專利名稱：經(jīng)穩(wěn)定化的酶組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含酶和辛醇的組合物。另外，本發(fā)明涉及包含過(guò)渡金屬離子的組合物。
背景技術(shù)：
展示許多不同官能團(tuán)的酶的復(fù)雜化學(xué)結(jié)構(gòu)不僅給予了酶在催化大范圍轉(zhuǎn)化時(shí)前所未有的特異性和反應(yīng)性，并且是酶屬于相對(duì)易變的化合物的原因。顯然，這一現(xiàn)象導(dǎo)致了下述事實(shí)用于優(yōu)化酶穩(wěn)定性的研究持續(xù)進(jìn)行，導(dǎo)致對(duì)一般性問(wèn)題產(chǎn)生了大量的通常是特異性的解答。酶可以通過(guò)酶三維結(jié)構(gòu)的解折疊(unfolding)或通過(guò)化學(xué)降解而去穩(wěn)定化 (destablized)。去穩(wěn)定化可由于與極性溶劑、微生物攻擊、電解質(zhì)、表面活性劑、溫度和極端PH的接觸而容易地發(fā)生。為了補(bǔ)償儲(chǔ)藏階段期間酶活性的損失，配制者可在液體酶組合物中使用過(guò)量的酶。然而，這是一種不受歡迎的解決方案，因?yàn)槊甘窍鄬?duì)昂貴的配制物成分。該問(wèn)題可以通過(guò)添加穩(wěn)定劑來(lái)克服。用于使酶穩(wěn)定化的材料包括多種有機(jī)和無(wú)機(jī)化合物，例如多元醇，羧酸，羧酸鹽，羧酸酯，和糖；鈣鹽；硼化合物，及其多種組合。也可以使用蛋白質(zhì)提取物，通過(guò)抑制酶而使酶穩(wěn)定化。然而，由于存在大量多種酶，所以仍然需要、并且將來(lái)也需要對(duì)酶去穩(wěn)定化這一問(wèn)題的替代性解決方案。發(fā)明詳述本發(fā)明的第一方面中公開了包含酶和辛醇的組合物。這樣的組合物令人驚訝地展示出與不含辛醇的相同混合物相比增強(qiáng)的穩(wěn)定性。優(yōu)選地，所述辛醇是ι-辛醇，但同分異構(gòu)體例如2-辛醇、3-辛醇、2-甲基-1-庚醇、3-甲基-1-庚醇也展示出類似的特性。組合物中優(yōu)選的辛醇量是占總組合物重量的0. 05%到15%，更優(yōu)選地占總組合物重量的0. 1% 至Ij 5%。在本發(fā)明第一方面的一個(gè)實(shí)施方案中，酶是乙內(nèi)酰脲消旋酶。具有乙內(nèi)酰脲消旋酶活性的多肽(也稱作乙內(nèi)酰脲消旋酶)是本領(lǐng)域已知的。它們已在多種生物中被發(fā)現(xiàn)，例如 WO 01/2；3582 描述了來(lái)自 Arthrobacter aurescens (DSM 3747)的乙內(nèi)酰脲消旋酶，JP 04271784描述了來(lái)自I^seudomonas NS 672的乙內(nèi)酰脲消旋酶(Watabe et al.，J. Bact. 174,3461-3466(1992))。還描述了 Sinorhizobium meliloti (保藏號(hào) CAC 47181，Capela et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. 98,9877-9882 (2001))中，Microbacterium Iiquefaciens (保藏號(hào) CAD 32593，EP 1188826)中，禾口 Agrobacterium tumefaciens 菌株 C58(保藏號(hào) AAL 45498、AAK 88746 和 AAK 90298, Las Heras-Vazquez et al.，Biochem. Biophys. Res. Commun. 303,541-547 (2003), Wood et al.，Science 294,2317-2323(2001) 禾口 Hinkle et al. , NCBI database, Complete Genome Sequence of Agrobacterium tumefaciens C58(Rhizobium radiobacter C58), the Causative Agent of Crown Gall Disease in Plants. Direct Submission, submitted August 14,2001)中的乙內(nèi)酰脲消旋酶。顯示乙內(nèi)酰脲消旋酶并且不具有底物抑制的經(jīng)分離的多肽已在WO 2003/100050中描述。通常，乙內(nèi)酰脲消旋酶意味著存在多于一種酶，例如乙內(nèi)酰脲酶和消旋酶。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明還適用于包含其他酶例如氨甲?；饷?carbamoylases)的混合物。在第二個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含酶、辛醇和過(guò)渡金屬離子的組合物。酶和金屬的組合本身是已知的。事實(shí)上，某類酶(即金屬酶)僅能在存在金屬時(shí)發(fā)揮功能。金屬酶是含有金屬離子輔因子的酶的總稱。事實(shí)上，所有酶中約四分之一到三分之一需要金屬來(lái)發(fā)揮它們的功能。金屬離子通常通過(guò)屬于多肽鏈中氨基酸和/或摻入酶內(nèi)的大環(huán)配體的氮、氧或硫原子來(lái)配位。金屬離子的存在允許金屬酶發(fā)揮功能，例如通過(guò)氨基酸中存在的有限的官能團(tuán)集合不容易進(jìn)行的氧化還原反應(yīng)(.Messerschmidt et al. , (2001)Handbook of Metalloproteins ；Wiley, ISBN 0-471-62743-7)。通常，這些金屬(例如過(guò)渡金屬)的量非常低，從而在配制物中的濃度不超過(guò)l-lOOymol/kg。事實(shí)上，更高的濃度對(duì)酶而言通常是有毒的。驚訝地發(fā)現(xiàn)，某些相對(duì)高濃度的過(guò)渡金屬對(duì)酶具有穩(wěn)定化效應(yīng)。因此，在包含酶的組合物中，范圍從2mmol/kg到lOOmmol/kg的過(guò)渡金屬離子濃度導(dǎo)致增強(qiáng)的酶穩(wěn)定性。優(yōu)選地，所述過(guò)渡金屬以范圍從2. 5mmol/kg到50mmol/kg，更優(yōu)選地從3mmol/kg到25mmol/ kg的濃度存在。優(yōu)選地，本發(fā)明的過(guò)渡金屬是鈷或錳。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)過(guò)渡金屬(有時(shí)也稱作過(guò)渡元素)是指下述元素，其原子具有不完全的d亞殼層，或能夠產(chǎn)生具有不完全的d亞殼層的陽(yáng)離子。該定義對(duì)應(yīng)于元素周期表的第3族到第11族。本發(fā)明的第二個(gè)方面中提供了用于制備包含酶和辛醇的組合物的方法，所述方法包括在生產(chǎn)所述酶后添加辛醇。所述生產(chǎn)可以是發(fā)酵過(guò)程，任選地之后進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)下游加工步驟，例如濃縮，例如通過(guò)蒸發(fā)、滲濾(diafiltration)、凍干、微量過(guò)濾、超濾和技術(shù)人員已知的相似或其他技術(shù)進(jìn)行。


圖1展示了辛醇和錳(Mn2+)的存在對(duì)來(lái)自Escherichia coll RV308的L-乙內(nèi)酰脲酶隨時(shí)間的殘余活性的影響。Y-軸表示以％為單位的相對(duì)于起始活性(設(shè)定為100%) 的殘余活性。X-軸表示孵育時(shí)間(g)。圖例 =空白(未添加Mn2+或辛醇)；Δ= ImM Mn2+ ；A = 5mM Mn2+; =IOmM Mn2+；〇=辛醇；·=辛醇+ImM Mn2+；■=辛醇+5mM Mn2+ ；□ =辛醇+IOmM Mn2+?？梢钥闯觯链嫉奶砑訉?dǎo)致與空白樣品相比殘余活性的提高。與ImM、 5mM和IOmM Mn2+(它們自身也對(duì)酶活性的穩(wěn)定化具有影響)的組合進(jìn)一步增強(qiáng)了辛醇的積極貢獻(xiàn)。
實(shí)施例材料和方法除非另有說(shuō)明，使用的所有分子技術(shù)基本上根據(jù)Maniatis et al. (J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis. Molecular Cloning 2nd edition. CSH Press)進(jìn)行。用于將pKECaroP-hyul 構(gòu)建體轉(zhuǎn)化進(jìn) Escherichia coli RV308 的流程·在冰上融化hcherichia coli RV308小份試樣QOO μ 1，超感受態(tài)) 添加15 μ 1 LR反應(yīng)混合物(見上文)·在冰上孵育30分鐘
·42 熱激1分鐘·在冰上將細(xì)胞冷卻2分鐘·添加1ml LB培養(yǎng)基(5g/l NaCl、5g/l酵母提取物、10g/l胰蛋白胨) 在37°C孵育1小時(shí)·涂布在補(bǔ)充有卡那霉素的LB瓊脂平板上(5g/l NaCl、5g/l酵母提取物、10g/l 胰蛋白胨、15g/l瓊脂、50mg/l卡那霉素)·在下孵育M小時(shí)·分離單個(gè)菌落用于在Escherichia coli RV308中表汰Hyu基因的流稈使用來(lái)自轉(zhuǎn)化(見上文)的單個(gè)克隆接種補(bǔ)充有0. 05g/l卡那霉素和分別為ImM MnCl2或CoCl2的5ml 2xTY培養(yǎng)基(10g/l酵母提取物、16g/l胰胨、5g/l NaCl) 0將培養(yǎng)物在和150rpm下孵育M小時(shí)，然后用于接種補(bǔ)充有0. 05g/l卡那霉素和分別為ImM MnCl2或CoCl2的IOOmlhTY培養(yǎng)基。將培養(yǎng)物在前述條件下再次孵育小時(shí)，隨后通過(guò)離心(20分鐘，5000rpm，4°C )收獲。將細(xì)胞沉淀物重懸于5ml Tris-HCl (lOOmM,pH7)中， 再次離心(20分鐘，5000rpm，4°C )，并將細(xì)胞冷凍于_20°C下。分析方法乙內(nèi)酰脲酶活件測(cè)定法單位定義一個(gè)乙內(nèi)酰脲酶活件單位被定義為在pH8. 0和40°C下每分鐘生產(chǎn) Iymol N-氨甲?；奖彼岬拿傅牧俊５子?30mM TRIS/HC1緩沖液pH8. 0中的IOOmM D/L-苯丙氨酸乙內(nèi)酰脲懸浮液， 其還含有1. 43mM MnCl2。樣品預(yù)處理將一克樣品懸浮于還含有1. 43mM MnCl2的IOmL 130mM TRIS/HC1緩沖液PH8.0中。混合后用相同的緩沖液將懸浮液稀釋至約0.9U/mL。使用前將樣品保持在冰上。該方法的線性范圍是從0. 16到1. 62U/mL。測(cè)定法將2. ImL底物懸浮液置于反應(yīng)管中，隨后在40°C水浴中預(yù)加熱10分鐘。 通過(guò)添加100 μ L樣品并混合來(lái)起始反應(yīng)。通過(guò)用100 μ L緩沖液代替樣品來(lái)孵育底物，使底物空白被包括在內(nèi)。30分鐘后如下所述終止酶促反應(yīng)添加400 μ L IM HCl溶液，之后混合，并隨后在冰水上冷卻。將反應(yīng)混合物在0.45 μ m濾器上過(guò)濾。將澄清的溶液轉(zhuǎn)移進(jìn) HPLC注射管中。Ml=ImM N-氨甲?；?L-苯丙氨酸和L-苯丙氨酸。反應(yīng)混合物和標(biāo)準(zhǔn)的HPLC ·柱Xbridge 苯基 5 μ m，4. 6X150mm, Waters·檢測(cè)器UV@220nm 流速1.2mL/分鐘 注射體積20 μ 1 樣品架溫度10°C·柱溫度室溫·運(yùn)行時(shí)間20分鐘·流動(dòng)相 A :40mM 磷酸緩沖液；ρΗ5· 2/ 乙腈(98/2 (v/v))
·流動(dòng)相 B :40mM 磷酸緩沖液；ρΗ5· 2/ 乙腈(70/30 (v/v))·梯度
時(shí)間[分鐘]I流動(dòng)相Α[%]~~流動(dòng)相Β[%]
權(quán)利要求
1.包含酶和辛醇的組合物，其中辛醇的量為按總組合物重量計(jì)0.到5%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述辛醇是1-辛醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求1到2中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述酶是乙內(nèi)酰脲酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的組合物，其還包含氨甲?；饷浮?br> 5.根據(jù)權(quán)利要求3到4中任一項(xiàng)所述的組合物，其還包含消旋酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到5中任一項(xiàng)所述的組合物，其還包含過(guò)渡金屬離子。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其中所述過(guò)渡金屬是鈷或錳。
8.用于生產(chǎn)包含酶和辛醇的下述組合物的方法，其中辛醇的量為按總組合物重量計(jì) 0. 到5 %，所述方法包括在生產(chǎn)所述酶之后添加辛醇。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述辛醇是1-辛醇。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含酶和辛醇的組合物。另外，本發(fā)明涉及包含過(guò)渡金屬離子的組合物。
文檔編號(hào)C12N9/86GK102482661SQ201080031045
公開日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月9日
發(fā)明者威廉·比杰勒威爾德, 洛蘭德·克里斯琴·沃林格, 魯?shù)婪颉し丁さ隆げ?申請(qǐng)人:中化帝斯曼制藥有限公司荷蘭公司