專利名稱：核酸擴增方法
核酸擴增方法本發(fā)明一般性地涉及擴增目的核酸區(qū)域的方法，更特別地，本發(fā)明涉及通過巢式單管PCR(nested single tube PCR)來擴增目的核酸區(qū)域的方法。設(shè)計本發(fā)明方法以提供下述手段，即選擇性失活外引物的功能并在整個反應過程中保持擴增效率。在單管巢式PCR 的背景下開發(fā)實現(xiàn)用外引物有效擴增而后用內(nèi)引物有效擴增的手段可用于一些應用，其包括但不限于診斷和/或監(jiān)測特征為特定基因序列的疾病狀況，以及表征或分析特定目的基因區(qū)域。本發(fā)明方法不僅用于簡單的檢測，還能進行定量。
背景技術(shù)：
本說明書對任何現(xiàn)有出版物(或源自其的信息)或任何已知事實的引用不是并且不應被認為是承認或認可或以任何形式暗示現(xiàn)有出版物(或源自其的信息)或已知事實構(gòu)成本說明書相關(guān)領(lǐng)域的公知常識。本說明書中作者所引用的出版物詳細目錄在本說明書結(jié)尾處按字母順序匯總。聚合酶鏈式反應(PCR)是用于擴增DNA鏈的特定區(qū)域的技術(shù)。DNA鏈可以是單個基因、基因的僅僅一部分或非編碼序列。大部分PCR方法通常擴增多達IOk堿基對(kilo base pair，kb)的DNA片段，但一些技術(shù)允許擴增大小達40kb的片段(Cheng等，1994， Natl Acad Sci. 91 :5695-5699)。目前實施的PCR需要幾種基本組分(Sambrook禾Π Russel，2001，Molecular Cloning =A Laboratory Manual，第三版)。這些組分是· DNA模板，其包含待擴增DNA片段的區(qū)域；眷引物，其與待擴增DNA區(qū)域5，和3，端的DNA區(qū)域互補；· DNA聚合酶(例如Taq聚合酶或最適溫度在70°C左右的其他熱穩(wěn)定DNA聚合酶)，其用于合成待擴增區(qū)域的DNA拷貝；和 三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)，DNA聚合酶利用其構(gòu)建新DNA。PCR在包含通常為15-100 μ 1反應體積的小反應管(體積0. 2-0. 5ml)中進行，所述小反應管被插入熱循環(huán)儀中。該儀器加熱和冷卻其中的反應管至反應每個步驟所需的精確溫度。大部分熱循環(huán)儀包含加熱蓋以防止在反應管帽內(nèi)部上的冷凝。或者，可在反應混合物上放置一層油以防止蒸發(fā)。因此，PCR是允許較長DNA分子中的DNA序列以指數(shù)擴增的方法。該反應包括多個擴增循環(huán)，并且在每個循環(huán)中每個分子反應的模板是樣品中初始DNA鏈或在先前循環(huán)中合成的DNA鏈。每個PCR循環(huán)包括以下步驟-加熱變性以將DNA雙鏈體的兩條鏈分離-將上游和下游引物與它們的互補序列雜交-DNA聚合酶將引物延伸以產(chǎn)生模板序列的互補拷貝通常，選擇PCR試劑和條件以使變性、雜交和延伸以接近最大效率進行，從而每個循環(huán)中期望序列的量以接近兩倍的倍數(shù)增加。在PCR結(jié)束時產(chǎn)生大量的擴增，例如30個循環(huán)的PCR會使初始模板擴增倍數(shù)接近23° (1，000，000，000)。這種程度的擴增便于檢測和分析擴增產(chǎn)物。
在多個擴增循環(huán)后，可以終止PCR并以多種方式分析產(chǎn)物，最常見地是通過凝膠電泳分析。當PCR進行至限定的終點時，擴增產(chǎn)物的量通常不與放入的靶DNA量密切相關(guān)， 并且這類PCR只是檢測特定DNA存在與否的定性工具和/或為了提供進一步分析所用的足
量靶DNA。為了測量信使RNA(mRNA)，該方法首先使用逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA轉(zhuǎn)化成互補 DNA (cDNA)，然后通過PCR擴增cDNA并用瓊脂糖凝膠電泳分析。類似地，逆轉(zhuǎn)錄而后進行終點PCR基本上是定性技術(shù)。為了提供定量能力，開發(fā)了實時PCR。該方法遵循PCR的一般模式，只是在每個循環(huán)中對所擴增的DNA定量。定量的兩種常見方法是使用嵌入雙鏈DNA的熒光染料以及使用其熒光在PCR步驟之一中發(fā)生變化的經(jīng)修飾DNA寡核苷酸引物或探針。實時聚合酶鏈式反應經(jīng)常與逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈式反應相組合來對低豐度的信使RNA(mRNA)進行定量，使研究者對特定時間或特定細胞或組織類型中的相對基因表達進行定量。(i)使用結(jié)合雙鏈DNA之染料的實時PCRDNA結(jié)合染料(如Sybr Green)在PCR反應中結(jié)合所有雙鏈(ds)DNA，導致染料熒光增強。因此PCR中DNA產(chǎn)物的增加導致在每個循環(huán)所測量的熒光強度增加，從而允許對 DNA濃度進行定量。(ii)熒光報告序列法已經(jīng)開發(fā)了使用熒光報告引物或探針的多種不同方法，它們傾向于比使用DNA結(jié)合染料更精確且更可靠。它們使用一種或多種DNA引物或探針從而僅定量與該引物或探針雜交的DNA。使用報告探針(如Taqman探針)顯著提高了特異性，并且甚至可以允許在一些非特異性DNA擴增存在時進行定量。使用序列特異性引物或探針允許通過使用帶有不同顏色標簽的特異性序列或探針在同一反應中多重測定幾種不同的擴增產(chǎn)物，前提是所有靶標以相似的效率擴增。對于定量，通過以對數(shù)刻度將熒光相對于循環(huán)數(shù)作圖來確定反應指數(shù)期中所存在 DNA的相對濃度。測定熒光增加至高于背景或降低至低于背景(取決于確切方法)的閾值。 樣品熒光跨過該閾值的循環(huán)數(shù)被稱為循環(huán)閾值Ct。然后通過將測試結(jié)果與一種或多種標準品生成的結(jié)果進行比較來確定靶DNA的量。當靶DNA是基因組DNA時，則通常使用一系列標準品(通常是已知量的靶DNA的10倍稀釋)。當靶DNA是cDNA時，則通常使用另一基因cDNA的一種或多種內(nèi)部標準品。為提高PCR擴增特異性而設(shè)計的傳統(tǒng)PCR的一種變化形式是巢式PCR反應。在該擴增反應中，在兩個接連的反應中使用兩組引物。在第一反應中，使用一對引物產(chǎn)生DNA 產(chǎn)物，該產(chǎn)物可能還含有從非靶標區(qū)域擴增的產(chǎn)物。然后將第一 PCR的產(chǎn)物用于起始第二反應，所述第二反應使用結(jié)合位點位于第一組引物以內(nèi)的一個(半巢式)或兩個不同引物 (巢式)。所有引物的特異性相結(jié)合，通常獲得單個產(chǎn)物。巢式PCR通常這樣實施在一個反應管中進行初始PCR，將擴增產(chǎn)物的等分試樣轉(zhuǎn)移到第二反應管中，然后進行第二 PCR。該方法有兩個缺點。這比單個PCR更復雜，并且更重要的是，其具有第一 PCR的擴增產(chǎn)物對環(huán)境造成污染的風險，這可以導致后續(xù)試驗過程的污染。因此，已經(jīng)開發(fā)了幾種方法來在一個反應管中進行接連的PCR。在一個反應管中進行兩輪PCR涉及向初始反應混合物中添加兩輪所用的引物。然后該方法已被用于進行兩輪接連的PCR，第一輪使用外引物對，第二輪使用內(nèi)部對，所述方法包括-對兩輪PCR使用不同退火溫度(Kemp等，Gene1990，94 :223_228，Erlich等美國專利5314809)-降低第一輪PCR的引物濃度(Erlich等美國專利5314809)-使兩輪PCR的退火時間有所不同(Grosz等美國專利5340728)-改造第二輪PCR的引物結(jié)構(gòu)，并在該輪中使用兩種不同的退火溫度(Xu Dingbang 公布 CN1858219)-對第二輪PCR使用低變性溫度(Erlich等美國專利5314809)-對第一輪PCR使用經(jīng)化學修飾的引物，以及使用逐漸對其進行破壞的酶(Du Breuil Lastrucci 美國專利 7273730)-對第一和第二輪PCR使用試劑的起始物理分離Wourno美國專利5556773， Ching等美國專利申請20060177844)所有這些方法的原理是在某點產(chǎn)生第一輪PCR引物之活性的快速或逐漸抑制，以使正在進行的擴增逐漸地依賴于第二輪PCR引物的活性。然而，所有這些方法都有缺點，缺點的性質(zhì)取決于所述方法。它們的有效性各有不同，反應條件可能需要根據(jù)待擴增的目的序列來進行調(diào)整。在一些情況下，在整個第一輪PCR中，擴增可能是低效的(inefficient)， 在另一些情況下，在從第一輪到第二輪PCR過渡期間，擴增可能是低效的。因此，在實踐中所述方法中的一些沒有被廣泛使用，而另一些僅用于檢測而非定量。在導致本發(fā)明的工作中開發(fā)了單管巢式PCR法，其通過提供以下機制同時提高了特異性和效率，所述機制即一旦不再需要外引物則對其功能進行選擇性失活，從而在使用外引物有效擴增后允許使用內(nèi)引物有效擴增。因此這使得開發(fā)了這樣的PCR方法，其足夠有效地進行定量以及檢測，并且提供單管巢式PCR反應的獨特優(yōu)勢。

發(fā)明內(nèi)容
在本說明書及所附權(quán)利要求通篇中，除非根據(jù)上下文需要有另外含義，應理解詞語“包含”和變化形式如“包括”和“含有”表明包括所示整數(shù)或步驟或者整數(shù)或步驟的組， 但不排除任何其他整數(shù)或步驟或者整數(shù)或步驟的組。本文所用術(shù)語“衍生自”應理解為表明具體整數(shù)或整數(shù)的組來源于所指出的類群， 但不一定從所指出的來源直接獲得。而且，除非上下文另外明確說明，否則不使用數(shù)量詞時包括多個對象。除非另外定義，本文所用的全部技術(shù)和科學術(shù)語的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同。本發(fā)明的一個方面涉及擴增目的核酸區(qū)域的方法，所述方法包括(i)將核酸樣品與以下項相接觸(a)針對所述目的區(qū)域的第一正向引物和針對所述目的區(qū)域的第一反向引物；和(b)針對所述目的區(qū)域的第二正向引物，其中所述第二正向引物針對位于所述第一正向引物所針對序列3’的核酸序列，并且所述第二正向引物的Tm低于所述第一正向引物的Tm ；和
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針對所述目的區(qū)域的第二反向引物，其中所述第二反向引物針對位于所述第一反向引物所針對序列5’的核酸序列，并且所述第二反向引物的Tm低于所述第一反向引物的 Tm;和(c)針對所述第一引物的一種或多種反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸的Tm低于所述第一引物；而且其中(b)和(C)部分的所述分子可以在所述擴增步驟(ii)之前、期間或之后但在所述擴增步驟(iii)之前加入反應；(ii)在下述退火溫度下擴增步驟⑴的核酸樣品，所述退火溫度使所述第一引物雜交但不使所述第二引物以及所述反義寡核苷酸雜交；和(iii)在下述退火溫度下擴增步驟(ii)的核酸樣品，所述退火溫度使所述第二引物以及所述反義寡核苷酸雜交。本發(fā)明的另一方面涉及擴增目的DNA區(qū)域的方法，所述方法包括(i)將DNA樣品與以下項相接觸(a)針對所述目的區(qū)域的第一正向引物和針對所述目的區(qū)域的第一反向引物；和(b)針對所述目的區(qū)域的第二正向引物，其中所述第二正向引物針對位于所述第一正向引物所針對序列3’的核酸序列，并且所述第二正向引物的Tm低于所述第一正向引物的Tm ；和針對所述目的區(qū)域的第二反向引物，其中所述第二反向引物針對位于所述第一反向引物所針對序列5’的核酸序列，并且所述第二反向引物的Tm低于所述第一反向引物的 Tm;和(c)針對所述第一引物的一種或多種反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸的Tm低于所述第一引物；而且其中(b)和(C)部分的所述分子可以在所述擴增步驟(ii)之前、期間或之后但在所述擴增步驟(iii)之前加入反應；(ii)在下述退火溫度下擴增步驟(i)的DNA樣品，所述退火溫度使所述第一引物雜交但不使所述第二引物以及所述反義寡核苷酸雜交；和(iii)在下述退火溫度下擴增步驟(ii)的DNA樣品，所述退火溫度使所述第二引物以及所述反義寡核苷酸雜交。本發(fā)明的又一方面涉及擴增目的DNA區(qū)域的方法，所述方法包括(i)將DNA樣品與以下項相接觸(a)針對所述目的區(qū)域的第一正向引物和針對所述目的區(qū)域的第一反向引物；和(b)針對所述目的區(qū)域的第二正向引物，其中所述第二正向引物針對位于所述第一正向引物所針對序列3’的核酸序列，并且所述第二正向引物的Tm低于所述第一正向引物的Tm ；和針對所述目的區(qū)域的第二反向引物，其中所述第二反向引物針對位于所述第一反向引物所針對序列5’的核酸序列，并且所述第二反向引物的Tm低于所述第一反向引物的 Tm;和(c)針對所述第一引物的一種或多種反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸的Tm低于所述第一引物；而且所述反義寡核苷酸之一與所述引物的3’端雜交并且包含5’核酸標簽序列，所述標簽的互補核苷酸序列相對于所述引物雜交位點的5’端相鄰的DNA區(qū)域之核苷酸序列是錯配的其中(b)和(C)部分的所述分子可以在所述擴增步驟(ii)之前、期間或之后但在所述擴增步驟(iii)之前加入反應；(ii)在下述退火溫度下擴增步驟(i)的DNA樣品，所述退火溫度使所述第一引物雜交但不使所述第二引物以及所述反義寡核苷酸雜交；和(iii)在下述退火溫度下擴增步驟(ii)的DNA樣品，所述退火溫度使所述第二引物以及所述反義寡核苷酸雜交。本發(fā)明的又一方面涉及擴增目的DNA區(qū)域的方法，所述方法包括(i)將DNA樣品與以下項相接觸(a)針對所述目的區(qū)域的第一正向引物和針對所述目的區(qū)域的第一反向引物；和(b)針對所述目的區(qū)域的第二正向引物，其中所述第二正向引物針對位于所述第一正向引物所針對序列3’的核酸序列，并且所述第二正向引物的Tm低于所述第一正向引物的Tm ；和針對所述目的區(qū)域的第二反向引物，其中所述第二反向引物針對位于所述第一反向引物所針對序列5’的核酸序列，并且所述第二反向引物的Tm低于所述第一反向引物的 Tm;和(c)針對所述第一引物的一種或多種反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸的Tm低于所述第一引物；而且一種或多種所述反義寡核苷酸包含不能進行正常延伸的3’端其中(b)和(C)部分的所述分子可以在所述擴增步驟(ii)之前、期間或之后但在所述擴增步驟(iii)之前加入反應；(ii)在下述退火溫度下擴增步驟(i)的DNA樣品，所述退火溫度使所述第一引物雜交但不使所述第二引物以及所述反義寡核苷酸雜交；和(iii)在下述退火溫度下擴增步驟(ii)的DNA樣品，所述退火溫度使所述第二引物以及所述反義寡核苷酸雜交。本發(fā)明的又一方面涉及擴增目的DNA區(qū)域的方法，所述方法包括(i)將DNA樣品與以下項相接觸(a)針對所述目的區(qū)域的第一正向引物和針對所述目的區(qū)域的第一反向引物；和(b)針對所述目的區(qū)域的第二正向引物，其中所述第二正向引物針對位于所述第一正向引物所針對序列3’的核酸序列，并且所述第二正向引物的Tm低于所述第一正向引物的Tm ；和針對所述目的區(qū)域的第二反向引物，其中所述第二反向引物針對位于所述第一反向引物所針對序列5’的核酸序列，并且所述第二反向引物的Tm低于所述第一反向引物的 Tm;和(c)針對所述第一引物的一種或多種反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸的Tm低于所述第一引物；而且所述反義寡核苷酸包含 與所述引物的3’端雜交的所述反義寡核苷酸上的5’核酸標簽序列，其，所述標簽的互補核苷酸序列相對于所述引物雜交位點的5’端相鄰的DNA區(qū)域之核苷酸序列是錯配的；和
不能進行正常延伸的3’端其中(b)和(C)部分的所述分子可以在所述擴增步驟(ii)之前、期間或之后但在所述擴增步驟(iii)之前加入反應；(ii)在下述退火溫度下擴增步驟(i)的DNA樣品，所述退火溫度使所述第一引物雜交但不使所述第二引物以及所述反義寡核苷酸雜交；和(iii)在下述退火溫度下擴增步驟(ii)的DNA樣品，所述退火溫度使所述第二引物以及所述反義寡核苷酸雜交。根據(jù)本實施方案，提供了擴增目的DNA區(qū)域的方法，所述方法包括(i)將DNA樣品與以下項相接觸(a)針對所述目的區(qū)域的第一正向引物和針對所述目的區(qū)域的第一反向引物；和(b)針對所述目的區(qū)域的第二正向引物，其中所述第二正向引物針對位于所述第一正向引物所針對序列3’的核酸序列，并且所述第二正向引物的Tm比所述第一正向引物的 Tm 低 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20°C ；和針對所述目的區(qū)域的第二反向引物，其中所述第二反向引物針對位于所述第一反向引物所針對序列5’的核酸序列，并且所述第二反向引物的Tm比所述第一反向引物的Tm 低 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20°C ；和(c)針對所述第一引物的一種或多種反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸的Tm比所述第一引物低 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 0C ；而且所述反義寡核苷酸包含 與所述引物的3’端雜交的所述反義寡核苷酸上的5’核酸標簽序列，其，所述標簽的互補核苷酸序列相對于所述引物雜交位點的5’端相鄰的DNA區(qū)域之核苷酸序列是錯配的；和 不能進行正常延伸的3’端其中(b)和(C)部分的所述分子可以在所述擴增步驟(ii)之前、期間或之后但在所述擴增步驟(iii)之前加入反應；(ii)在下述退火溫度下擴增步驟(i)的DNA樣品，所述退火溫度使所述第一引物雜交但不使所述第二引物以及所述反義寡核苷酸雜交；和(iii)在下述退火溫度下擴增步驟(ii)的DNA樣品，所述退火溫度使所述第二引物以及所述反義寡核苷酸雜交。本發(fā)明的另一實施方案涉及擴增目的DNA區(qū)域的方法，所述方法包括(i)將DNA樣品與以下項相接觸(a)針對所述目的區(qū)域的第一正向引物和針對所述目的區(qū)域的第一反向引物；和(b)針對所述目的區(qū)域的第二正向引物，其中所述第二正向引物針對位于所述第一正向引物所針對序列3’的核酸序列，并且所述第二正向引物的Tm低于所述第一正向引物的Tm ；和針對所述目的區(qū)域的第二反向引物，其中所述第二反向引物針對位于所述第一反向引物所針對序列5’的核酸序列，并且所述第二反向引物的Tm低于所述第一反向引物的 Tm;和(c)針對所述目的區(qū)域的第三正向引物，其中所述第三正向引物針對位于所述第二正向引物所針對序列3’的DNA序列，并且所述第三正向引物的Tm低于所述第二正向引物的Tm ；和針對所述目的區(qū)域的第三反向引物，其中所述第三反向引物針對位于所述第二反向引物所針對序列5’的DNA序列，并且其中所述第三反向引物的Tm低于所述第二反向引物的Tm ；和(d)針對所述第一引物的一種或多種反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸的Tm低于所述第一引物；以及針對所述第二引物的一種或多種反義寡核苷酸，其中每種所述反義寡核苷酸的Tm低于所述第二引物；其中(b)、(C)和(d)部分的所述分子可以在所述擴增步驟(ii)之前、期間或之后但在所述擴增步驟(iii)之前加入反應；(ii)在下述退火溫度下擴增步驟(i)的DNA樣品，所處退火溫度使所述第一引物雜交，但不使所述第二引物以及第三引物以及所述反義寡核苷酸雜交；和(iii)在下述退火溫度下擴增步驟(ii)的DNA樣品，所處退火溫度使所述第二引物以及針對所述第一引物的所述反義寡核苷酸雜交，但不使所述第三引物以及針對所述第二引物的所述反義寡核苷酸雜交；(iv)在下述退火溫度下擴增步驟(iii)的DNA樣品，所處退火溫度使所述第三引物以及針對所述第二引物的所述反義寡核苷酸雜交。


圖1是兩階段巢式單管定量PCR策略的示意圖。該反應包含具有高Tm的外引物、 反義寡核苷酸(其Tm足夠低以防止在第一階段的高溫度下結(jié)合外引物，但足夠高以使得在第二階段的低溫度下結(jié)合)和內(nèi)引物(其Tm也足夠低以防止在第一階段的高溫度下結(jié)合模板鏈，但足夠高以使得在第二階段的低溫度下結(jié)合)。反義寡核苷酸可以有多種設(shè)計，在圖中顯示了 2種。最優(yōu)選的設(shè)計包含(a)5’端小延伸，這樣設(shè)計使得如果外引物與反義寡核苷酸結(jié)合并延伸，會產(chǎn)生對模板鏈的錯配，和(b)3’端的小延伸，其導致錯配，該錯配防止反義寡核苷酸沿外引物全長延伸。在PCR的第一階段中，退火溫度足夠高以使雜交僅發(fā)生在外引物和模板之間，從而發(fā)生有效的擴增。在PCR的第二階段中，退火溫度足夠低以使得發(fā)生2種機制。-反義寡核苷酸與外引物雜交，外引物沿它們延伸，從而即使外引物確實隨后與 PCR模板雜交也不能導致沿PCR模板的延伸。-內(nèi)引物雜交并延伸以使得有效的PCR擴增繼續(xù)。圖2是反義寡核苷酸上的5’標簽序列產(chǎn)生的功能效果的示意圖。不同的核苷酸堿基示意性表示為A、B、C、D，互補堿基表示為a、b、c、d。如果標簽序列從3’至5’方向為 abcd，則引物延伸會是5’至3’方向的AB⑶并且延伸的引物會與其模板完美匹配，進一步延伸并有效擴增。任何其他寡核苷酸標簽序列會導致延伸的引物和模板鏈之間部分地或完全地錯配，并且使引物部分地或完全地失活。產(chǎn)生完全錯配的最簡單策略是將序列ABCD用于標簽序列，其與模板序列abcd(3’至5’)互補，并且也是原有引物在其模板上延伸所產(chǎn)生的序列(5’至3’)。圖3是對IOOng至50pg DNA質(zhì)量的N-RAS基因進行定量的CT值，最初15個循環(huán)PCR退火溫度是72°C，剩余循環(huán)是58°C。紅色顯示的點是使用“外”引物的標準PCR結(jié)果。 藍色顯示的點是兩階段單管方案的結(jié)果，其中PCR包含外引物、針對外引物的反義寡核苷酸和內(nèi)引物?？梢园l(fā)現(xiàn)兩階段單管方案與標準PCR結(jié)果相同，說明其具有最佳效率。在最初15個循環(huán)中，由于反義寡核苷酸和內(nèi)引物均不能退火，因此擴增由外引物引導以最佳效率進行。在隨后的循環(huán)中，所述反義寡核苷酸逐漸失活外引物，但內(nèi)引物可以退火并以最佳效率產(chǎn)生擴增。綠色數(shù)據(jù)是PCR僅包含外引物和反義寡核苷酸的結(jié)果。50或更大的Ct值表示無擴增，可以發(fā)現(xiàn)一旦退火溫度為58°C外引物就逐漸失活。藍紫色顯示的點是內(nèi)引物單獨存在的Ct值。Ct值被延后約15個循環(huán)表明內(nèi)引物在最初的15個循環(huán)中不退火。空心和實心三角形是不包含DNA的對照管的結(jié)果。圖4是兩階段單管巢式PCR系統(tǒng)的性能分析的示意圖。研究了四個基因N-RAS、 APC、BCR和重排的IGH基因，并且使用一系列DNA質(zhì)量進行擴增以產(chǎn)生一系列Ct值。在 72°C進行15個循環(huán)，剩余的循環(huán)為58°C，用Taqman探針確定Ct。藍色符號表示僅使用外引物的常規(guī)PCR;紅色符號表示包含外引物、反義寡核苷酸(其針對外引物)和內(nèi)引物的兩階段PCR ；以及綠色符號表示包含外引物和反義寡核苷酸的PCR。兩階段系統(tǒng)的Ct結(jié)果與常規(guī)PCR相同，但58°C的第二階段的擴增由內(nèi)引物介導，正如內(nèi)引物不存在時反義寡核苷酸的抑制作用所證明。Ct值為55表示陰性結(jié)果。本方法使得能夠?qū)θ?個基因并且使用相同的實驗條件開發(fā)出有效的巢式單管PCR的結(jié)果證實了所述方法的有效性(robustness)。圖5是兩階段巢式PCR系統(tǒng)動力學的示意圖并且說明反義寡核苷酸對外引物活性的逐漸抑制作用。使用兩階段系統(tǒng)、僅外引物或者在反義寡核苷酸存在下的外引物進行PCR 擴增。在15、18、21、M或32循環(huán)后，終止PCR并且在第二輪PCR中測定等分試樣，以測量下述擴增子的擴增即兩階段PCR中的長和短擴增子或者另外兩種PCR中的長擴增子(其中不存在內(nèi)引物，擴增只是由外引物介導的)。注意Ct值是逆向顯示的，以表明隨PCR循環(huán)增加產(chǎn)生的產(chǎn)物量增加。兩階段PCR中擴增子的總數(shù)和僅存在長引物的PCR中長擴增子的數(shù)目均呈指數(shù)增加(顯示兩組數(shù)據(jù)的回歸線)。然而，在存在反義寡核苷酸時，在兩階段 PCR中和所存在的引物僅為長引物的PCR中長擴增子的擴增均逐漸減緩。圖6是當退火溫度為72°C (如兩階段巢式PCR的第一階段的情況)時反義寡核苷酸對外引物引起的擴增缺乏抑制作用的示意圖。研究了 3個基因N-RAS、APC和BCR，以及檢測了針對N-RAS的Tm值稍有不同的2對反義寡核苷酸和針對APC的1對反義寡核苷酸和針對BCR的1對反義寡核苷酸的作用。在PCR中使用多種DNA質(zhì)量。觀察到的僅有的抑制作用是具有高Tm的針對N-RAS的寡核苷酸在33個PCR循環(huán)后產(chǎn)生的。圖7是用Sybr Green或Taqman探針進行熒光檢測的示意圖。進行了研究N-RAS、 APC和BCR基因的三個實驗，并將兩階段巢式PCR與僅用外引物的常規(guī)PCR比較。用多種量的DNA開始進行PCR，并且用Taqman探針或Sybr Green測量終點。使用常規(guī)PCR，用Sybr Green的Ct值比用Taqman的小，這表明在常規(guī)PCR中擴增了一些非特異性物質(zhì)，并且被 Sybr Green檢測到。2個終點之間的差異在2階段巢式系統(tǒng)中沒有觀察到，這表明在該系統(tǒng)中沒有非特異性擴增。發(fā)明詳述本發(fā)明部分地基于以下結(jié)果通過使用具有獨特解鏈溫度的引物和能失活外引物
11的反義分子，可以設(shè)計保持恒定且最佳效率水平從而利于定量PCR讀出(而不只是定性讀出)的單管巢式PCR法。更特別地，該進展已實現(xiàn)了之前在單管巢式PCR背景下未獲得的控制程度和有效性程度。本發(fā)明方法可用于需要分析特定目的DNA區(qū)域(如特定基因)的任何應用背景下。因此，本發(fā)明的一方面涉及擴增目的核酸區(qū)域的方法，所述方法包括(i)將核酸樣品與以下項相接觸(a)針對所述目的區(qū)域的第一正向引物和針對所述目的區(qū)域的第一反向引物；和(b)針對所述目的區(qū)域的第二正向引物，其中所述第二正向引物針對位于所述第一正向引物所針對序列3’的核酸序列，并且所述第二正向引物的Tm低于所述第一正向引物的Tm ；和針對所述目的區(qū)域的第二反向引物，其中所述第二反向引物針對位于所述第一反向引物所針對序列5’的核酸序列，并且所述第二反向引物的Tm低于所述第一反向引物的 Tm;和(c)針對所述第一引物的一種或多種反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸的Tm低于所述第一引物；以及其中(b)和(C)部分的所述分子可以在所述擴增步驟(ii)之前、期間或之后但在所述擴增步驟(iii)之前加入反應；(ii)在下述退火溫度下擴增步驟(i)的核酸樣品，所述退火溫度使所述第一引物雜交但不使所述第二引物以及所述反義寡核苷酸雜交；和(iii)在下述退火溫度下擴增步驟(ii)的核酸樣品，所述退火溫度使所述第二引物以及所述反義寡核苷酸雜交。應理解提及核酸“目的區(qū)域”是指待擴增的任何DNA或RNA區(qū)域。它可以是基因、 基因一部分或基因間區(qū)域。對此，應理解提及“基因”是指編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物(全長蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段)的DNA分子。對于染色體DNA，基因會包含內(nèi)含子和外顯子區(qū)域兩者。然而， 在目的DNA為cDNA時(例如如果目的DNA是載體DNA或經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄的mRNA時會發(fā)生的)，可以不存在內(nèi)含子區(qū)域。這樣的DNA仍可以包含5’或3’非翻譯區(qū)。因此，應理解本文提及的“基因”涵蓋編碼蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段的任何DNA形式，其包括例如基因組DNA和cDNA。 本發(fā)明目的核酸區(qū)域還可以是未知與任何特定基因相關(guān)的基因組DNA的非編碼部分(如通常所說的“垃圾"DNA區(qū)域)。它可以是由重組產(chǎn)生的任何基因組DNA區(qū)域，所述重組在2個基因組DNA區(qū)域之間進行或者在1個基因組DNA區(qū)域和外源DNA區(qū)域(例如病毒或引入的序列)之間進行。它可以是部分或完全合成或者重組產(chǎn)生的核酸分子。本發(fā)明目的核酸序列還可以是之前通過任何核酸擴增法(包括聚合酶鏈式反應(PCR))擴增的DNA區(qū)域，即它已通過擴增方法產(chǎn)生。本發(fā)明“核酸”區(qū)域可以是DNA或RNA或者其衍生物或類似物。當目的區(qū)域是編碼蛋白樣分子的DNA序列時，它的形式可以是基因組DNA、從mRNA轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生的cDNA或者通過核酸擴增產(chǎn)生的DNA。而在所述DNA不編碼蛋白質(zhì)時，基因組DNA或者合成或重組產(chǎn)生的DNA均可以是分析對象。如技術(shù)人員所理解地，合成和重組產(chǎn)生的DNA兩者都還可編碼蛋白質(zhì)的全部或部分。然而，如果本發(fā)明的方法涉及檢測RNA區(qū)域，應理解首先需要將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成DNA，例如使用RT-PCR。本發(fā)明的RNA可以是任何形式的RNA，如mRNA、初始RNA轉(zhuǎn)錄本(primary RNA transcript)、核糖體RNA、轉(zhuǎn)運RNA、小RNA等。優(yōu)選地，所述目的核酸區(qū)域是目的DNA區(qū)域。為此，所述DNA包括通過逆轉(zhuǎn)錄從RNA (其為最終的分析對象)產(chǎn)生的DNA以及通過核酸擴增法(如PCR)產(chǎn)生的DNA。因此，本發(fā)明的一個實施方案涉及擴增目的DNA區(qū)域的方法，所述方法包括(i)將DNA樣品與以下項相接觸(a)針對所述目的區(qū)域的第一正向引物和針對所述目的區(qū)域的第一反向引物；和(b)針對所述目的區(qū)域的第二正向引物，其中所述第二正向引物針對位于所述第一正向引物所針對序列3’的核酸序列，并且所述第二正向引物的Tm低于所述第一正向引物的Tm ；和針對所述目的區(qū)域的第二反向引物，其中所述第二反向引物針對位于所述第一反向引物所針對序列5’的核酸序列，并且所述第二反向引物的Tm低于所述第一反向引物的 Tm;和(c)針對所述第一引物的一種或多種反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸的Tm低于所述第一引物；以及其中(b)和(C)部分的所述分子可以在所述擴增步驟(ii)之前、期間或之后但在所述擴增步驟(iii)之前加入反應；(ii)在下述退火溫度下擴增步驟(i)的DNA樣品，所述退火溫度使所述第一引物雜交但不使所述第二引物以及所述反義寡核苷酸雜交；和(iii)在下述退火溫度下擴增步驟(ii)的DNA樣品，所述退火溫度使所述第二引物以及所述反義寡核苷酸雜交。應理解所提及的“DNA”是指脫氧核糖核酸或其衍生物或類似物。對此，應理解其涵蓋所有形式的DNA，包括cDNA和基因組DNA。本發(fā)明的核酸分子可以是任何來源的，包括天然的(例如源自生物樣品的)、重組產(chǎn)生的或合成產(chǎn)生的。應理解所提及的“衍生物”包括來自天然、合成或重組來源的所述DNA的片段、同源物或直系同源物(ortholog)。應理解“功能性衍生物”是顯示任何一種或多種DNA功能活性的衍生物。所述DNA序列的衍生物包括具有融合至其他蛋白樣或非蛋白樣分子之特定 DNA分子區(qū)域的片段。本文提及的“類似物”包括但不限于對核苷酸或核酸分子的修飾，如對其化學組成或整體構(gòu)型的修飾。這包括，例如摻入新的或經(jīng)修飾的嘌呤或嘧啶堿基，或者改變核苷酸或核酸分子與其他核苷酸或核酸分子的相互作用方式，例如在骨架形成或互補堿基對雜交的水平上。生物素化或其他形式的核苷酸或核酸分子標記是本文所定義的“功能性衍生物”的實例。優(yōu)選地，所述DNA是基因或基因片段、染色體基因轉(zhuǎn)位斷裂點或由在先核酸擴增 (如PCR)產(chǎn)生的DNA。目的DNA可以是化學合成的，或者可以源自任何生物體(包括但不限于任何動物、植物、細菌或病毒)的DNA或RNA。在經(jīng)典PCR中，設(shè)計引物和反應條件以使正向和反向引物的雜交和延伸處于或接近最大效率，從而每循環(huán)擴增子數(shù)大致上倍增，產(chǎn)生有效的指數(shù)擴增。足夠濃度的引物對于達到最大效率很重要。如果在接連的反應中使用兩組或更多組引物可以獲得更大的DNA擴增特異性。以這種方式，可以通過用結(jié)合位點位于第一組引物的結(jié)合位點內(nèi)的引物進行進一步擴增來使得非靶標區(qū)域擴增的非特異產(chǎn)物的影響最小化。所有引物的特異性相結(jié)合，通常產(chǎn)生單一產(chǎn)物。巢式PCR可以以一系列接連的分開反應進行，或者其可以在單個反應容器中進行。盡管單管巢式PCR反應的吸引力是明顯的，但該方法仍有一些問題，如不同輪擴增之間的效率不一致，這使得在期望獲得定量結(jié)果時有顯著局限性。為了以接連的順序從不同引物組有效擴增，許多現(xiàn)有技術(shù)的方向主要關(guān)注于這樣的方法降低外引物的濃度， 和在第一階段有高退火溫度并且在第二階段有較低的溫度。然而，不同引物組之間的擴增效率顯著不同，從而限制了該方法的應用。不將本發(fā)明限制于任一理論或作用方式，已確定在用外引物組擴增后，針對外引物的反義寡核苷酸的作用可以有效地使通過外正向引物進行的擴增下降。反義寡核苷酸與外引物的雜交會導致游離外引物的濃度降低，從而會導致該引物無法有效地與靶DNA模板雜交。雜交取決于多個變量。反義寡核苷酸與引物雜交的強度和程度取決于寡核苷酸的Tm， 該Tm繼而取決于寡核苷酸序列和長度、任何錯配或者降低或增加雜交的修飾的存在、寡核苷酸的濃度以及退火溫度和時間。除反義寡核苷酸的大部分3’堿基與引物的大部分5’堿基雜交的反義寡核苷酸之外，反義寡核苷酸的雜交會導致其沿3’方向延伸。這會產(chǎn)生具有更高Tm的更長反義寡核苷酸，其在隨后的循環(huán)中更強地雜交。認識到影響雜交的這些不同因素會幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員設(shè)計單管巢式PCR，其包含一種或多種反義寡核苷酸引物，以使在PCR起始的較高溫度階段反義寡核苷酸與引物的雜交最小化或不存在，而在隨后的較低溫度階段發(fā)生。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應理解，在高溫度階段外引物以高功能性濃度存在，因此該階段的PCR擴增效率是最佳的，而在較低溫度階段外引物以低得多的游離濃度存在，但內(nèi)引物以不變的高濃度存在，從而擴增可以以最佳效率繼續(xù)。在較低溫度階段的擴增中，一旦內(nèi)引物開始產(chǎn)生擴增子，所有其“后代，，擴增子和隨后循環(huán)中產(chǎn)生的擴增子將僅由內(nèi)引物產(chǎn)生。因此在該階段中，每循環(huán)的擴增將逐漸地從由外引物引發(fā)轉(zhuǎn)化為由內(nèi)引物引發(fā)。應理解所提及的“引物”和“反義寡核苷酸”是指包含核苷酸序列或其功能性衍生物或類似物的任何分子，其功能包括與目的核酸分子區(qū)域(目的DNA也稱為“靶DNA”)雜交和擴增DNA序列的5’至該區(qū)域。應理解引物或反義寡核苷酸可以包含非核酸成分。例如， 引物或反義寡核苷酸還可以包含非核酸標簽(如熒光或酶標簽或一些其他非核酸成分)， 它們利于所述分子用作探針的用途，或者利于其檢測或固定化。引物或反義寡核苷酸還可以包含另外的核酸成分。在另一實例中，引物或反義寡核苷酸可以是蛋白質(zhì)核酸，其包含展示核酸側(cè)鏈的肽骨架。優(yōu)選地，所述寡核苷酸引物是DNA引物。 應理解所涉及的“正向引物”是指通過與靶DNA的反義鏈雜交而在PCR中擴增目的DNA樣品中的靶DNA的引物。應理解所涉及的“反向引物”是指通過與靶DNA的有義鏈雜交而在PCR中擴增目的DNA樣品中的靶DNA的引物。如之前詳述地，巢式PCR基于使用兩組或更多組正向和反向引物，它們用于逐漸地與目的DNA區(qū)域中更靠內(nèi)的序列雜交。在本發(fā)明背景中，應理解所提及的“第一”正向和反向引物是指雜交目的DNA區(qū)域最外位置的引物。應理解“第二”正向和反向引物指內(nèi)引物。也就是說這些第二引物設(shè)計成分別與第一正向引物下游和第一反向引物上游的序列雜交。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以設(shè)計這些引物沿目的DNA區(qū)域雜交的間隔。應理解本文所涉及的 “第三”正向和反向引物組是指更靠內(nèi)的引物組，其設(shè)計成分別與第二正向引物下游和第二反向引物上游的序列雜交。本發(fā)明的反義寡核苷酸設(shè)計成與特定正向引物雜交。因此，“針對(directed to)，， 是指反義寡核苷酸與本發(fā)明的引物區(qū)域雜交。因此，反義寡核苷酸可以僅與所述引物的一部分雜交，或者它可以在引物的全部長度上雜交。應理解盡管該寡核苷酸被稱為“反義”寡核苷酸，該術(shù)語的使用旨在表示該寡核苷酸的核苷酸序列設(shè)計成使該寡核苷酸與本發(fā)明的引物雜交。還應理解本說明書中描述反義寡核苷酸的命名中，與所述引物3’端雜交的寡核苷酸末端被稱為寡核苷酸的5’端，而另一端是寡核苷酸的3’端。不將本發(fā)明限制于任一理論或作用模式，本發(fā)明的反應可設(shè)計成使用一種或多于一種類型的反義寡核苷酸。當使用多于一種類型的反義寡核苷酸時，這些寡核苷酸可設(shè)計成與外引物的不同區(qū)域雜交。應理解所使用的反義寡核苷酸可以僅針對正向引物或僅針對反向引物。在另一備選方案中，反應可以設(shè)計成使用針對正向引物的反義寡核苷酸和針對反向引物的反義寡核苷酸兩者。也不將本發(fā)明限制于任一理論或作用模式，本發(fā)明反應可設(shè)計成使用半巢式而不是巢式反應。在這種情況下，不使用第二正向或第二反向引物，并且不存在針對剩余的單個正向或單個反向引物的反義寡核苷酸。本發(fā)明反義寡核苷酸的形式可以是簡單的反義寡核苷酸，或者它可以包含另外的功能或結(jié)構(gòu)特征，所述特征增強反義寡核苷酸抑制正向引物所致進行中之擴增的作用，或者以其他方式使該作用更有效。這些特征可包括但不限于(i)反義寡核苷酸上的5’標簽這是抑制外引物所致擴增的另外機制，并且其基于將反義寡核苷酸設(shè)計為與正向或反向引物的3’端雜交并且在寡核苷酸5’端安置寡核苷酸標簽(本文中也相互替換地稱為“寡核苷酸延伸”)。該寡核苷酸標簽的作用在圖2中顯示。當引物與帶有標簽的反義寡核苷酸雜交時，引物沿3’方向延伸。該雙鏈體解離后，在相同或隨后的PCR循環(huán)中，延伸的引物可以與互補模板鏈雜交。為了沿模板有效延伸，引物延伸序列必須與和該延伸雜交的模板鏈序列互補，而為此所述寡核苷酸標簽的序列必須與和該延伸雜交的模板鏈序列相同。相反，如果寡核苷酸標簽的序列與和該延伸雜交的模板鏈序列不同，將不會發(fā)生進一步的延伸和擴增，即引物會失活。因此，在許可溫度下的PCR中，發(fā)生了外引物分子隨循環(huán)數(shù)增加而逐漸失活，該現(xiàn)象與反義寡核苷酸和外引物雜交所產(chǎn)生的直接抑制作用協(xié)同作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解標簽的基本特性是作為正向和/或反向引物3’延伸的模板，從而使得延伸的引物在后續(xù)的PCR循環(huán)中不能發(fā)揮作用；這可以通過包含5’反義寡核苷酸標簽來實現(xiàn)，該標簽是正常核苷酸或經(jīng)修飾的核苷酸，如異脫氧胞嘧啶或異脫氧鳥嘌呤(反應中必須存在互補核苷酸)；寡核苷酸標簽序列與將和該延伸雜交的模板鏈序列之間的差異越大，引物失活得程度就越大；這樣產(chǎn)生特別有效的失活，即通過使寡核苷酸標簽序列與將和該延伸雜交的模板鏈序列完全互補來實現(xiàn)。(ii)抑制反義寡核苷酸的3’延伸可以設(shè)計反義寡核苷酸使得當其與引物雜交時可以阻止正在進行的3’延伸。當反義寡核苷酸分子在非引物5’端處與引物分子雜交時，它會進行3’延伸直至到達5’端。 不以任何方式限制本發(fā)明，在隨后的PCR循環(huán)中，延伸的寡核苷酸分子(具有增加的Tm)會對外引物的擴增發(fā)揮更大的抑制作用，其原因是更多的雜交導致游離引物濃度降低以及更多的雜交導致由沿寡核苷酸標簽的3’延伸引起的更多的失活。如果3’延伸的寡核苷酸的該增強的抑制作用太大以致導致PCR高溫度階段中對擴增的一些抑制，則該作用在一些情況下可能不利于生產(chǎn)。因此，可能期望阻止反義寡核苷酸的3’延伸。本領(lǐng)域技術(shù)人員應理解反義寡核苷酸的3’延伸可以通過3’端的多種不同修飾被阻止。這些包括但不限于-將導致標簽與引物錯配的標簽放置在3’端；或-將不允許延伸的分子(例如雙脫氧胸苷、異脫氧胞嘧啶或異脫氧鳥嘌呤)放置在 3’端；或-使3’端磷酸化。圖1和圖3-6顯示的結(jié)果使用3個核苷酸的錯配標簽。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應理解通過使用寡核苷酸(3’端未修飾或修飾)的混合物，可以控制反義寡核苷酸3’延伸發(fā)生的程度。(iii)摻入(i)和(ii)中所述的兩種反義寡核苷酸修飾。因此，本發(fā)明的一個實施方案涉及擴增目的DNA區(qū)域的方法，所述方法包括(i)將DNA樣品與以下項相接觸(a)針對所述目的區(qū)域的第一正向引物和針對所述目的區(qū)域的第一反向引物；和(b)針對所述目的區(qū)域的第二正向引物，其中所述第二正向引物針對位于所述第一正向引物所針對序列3’的核酸序列，并且所述第二正向引物的Tm低于所述第一正向引物的Tm ；和針對所述目的區(qū)域的第二反向引物，其中所述第二反向引物針對位于所述第一反向引物所針對序列5’的核酸序列，并且所述第二反向引物的Tm低于所述第一反向引物的 Tm;和(c)針對所述第一引物的一種或多種反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸的Tm低于所述第一引物；而且所述反義寡核苷酸之一與所述引物的3’端雜交并且包含5’核酸標簽序列，所述標簽的互補核苷酸序列相對于所述引物雜交位點5’端相鄰DNA區(qū)域之核苷酸序列是錯配的其中(b)和(C)部分的所述分子可以在所述擴增步驟(ii)之前、期間或之后但在所述擴增步驟(iii)之前加入反應；(ii)在下述退火溫度下擴增步驟(i)的DNA樣品，所述退火溫度使所述第一引物雜交但不使所述第二引物以及所述反義寡核苷酸雜交；和(iii)在下述退火溫度下擴增步驟(ii)的DNA樣品，所述退火溫度使所述第二引物以及所述反義寡核苷酸雜交。在另一實施方案中，本發(fā)明涉及擴增目的DNA區(qū)域的方法，所述方法包括(i)將DNA樣品與以下項相接觸(a)針對所述目的區(qū)域的第一正向引物和針對所述目的區(qū)域的第一反向引物；和(b)針對所述目的區(qū)域的第二正向引物，其中所述第二正向引物針對位于所述第一正向引物所針對序列3’的核酸序列，并且所述第二正向引物的Tm低于所述第一正向引物的Tm ；和
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針對所述目的區(qū)域的第二反向引物，其中所述第二反向引物針對位于所述第一反向引物所針對序列5’的核酸序列，并且所述第二反向引物的Tm低于所述第一反向引物的 Tm;和(c)針對所述第一引物的一種或多種反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸的Tm低于所述第一引物；而且一種或多種所述反義寡核苷酸包含不能進行正常延伸的3’端其中(b)和(C)部分的所述分子可以在所述擴增步驟(ii)之前、期間或之后但在所述擴增步驟(iii)之前加入反應；(ii)在下述退火溫度下擴增步驟(i)的DNA樣品，所述退火溫度使所述第一引物雜交但不使所述第二引物以及所述反義寡核苷酸雜交；和(iii)在下述退火溫度下擴增步驟(ii)的DNA樣品，所述退火溫度使所述第二引物以及所述反義寡核苷酸雜交。在另一實施方案中，本發(fā)明涉及擴增目的DNA區(qū)域的方法，所述方法包括(i)將DNA樣品與以下項相接觸(a)針對所述目的區(qū)域的第一正向引物和針對所述目的區(qū)域的第一反向引物；和(b)針對所述目的區(qū)域的第二正向引物，其中所述第二正向引物針對位于所述第一正向引物所針對序列3’的核酸序列，并且所述第二正向引物的Tm低于所述第一正向引物的Tm ；和針對所述目的區(qū)域的第二反向引物，其中所述第二反向引物針對位于所述第一反向引物所針對序列5’的核酸序列，并且所述第二反向引物的Tm低于所述第一反向引物的 Tm;和(c)針對所述第一引物的一種或多種反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸的Tm低于所述第一引物；而且所述反義寡核苷酸包含 與所述引物的3’端雜交的所述反義寡核苷酸上的5’核酸標簽序列，其，所述標簽的互補核苷酸序列相對于所述引物雜交位點的5’端相鄰的DNA區(qū)域之核苷酸序列是錯配的；和 不能進行正常延伸的3’端其中(b)和(C)部分的所述分子可以在所述擴增步驟(ii)之前、期間或之后但在所述擴增步驟(iii)之前加入反應；(ii)在下述退火溫度下擴增步驟(i)的DNA樣品，所述退火溫度使所述第一引物雜交但不使所述第二引物以及所述反義寡核苷酸雜交；和(iii)在下述退火溫度下擴增步驟(ii)的DNA樣品，所述退火溫度使所述第二引物以及所述反義寡核苷酸雜交。應理解所提及的“寡核苷酸標簽”是指與本發(fā)明反義寡核苷酸連接的核苷酸序列。 在一個實施方案中，所述標簽長度為1-10個堿基，優(yōu)選長2-5個堿基，更優(yōu)選長2-3個堿基。所述標簽設(shè)計成使與所述標簽序列互補的核苷酸序列相對于引物3’端雜交位點的5’ DNA區(qū)域之核苷酸序列是錯配的?！板e配的(mismatched)”是指所述標簽序列使得隨后引物與反義寡核苷酸雜交并且引物沿標簽延伸，只有對應于初始引物的延伸引物區(qū)段才能夠與目的DNA區(qū)域雜交，而延伸的區(qū)段是不利于其與目的DNA區(qū)域雜交的序列。這樣，由于引物的3’端不能與目的DNA區(qū)域雜交，則擴增期間該引物的任何進一步延伸均被抑制。 因此，當引物與反義寡核苷酸雜交時，引物沿3’方向延伸，并且當這樣修飾的引物隨后與其擴增子模板雜交時，產(chǎn)生阻止沿3’方向有效延伸的終止序列。因此，本發(fā)明方法使得最外部引物的初始擴增作為主要擴增反應在起始時有效地進行。然而，由于應該終止該擴增并進行內(nèi)部第二引物對的擴增，反義寡核苷酸雜交以及第一正向引物沿反義寡核苷酸標簽區(qū)域延伸的進行導致產(chǎn)生下述引物，即有效阻止在目的 DNA區(qū)域背景下進行任何進一步延伸的引物。伴隨著退火溫度條件的變化，正在進行的外引物擴增被最小化，并且內(nèi)引物的擴增可以在利于有效擴增的條件下進行。應理解可以這樣設(shè)計反應，使用針對正向引物或反向引物或者正向和反向引物兩者的反義分子。適用于本發(fā)明的引物和反義寡核苷酸的設(shè)計和合成是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。引物和寡核苷酸的Tm值很大程度上取決于不同PCR階段期望的退火溫度。例如，對于圖1和 3-6所示的實驗，由于使用了 Taqman探針并且為了使非特異性最小化，對第二階段期望使用58°C的退火溫度。根據(jù)經(jīng)驗，Tm值為58-66°C的內(nèi)引物和Tm值為48_52°C的反義寡核苷酸會在該溫度發(fā)揮滿意作用，但會在高于68-70 V的溫度下喪失作用。因此第一階段的退火溫度被設(shè)置為72°C。單管巢式PCR的這種設(shè)計顯示是穩(wěn)定的，因為其對所研究的4個基因均運作良好。如果期望第二階段有更低的退火溫度或者如果第三階段應使用甚至更低的溫度進行，則本領(lǐng)域技術(shù)人員能對方案進行修改。所述引物可以是達到具有特定退火溫度的功能目標的任何合適長度。例如，對象外引物長4至60個核苷酸，在另一實施方案中長10至50，在又一實施方案中長15至45， 在另一實施方案中長20至40，在又一實施方案中長25至35。在又一實施方案中，引物的長度為約26、27、觀、29、30、31、32、33或34個核苷酸。本發(fā)明的內(nèi)引物具有較低的Tm并且通常較短，長4至50個核苷酸，在另一實施方案中長8至40個核苷酸，在又一實施方案中長12至30個核苷酸，在另一實施方案中長13至30個核苷酸，在又一實施方案中長14至 25個核苷酸，在又一實施方案中長15、16、17、18、19、20、21或22個核苷酸。本發(fā)明引物被設(shè)計為顯示彼此不同的解鏈溫度(Tm)，同時反義寡核苷酸顯示另外的Tm。不以任何方式限制本發(fā)明，獨特解鏈溫度和反義寡核苷酸的使用相聯(lián)合使得保持一個擴增階段到下一個階段的良好擴增效率，特別是擴增的良好效率。更特別地，最外部的引物被設(shè)計為具有最高的Tm。這使得第一階段的擴增在高退火溫度下進行，并且使非特異退火和擴增最小化。具體而言，由于反義寡核苷酸和內(nèi)引物顯示更低的Tm值，不利于這些分子退火和擴增。本領(lǐng)域技術(shù)人員能容易地確定所述第一引物、所述第二引物和所述反義寡核苷酸雜交并使其有效或無效地行使功能的退火溫度范圍。因此，反應條件的設(shè)計(例如確定“能使所述第一引物雜交而不使所述第二引物和所述反義寡核苷酸雜交的退火溫度”)是常規(guī)方法。所述確定可以直接通過使用多種qPCR儀器(例如BioRad生產(chǎn)的iQ實時PCR儀器) 之一來完成，它在一系列反應孔中提供退火溫度的梯度，使得可以在不同退火溫度進行獨立的PCR。可以直接確定Ct值以及隨之確定的使得能或不能雜交的退火溫度。或者，可以通過獲得所述第一引物、所述第二引物和所述反義寡核苷酸的預估Tm圖(通過參考用堿基堆積算法來估計Tm的多個網(wǎng)站中的一個,例如http://www. promega. com/biomath/calcll.htm、http://www. idtdna. com/analyzer/App Ii cat ions/01 igoAnalyzer)來間接進行所述確定。我們實驗室的實驗結(jié)果表明在退火溫度低于大約它們相應的預估Tm值加5°C時，所述第一和第二引物有效擴增；所述第二引物在高于大約相應預估Tm值加7°C時不產(chǎn)生顯著擴增；以及在退火溫度低于大約寡核苷酸的預估Tm加10°C時，所述反義寡核苷酸顯示對所述第一引物擴增的可測量抑制。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應理解，步驟(ii)可以在最高溫度(使得通過所述第一引物有效擴增)和最低溫度(在該溫度所述內(nèi)引物不顯示可測量的擴增， 而且所述反義寡核苷酸不顯示可測量的抑制)范圍內(nèi)的任何退火溫度下方便地進行，步驟 (iii)可以在所述第二引物有效擴增而且所述反義寡核苷酸有可測量抑制的任何退火溫度下方便地進行。還應理解可以利用任何適合技術(shù)將步驟(ii)的擴增設(shè)計為不能使第二引物以及反義寡核苷酸雜交，所述技術(shù)如，由于選定退火溫度比它們各自的Tm值大，或者僅是由于在步驟(ii)的擴增發(fā)生時，第二引物和反義寡核苷酸還沒有加入到反應混合物中。在一個實施例中，將第一組外引物設(shè)計為顯示65-75°C的Tm，而第二組內(nèi)引物被設(shè)計為顯示約低KTCWTm，即55_65°C。如果使用第三組內(nèi)引物，其將被設(shè)計為具有更低的 Tm，如45-55°C，針對第二正向引物的反義寡核苷酸顯示最低的Tm。因此，所述不同引物的解鏈溫度可以被設(shè)計為顯示5-15°C的差異，如5°C、6°C、7°C、8°C、9°C、10°C、11 °C和12°C的差異。在一個實施方案中，所述第一引物顯示70-75°C的Tm，而所述第二引物顯示58-62°C的 Tm，而且所述反義寡核苷酸顯示48-52°C的Tm。根據(jù)該實施方案，提供擴增目的DNA區(qū)域的方法，所述方法包括(i)將DNA樣品與以下項相接觸(a)針對所述目的區(qū)域的第一正向引物和針對所述目的區(qū)域的第一反向引物；和(b)針對所述目的區(qū)域的第二正向引物，其中所述第二正向引物針對位于所述第一正向引物所針對序列3’的核酸序列，并且所述第二正向引物的Tm比所述第一正向引物的 Tm 低 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20°C ；和針對所述目的區(qū)域的第二反向引物，其中所述第二反向引物針對位于所述第一反向引物所針對序列5’的核酸序列，并且所述第二反向引物的Tm比所述第一反向引物的Tm 低 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20°C ；和(c)針對所述第一引物的一種或多種反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸的Tm比所述第一引物低 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 0C ；而且所述反義寡核苷酸包含 與所述引物的3’端雜交的所述反義寡核苷酸上的5’核酸標簽序列，其，所述標簽的互補核苷酸序列相對于所述引物雜交位點的5’端相鄰的DNA區(qū)域之核苷酸序列是錯配的；和 不能進行正常延伸的3’端其中(b)和(C)部分的所述分子可以在所述擴增步驟(ii)之前、期間或之后但在所述擴增步驟(iii)之前加入反應；(ii)在下述退火溫度下擴增步驟(i)的DNA樣品，所述退火溫度使所述第一引物雜交但不使所述第二引物以及所述反義寡核苷酸雜交；和(iii)在下述退火溫度下擴增步驟(ii)的DNA樣品，所述退火溫度使所述第二引物以及所述反義寡核苷酸雜交。在另一實施方案中，所述第一引物顯示65-75 °C的Tm，優(yōu)選69_73 °C，所述第二引物顯示55-65 °C的Tm，優(yōu)選59-63 °C，而且所述反義寡核苷酸顯示45-55 V的Tm，優(yōu)選 49-52 "C。應理解本發(fā)明的引物、寡核苷酸和標簽不應限于本文示例的具體結(jié)構(gòu)(線性、單鏈分子)，而是可擴展至達成本文詳細描述的功能目標的任何適合結(jié)構(gòu)構(gòu)型。例如，所述引物可設(shè)計成包含下述5’序列，其自身可以作為3’端引物序列的反義寡核苷酸在PCR的低溫階段形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)(具有或不具有5’標簽)；在這種情況下可以不需要單獨的反義寡核苷酸。其他實例可以包括-由兩個或更多個雜交序列組成的引物，所述雜交序列由一個或多個非雜交區(qū)域分隔開；-由兩個或更多個雜交序列組成的反義寡核苷酸，所述雜交序列由一個或多個非雜交或弱雜交區(qū)域分隔開，每個這種區(qū)域包含一個或多個非雜交或弱雜交堿基或接頭；-通過連接兩個或更多個較小的反義寡核苷酸在PCR過程中形成的反義寡核苷酸。在一些情況下，可期望進行三階段巢式擴增。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用上述實施方案中涵蓋的原理和多種變化來設(shè)計這種擴增。因此，本發(fā)明的另一方面涉及擴增目的DNA區(qū)域的方法，所述方法包括(i)將DNA樣品與以下項相接觸(a)針對所述目的區(qū)域的第一正向引物和針對所述目的區(qū)域的第一反向引物；和(b)針對所述目的區(qū)域的第二正向引物，其中所述第二正向引物針對位于所述第一正向引物所針對序列3’的核酸序列，并且所述第二正向引物的Tm低于所述第一正向引物的Tm ；和針對所述目的區(qū)域的第二反向引物，其中所述第二反向引物針對位于所述第一反向引物所針對序列5’的核酸序列，并且所述第二反向引物的Tm低于所述第一反向引物的 Tm;和(c)針對所述目的區(qū)域的第三正向引物，其中所述第三正向引物針對位于所述第二正向引物所針對序列3’的DNA序列，并且所述第三正向引物的Tm低于所述第二正向引物的Tm ；和針對所述目的區(qū)域的第三反向引物，其中所述第三反向引物針對位于所述第二反向引物所針對序列5’的DNA序列，并且其中所述第三反向引物的Tm低于所述第二反向引物的Tm ；和(d)針對所述第一引物的一種或多種反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸的Tm低于所述第一引物；以及針對所述第二引物的一種或多種反義寡核苷酸，每種所述反義寡核苷酸的Tm低于所述第二引物；其中(b)、(C)和(d)部分的所述分子可以在所述擴增步驟(ii)之前、期間或之后但在所述擴增步驟(iii)之前加入反應；(ii)在下述退火溫度下擴增步驟(i)的DNA樣品，所述退火溫度使所述第一引物雜交，但不使所述第二引物以及第三引物以及所述反義寡核苷酸雜交；和
(iii)在下述退火溫度下擴增步驟(ii)的DNA樣品，所述退火溫度使所述第二引物以及所述針對所述第一引物的反義寡核苷酸雜交，但不使所述第三引物以及所述針對所述第二引物的反義寡核苷酸雜交；(iv)在下述退火溫度下擴增步驟(iii)的DNA樣品，所述退火溫度使所述第三引物以及所述針對所述第二引物的反義寡核苷酸雜交。在一個實施方案中，本發(fā)明的反義寡核苷酸包含(a)與所述引物的3’端雜交的所述反義寡核苷酸上的5’核酸標簽序列，其，所述標簽的互補核苷酸序列相對于所述引物雜交位點的5’端相鄰的DNA區(qū)域之核苷酸序列是錯配的；和(b)不能進行正常延伸的3’端可用于該實施方案的條件的實例為第一正向和反向引物的Tm值為70-72°C，第二正向和反向引物的Tm為58-62°C，第三正向和反向引物的Tm為42-50°C，和；針對第一正向和反向引物之一或兩者的反義寡核苷酸的Tm值為48-52°C，針對第二正向和反向引物之一或兩者的反義寡核苷酸Tm為30-45°C。利用相似的原理，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以設(shè)計包含 4階段的單管巢式PCR，其使用4對引物和3對反義寡核苷酸?？梢酝ㄟ^任何合適方法來利于引物和反義寡核苷酸與靶DNA的相互作用。這些方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。為此，應理解可以在任何時間點將反義寡核苷酸和/或內(nèi)引物摻入反應管。盡管一般在初始擴增循環(huán)開始前摻入(即與正向和反向外引物一起摻入)，可以在用外引物進行初始擴增循環(huán)之后摻入其之一或更多。在任一情況下，反義寡核苷酸僅在反應溫度降低至允許第二引物對擴增后發(fā)揮全部作用。反義寡核苷酸和/或內(nèi)引物的摻入模式將取決于本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇如何進行擴增反應，但通常地，為了便于使用和避免污染，通常期望能夠在單管中進行全部反應。但是可以使用任何其他達成本發(fā)明步驟的方法。本發(fā)明方法優(yōu)選以兩階段反應進行。階段1的退火溫度保證僅有第一外引物組以任何程度雜交，而反義寡核苷酸或者第二或第三引物組不雜交。但是，階段2的退火溫度選擇成使第二引物組以及針對第一引物組的反義寡核苷酸雜交。每個階段進行的適合循環(huán)數(shù)可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。例如，通常第一階段可以用15-30個循環(huán)，第二階段10-40個循環(huán)?？梢灾饾u降低退火溫度以使兩個階段逐漸轉(zhuǎn)換，而不是在PCR第二階段開始時急速降低退火溫度。實現(xiàn)引物引導擴增的方法也是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。在一個優(yōu)選的方法中，所述擴增是聚合酶鏈式反應。應理解所提及的“樣品”是指生物或非生物樣品。非生物樣品的實例包括，例如合成產(chǎn)生的核酸類群的核酸產(chǎn)物。應理解所提及的“生物樣品”是指源自動物、植物或微生物 (包括微生物培養(yǎng)物)的任何生物材料樣品，包括但不限于細胞材料、血液、粘液、糞便、尿液、組織活檢樣本、引入動物機體并隨后取出的流體(如洗肺后從肺提取的鹽溶液或者灌腸洗液中回收的溶液)、植物材料或植物繁殖材料(如種子或花)或者微生物集落。根據(jù)本發(fā)明方法檢測的生物樣品可以直接被檢測或者可以需要在檢測前進行一些形式的處理。例如活檢樣品在測試前可能需要勻漿。而且，在生物樣品不是液體形式的情況下，可能需要添加試劑(如緩沖液)以使樣品流動。
在靶DNA存在于生物樣品中的情況下，可以直接測試生物樣品，或者可以在測試前分離生物樣品中存在的全部或一些核酸物質(zhì)。在測試前對靶核酸分子進行預處理(例如滅活活病毒或者進行凝膠電泳)在本發(fā)明的范圍內(nèi)。還應理解生物樣品可以是新收集的， 或者其可以在測試前被儲存(例如通過冷凍)或者在測試前進行了另外的處理(如通過進行培養(yǎng))。應理解所提及的將樣品與引物或反義寡核苷酸“相接觸”是指促使引物與樣品混合以發(fā)生相互作用(例如雜交)。達到該目的的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。選擇何種類型的樣品最適于根據(jù)本文公開方法的測試將取決于情況的性質(zhì)，如所監(jiān)測病癥的性質(zhì)。例如，在一個優(yōu)選的實施方案中，腫瘤病癥是分析的對象。如果腫瘤病癥是白血病，則血液樣品、淋巴液樣品或骨髓抽取物可能提供適合的測試樣品。當腫瘤病癥是淋巴瘤時，淋巴結(jié)活檢或者血液或骨髓樣品可能提供適合的測試樣品來源。還需要考慮是否監(jiān)測腫瘤細胞的初始來源，或者監(jiān)測是否存在腫瘤從起始位點轉(zhuǎn)移或其他形式的擴散。 為此，可期望從任一哺乳動物收集并檢測多個樣品。選擇對任何給定檢測情況適合的樣品在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。本文所用術(shù)語“哺乳動物”包括人、靈長動物、家畜(例如馬、牛、羊、豬、猴)、實驗室測試動物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠)、寵物(例如狗、貓)和捕獲的野生動物(如袋鼠、 鹿、狐)。優(yōu)選地，哺乳動物是人或?qū)嶒炇覝y試動物。甚至更優(yōu)選地，哺乳動物是人。盡管本發(fā)明方法設(shè)計成使得其作為以退火溫度轉(zhuǎn)變區(qū)分的兩階段擴增進行，不應將其理解為對技術(shù)人員是否要加入另外的步驟(例如提供擴增目的核酸區(qū)域的有效手段) 的限制。本發(fā)明方法可用于一些應用，包括但不限于診斷和/或監(jiān)測以特定基因序列為特征的疾病病癥，表征或分析目的基因區(qū)域，細菌、病毒或其他急性或潛在病原生物體的全部檢測和定量，研究司法或存檔DNA樣品或者研究存在PCR非特異性問題的任何樣品。參照以下非限制性實施例進一步描述本發(fā)明。實施例1設(shè)計兩階段巢式單管PCR的公認標準基本循環(huán)條件
權(quán)利要求
1.一種擴增目的核酸區(qū)域的方法，所述方法包括(i)將核酸樣品與以下項相接觸(a)針對所述目的區(qū)域的第一正向引物和針對所述目的區(qū)域的第一反向引物；和(b)針對所述目的區(qū)域的第二正向引物，其中所述第二正向引物針對位于所述第一正向引物所針對序列3’的核酸序列，并且所述第二正向引物的Tm低于所述第一正向引物的 Tm;和針對所述目的區(qū)域的第二反向引物，其中所述第二反向引物針對位于所述第一反向引物所針對序列5’的核酸序列，并且所述第二反向引物的Tm低于所述第一反向引物的Tm ；和(c)針對所述第一引物的一種或多種反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸的TJS于所述第一引物；而且其中(b)和(c)部分的所述分子可以在所述擴增步驟(ii)之前、期間或之后但在所述擴增步驟(iii)之前加入反應；( )在下述退火溫度下擴增步驟(i)的核酸樣品，所述退火溫度使所述第一引物雜交但不使所述第二引物以及所述反義寡核苷酸雜交；和(iii)在下述退火溫度下擴增步驟(ii)的核酸樣品，所述退火溫度使所述第二引物以及所述反義寡核苷酸雜交。
2.權(quán)利要求1的方法，所述方法包括(i)將DNA樣品與以下項相接觸(a)針對所述目的區(qū)域的第一正向引物和針對所述目的區(qū)域的第一反向引物；和(b)針對所述目的區(qū)域的第二正向引物，其中所述第二引物針對位于所述第一正向引物所針對序列3’的核酸序列，并且所述第二正向引物的Tm低于所述第一正向引物的Tm ；和針對所述目的區(qū)域的第二反向引物，其中所述第二反向引物針對位于所述第一反向引物所針對序列5’的核酸序列，并且所述第二反向引物的Tm低于所述第一反向引物的Tm ；和(c)針對所述目的區(qū)域的第三正向引物，其中所述第三正向引物針對位于所述第二正向引物所針對序列3’的DNA序列，并且所述第三正向引物的Tm低于所述第二正向引物的 Tm;和針對所述目的區(qū)域的第三反向引物，其中所述第三反向引物針對位于所述第二反向引物所針對序列5’的DNA序列，并且所述第三反向引物的Tm值低于所述第二反向引物的Tm 值；和(d)針對所述第一引物的一種或多種反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸的TJS于所述第一引物；以及針對所述第二引物的一種或多種反義寡核苷酸，每種所述反義寡核苷酸的 Tm低于所述第二引物；其中(b)、(c)和(d)部分的所述分子可以在所述擴增步驟(ii)之前、期間或之后但在所述擴增步驟(iii)之前加入反應；(ii)在下述退火溫度下擴增步驟(i)的DNA樣品，所述退火溫度使所述第一引物雜交， 但不使所述第二引物以及第三引物以及所述反義寡核苷酸雜交；和(iii)在下述退火溫度下擴增步驟(ii)的DNA樣品，所述退火溫度使所述第二引物以及針對所述第一引物的所述反義寡核苷酸雜交，但不使所述第三引物以及針對所述第二引物的所述反義寡核苷酸雜交；(iv)在下述退火溫度下擴增步驟(iii)的DNA樣品，所述退火溫度使所述第三引物以及針對所述第二引物的所述反義寡核苷酸雜交。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述核酸是DNA。
4.權(quán)利要求1或2或3的方法，其中所述反義寡核苷酸之一與所述引物的3’端雜交并且包含5’核酸標簽序列，所述標簽的互補核苷酸序列相對于所述引物雜交位點的5’端相鄰的DNA區(qū)域之核苷酸序列是錯配的。
5.權(quán)利要求1或2或3的方法，其中一種或多種所述反義寡核苷酸包含不能進行正常延伸的3’端。
6.權(quán)利要求1或2或3的方法，其中所述反義寡核苷酸包含 所述反義寡核苷酸上與所述引物的3’端雜交的5’核酸標簽序列，所述標簽的互補核苷酸序列相對于所述引物雜交位點的5’端相鄰的DNA區(qū)域之核苷酸序列是錯配的；和 不能進行正常延伸的3’端。
7.權(quán)利要求1至4中任一項的方法，其中所述寡核苷酸標簽長1-10個堿基。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述寡核苷酸標簽長2、3、4或5個堿基。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述寡核苷酸標簽長2或3個堿基。
10.權(quán)利要求1至9中任一項的方法，其中所述第一引物長10-50個核苷酸而且所述第二引物長8-40個核苷酸。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述第一引物長15-45個核苷酸而且所述第二引物長 12-30個核苷酸。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述第一引物長20、21、22、23、24、25、26、27、28、四、30、 31、32、33、34、35、36、37、38、39 或 40 個核苷酸。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述第二引物長13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28、29 或 30 個核苷酸。
14.權(quán)利要求11的方法，其中所述第一引物長沈、27、觀、29、30、31、32、33或34個核苷酸而且所述第二引物長15、16、17、18、19、20、21或22個核苷酸。
15.權(quán)利要求1至14中任一項的方法，其中所述第二引物顯示比所述第一引物的1低 5°C -20°C的Tm，而且所述反義寡核苷酸顯示比所述第二引物的Tm低5°C至20°C的Tm。
16.權(quán)利要求2至15中任一項的方法，其中所述第三引物顯示比所述第二引物的T1JS 5-20°C 的 Tm。
17.權(quán)利要求1至16中任一項的方法，其中所述第二引物顯示比所述第一引物的Tm 低7°C、8°C、9°C、10°C、11°C、12°C、13°C、14°C或15°C的Tm，而且所述反義寡核苷酸顯示比所述第一引物的 Tm 低 10°C、11°C、12°C、13°C、14°C、15°C、16°C、17°C、18°C、19°C、20°C、21°C、 22°C、23°C、24°C、25°C、26°C、27°C、28°C、29°C或 30°C 的 Tm。
18.權(quán)利要求15至17中任一項的方法，其中所述第一引物顯示的Tm為651_75°C，所述第二引物顯示的1為55°C _65°C，而且所述反義寡核苷酸顯示的1為45°C _55°C。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述第一引物顯示的Tm*69°C-75°C，所述第二引物顯示的Tm為59°C _63°C，而且所述反義寡核苷酸顯示的Tm為49°C _52°C。
20.權(quán)利要求16的方法，其中所述第一引物的Tm為70°C_72°C，所述第二引物的Tm為 580C -62°C，所述第三引物的Tm為42°C _50°C，而且所述反義寡核苷酸的Tm為30°C -45°C。
全文摘要
本發(fā)明一般性地涉及擴增目的核酸區(qū)域的方法，更特別地，本發(fā)明涉及通過巢式單管PCR來擴增目的核酸區(qū)域的方法。設(shè)計本發(fā)明方法以提供下述手段，即通過靶向至少一個外引物的反義核酸分子來選擇性失活所述外引物功能，從而在整個反應過程中保持擴增效率。在單管巢式PCR的背景下開發(fā)實現(xiàn)用外引物有效擴增而后用內(nèi)引物有效擴增的手段可用于一系列應用，其包括但不限于診斷和/或監(jiān)測特征為特定基因序列的疾病狀況，以及表征或分析特定目的基因區(qū)域。本發(fā)明方法不僅用于簡單的檢測，還能進行定量。
文檔編號C12P19/34GK102459626SQ201080030802
公開日2012年5月16日 申請日期2010年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月2日
發(fā)明者亞歷山大·艾倫·莫利, 邁克爾·朱利安·布里斯科 申請人:弗林德斯大學, 莫諾夸特有限公司