專利名稱：蛋白酶變體的制作方法
蛋白酶變體
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及相對于野生型人中性溶酶具有改變的底物特異性的人中性溶酶變體的核酸和氨基酸序列以及此類變體在藥物組合物中的用途。具體地說，本發(fā)明涉及與野生型中性溶酶相比裂解β淀粉樣(Αβ)肽的特異性得以提高的中性溶酶變體多肽。本發(fā)明還涉及包含此類中性溶酶變體分子的融合蛋白。包含中性溶酶變體的多肽可用于治療與β淀粉樣肽集聚相關(guān)的疾病，特別是阿爾茨海默氏病(Alzheimer' s disease)。
背景技術(shù)：
工程蛋白酶作為治療劑是合乎需要的，因為它的裂解作用往往會導(dǎo)致與疾病相關(guān)的底物肽或蛋白質(zhì)不可逆地失活或活化。然而，對于藥物用途來說，蛋白酶必須對靶標具有足夠的活性，但不能使其它底物裂解到產(chǎn)生在治療情況下不可接受的毒副作用的程度。蛋白酶的特異性(即其識別和優(yōu)先水解某些肽底物的能力)可在性質(zhì)上和數(shù)量上來表示。在性質(zhì)方面，作用于一種或少數(shù)肽的蛋白酶具有較高特異性，而作用于許多不同的肽的蛋白酶被認為具有較低特異性。在數(shù)量上，蛋白酶的特異性概況是由針對所有底物的相應(yīng)kcat/Km比率來指示的,包括針對特定底物中的若干潛在裂解位點的kcat/Km比率?，F(xiàn)代蛋白質(zhì)工程方法可以轉(zhuǎn)變指定蛋白酶的特異性，從而能夠產(chǎn)生適合用作預(yù)防或治療性蛋白質(zhì)藥物的具有所需特異性的蛋白酶。與“正常”水平相比，多肽活性的集聚或增加可造成疾病的起因或癥狀；在此類情況下，通過蛋白水解裂解使多肽失活可能對患者有益。許多不同的多肽可預(yù)想為蛋白水解失活的靶標。這些多肽包括諸如內(nèi)分泌系統(tǒng)的生物活性肽的小肽，例如涉及調(diào)節(jié)血管活性、疼痛、食欲、心臟功能、免疫功能、代謝調(diào)節(jié)、晝夜節(jié)律及其它方面的生物活性肽。其它實例包括小的和大的蛋白質(zhì)或同源和異源多蛋白復(fù)合體，諸如可溶性和膜結(jié)合蛋白質(zhì)和受體、結(jié)構(gòu)蛋白、細胞因子、酶、抗體、轉(zhuǎn)運蛋白及其它。已知許多肽具有有效的調(diào)節(jié)功能，包括血管緊張素-I和-2、ANP、BNP、緩激肽、內(nèi)皮素-I和-2、神經(jīng)肽Y和神經(jīng)降壓素，以及腎上腺髓質(zhì)素、蛙皮素、BLP、CGRP、腦啡肽、FGF-2、fMLP、GRP、神經(jīng)激肽、神經(jīng)介素C、催產(chǎn)素、PAMP、P物質(zhì)、VIP及其它。這些肽中任何一個的活性增加都可能在患者體內(nèi)產(chǎn)生不良作用。例如，神經(jīng)降壓素刺激前列腺癌PC3細胞的增殖(Carraway等(2007)Regul Pept. 141(1-3)140-53)并且其在活體內(nèi)的降解可減輕疾病。緩激肽涉及血壓調(diào)節(jié)，但也涉及神經(jīng)性疼痛和心肌重構(gòu)。如下文所示，可產(chǎn)生針對神經(jīng)降壓素或緩激肽的特異性得以提高的蛋白酶變體。阿爾茨海默氏病(AD)是一種漸進性神經(jīng)退行性病癥，其特征為在大腦的不連續(xù)區(qū)域內(nèi)發(fā)生神經(jīng)元的損失，特別是在皮質(zhì)和海馬中。在患AD個體的大腦中出現(xiàn)的神經(jīng)病理標志是衰老斑和嚴重細胞骨架改變以及同時發(fā)生的纖維結(jié)構(gòu)異常。神經(jīng)元損失伴有衰老斑形式的β淀粉樣(Αβ)肽在胞外沉積和由高度磷酸化形式的微管相關(guān)tau蛋白構(gòu)成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)在胞內(nèi)集聚。家族性和偶發(fā)性病例都有胞外、原纖維性β淀粉樣肽在大腦內(nèi)沉積作為共同病理標志，這一現(xiàn)象被認為是與神經(jīng)元功能損傷和神經(jīng)元損失有關(guān)(Younkin S. G. , Ann. Neurol. 37,287-288,1995 ；Selkoe, D. J. , Nature 399, A23-A31,1999 ；Borchelt D. R.等，Neuron 17，1005-1013，1996)。β 淀粉樣沉積物由若干 β 淀粉樣肽(Αβ)類物質(zhì)組成；特別是逐漸沉積為淀粉樣斑的Ah_42。遺傳證據(jù)表明在許多(如果不是全部)引起家族性AD的遺傳病狀中，所產(chǎn)生的A ^_42的量增加(Borchelt D. R.等，Neuron 17,1005-1013,1996 ；Duff K.等，Nature 383，710-713，1996 ;Scheuner D.等，Nat. Med. 2,864-870,1996 ；Citron M.等，Neurobiol. Dis. 5，107-116，1998)，表明淀粉樣蛋白的形成可能是由Αβ卜42的產(chǎn)生增加，或降解減少，或兩者同時所引起(Glabe，C.，Nat.Med. 6，133-134,2000)。目前尚無法治愈AD。然而，Αβ已成為藥物開發(fā)的主要靶標，目的在于同時減少形成(Vassar，R.等，Science 286，735-41，1999)和激活加速其從大腦中清除的機制。雖然大量努力集中在減少Αβ的產(chǎn)生，但是對于清除這些肽的關(guān)注相當(dāng)少。Bard 等(Nature Medicine,第 6 卷,第 8 期,916-919, 2000)報道稱 Αβ 抗體的外周施用足以減少淀粉樣蛋白負荷。被動施用的抗體能夠穿過血腦屏障并且進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，結(jié)合于(“修飾”)斑塊并且誘導(dǎo)先前存在的淀粉樣蛋白的清除。然而，即使是Αβ被動免疫接種都可能在人類患者中引起不當(dāng)?shù)母弊饔?。DeMattos (PNAS 98 =8850-8855,2001)描述了沉陷假說，其描述可通過降低血漿中的肽濃度而間接地從CNS中除去Aβ肽。De Mattos使用結(jié)合血漿中的Aβ的抗體。通過防止A β從血漿流入CNS和/或改變血漿和CNS之間的平衡(由于血漿中游離A β濃度的降低)，將Αβ阻隔于CNS之外。經(jīng)由在血漿中的結(jié)合作用，兩種與抗體無關(guān)的其它Αβ結(jié)合劑(凝溶膠蛋白和GMl)也顯示可有效地從CNS中除去Aβ并且減少或預(yù)防腦淀粉樣變性(Matsuoka 等，J. Neuroscience 23 :29_33,2003)。一種除去A β的替代方法是使用酶將A β降解成具有較低毒性效應(yīng)并且更容易清除的較小片段。據(jù)聲稱這種由酶進行的Αβ分解過程也經(jīng)由所述沉陷假說機制、通過降低血漿中的Aβ游離濃度來完成。然而，該方法也提供了直接清除CNS和/或CSF中的Αβ的可能性。該方法不僅會降低Αβ的游離濃度，而且從環(huán)境中直接清除全長肽。該方法是有利的，因為它不會像在使用諸如抗體的Aβ肽結(jié)合劑的情況下發(fā)生的那樣增加血漿中的Αβ的總(游離和結(jié)合)濃度。中性溶酶是在文獻中描述的一種酶，其在多個裂解位點降解Αβ肽，產(chǎn)生可從血流中容易地清除的小片段(Leissring等，JBC. 278 =37314-37320, 2003)。也有報道稱中性溶酶在調(diào)節(jié)大腦內(nèi)的Αβ肽水平中發(fā)揮重要作用。有證據(jù)表明，在伴有衰老、遺傳缺陷(剔除)或用中性溶酶抑制劑治療的情況下，在AD發(fā)病早期的中性溶酶減量調(diào)節(jié)引起大腦內(nèi)集聚的Αβ肽增多，從而導(dǎo)致記憶損傷。相反地，中性溶酶的過度表達導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因AD小鼠大腦內(nèi)的集聚斑減少。已經(jīng)描述一些其它的降解Αβ肽的蛋白酶，包括胰島素降解酶、纖溶酶、ACE及其它。已應(yīng)用抗A β肽抗體來有效降低血液中的游離A β水平，導(dǎo)致腦內(nèi)沉積斑減少。然而，降解和滅活Αβ肽的蛋白酶的全身性應(yīng)用可能是替代方案；此蛋白酶還需要具有足夠的Αβ肽特異性以實現(xiàn)有效性并且避免由于脫靶活性引起的毒副作用。人中性溶酶(也稱為ΝΕΡ、中性肽鏈內(nèi)切酶、⑶10、普通急性淋巴母細胞性白血病抗原(CALLA)、中性溶酶；SwissProt登錄號P08473)是一種94kD、2型膜結(jié)合Zn金屬肽酶(SEQ ID NO :1)，其由750個殘基組成，或由于初始甲硫氨酸的去除由749個殘基組成。將、在全文使用749aa命名法(pdb編號)。其存在于CNS中的肽能神經(jīng)元中，其在大腦內(nèi)的表達是以細胞特異性的方式加以調(diào)節(jié)的(Roques B. P.等，Pharmacol. Rev. 45，87-146，1993 ;Lu B.等，J. Exp. Med. 181，2271-2275，1995 ;Lu B.等，Ann. N. Y. Acad. Sci. 780，156-163，1996)。蛋白水解結(jié)構(gòu)域(胞外催化結(jié)構(gòu)域，E⑶)包含aa 51至749，并且含有包含鋅結(jié)合基序(HEXXH)的活性位點。已知一種不具備跨膜和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的可溶性形式存在于循環(huán)中。中性溶酶能降解許多肽底物，包括Αβ肽的單體和(可能)低聚體形式并且可充當(dāng)肽鏈內(nèi)切酶以及羧肽酶，雖然在生理條件下這些不同活性的相關(guān)性還沒有詳細地得到測定。所降解的肽包括但不限于(表I):表I:
權(quán)利要求
1.一種多肽，其包含如SEQ ID NO :2所示的野生型人中性溶酶胞外結(jié)構(gòu)域的蛋白酶變體，所述多肽對中性溶酶底物的特異性與野生型人中性溶酶相比提高至少10倍。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的包含蛋白酶變體的多肽，所述多肽對β淀粉樣肽的特異性與野生型人中性溶酶(SEQ ID NO 1)相比提高至少10倍。
3.一種多肽，其包含野生型人中性溶酶胞外催化結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO 2)的蛋白酶變體，所述多肽與野生型人中性溶酶相比對A β肽的特異性更高，其中以下位置的氨基酸中的一個或多個被另一種天然存在的氨基酸替換T99、S100、SlOU G104、D107、G195、Τ206、H211、H214、H217、D219、Q220、G224、S227、R228、D229、F247、A287、R292、L323、Y346、M376、D377、L378、S380、S381、F393、R394、A396、G399、E403、T404、A405、Y413、N415、G416、N417、E419、V422、A468、1485、1510、L514、F516、S517、Q518、Q521、L522、K524、E533、W534、S536、G537、V540、Y545、S546、S547、G548、D590、D591、N592、G593、F596、G600、W606、Q624、A649、V692、W693、Y697、Y701、N704、S705、T708、D709、V710、S712、G714、R735 和 K745。
4.一種多肽，其包含人中性溶酶胞外催化結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO 2)的蛋白酶變體，所述多肽與野生型人中性溶酶相比對A β肽的特異性更高，其中已在一個或多個位置處進行如下氨基酸更換 Τ99被D替換， SlOO被I替換， SlOl被L、V、Y或I替換， G104 被L、M、R、V 或W替換， D107被N、V或W替換， G195被V替換， T206被R替換， H211被N替換， H214被N替換， H217被N替換， D219被A替換， Q220被K替換， G224被W替換， S227被L或R替換， R228被G替換， D229被N替換， F247被C或L替換， A287被S替換， R292被M替換， L323被F替換， Y346被W替換， M376被Y替換， D377 被 F、H、T、Y 或 G 替換， L378被E、K或R替換，S380被K或R替換，S381被R替換，F(xiàn)393被S替換，R394 被 C、E、G、M 或 P 替換，A396被D替換，G399被V替換，E403被H、L或S替換，T404被D或F替換，A405被T替換， Y413被D替換，N415被A替換，G416被R或W替換，N417被W替換，E419被L、M、F或K替換，V422被M替換，A468被S替換，1485被V替換，1510被D、E、F或R替換，L514被K或F替換，F(xiàn)516被R替換，S517 被D、F、R、W 或 Y 替換，Q518被R或P替換，Q521被R或E替換，L522被Y替換，K524被R替換，E533被F、A或R替換，W534被C替換，S536 被 G、P、R、E、E 或 W 替換，G537被E或T替換，V540被C、E、F或G替換，Y545被S或V替換，5546被 D、E、I、R、W 或 Y 替換，5547被 D、E、F、G 或 K 替換，G548被C、E、R或W替換，D590被F、M或W替換，D591被E或L替換，N592被P替換，G593被V或D替換，F(xiàn)596被P替換，G600被D、V或W替換， W606被S替換， Q624被H替換， A649被G替換， V692被M替換， W693 被 C、F、N、Q、V 或 L 替換， Y697被G替換， Y701被G或R替換， N704被E、G、R或W替換， S705被R替換， T708被K替換， D709被K或V替換， V710被F替換， S712被H、L、Q或G替換， G714被H或K替換， R735被H替換，以及 K745被N替換。
5.一種多肽，其包含野生型人中性溶酶胞外催化結(jié)構(gòu)域(SEQ IDNO 2)的蛋白酶變體，所述多肽與野生型人中性溶酶相比對Αβ肽的特異性更高，其中G399被另一種天然存在的氨基酸替換且/或G714被另一種天然存在的氨基酸替換，任選地所述天然存在的氨基酸是除Ala (A)以外的氨基酸。
6.一種多肽，其包含根據(jù)權(quán)利要求5所述的蛋白酶變體，其中G399被纈氨酸(V)替換且/或G714被賴氨酸⑷替換。
7.根據(jù)權(quán)利要求I至6中任一項所述的多肽，其包含如SEQIDNO :2所示的野生型人中性溶酶胞外催化結(jié)構(gòu)域的蛋白酶變體，所述多肽具有針對β 4(1淀粉樣蛋白、β 42淀粉樣蛋白、血管緊張素-I和_2、ΑΝΡ、ΒΝΡ、緩激肽、內(nèi)皮素-I和-2、神經(jīng)肽Y、神經(jīng)降壓素、腎上腺髓質(zhì)素、蛙皮素、BLP、CGRP、腦啡肽、FGF-2、fMLP、GRP、神經(jīng)激肽A、神經(jīng)介素C、催產(chǎn)素、PAMP,P物質(zhì)或VIP的改變的特異性。
8.根據(jù)權(quán)利要求I至6中任一項所述的多肽，其包含SEQID NO :2的野生型人中性溶酶胞外結(jié)構(gòu)域的蛋白酶變體，并具有針對β 淀粉樣蛋白、β42淀粉樣蛋白、血管緊張素-I和-2、ANP、ΒΝΡ、緩激肽、內(nèi)皮素-I和-2、神經(jīng)肽Y或神經(jīng)降壓素的改變的特異性。
9.根據(jù)權(quán)利要求I至8中任一項所述的多肽，其包含位于所述蛋白酶變體的N-末端的半衰期調(diào)節(jié)部分，優(yōu)選所述半衰期調(diào)節(jié)部分選自Fe結(jié)構(gòu)域和HSA或其變體，任選地所述半衰期調(diào)節(jié)部分與蛋白酶變體通過連接物接合。
10.一種核酸，其編碼根據(jù)權(quán)利要求I至9中任一項所述的多肽。
11.一種載體,其包含根據(jù)權(quán)利要求10所述的核酸。
12.—種宿主細胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求12所述的載體。
13.一種用于產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求I至9中任一項所述的多肽的方法，其中所述方法包括以下步驟a.在適于表達所述蛋白酶變體的條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求12所述的宿主細胞；和 b.從所述宿主細胞培養(yǎng)物中回收所述蛋白酶變體。
14.一種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求I至9中任一項所述的多肽。
15.一種用于治療人中性溶酶底物相關(guān)的疾病,諸如Αβ相關(guān)的病狀，如阿爾茨海默氏病的方法，所述方法包括對有需要的患者施用治療有效劑量的包含根據(jù)權(quán)利要求I至9所述的蛋白酶變體的多肽，由此改善所述人中性溶酶底物相關(guān)的疾病的癥狀。
16.根據(jù)權(quán)利要求I至9中任一項所述的多肽，其用作人中性溶酶底物相關(guān)的疾病，如Αβ相關(guān)的病狀，如阿爾茨海默氏病的藥物。
17.根據(jù)權(quán)利要求I至9所述的對Aβ特異性提高的多肽，其用于預(yù)防和/或治療諸如阿爾茨海默氏病的Αβ相關(guān)的病狀。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含具有改變的特異性和/或活性的野生型人中性溶酶的蛋白酶變體的多肽。具體地說，本發(fā)明涉及包含針對特定物質(zhì)，特別是針對淀粉樣β具有提高的特異性和/或活性的源于人中性溶酶的蛋白酶變體的多肽。
文檔編號C12N9/64GK102647998SQ201080035091
公開日2012年8月22日 申請日期2010年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月19日
發(fā)明者A·沙伊迪格, A·艾克, C·I·韋伯斯特, C·格茨貝格爾-沙德, C·馬勒特, J·P·瓦林, J·因尼格, J·格魯?shù)虑嗨箍? J·比肯費爾德, J·特伯, L·U·J·W·葉爾穆圖斯, M·施特雷拉特, N·沃布斯特, P-O·弗雷斯克加德, U·豪普茨 申請人:醫(yī)學(xué)免疫有限責(zé)任公司