模板的逆轉(zhuǎn)錄所得到的DNA鏈。
7.—種核酸擴(kuò)增用試劑盒，其含有(i)包含具有與擴(kuò)增對(duì)象堿基序列的3’端側(cè)相鄰的區(qū)域的互補(bǔ)堿基序列且3’端經(jīng)化學(xué)修飾的引物的引物對(duì)；( )含有擴(kuò)增對(duì)象堿基序列的環(huán)狀單鏈DNA;(iii)鏈取代型DNA聚合酶；(iv)dNTPo
8.—種檢測(cè)雙鏈的目標(biāo)核酸分子的方法，其包括(a)在檢測(cè)對(duì)象試樣中添加包含具有與目標(biāo)核酸分子的目標(biāo)堿基序列的3’端側(cè)相鄰的區(qū)域的互補(bǔ)堿基序列且3’端經(jīng)化學(xué)修飾的引物的引物對(duì)、含有目標(biāo)堿基序列的環(huán)狀單鏈 DNA、鏈取代型DNA聚合酶和dNTP，在上述鏈取代型DNA聚合酶具有活性的溫度下進(jìn)行酶反應(yīng)；(b)確認(rèn)在進(jìn)行了酶反應(yīng)的試樣中核酸是否被擴(kuò)增；和(c)在核酸被擴(kuò)增時(shí)，確定檢測(cè)對(duì)象試樣中存在雙鏈的目標(biāo)核酸分子。
9.一種檢測(cè)單鏈的目標(biāo)核酸分子的方法，其包括(a)在檢測(cè)對(duì)象試樣中添加具有與目標(biāo)核酸分子的目標(biāo)堿基序列的3’端側(cè)相鄰的區(qū)域的互補(bǔ)堿基序列且3’端經(jīng)化學(xué)修飾的引物、具有與目標(biāo)核酸分子的上述目標(biāo)堿基序列的區(qū)域不同區(qū)域的目標(biāo)堿基序列的3’端側(cè)相鄰的區(qū)域的堿基序列且3’端經(jīng)化學(xué)修飾的引物、含有上述目標(biāo)堿基序列的環(huán)狀單鏈DNA、鏈取代型DNA聚合酶和dNTP，在上述鏈取代型 DNA聚合酶具有活性的溫度下進(jìn)行酶反應(yīng)；(b)確認(rèn)在進(jìn)行了酶反應(yīng)的試樣中核酸是否被擴(kuò)增；和(d)在核酸被擴(kuò)增時(shí)，確定檢測(cè)對(duì)象試樣中存在單鏈的目標(biāo)核酸分子。
10.一種雙鏈的目標(biāo)核酸分子的檢測(cè)用試劑盒，其含有(i)包含具有與雙鏈的目標(biāo)核酸分子的目標(biāo)堿基序列的3’端側(cè)相鄰的區(qū)域的互補(bǔ)堿基序列且3’端經(jīng)化學(xué)修飾的引物的引物對(duì)； ( )含有目標(biāo)堿基序列的環(huán)狀單鏈DNA;(iii)鏈取代型DNA聚合酶；和(iv)dNTPo
11.一種單鏈的目標(biāo)核酸分子的檢測(cè)用試劑盒，其含有(i)具有與單鏈的目標(biāo)核酸分子的目標(biāo)堿基序列的3’端側(cè)相鄰的區(qū)域的互補(bǔ)堿基序列且3’端經(jīng)化學(xué)修飾的引物；( )具有與目標(biāo)核酸分子的上述目標(biāo)堿基序列的區(qū)域不同區(qū)域的3’端側(cè)相鄰的區(qū)域的堿基序列且3’端經(jīng)化學(xué)修飾的引物；(iii)含有目標(biāo)堿基序列的環(huán)狀單鏈DNA;(iv)鏈取代型DNA聚合酶；和(v)dNTPo
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的檢測(cè)用試劑盒，其還含有(vi)逆轉(zhuǎn)錄酶。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種基于新原理的核酸擴(kuò)增方法，該方法能夠簡(jiǎn)便地且在短時(shí)間內(nèi)高效擴(kuò)增具有特定堿基序列的核酸；另外提供利用了該方法的核酸檢測(cè)方法。本發(fā)明提供一種核酸擴(kuò)增方法，其特征在于，包括(a)使用含有擴(kuò)增對(duì)象堿基序列的模板DNA、和包含具有與上述堿基序列的3’端側(cè)相鄰的區(qū)域的互補(bǔ)堿基序列且3’端經(jīng)化學(xué)修飾的引物的引物對(duì)來(lái)進(jìn)行DNA聚合酶延伸反應(yīng)，得到直鏈狀DNA片段；和(b)以含有擴(kuò)增對(duì)象堿基序列的環(huán)狀單鏈DNA作為模板，以由(a)得到的直鏈狀DNA片段的3’端作為復(fù)制起點(diǎn)，進(jìn)行鏈取代型DNA聚合酶延伸反應(yīng)。
文檔編號(hào)C12N15/09GK102549154SQ201080041390
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2010年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月17日
發(fā)明者遠(yuǎn)山將史 申請(qǐng)人:東洋制罐株式會(huì)社