專利名稱：提高維生素k依賴性蛋白質(zhì)的表達(dá)產(chǎn)量的方法
提高維生素K依賴性蛋白質(zhì)的表達(dá)產(chǎn)量的方法維生素K參與蛋白質(zhì)中某些谷氨酸殘基的羧化以形成Y-羧基谷氨酸殘基 (Gla-殘基)。經(jīng)修飾的殘基位于稱為Gla結(jié)構(gòu)域的特定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域內(nèi)。Gla-殘基通常參與鈣結(jié)合。Gla-殘基是所有已知Gla-蛋白的生物活性所必需的。在過(guò)去30年已闡明了如何將維生素K用于把Glu轉(zhuǎn)化成Gla的生物化學(xué)法。在細(xì)胞內(nèi)，維生素K通過(guò)維生素K環(huán)氧化物還原酶(VKOR)被電子還原成維生素K的還原形式 (稱為維生素K氫醌)。編碼VKOR的基因(VKORCl)最近已被鑒定，并且詳細(xì)地描述于Rost 等人，2004(Q004)Nature，427，537-541))中。隨后另一種酶氧化維生素K氫醌以使Glu 羧化成Gla;該酶稱為Y-谷氨酰羧化酶或維生素K依賴性羧化酶(VKGC)。只有這種羧化酶能夠同時(shí)將維生素K氫醌氧化成維生素K環(huán)氧化物時(shí)，羧化反應(yīng)才進(jìn)行；羧化和環(huán)氧化反應(yīng)據(jù)認(rèn)為是偶聯(lián)反應(yīng)。維生素K環(huán)氧化物隨后被維生素K環(huán)氧化物還原酶再轉(zhuǎn)變成維生素K。這兩種酶包含所謂的維生素K循環(huán)(維生素K)。http //en. wikipedia. org/wiki/ Vitamin K—cite note-Stafford_28#cite note-Stafford-28。目前，已在一級(jí)結(jié)構(gòu)水平上表征了下列人含Gla蛋白質(zhì)凝血因子11(凝血酶原)、VII、IX、X、抗凝蛋白C和S及因子X(jué)靶向蛋白Z，以及骨Gla-蛋白質(zhì)骨鈣素、抑制鈣化的基質(zhì)Gla蛋白(MGP)、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的生長(zhǎng)抑制特異性基因6蛋白(Gas6)以及功能仍然未知的4種跨膜Gla蛋白(TMGP)?？捎米骷せ預(yù)xl受體酪氨酸激酶和刺激細(xì)胞增殖或阻止某些細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的生長(zhǎng)因子。在其功能已知的所有情況下，此類蛋白質(zhì)中的 Gla殘基的存在顯示是功能活性所必需的。多個(gè)Gla殘基允許Gla-結(jié)構(gòu)域經(jīng)歷構(gòu)象變化， 所述構(gòu)象變化是維生素K依賴性蛋白的活性以及對(duì)磷脂膜表面的結(jié)合所必需的。維生素K依賴性凝血蛋白質(zhì)需要完全或幾乎完全羧化來(lái)在鈣離子存在的情況下結(jié)合膜表面。如果維生素K拮抗劑抑制Y羧化，那么羧化不全的維生素K依賴性蛋白不能形成鈣依賴性結(jié)構(gòu)，這導(dǎo)致對(duì)磷脂膜的低親和力和較低的活性。B型血友病患者中發(fā)現(xiàn)的羧化不全因子IX突變體的前凝血?jiǎng)┗钚詥适Э蓺w因于受損的鈣誘導(dǎo)構(gòu)象變化和結(jié)合磷脂小囊泡的能力的喪失。生物技術(shù)已提供了產(chǎn)生低成本生物藥劑產(chǎn)品的希望。關(guān)于凝血因子，這提供了為更廣泛的血友病患者提供充分治療的機(jī)會(huì)。不幸地，該希望主要因天然存在的生物分子的固有復(fù)雜性和多種與它們的重組蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)物在基因工程改造的細(xì)胞中的合成相關(guān)的限制而未得到滿足。本申請(qǐng)針對(duì)的是對(duì)產(chǎn)生維生素K依賴性蛋白例如因子IX或因子IX或因子VII/ VIIa的方法的需要，所述蛋白已被適當(dāng)加工以便它們具有活性并且對(duì)于商業(yè)生產(chǎn)來(lái)說(shuō)具有足夠的產(chǎn)率。為了增加維生素K依賴性凝血蛋白的可用度(以滿足對(duì)出血障礙例如B型血友病的治療的世界范圍內(nèi)醫(yī)學(xué)需要)，提高完全功能性蛋白質(zhì)的產(chǎn)量，在本實(shí)例中需要來(lái)自基因工程改造的細(xì)胞的因子IX。具體地，需要鑒定和補(bǔ)充獲得基本上完全的翻譯后修飾所需要的酶促活性的缺乏。因此，存在對(duì)在宿主生物中增加維生素K依賴性蛋白的表達(dá)，特別是重組表達(dá)，從而導(dǎo)致表達(dá)的維生素K依賴性蛋白的分泌速率和/或活性提高的強(qiáng)烈需求。
在人因子IX的情況下，Y -羧化蛋白質(zhì)的重組過(guò)表達(dá)顯示對(duì)更高的分泌率下前肽切割和Y -羧化的限制，從而當(dāng)維生素K在培養(yǎng)基中可過(guò)量獲得時(shí)，也產(chǎn)生只被Gla殘基部分占據(jù)的蛋白質(zhì)。這導(dǎo)致分泌活性減小的維生素K依賴性重組蛋白變體。維生素K向培養(yǎng)基的加入在高表達(dá)水平上不增加因子IX活性。已顯示為了引發(fā)活性因子IX而需要存在于細(xì)胞培養(yǎng)基中的維生素K達(dá)到5 μ g/ml的飽和度。低于該水平，活性因子IX從中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞的分泌量依賴于維生素K濃度(Kaufman, R.J.等人(1986)，J. Biol. Chem.， 261,9622-9628)。維生素K和維生素K類似物構(gòu)成一組具有共同的2-甲基-1，4-萘醌結(jié)構(gòu)(稱為甲萘醌)的親脂性、疏水性維生素。維生素的維生素K族的所有成員共有甲基化的萘醌環(huán)結(jié)構(gòu)，并且在于3位置連接的脂肪族側(cè)鏈中變化。植物和藍(lán)細(xì)菌(cyanobacteria)(幾乎不變地)只合成一種稱為葉綠醌 (phylloquinone)(也稱為維生素K1)的化學(xué)形式，其具有與葉綠素中相同的植基(phytyl) 側(cè)鏈。通常由腸中細(xì)菌產(chǎn)生的甲基萘醌類(也稱為維生素K2)與葉綠醌的差異在于3-側(cè)鏈通常包含重復(fù)異戊二烯基單元的聚合物而非植基鏈。為了命名，按照異戊二烯基單元的數(shù)目分類甲基萘醌類，該數(shù)目以后綴給出(即縮寫為Mk-n的甲基萘醌-η)，一些異戊二烯基單元也可被飽和，如由前綴二氫、四氫等所標(biāo)示的，并且縮寫為Mk-N (H2)、Mk-N (H4)等。普遍公認(rèn)萘醌是官能團(tuán)，其作用機(jī)制對(duì)于所有維生素K類是相似的。在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中還顯示甲萘醌和還原型甲萘醌在促進(jìn)Y羧化中無(wú)活性 (Sadowski 等人(1976)，J. Biol. Chem.第 251 卷，No. 9pp. 2770-2776)。除了將維生素K補(bǔ)充到細(xì)胞培養(yǎng)基中外，還已嘗試增加功能性維生素K的表達(dá)的其他方法。維生素K依賴性γ -羧化酶(VKGC)的過(guò)表達(dá)在因子IX的情況下未導(dǎo)致蛋白質(zhì)分泌增力口 (Rehemtulla, Α.等人(1993) PNAS 90,4611-4615)。最近一些研究小組顯示，VKGC和VKOR的共表達(dá)可增加功能性維生素K依賴性蛋白的表達(dá)水平(W0 2005/030039、WO 2005/040367、W02006/089613、WO 2006/101474、WO 2007/065173 和 WO 2007/075976)。發(fā)明概述本發(fā)明的發(fā)明者已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，通過(guò)用選自i)維生素K的還原形式和/或 ii)維生素K類似物的還原形式和/或iii)維生素K前體的還原形式之中的一種或多種化合物補(bǔ)充維生素K依賴性蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基，相應(yīng)的活性維生素K依賴性蛋白的表達(dá)產(chǎn)率與當(dāng)將相同量的所述各維生素K和/或維生素K其類似物和/或維生素K前體(但非其還原形式)加入細(xì)胞培養(yǎng)基時(shí)獲得的表達(dá)產(chǎn)率相比較而言獲得顯著增加。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是維生素K的還原形式和/或維生素K類似物的還原形式用于增加哺乳動(dòng)物細(xì)胞中功能性維生素K依賴性蛋白的表達(dá)產(chǎn)率的用途。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及產(chǎn)生重組生物活性維生素K依賴性蛋白產(chǎn)物的方法， 該方法包括在細(xì)胞培養(yǎng)基(所述培養(yǎng)基在表達(dá)期過(guò)程中至少在一些時(shí)間點(diǎn)包含維生素K的還原形式和/或維生素K類似物的還原形式和/或維生素K前體的還原形式)中使用具有
5與表達(dá)所述生物活性維生素K依賴性蛋白的啟動(dòng)子有效連接的編碼維生素K依賴性蛋白的至少一個(gè)基因的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，和收獲所述維生素K依賴性蛋白產(chǎn)物。任選地，哺乳動(dòng)物細(xì)胞系此外還包含與至少一個(gè)啟動(dòng)子有效連接的編碼加工因子(processing factor)的基因。在優(yōu)選實(shí)施方案中，維生素K依賴性蛋白產(chǎn)物為因子II、因子VII、因子IX、因子X(jué)、蛋白C或蛋白S。更優(yōu)選地，維生素K依賴性蛋白為因子IX或因子VII。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述加工因子是與一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子有效連接的核酸，所述 tISIit S ^BI (paired basicamino acid converting enzyme) (PACE) > 維生素K依賴性環(huán)氧化物還原酶(VKOR)、維生素K依賴性Y-谷氨酰羧化酶(VKGC)和其組合。更優(yōu)選，所述加工因子蛋白包括VKOR和VKGC。優(yōu)選地，所述基因中的至少一個(gè)被過(guò)表達(dá)。本發(fā)明因而包括選自i)維生素K的還原形式和/或ii)維生素K類似物的還原形式和/或iii)維生素K前體的還原形式之中的一種或多種化合物用于在細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)一種或多種功能性維生素K依賴性蛋白的用途，以及用于發(fā)酵表達(dá)一種或多種維生素 K依賴性蛋白的真核細(xì)胞的方法，其中在發(fā)酵方法之前和/或在發(fā)酵方法過(guò)程中將選自i) 維生素K的還原形式和/或ii)維生素K類似物的還原形式和/或iii)維生素K前體的還原形式之中的一種或多種化合物加入細(xì)胞培養(yǎng)基。本發(fā)明還包括維生素K和/或維生素K類似物和/或維生素K前體的還原形式用于在發(fā)酵中增加細(xì)胞的存活力的用途。附圖概述

圖1 前體因子IX的維生素K依賴性羧化。圖2 維生素K1、K2和甲萘醌的化學(xué)式。圖3 亞硫酸氫鈉甲萘醌的還原。圖4 實(shí)驗(yàn)2中反應(yīng)器Α4和Β4的總活細(xì)胞數(shù)目曲線。圖5 實(shí)驗(yàn)3中4個(gè)反應(yīng)器的活細(xì)胞密度曲線。圖6 在增加滴度的MSB和rMSB下細(xì)胞的存活力隨時(shí)間的關(guān)系。圖7 在增加滴度的MSB和rMSB下活細(xì)胞密度數(shù)據(jù)。發(fā)明詳述雖然所描述的實(shí)施方案代表了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)應(yīng)理解，可進(jìn)行改變而不背離本發(fā)明的要旨。本發(fā)明的范圍因此只由所附權(quán)利要求書確定。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案涉及維生素K的還原形式和/或維生素K類似物的還原形式和/或維生素K前體的還原形式用于增加細(xì)胞培養(yǎng)物中功能性維生素K依賴性蛋白的表達(dá)產(chǎn)率的用途。將維生素K的還原形式和/或維生素K類似物的還原形式和/或維生素K 前體的還原形式添加至細(xì)胞培養(yǎng)基中，在所述培養(yǎng)基中其被細(xì)胞吸收。優(yōu)選地，使用水溶性的維生素K的還原形式和/或維生素K類似物的還原形式和 /或維生素K前體的還原形式。然而，通過(guò)胞吞作用和/或特異性受體，不溶于水的維生素 K的還原形式和/或維生素K類似物的還原形式和/或維生素K前體的還原形式也可被細(xì)胞吸收。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及維生素K的還原形式和/或維生素K類似物的還原形式和/或維生素K前體的還原形式用于在細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)功能性維生素K依賴性蛋白的用途，其中相應(yīng)功能性維生素K依賴性蛋白的表達(dá)產(chǎn)率與當(dāng)將相同量的相應(yīng)維生素K和/ 或維生素K類似物和/或維生素K前體但非其還原形式以相同的方式加入細(xì)胞培養(yǎng)基時(shí)獲得的表達(dá)產(chǎn)率相比較而言得到增加。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案涉及用于增加哺乳動(dòng)物細(xì)胞中生物活性維生素K依賴性蛋白的產(chǎn)率的方法。優(yōu)選對(duì)所述細(xì)胞進(jìn)行基因工程改造。針對(duì)因子IX和因子VII的產(chǎn)生描述了本發(fā)明的實(shí)施方案。然而，所述公開(kāi)的方法適用于所有維生素K依賴性蛋白凝血因子II (凝血酶原)、VII、IX和X、抗凝蛋白C和S 及因子X(jué)靶向蛋白Z，以及骨Gla-蛋白骨鈣素、抑制鈣化的基質(zhì)Gla蛋白(MGP)、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的生長(zhǎng)抑制特異性基因6蛋白(Gas6)以及所述4種跨膜Gla蛋白(TMGP)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，維生素K依賴性蛋白在表達(dá)期期間的某些時(shí)間點(diǎn)上在含有維生素K的還原形式和/或維生素K類似物的還原形式和/或維生素K前體的還原形式的細(xì)胞培養(yǎng)基中表達(dá)。維生素K和維生素K類似物包括一組具有共同的2-甲基-1，4-萘醌結(jié)構(gòu)(稱為甲萘醌)的親脂性、疏水性維生素。本發(fā)明的維生素K族的所有成員共有甲基化的萘醌環(huán)結(jié)構(gòu)，并且在于3-位置上連接的脂肪族側(cè)鏈中具有變化。植物和藍(lán)細(xì)菌(幾乎不變地)只合成一種稱為葉綠醌(也稱為維生素K1)的化學(xué)形式，其具有與葉綠素中相同的植基側(cè)鏈。通常由腸中細(xì)菌產(chǎn)生的甲基萘醌類(也稱為維生素K2)與葉綠醌的差異在于3-側(cè)鏈通常包含重復(fù)異戊二烯基單元的聚合物而非植基鏈。為了命名，按照異戊二烯基單元的數(shù)目分類甲基萘醌類，該數(shù)目以后綴給出(即縮寫為Mk-n的甲基萘醌-η)，一些異戊二烯基單元也可被飽和，如由前綴二氫、四氫等所標(biāo)示的，并且縮寫為Mk-n (H2)、Mk-n (H4)等。通常認(rèn)識(shí)到萘醌是官能團(tuán)，其作用機(jī)制對(duì)于所有維生素K類是相似的。在部分純化的肝微粒體酶制劑中測(cè)量葉綠醌和幾種甲基萘醌類用作VKGC的輔因子的相對(duì)能力(Buitenhuis 等人，Biochim. Biophys Acta (1990) 1034 :170-175) 甲基萘醌類的活性隨3-側(cè)鏈長(zhǎng)度變化而變化，并且隨著長(zhǎng)度增加而活性減小。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“維生素K”包括a)維生素Kl (葉綠醌，參見(jiàn)圖2)，包括其各種鹽，如維生素Kl 二磷酸鹽Q-甲基-3-植基-1，4-萘氫醌-1，4- 二磷酸鹽)、維生素Kl 二乙酸鹽O-甲基-3-植基-1，4-萘氫醌-1，4- 二乙酸鹽)和維生素Kl 二硫酸鹽(2-甲基-3-植基-1，4-萘氫醌-1，4- 二硫酸鹽)。b)具有可變數(shù)目(η)的維生素Κ2 (甲基萘醌類，參見(jiàn)圖2)c)維生素K類似物d)維生素K前體如甲萘醌(參見(jiàn)圖2)、甲萘氫醌二乙酸鹽O-甲基-1，4-萘氫醌二乙酸鹽)、甲萘氫醌二磷酸鹽O-甲基-1，4- 二羥基萘-雙(二氫磷酸)四鈉六水合物)、 甲萘氫醌二丁酸鹽(2-甲基-1，4- 二羥基萘二丁酸鹽)、甲萘氫醌二硫酸鹽2-甲基-1， 4-二羥基萘雙(硫酸氫)二鈉鹽、甲萘醌煙酰胺亞硫酸氫鹽(2-甲基-1，4-二羥基萘雙(硫酸氫)二鈉鹽和甲萘多昔(3-甲基-4-氧-1 (4H)-萘乙二烯)氨基]氧基]-醋酸銨鹽。如本文中所使用的，“維生素K類似物”包含任何其他化合物，只要所述化合物包含2-甲基-1，4-萘醌環(huán)結(jié)構(gòu)并且可在維生素K依賴性蛋白的谷氨酸殘基向Gla殘基的維生素K循環(huán)依賴性γ羧化中在功能上替代維生素Kl即可。如本文中所使用的，“維生素K前體”包括任何其他化合物，所述化合物在被哺乳動(dòng)物細(xì)胞吸收后可被所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)化成化合物，所述化合物包含甲基化的萘醌環(huán)結(jié)構(gòu)，并且可在維生素K依賴性蛋白的谷氨酸殘基至Gla殘基的維生素K循環(huán)依賴性γ羧化中在功能上替代維生素Kl即可，例如甲萘醌。如本文中所使用的，“維生素K的還原形式和/或生素K類似物的還原形式和/或維生素K前體的還原形式”意指任何化合物，包括如上定義的維生素K、維生素K類似物和維生素K前體的不同形式的氫醌形式，所述化合物可被接受為將維生素K依賴性蛋白中的谷氨酸殘基轉(zhuǎn)化成Gla-殘基的羧化反應(yīng)中VKGC的共底物而無(wú)需其他還原步驟。維生素K的還原形式和/或維生素K類似物的還原形式和/或維生素K前體的還原形式必須在目的維生素K依賴性蛋白的表達(dá)期過(guò)程中一些時(shí)間點(diǎn)上存在于細(xì)胞培養(yǎng)基中。本發(fā)明包括表達(dá)維生素K依賴性蛋白的方法，其中細(xì)胞培養(yǎng)基中包含單一的維生素K 的還原形式或單一的維生素K類似物的還原形式或單一的維生素K前體的還原形式或化合物的這些種類中每一種類的超過(guò)一個(gè)成員以及化合物的這些種類中每一個(gè)種類的一個(gè)或多個(gè)成員的組合。還原醌類的一個(gè)方法是利用鋅粉和氯化鋅或鋅粉和氫離子的作用。已知在酸性pH下，優(yōu)選在2至4. 5的pH下的抗壞血酸(Isaacs等人(1997) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2，第1465至1467頁(yè))具有有限的還原醌類的能力。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是通過(guò)使用鋅粉與約pH5. 3下的抗壞血酸的組合以利用鋅還原MSB來(lái)產(chǎn)生rMSB的新型方法?？箟难嵊米鳉潆x子的來(lái)源和幫助使rMSB保持還原形式。本發(fā)明的其他實(shí)施方案涉及產(chǎn)生重組生物活性維生素K依賴性蛋白產(chǎn)物的方法， 所述方法包括在細(xì)胞培養(yǎng)基中使用具有與表達(dá)所述生物活性維生素K依賴性蛋白的啟動(dòng)子有效連接的編碼維生素K依賴性蛋白的基因的哺乳動(dòng)物細(xì)胞和收獲維生素K依賴性蛋白產(chǎn)物，所述培養(yǎng)基在表達(dá)期過(guò)程中至少在某些時(shí)間點(diǎn)上包含維生素K的還原形式和/或維生素K類似物的還原形式和/或維生素K前體蛋白的還原形式。任選地，此外細(xì)胞系包含與至少一個(gè)啟動(dòng)子有效連接的編碼加工因子的至少一個(gè)基因。如本文中所使用的，“功能性”是指維生素K依賴性蛋白，當(dāng)從血漿分離時(shí)，優(yōu)選具有相應(yīng)維生素K依賴性蛋白的至少10%，優(yōu)選至少25%的生物活性。例如，當(dāng)表達(dá)因子IX 時(shí)，參照來(lái)源于人血漿的因子IX標(biāo)準(zhǔn)例如Μ0Ν0ΝΙΝΕ (CSL Behring)測(cè)定其功能性。相應(yīng)維生素K依賴性蛋白標(biāo)準(zhǔn)的生物活性被視為100%。相應(yīng)維生素K依賴性蛋白優(yōu)選具有相應(yīng)維生素K依賴性蛋白標(biāo)準(zhǔn)的生物活性的至少10%。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的相應(yīng)維生素K依賴性蛋白具有相應(yīng)維生素K依賴性蛋白標(biāo)準(zhǔn)的生物活性的至少25%，更優(yōu)選相應(yīng)維生素K依賴性蛋白標(biāo)準(zhǔn)的生物活性的至少50%。本發(fā)明的另一個(gè)方面是通過(guò)在本發(fā)明的方法或過(guò)程中使用維生素K的還原形式和/或維生素K類似物的還原形式和/或維生素K前體的還原形式，維生素K依賴性蛋白的比活性對(duì)維生素K依賴性蛋白的抗原含量的比率與當(dāng)將相同量的所述各維生素K和/或維生素K類似物和/或維生素K前體但非其還原形式以相同方式加入細(xì)胞培養(yǎng)基時(shí)獲得的維生素K依賴性蛋白的比活性對(duì)相同功能性維生素K依賴性蛋白的維生素K依賴性蛋白的抗原含量的比率相比較而言，優(yōu)選增加至少15%或優(yōu)選至少25%，或更優(yōu)選至少50%，或甚至更優(yōu)選至少75%或至少100%。以非限定性實(shí)例為例，在維生素K的還原形式和/或維生素K類似物的還原形式和/或維生素K前體的還原形式存在的情況下，根據(jù)本發(fā)明表達(dá)的維生素K依賴性蛋白因子IX具有至少0. 7，優(yōu)選至少1，更優(yōu)選至少1. 5或甚至更優(yōu)選至少2的活性/抗原比。本發(fā)明的另一個(gè)方面是通過(guò)在本發(fā)明的方法或過(guò)程中使用維生素K的還原形式和/或維生素K類似物的還原形式和/或維生素K前體的還原形式，維生素K依賴性蛋白的細(xì)胞密度比活性生產(chǎn)率(productivity)與當(dāng)將相同量的所述各維生素K和/或維生素 K類似物和/或維生素K前體但非其還原形式以相同方式加入細(xì)胞培養(yǎng)基時(shí)獲得的相同功能性維生素K依賴性蛋白的細(xì)胞密度比活性生產(chǎn)率相比較而言，增加至少25%或優(yōu)選至少 50%或更優(yōu)選至少75%。同樣地作為非限定性實(shí)例，在維生素K的還原形式和/或維生素K類似物的還原形式和/或維生素K前體的還原形式存在的情況下根據(jù)本發(fā)明表達(dá)的維生素K依賴性蛋白因子IX具有至少0. 22U/106個(gè)細(xì)胞/天或優(yōu)選至少U/106個(gè)細(xì)胞/天或至少0. 37U/106個(gè)細(xì)胞/天的細(xì)胞比活性生產(chǎn)率。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)用對(duì)于如WO 00作4787(將其通過(guò)引用并入本文)中論述的Y羧化酶具有更低的親和力的前肽序列替代天然前肽序列來(lái)增加Y-羧化作用。有用的前肽序列包括異源維生素K依賴性蛋白的野生型序列或前肽序列的改變形式或其組合。 維生素K依賴性蛋白的前肽序列是指導(dǎo)該蛋白質(zhì)的Y羧化的酶的識(shí)別元件。除非它們包含高百分比的Y羧化部分，否則維生素K依賴性蛋白不具有完全功能性。因此，當(dāng)產(chǎn)生此類蛋白質(zhì)的重組變型時(shí)，重要地實(shí)施機(jī)制以確保所述蛋白質(zhì)的完全Y羧化。幾個(gè)前肽序列的序列比對(duì)示于WO 00/54787的圖3中。因此，在本發(fā)明中有用的前肽是具有圖3中顯示的序列的那些前體，其中顯示了幾個(gè)有用的前肽的18個(gè)氨基酸序列連同此類前肽對(duì)于Y羧化酶的相對(duì)親和力?？赏ㄟ^(guò)修飾凝血酶原或蛋白C上氨基酸-9 或-13的任一個(gè)來(lái)產(chǎn)生低親和力前肽。優(yōu)選的修飾包括位置-9上的Arg或His殘基的置換和位置-13上的Pro或Ser殘基的置換。其他優(yōu)選的嵌合蛋白質(zhì)包括選自改變的因子IX、 因子X(jué)、因子VII、蛋白S、蛋白C和凝血酶原或與對(duì)于所選擇的前肽序列來(lái)說(shuō)是非天然的成熟維生素K依賴性蛋白組合的未改變前肽之中的前肽。術(shù)語(yǔ)“加工因子”是包括促進(jìn)功能性維生素K依賴性蛋白的形成的任何蛋白質(zhì)、 肽、非肽輔因子、底物或核酸的廣義術(shù)語(yǔ)。此類加工因子的實(shí)例包括但不限于PACE、VK0R和 VKGC0如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"PACE"是最初從人肝細(xì)胞系分離的成對(duì)堿性氨基酸轉(zhuǎn)化(或切割)酶的縮寫詞，其為枯草桿菌蛋白酶樣內(nèi)肽酶，即切割前肽的酶，其展示對(duì)于蛋白質(zhì)在堿性殘基例如-Lys-Arg-、-Arg-Arg或-Lys-Lys-處進(jìn)行切割的特異性。PACE和需要加工以產(chǎn)生成熟蛋白質(zhì)的前蛋白的共表達(dá)導(dǎo)致成熟蛋白的高水平表達(dá)。此外，PACE與需要Y-羧化以獲得生物活性的蛋白質(zhì)的共表達(dá)允許真核生物(優(yōu)選哺乳動(dòng)物)細(xì)胞中功能性的生物活性成熟蛋白質(zhì)的增加的產(chǎn)量的表達(dá)。維生素K依賴性環(huán)氧化物還原酶(VKOR)對(duì)于維生素K依賴性蛋白是重要的，因?yàn)樵谄錇檩o因子的反應(yīng)過(guò)程中所述維生素K被轉(zhuǎn)化成維生素K環(huán)氧化物。人飲食中維生素K 的量是有限的。因此，必須通過(guò)VKOR將維生素K環(huán)氧化物轉(zhuǎn)化回維生素K以防止耗盡。因此，與VLOR共轉(zhuǎn)染為維生素K依賴性酶例如維生素K依賴性Y-谷氨酰羧化酶(VKCG)的適當(dāng)功能發(fā)揮提供了充足的維生素K。維生素K依賴性VKCG的適當(dāng)功能發(fā)揮是維生素K依賴性凝血因子的Gla-結(jié)構(gòu)域的適當(dāng)Y -羧化所必需的。維生素K依賴性γ -谷氨酰羧化酶(VKGC)是參與維生素K依賴性蛋白的翻譯后修飾的酶。VKGC將羧基摻入谷氨酸以在前肽的約40個(gè)殘基內(nèi)修飾維生素K依賴性蛋白的多個(gè)殘基。人維生素K依賴性γ谷氨酰羧化酶的cDNA序列由美國(guó)專利5，沈8，275(將所述美國(guó)專利通過(guò)引用并入本文)進(jìn)行了描述。載體是具有在宿主中復(fù)制的能力(通常由復(fù)制起始點(diǎn)賦予的)和幫助識(shí)別轉(zhuǎn)化體的選擇基因的DNA構(gòu)建體。載體在本文中用于擴(kuò)增編碼維生素K依賴性蛋白的DNA和/或表達(dá)編碼維生素K依賴性蛋白的DNA。表達(dá)載體是可復(fù)制的DNA構(gòu)建體，其中編碼維生素K 依賴性蛋白的DNA序列與能夠?qū)崿F(xiàn)維生素K依賴性蛋白在適當(dāng)?shù)乃拗髦斜磉_(dá)的適當(dāng)控制序列有效連接。對(duì)于此類控制序列的需要將視所選擇的宿主和所選擇的轉(zhuǎn)化方法而變化。通常，控制序列包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、控制轉(zhuǎn)錄的任選操縱子序列、編碼適當(dāng)?shù)膍RNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列和控制轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止的序列。載體包括質(zhì)粒、病毒(例如腺病毒、巨細(xì)胞病毒)、噬菌體和DNA片段，所述載體能夠通過(guò)重組整合入宿主基因組。載體獨(dú)立于宿主基因組而復(fù)制和起作用，或在某些情況下可以整合入基因組本身。表達(dá)載體應(yīng)當(dāng)包含與待表達(dá)的基因有效連接的并且可在宿主生物中發(fā)揮作用的啟動(dòng)子和RNA結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)DNA區(qū)域在功能上彼此相關(guān)時(shí)，它們是有效連接或可操作地地關(guān)聯(lián)的。例如，如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么其與編碼序列有效連接；或如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被這樣放置以允許翻譯，則其與編碼序列有效連接。轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞是已使用重組DNA技術(shù)，用一個(gè)或多個(gè)包含一個(gè)或多個(gè)編碼一種或多種維生素K依賴性蛋白載體的基因的載體所轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。本發(fā)明的實(shí)施方案涉及為細(xì)胞提供加工維生素K依賴性蛋白的必需酶和輔因子， 以便獲得更高產(chǎn)量的生物活性維生素K依賴性蛋白。當(dāng)由重組細(xì)胞產(chǎn)生足夠水平的完全功能性維生素K依賴性蛋白時(shí)，避免了設(shè)計(jì)用以從想要的產(chǎn)品中除去無(wú)用的、部分修飾的或未修飾的維生素K依賴性蛋白的冗長(zhǎng)純化步驟。這降低了生產(chǎn)成本并且消除了可能對(duì)于患者具有不想要的副作用的無(wú)活性物質(zhì)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用于通過(guò)與PACE、VKGC和/或VKOR共表達(dá)來(lái)產(chǎn)生維生素K依賴性蛋白的方法可包括下列技術(shù)。首先，可將包含超過(guò)一種蛋白質(zhì)例如PACE和維生素K依賴性蛋白的編碼序列的單個(gè)載體插入所選擇的宿主細(xì)胞?？蛇x擇地，可將編碼維生素K依賴性蛋白+—種或多種其它蛋白質(zhì)的兩個(gè)或更多個(gè)分開(kāi)的載體插入宿主。當(dāng)在用于所選擇的宿主細(xì)胞的適當(dāng)條件下培養(yǎng)時(shí)，產(chǎn)生所述兩種或更多種蛋白質(zhì)并且相互作用以將前蛋白切割和修飾成成熟蛋白質(zhì)。另一個(gè)選擇是使用兩種轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中一種宿主細(xì)胞表達(dá)維生素K依賴性蛋白，并且另一種宿主細(xì)胞表達(dá)如下將被分泌入培養(yǎng)基的蛋白質(zhì)中的一種或多種PACE、 VKGC和/或VK0R?？稍谠试S重組維生素K依賴性蛋白和共表達(dá)的重組蛋白質(zhì)的表達(dá)和分泌或釋放(包括通過(guò)細(xì)胞外PACE切割成成熟形式和N-末端谷氨酸的γ羧化)的條件下共培養(yǎng)此類宿主細(xì)胞。在該方法中，優(yōu)選PACE蛋白缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域以便其分泌進(jìn)入培養(yǎng)基。在某些情況下，可能期望相對(duì)于另一基因而言具有多個(gè)拷貝、2或更多個(gè)拷貝的表達(dá)維生素K依賴性蛋白的基因，或反之亦然。這可以以多種方式實(shí)現(xiàn)。例如，可使用分開(kāi)的載體或質(zhì)粒，其中包含維生素K依賴性蛋白編碼多核苷酸的載體具有比包含另一多核苷酸序列的載體而言更多的拷貝數(shù)，或反之亦然。在該情況下，理想的是在2個(gè)質(zhì)粒上具有不同的選擇標(biāo)記，以便確這些保質(zhì)粒在宿主中的連續(xù)維持?？蛇x擇地，可將一個(gè)或兩個(gè)基因整合入宿主基因組，并且可使所述基因之一與擴(kuò)增基因(例如，dhfr或金屬硫蛋白基因之一)連接?？蛇x擇地，可使用兩個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，所述調(diào)控區(qū)具有不同轉(zhuǎn)錄起始率，提供增加的維生素K依賴性蛋白的表達(dá)或相對(duì)于維生素K依賴性蛋白而言任何其他加工因子蛋白的表達(dá)。作為另一選擇，可使用不同的啟動(dòng)子，其中一個(gè)啟動(dòng)子提供低水平的維生素K依賴性蛋白的組成型表達(dá)，而第二啟動(dòng)子提供高水平的或誘導(dǎo)型的另一產(chǎn)物的表達(dá)。許多種啟動(dòng)子對(duì)于所選擇的宿主細(xì)胞是已知的，并且可被本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地選擇和用于本發(fā)明，例如CMV、MMTV、SV 40或SRa啟動(dòng)子，它們均為公知的哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子。任選地通過(guò)過(guò)表達(dá)PACE、VKOR和/或VKGC中的一種或多種和/或通過(guò)修飾Gla區(qū)域以使Y-羧化最大化來(lái)使生物活性的維生素K依賴性蛋白例如因子IX或因子Vll/VIIa 的產(chǎn)量最大化。即，以充足的量表達(dá)限速成分以便整個(gè)系統(tǒng)運(yùn)行產(chǎn)生商業(yè)上可行的量的維生素K依賴性蛋白。適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞包括原核生物、酵母或高等真核細(xì)胞例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞。來(lái)源于多細(xì)胞生物的細(xì)胞是特別適合的用于重組維生素K依賴性蛋白合成的宿主，哺乳動(dòng)物細(xì)胞是特別優(yōu)選的。在細(xì)胞培養(yǎng)中增殖此類細(xì)胞已變成常規(guī)方法(Tissue Culture, Academic Press，Kruse和Patterson，編者(1973))。有用的宿主細(xì)胞系的實(shí)例是VERO和 HeLa細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系和WI138、HEK 293、BHK、C0S_7、Per· C6、H印G2、HeLa、 Vero、COS、CV以及MDCK細(xì)胞系。一個(gè)優(yōu)選的細(xì)胞系是CHO-Kl或CHO-S。此類細(xì)胞的表達(dá)載體通常包括(必要時(shí))復(fù)制起點(diǎn)、位于編碼待表達(dá)的維生素K 依賴性蛋白的DNA上游并且與其有效連接的啟動(dòng)子連同核糖體結(jié)合位點(diǎn)、RNA剪接位點(diǎn)(如果使用含內(nèi)含子的基因組DNA)、多腺苷酸化位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止序列。復(fù)制始點(diǎn)可通過(guò)構(gòu)建載體以包括外源起點(diǎn)來(lái)提供，例如其可來(lái)源于SV 40或其他病毒(例如，多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)來(lái)源，或可由宿主細(xì)胞染色體復(fù)制機(jī)制提供。如果將載體整合入宿主細(xì)胞染色體，那么后者通常是足夠的。不使用包含病毒復(fù)制起點(diǎn)的載體，而是可利用選擇標(biāo)記和維生素K依賴性蛋白的 DNA通過(guò)共轉(zhuǎn)化的方法來(lái)轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞。適當(dāng)?shù)倪x擇標(biāo)記的實(shí)例是二氫葉酸還原酶 (DHFR)或胸苷激酶。一般地，如果將除哺乳動(dòng)物細(xì)胞外的細(xì)胞用于表達(dá)維生素K依賴性蛋白時(shí)，可能必需還提供編碼目的蛋白質(zhì)的生物功能所需的翻譯后修飾所必需的蛋白質(zhì)的其他基因。本發(fā)明的克隆基因可編碼任何物種來(lái)源，包括小鼠、大鼠、兔、貓、豬和人，但優(yōu)選編碼人來(lái)源的維生素K依賴性蛋白。還涉及可與編碼本文中公開(kāi)的蛋白質(zhì)的DNA雜交的編碼維生素K依賴性蛋白的DNA。
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此類序列的雜交可在減小的嚴(yán)格度的條件或甚至嚴(yán)格條件(例如，由在標(biāo)準(zhǔn)原位雜交測(cè)定中針對(duì)編碼本文中公開(kāi)的維生素K依賴性蛋白的DNA的60°C或甚至70°C 下0. 3M NaCl，0.03M檸檬酸鈉，0. SDS的洗滌嚴(yán)格度代表的條件。參見(jiàn)J. Sambrook 等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第 2d 版，1989Cold Spring Harbor Laboratory))提及的用于在細(xì)胞培養(yǎng)中表達(dá)維生素K依賴性蛋白的方法是懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法，其中存在3個(gè)主要選擇1.灌注法和2.分批法以及3.充排法(draw-fill processes) 01.灌注法在懸浮細(xì)胞-灌注法中，將細(xì)胞接種在裝有培養(yǎng)基優(yōu)選不存在動(dòng)物來(lái)源成分的種子培養(yǎng)容器中并且進(jìn)行增殖直至細(xì)胞達(dá)到最低密度。隨后，將擴(kuò)增的種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至裝有不存在動(dòng)物來(lái)源成分的培養(yǎng)基的大規(guī)模培養(yǎng)容器內(nèi)并且進(jìn)行增殖直至至少達(dá)到預(yù)定的細(xì)胞密度。在該時(shí)期中，將細(xì)胞以懸浮形式生長(zhǎng)以允許培養(yǎng)容器內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量增加至預(yù)定或臨界值。通過(guò)用新鮮培養(yǎng)基連續(xù)灌注培養(yǎng)容器來(lái)實(shí)施培養(yǎng)基更換。灌注的培養(yǎng)基的量取決于細(xì)胞密度，并且通?？梢詾?0-300%，優(yōu)選10%至 95%，25%至80%的罐體積/天04小時(shí))。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到適合于啟動(dòng)生產(chǎn)期的值時(shí)，每M小時(shí)更換罐中60-95%的罐培養(yǎng)基，優(yōu)選80%的罐培養(yǎng)基。也優(yōu)選地將80%的培養(yǎng)基更換用于生產(chǎn)期。在生長(zhǎng)期中，增殖培養(yǎng)物直至細(xì)胞達(dá)到一定密度。達(dá)到該密度后，培養(yǎng)物進(jìn)入生產(chǎn)期。也可在該點(diǎn)上改變?cè)O(shè)置點(diǎn)，將其設(shè)置在適合產(chǎn)生相應(yīng)維生素K依賴性蛋白的值上。優(yōu)選連續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)基灌注?？梢悦看_定的時(shí)期內(nèi)培養(yǎng)基的百分比罐體積的培養(yǎng)基來(lái)表示培養(yǎng)基的流速。培養(yǎng)基灌注可以為10至200%的罐體積/10-48小時(shí)，優(yōu)選地，培養(yǎng)基灌注為90% /10-48小時(shí)，更優(yōu)選80%罐體積/ 小時(shí)?？墒褂迷S多細(xì)胞保留裝置來(lái)實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)容器內(nèi)的細(xì)胞保留。可將下列成套裝置用于該方法。(1).外置沉降頭(External settling head)(2).內(nèi)置沉降頭(Internal settling head)(3).連續(xù)離心機(jī)(4).內(nèi)置或外置旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器(spin filter)(5).外置過(guò)濾器或中空纖維濾注(hollow fibre cartridge)(6).超聲細(xì)胞分離裝置(7).培養(yǎng)容器內(nèi)部的一段管。2.分批法2.1簡(jiǎn)單分批法在簡(jiǎn)單分批法中，將細(xì)胞接種至裝有不存在動(dòng)物來(lái)源成分的培養(yǎng)基的種子培養(yǎng)容器中并且增殖直至細(xì)胞達(dá)到最低密度。隨后將擴(kuò)增的種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至裝有培養(yǎng)基(優(yōu)選不存在動(dòng)物來(lái)源成分)的大規(guī)模培養(yǎng)容器中。然后操作培養(yǎng)容器直至培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物被耗盡。
必須確定收獲的時(shí)間。操作常規(guī)分批法直至所有營(yíng)養(yǎng)物被耗盡。然而，這通常引起細(xì)胞裂解，這可對(duì)產(chǎn)物造成損害或可對(duì)純化引起問(wèn)題。2. 2補(bǔ)料分批法如先前提到的，簡(jiǎn)單分批法包括利用細(xì)胞接種培養(yǎng)容器和操作培養(yǎng)罐直至培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物被耗盡。分批法例如該方法可通過(guò)將營(yíng)養(yǎng)物的濃縮液補(bǔ)充至罐中來(lái)進(jìn)行擴(kuò)展。 這延長(zhǎng)了處理時(shí)間并且最終導(dǎo)致培養(yǎng)容器內(nèi)相應(yīng)維生素K依賴性蛋白的產(chǎn)量增加。通常，培養(yǎng)物中最至關(guān)重要的營(yíng)養(yǎng)物是葡萄糖濃度。因此，可將進(jìn)料的控制和起始與該營(yíng)養(yǎng)物的水平聯(lián)系起來(lái)。當(dāng)葡萄糖濃度下降至低于臨界值時(shí)，開(kāi)始進(jìn)料，并且加入的進(jìn)料量足以使葡萄糖濃度升回至該臨界值。如在簡(jiǎn)單分批中一樣，必須將收獲的時(shí)間確定為罐的最長(zhǎng)可能操作與細(xì)胞裂解和產(chǎn)品質(zhì)量降低的風(fēng)險(xiǎn)之間的平衡。進(jìn)料的添加方法也是可變的。可以以單脈沖形式(每天1次、2次、3次等)加入進(jìn)料或可在整個(gè)M小時(shí)期間逐漸進(jìn)料。必須確定收獲的時(shí)間。操作常規(guī)或簡(jiǎn)單分批直至所有營(yíng)養(yǎng)物耗盡。然而，因毒性代謝產(chǎn)物的積累，該方法不能無(wú)限持續(xù)。這導(dǎo)致細(xì)胞生存力的減少和最終細(xì)胞裂解。這可引起對(duì)產(chǎn)物的破壞或?qū)﹄S后的純化產(chǎn)生問(wèn)題。3.充排法簡(jiǎn)單draw-fill法與重復(fù)的分批發(fā)酵十分相似。在分批發(fā)酵中，細(xì)胞生長(zhǎng)在培養(yǎng)容器中并且在運(yùn)行結(jié)束時(shí)收獲培養(yǎng)基。在充排法中，在任何營(yíng)養(yǎng)物耗盡之前收獲培養(yǎng)容器。 與從培養(yǎng)瓶除去所有內(nèi)容物，其中僅除去一定比例的罐體積(通常是80%的罐體積)。在收獲后，將相同體積的新鮮培養(yǎng)基加回容器。隨后使細(xì)胞在容器中再生長(zhǎng)一次并且在一定天數(shù)后進(jìn)行另外80%的收獲。在重復(fù)的分秕法中，可將收獲后留在容器中的細(xì)胞用作下一批次的接種物?？梢詢蓚€(gè)階段操作所述方法，第一階段與簡(jiǎn)單分批法一樣操作。在第一次收獲后， 再次如簡(jiǎn)單分批法一樣操作培養(yǎng)容器；然而，由于起始細(xì)胞密度更高，分批的長(zhǎng)度比第一分批更短?？蔁o(wú)限地繼續(xù)這些短的重復(fù)的分批階段"?？稍趯挿秶难h(huán)時(shí)間和寬范圍的充排體積內(nèi)操作培養(yǎng)容器。在實(shí)施本發(fā)明時(shí)，培養(yǎng)的細(xì)胞優(yōu)選為哺乳動(dòng)物細(xì)胞，更優(yōu)選為已建立的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，包括但不限于CHO(例如，ATCC CCL 61)、C0S-1 (例如，ATCC CRL 1650)、幼倉(cāng)鼠腎 (BHK)和 HEK293 (例如，ATCC CRL 1573 ；Graham 等人，J. Gen. Virol. 36 :59-72,1977)細(xì)胞系。一種優(yōu)選的CHO細(xì)胞系是可從ATCC獲得的CHO Kl細(xì)胞系。另一種優(yōu)選的CHO細(xì)胞系是可從hvitrogen獲得的CH0-S細(xì)胞系。其他適當(dāng)?shù)募?xì)胞系包括但不限于大鼠H印1(大鼠肝瘤；ATCC CRL1600)、大鼠 Hep II (大鼠肝瘤；ATCC CRL 1548)、TCMK(ATCC CCL 139)、人肺(ATCC HB 8065)、NCTC 1469 (ATCC CCL 9. 1) ；DUKX 細(xì)胞(CH0 細(xì)胞系)(Urlaub 和 Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 :4216-4220,1980) (DUKX 細(xì)胞也稱為 DXBll 細(xì)胞)和 DG44(CH0 細(xì)胞系)(Cell, 33 405，1983，和 Somatic Cell and Molecular Geneticsl2 :555，1986)。也有用的是 3T3 細(xì)胞、Namalwa細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞和骨髓瘤與其他細(xì)胞的融合細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞可以是突變型細(xì)胞或重組細(xì)胞，例如表達(dá)在性質(zhì)或數(shù)量上與它們所源自的細(xì)胞類型不同的酶譜的細(xì)胞，所述酶催化蛋白質(zhì)的翻譯后修飾(例如，糖基化酶例如糖基轉(zhuǎn)移酶和/或糖苷酶或加工酶例如前肽)。在某些實(shí)施方案中，用于實(shí)施本發(fā)明的細(xì)胞能夠在懸浮培養(yǎng)物中生長(zhǎng)。如本文中所使用的，能夠懸浮的細(xì)胞(suspension-competent cell)是可懸浮生長(zhǎng)而不產(chǎn)生大的堅(jiān)硬的聚集體的細(xì)胞，即為單分散或在疏松聚集體(每個(gè)聚集體只有少數(shù)細(xì)胞)生長(zhǎng)的細(xì)胞。 能夠懸浮的細(xì)胞包括但不限于懸浮生長(zhǎng)而無(wú)需適應(yīng)或處理的細(xì)胞(例如，造血細(xì)胞或淋巴樣細(xì)胞)和已通過(guò)使貼壁依賴性細(xì)胞(attachment dependent cell)(例如，上皮或成纖維細(xì)胞)逐步適應(yīng)懸浮生長(zhǎng)的而變得能夠懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，用于實(shí)施本發(fā)明的細(xì)胞是粘著細(xì)胞(也稱為錨著依賴性或附著依賴性細(xì)胞)。如本文中所使用的，粘著細(xì)胞是需要將它們自己粘附或錨定至適當(dāng)?shù)谋砻嬉赃M(jìn)行增殖和生長(zhǎng)的細(xì)胞?；谖⑤d體的發(fā)酵是這樣的實(shí)施方案的實(shí)例。本發(fā)明包括將哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)在優(yōu)選不存在動(dòng)物來(lái)源成分的培養(yǎng)基中。如本文中所使用的，“動(dòng)物來(lái)源的”成分是在完整動(dòng)物(intact animal)中產(chǎn)生的任何成分(例如，從血清分離和純化的蛋白質(zhì))或通過(guò)使用完整動(dòng)物中產(chǎn)生的成分所產(chǎn)生的成分(例如， 通過(guò)使用從動(dòng)物產(chǎn)生和純化的酶水解植物來(lái)源材料制備的氨基酸)。相反地，具有動(dòng)物蛋白質(zhì)的序列(即，具有動(dòng)物的基因組來(lái)源)但在缺乏完整動(dòng)物中產(chǎn)生的以及從其分離和純化的成分的培養(yǎng)基中于細(xì)胞培養(yǎng)物中(例如，在重組酵母或細(xì)菌細(xì)胞中或在已建立的連續(xù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系(重組或非重組的)中)體外產(chǎn)生的蛋白質(zhì)不是"動(dòng)物來(lái)源的"成分(例如，在酵母或細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生的胰島素，或在已建立的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系例如CH0、BHK或HEK 細(xì)胞中產(chǎn)生的胰島素或在Namalwa細(xì)胞中產(chǎn)生的干擾素)。例如，具有動(dòng)物蛋白質(zhì)的序列 (即，具有動(dòng)物的基因組來(lái)源)但在缺乏動(dòng)物來(lái)源成分的培養(yǎng)基中于重組細(xì)胞中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)(例如，在酵母或細(xì)菌細(xì)菌中產(chǎn)生的胰島素)不是“動(dòng)物來(lái)源的”成分。因此，缺乏動(dòng)物來(lái)源成分的細(xì)胞培養(yǎng)基是可包含重組產(chǎn)生的動(dòng)物蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基；然而，這樣的培養(yǎng)基不包含例如動(dòng)物血清或從動(dòng)物血清純化的蛋白質(zhì)或其他產(chǎn)物。這樣的培養(yǎng)基可以例如包含一種或多種來(lái)源于植物的成分。可使用缺乏動(dòng)物來(lái)源成分的任何細(xì)胞培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基在本發(fā)明的條件下支持細(xì)胞生長(zhǎng)和維持。通常，所述培養(yǎng)基包含水、摩爾滲透壓(osmolality)調(diào)節(jié)劑、緩沖劑、能量來(lái)源、氨基酸、無(wú)機(jī)或重組鐵來(lái)源、一種或多種合成或重組生長(zhǎng)因子、維生素及輔因子。缺乏動(dòng)物來(lái)源成分和/或蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基可從商業(yè)提供商例如Sigma、SAFC、Invitrogen和 Gibco獲得。培養(yǎng)容器可以是例如其中通過(guò)常規(guī)葉輪類型獲得攪拌的常規(guī)攪拌釜式反應(yīng)器 (CSTR)，或其中通過(guò)從容器底部引入空氣來(lái)獲得攪拌的氣升式反應(yīng)器(airlift reactor)。 控制在指定限度內(nèi)的參數(shù)有pH、溶解氧張力(DOT)和溫度。pH可通過(guò)例如改變頂部空間氣體和/或噴霧器中的(X)2濃度以及需要時(shí)通過(guò)向培養(yǎng)液體中添加堿來(lái)進(jìn)行控制。溶解氧張力可以通過(guò)例如用空氣或純氧或其混合物鼓泡來(lái)維持。溫度控制介質(zhì)是水，必要時(shí)進(jìn)行加熱或冷卻。水可通過(guò)圍繞容器的套或通過(guò)浸在培養(yǎng)物中的蛇形管。在從培養(yǎng)容器取出培養(yǎng)基后，可將其進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)處理步驟以獲得所需的蛋白質(zhì)，所述處理步驟包括、不限于親和層析、疏水相互作用層析；離子交換層析；大小排阻層析；電泳方法(例如，制備性等電聚焦(IEF)、差異溶解度(differential solubility)(例如，硫酸銨沉淀)或提取等。通常參見(jiàn)，ScopesJrotein Purification, Springer-Verlag, New York,1982 ；禾口 Protein Purification, J. -C. Janson 禾口 Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York，1989?？稍谌魏芜m當(dāng)?shù)陌l(fā)酵容器中，利用生長(zhǎng)培養(yǎng)基和在適合于由如上所述選擇的特定宿主細(xì)胞表達(dá)維生素K依賴性蛋白的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。在期望的目的維生素K依賴性蛋白的表達(dá)期過(guò)程中某些點(diǎn)處，可將維生素K的還原形式和/或維生素K類似物的還原形式和 /或維生素K前體的還原形式包含在細(xì)胞培養(yǎng)基中。優(yōu)選所述維生素K的還原形式和/或維生素K類似物的還原形式和/或維生素K前體的還原形式在整個(gè)生長(zhǎng)和表達(dá)期過(guò)程中存在。在優(yōu)選實(shí)施方案中，可從培養(yǎng)基中直接收集維生素K依賴性蛋白，或者裂解宿主細(xì)胞和從其收集維生素K依賴性蛋白。在優(yōu)選實(shí)施方案中，隨后可按照已知的技術(shù)進(jìn)一步純化維生素K依賴性蛋白?？衫枚喾N生物化學(xué)和色譜方法濃縮和純化在上述類型的分泌細(xì)胞的培養(yǎng)基中積累的重組維生素K依賴性蛋白，所述方法包括利用所需蛋白質(zhì)與細(xì)胞培養(yǎng)基中其他物質(zhì)之間的大小、電荷、疏水性、溶解性、特異親和力等的差異的方法。作為一般提議，根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的重組蛋白質(zhì)的純度優(yōu)選為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知導(dǎo)致所述蛋白質(zhì)的最佳活性和穩(wěn)定性的適當(dāng)純度。例如，當(dāng)重組蛋白質(zhì)為因子IX時(shí)，所述因子IX優(yōu)選具有超高純度。優(yōu)選，將所述重組蛋白經(jīng)歷多個(gè)層析純化步驟，例如親和層析、離子交換層析、疏水相互作用層析、染料層析(dye chromatography)、羥磷灰石層析、大小排阻層析和優(yōu)選免疫親和層析，以濃縮所需蛋白質(zhì)和除去在制造、貯存和/或使用過(guò)程中引起重組蛋白質(zhì)的片段化、激活和/或降解的物質(zhì)。優(yōu)選通過(guò)純化除去的此類物質(zhì)的舉例說(shuō)明性實(shí)例包括其他蛋白質(zhì)污染物，例如修飾酶如PACE/弗林蛋白酶、VKOR和VKGC ；蛋白質(zhì)，例如宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)，其在重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)過(guò)程中被從生產(chǎn)細(xì)胞釋放至組織培養(yǎng)基中；非蛋白質(zhì)污染物例如脂質(zhì)；和蛋白質(zhì)與非蛋白質(zhì)污染物的混合物，例如脂蛋白類。用于維生素K依賴性蛋白的純化方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。例如，參見(jiàn)美國(guó)專利5，714，583，將其通過(guò)引用并入本文。為了使病毒污染的理論風(fēng)險(xiǎn)降至最低，可在方法中包括額外步驟，所述步驟允許使病毒有效失活或消除。此類步驟例如是液體或固體狀態(tài)下的加熱處理，利用溶劑和/或去垢劑的處理，可見(jiàn)或紫外光譜的輻照，Y-輻射或納米過(guò)濾。FIX和其他維生素K依賴性凝血因子的基因序列是已知的和可獲得的，例如因子 II (登錄號(hào)NM_000506)、因子VII (登錄號(hào)NMJH9616)、FIX (登錄號(hào)NM_000133)和因子X(jué) (登錄號(hào) NM_000504)?？蓪⑷绫景l(fā)明中描述的維生素K依賴性蛋白配制成用于治療用途的藥物制劑?？蓪⒓兓牡鞍踪|(zhì)溶解在常規(guī)生理相容性緩沖劑水溶液(可以任選地向所述緩沖液中加入藥物賦形劑)中以提供藥物制劑。此類藥物載體和賦形劑以及適當(dāng)?shù)乃幬镏苿┰诒绢I(lǐng)域內(nèi)是公知的(參見(jiàn)例如 "Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins，，，F(xiàn)rokjaer 等人，Taylor & Francis (2000)或“Handbook of Pharmaceutical Excipients，，，第 3 版， Kibbe等人，Pharmaceutical Press (2000)) 具體地，可以以凍干或穩(wěn)定的液體形式配制包含本發(fā)明的蛋白質(zhì)變體的藥物組合物?？衫枚喾N本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法凍干蛋白質(zhì)變體。可在使用前通過(guò)加入一種或多種藥學(xué)上可接受的稀釋劑例如無(wú)菌水或無(wú)菌生理鹽水溶液來(lái)重建凍干制劑。利用任何制藥上適當(dāng)?shù)氖┯梅椒ㄉ蠈⒔M合物制劑遞送至個(gè)體。多種遞送系統(tǒng)是已知的并且可用于通過(guò)任何方便的途徑施用組合物。優(yōu)選地，全身性施用本發(fā)明的組合物。為了進(jìn)行全身性使用，按照常規(guī)方法將本發(fā)明的蛋白質(zhì)配制用于胃腸外(例如靜脈內(nèi)、皮下、 肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、大腦內(nèi)、肺內(nèi)、鼻內(nèi)或經(jīng)皮膚)或腸內(nèi)(例如，口服、經(jīng)陰道或經(jīng)直腸)遞送。 最優(yōu)選的施用途徑是靜脈內(nèi)和皮下施用?？赏ㄟ^(guò)輸注連續(xù)地或通過(guò)單次快速靜脈注射施用制劑。某些制劑包含緩釋系統(tǒng)。以治療有效劑量給患者施用本發(fā)明的插入蛋白質(zhì)，所述治療有效劑量意指足以產(chǎn)生所需效果，預(yù)防或減輕待治療的狀況或適應(yīng)癥的嚴(yán)重性或傳播而未達(dá)到產(chǎn)生不可耐受的有害副作用的劑量。確切的劑量取決于許多因素例如適應(yīng)征、制劑、施用模式，并且必須針對(duì)每一個(gè)相應(yīng)的適應(yīng)征在臨床前和臨床試驗(yàn)中進(jìn)行確定?？蓪⒈景l(fā)明的藥物組合物單獨(dú)地或與其他治療劑組合施用。可包含所述試劑作為相同藥物的部分。
實(shí)施例實(shí)施例1 因子IX構(gòu)建體的克隆將人凝血因子IXcDNA符合讀框地克隆至人白蛋白cDNA的5，，兩個(gè)cDNA通過(guò)FIX 來(lái)源的連接子序列分隔。FIX與白蛋白之間的該連接子序列來(lái)源于參與FIX激活的內(nèi)源FIX 序列，從而使得能夠利用激活FIX的相同酶(FXIa或FVIIa/TF)切割融合蛋白。所述FIX序列在位點(diǎn)148上利用蘇氨酸(已知的Ala/Thr多態(tài)性位點(diǎn)上的最普遍的表型)并且包含P-3V突變以最優(yōu)化前肽切割(不存在于分泌的產(chǎn)物中)。白蛋白信號(hào)肽替代了 FIX的信號(hào)肽并且所得的cDNA序列經(jīng)密碼子最優(yōu)化以進(jìn)行高效的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)。蛋白質(zhì)編碼序列在5’末端側(cè)翼連接HindIII限制位點(diǎn)和共有Kozac序列以及在3’末端側(cè)翼連接EcoRI限制位點(diǎn)。核苷酸為SEQ ID N0:1[信號(hào)序列bp 1_60，前肽bp 61-123)、 FIX (bp 124-1368)、連接子 bp 1369-1422)、白蛋白(bpl423_3180)]，并且所得的 rlX-FP 蛋白質(zhì)的氨基酸序列為SEQ 10而2[ 1乂序列(脅1-415)、連接子序列(aa 416-433)；白蛋白序列(aa 434-1018)] ο將rlX-FP序列克隆入Lonza GSTM表達(dá)載體pEE12. 4內(nèi)，并且將人PACE/弗林蛋白酶絲氨酸酶蛋白cDNA克隆入Lonza GSTM表達(dá)載體pEE6. 4。PACE/弗林蛋白酶是高表達(dá)細(xì)胞系中前肽序列的高效切割所必需的。將處于單個(gè)CMV啟動(dòng)子的控制之下的rlX-FP和 PACE/弗林蛋白酶cDNA組合以產(chǎn)生最終的雙基因構(gòu)建體。實(shí)施例2 克隆A2和A5的轉(zhuǎn)染和選擇使rIX-FP-PACE/弗林蛋白酶構(gòu)建體電穿孔進(jìn)入CH0K1SV細(xì)胞，利用商業(yè)化的無(wú)谷氨酰胺培養(yǎng)基在96孔板中選擇集落。隨后就FIX表達(dá)和活性篩選所獲得的集落，選擇兩個(gè)具有所需表達(dá)/活性特征譜的克隆(A2和A5)進(jìn)行進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。實(shí)施例3 還原型甲萘醌亞硫酸氫鹽(rMSB)的產(chǎn)生所述方法包括使用抗壞血酸的水溶液和鋅粉的催化加成原位還原亞硫酸氫鈉甲萘醌(MSB)。在抗壞血酸和痕量Si存在的情況下，所得的過(guò)濾的反應(yīng)混合物包含MSB和兩種相應(yīng)的異構(gòu)還原產(chǎn)物(在圖3中顯示為No. 2和No. 3，還原型維生素K)。該濾液混合物用作終產(chǎn)物混合物。將抗壞血酸(12. 75g)在具有適合塞子(stopper)的200mL量筒中溶解在脫氣的 Milli Q 水(IOOmL)中。將亞硫酸氫鈉甲萘醌(10. OOg)在IOOmL燒杯中溶解在脫氣的Milli Q水(50mL) 中，加入抗壞血酸溶液中。用h20mL脫氣的肌11丨0水將燒杯漂洗2次，倒入2001^量筒中。 用脫氣的Mi 11 i Q水將所得的抗壞血酸/亞硫酸氫鈉甲萘醌配制成200mL，在室溫下通過(guò)翻轉(zhuǎn)反應(yīng)容器來(lái)混合，進(jìn)行10分鐘。按照教科書實(shí)用有機(jī)化學(xué)(PracticalOrganic Chemistry) ；Arthur Israel Vogel, A. R. Tatchell, B. S. Furnis.[年，編者]制備活化鋅。簡(jiǎn)而言之，向50mL聚丙烯管中的40g鋅粉加入15mL 10% ν/ν鹽酸。振蕩混合物，使其靜置2分鐘。將混合物轉(zhuǎn)移至500mL Pyrex燒杯，用Milli Q水洗滌數(shù)次。這也包括用MilliQ水充分淘洗以除去細(xì)粉。將經(jīng)漂洗的活化鋅懸浮于Milli Q水中，轉(zhuǎn)移至過(guò)濾器，在所述過(guò)濾器中將其捕獲在 0.45ymDui:apore GV膜上。用50mL HPLC級(jí)乙腈洗滌鋅數(shù)次，然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上于 60°C下干燥1. 5小時(shí)。將干燥的活化鋅在氬氣下貯存于Pyrex瓶中。將活化鋅粉末(4.73g)加入所述抗壞血酸/亞硫酸氫鈉甲萘醌溶液內(nèi)，通過(guò)持續(xù)輕輕翻轉(zhuǎn)量筒25至30分鐘進(jìn)行混合。完成后，將溶液在真空下通過(guò)o.22ymDurapore GV膜過(guò)濾。隨后將濾液轉(zhuǎn)移至無(wú)菌瓶中，用氬氣沖洗，然后用箔覆蓋以保護(hù)免受光照并且于-70°C下貯存。將該濾液加入生物反應(yīng)器。預(yù)期還原的MSB在某種程度上是不穩(wěn)定的。因此當(dāng)添加至生物反應(yīng)器時(shí)rMSB的實(shí)際濃度可能比宣稱的濃度略低(參見(jiàn)下列分析數(shù)據(jù))。因此，如本發(fā)明中所使用的，rMSB 的宣稱濃度應(yīng)當(dāng)被理解為相應(yīng)于用于如實(shí)施例3中所述產(chǎn)生rMSB的實(shí)際MSB濃度的標(biāo)稱濃度(nominal concentration)。還原型MSB的測(cè)定通過(guò)偶聯(lián)電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)的反相HPLC測(cè)定還原型MSB。使用Merck Supersher RP-Select B (4. 0x75mm)柱子，利用 IOmM 醋酸銨緩沖液作為緩沖液A和利用95%乙腈、IOmM醋酸銨作為緩沖液B來(lái)完成HPLC分離。使用下列梯度。
權(quán)利要求
1.用于對(duì)表達(dá)一種或多種維生素K依賴性蛋白質(zhì)的真核細(xì)胞進(jìn)行發(fā)酵的方法，其中在所述發(fā)酵方法之前和/或過(guò)程中將選自i)維生素K的還原形式和/或ii)維生素K類似物的還原形式和/或iii)維生素K前體的還原形式之中的一種或多種化合物加入細(xì)胞培養(yǎng)基。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述維生素K依賴性凝血因子選自FIX、FVII,FX、FII、蛋白C、蛋白S、蛋白Ζ、骨鈣素、抑制鈣化的基質(zhì)Gla蛋白(MGP)或調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的生長(zhǎng)抑制特異性基因6蛋白(Gas6)。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述維生素K依賴性凝血因子為FIX或FVII。
4.權(quán)利要求1至3的方法，其中所述還原的維生素K類似物是還原型甲萘醌亞硫酸氫Τττ . ο
5.權(quán)利要求1至4的方法，其中在生物反應(yīng)器中進(jìn)行所述表達(dá)。
6.權(quán)利要求1至5的方法，其中以充排模式進(jìn)行所述發(fā)酵。
7.權(quán)利要求1至5的方法，其中以分批模式進(jìn)行所述發(fā)酵。
8.權(quán)利要求1至5的方法，其中以灌注模式進(jìn)行所述發(fā)酵。
9.權(quán)利要求1至8的方法，其中，使用懸浮的細(xì)胞進(jìn)行所述發(fā)酵。
10.權(quán)利要求1至8的方法，其中利用貼壁細(xì)胞進(jìn)行所述發(fā)酵。
11.一種或多種選自下述中的化合物的用途i)維生素K的還原形式，和/或ii)維生素K類似物的還原形式，和/或iii)維生素K前體的還原形式；其中所述化合物用于通過(guò)將所述化合物加入細(xì)胞培養(yǎng)基來(lái)在細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)一種或多種功能性維生素K依賴性蛋白質(zhì)。
12.權(quán)利要求11的用途，其中相應(yīng)的功能性維生素K依賴性蛋白質(zhì)的表達(dá)產(chǎn)率與當(dāng)將相同量的所述相應(yīng)維生素K和/或維生素K類似物和/或維生素K前體的非還原形式以與相應(yīng)還原形式相同的方式加入細(xì)胞培養(yǎng)基時(shí)獲得的所述相同功能性維生素K依賴性蛋白質(zhì)的表達(dá)產(chǎn)率相比較而言得到增加。
13.權(quán)利要求11至12的用途，其中所述維生素K依賴性蛋白質(zhì)的活性與抗原水平表達(dá)之間的比率得到增加。
14.權(quán)利要求11至13的用途，其中所述維生素K依賴性蛋白質(zhì)的活性與抗原水平表達(dá)之間的比率增加至少15%。
15.權(quán)利要求11至14的用途，其中所述維生素K依賴性凝血因子選自FIX、FVII、FX 和FII、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、骨鈣素、抑制鈣化的基質(zhì)Gla蛋白(MGP)或調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的生長(zhǎng)抑制特異性基因6蛋白(Gas6)。
16.權(quán)利要求11至15的用途，其中所述維生素K依賴性凝血因子是FIX或FVII。
17.權(quán)利要求11至16的用途，其中所述還原型維生素K類似物是還原型甲萘醌亞硫酸氫鹽。
18.權(quán)利要求11至17的用途，其中在生物反應(yīng)器中進(jìn)行所述表達(dá)。
19.權(quán)利要求11至18的用途，其中以充排模式進(jìn)行所述發(fā)酵。
20.用于維生素K依賴性蛋白質(zhì)的發(fā)酵的培養(yǎng)基，其補(bǔ)充有維生素K和/或維生素K類似物和/或維生素K前體的還原形式。
21.權(quán)利要求20的培養(yǎng)基，其中補(bǔ)充有還原型甲萘醌亞硫酸氫鹽。
22.維生素K和/或維生素K類似物和/或維生素K前體的還原形式在細(xì)胞培養(yǎng)基中增強(qiáng)發(fā)酵中細(xì)胞的存活力的用途。
全文摘要
本發(fā)明包括一種或多種選自i)維生素K的還原形式和/或ii)維生素K類似物的還原形式和/或iii)維生素K前體的還原形式的化合物用于在細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)一種或多種功能性維生素K依賴性蛋白質(zhì)的用途以及用于發(fā)酵表達(dá)一種或多種維生素K依賴性蛋白質(zhì)的真核細(xì)胞的方法，其中在發(fā)酵方法之前和/或期間，將一種或多種選自i)維生素K的還原形式和/或ii)維生素K類似物的還原形式和/或iii)維生素K前體的還原形式的化合物加入細(xì)胞培養(yǎng)基。
文檔編號(hào)C12N5/02GK102471794SQ201080030939
公開(kāi)日2012年5月23日 申請(qǐng)日期2010年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月10日
發(fā)明者A·斯陶爾斯, F·古德溫, J·金納, P·休珀麥斯 申請(qǐng)人:Csl有限公司