專利名稱：用于卵母細(xì)胞的收集及成熟的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及卵母細(xì)胞的收集和成熟的方法。特別是，本發(fā)明涉及使用改進(jìn)的收集和成熟培養(yǎng)基的體外方法，該方法能促進(jìn)卵母細(xì)胞在受精前成熟。
背景技術(shù)：
在哺乳動(dòng)物中，未成熟的卵子(卵母細(xì)胞)在卵巢內(nèi)卵泡中生長(zhǎng)和發(fā)育。未成熟卵母細(xì)胞代謝性連接于體顆粒細(xì)胞，后者環(huán)繞卵母細(xì)胞并滋養(yǎng)卵母細(xì)胞發(fā)育直至排卵。從本質(zhì)上講，卵母細(xì)胞的成熟取決于其與其同伴體顆粒細(xì)胞的關(guān)聯(lián)，體顆粒細(xì)胞不僅支持卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育，而且調(diào)控減數(shù)分裂的進(jìn)行。在排卵前發(fā)展期間卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和核成熟是密切相關(guān)但可差異區(qū)分的過(guò)程， 對(duì)于成功受精、胚胎發(fā)育、并且可能還對(duì)于胚胎植入的能力至關(guān)重要，最終影響妊娠結(jié)果。在細(xì)胞質(zhì)發(fā)育期間，卵母細(xì)胞的直徑實(shí)質(zhì)上從約15 μ m增加至100 μ m，相當(dāng)于體積上增加300倍。在此階段卵母細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄和翻譯上均非?；钴S。例如，成熟小鼠卵母細(xì)胞含有比平均體細(xì)胞約200倍多的RNA和約50-60倍多的蛋白質(zhì)。卵母細(xì)胞中的mRNA含量也高，與體細(xì)胞中大約2-3%的含量相比，為約15-20%。卵母細(xì)胞的核成熟發(fā)生在促性腺激素黃體生成素激增之后，并且包含核膜溶解、 染色體濃縮、之后的染色體在赤道板的定位、及紡錘體中微管的組織。在西方國(guó)家，現(xiàn)在相當(dāng)比例的兒童使用輔助生殖技術(shù)、包括使用體外受精(IVF) 出生。IVF—般采取以下形式刺激婦女卵巢以產(chǎn)生多個(gè)生長(zhǎng)卵泡，從這些正準(zhǔn)備排卵的生長(zhǎng)的大卵泡中收集卵子，體外用精子接觸收集的卵子并將產(chǎn)生的胚胎引入至子宮。卵母細(xì)胞的體外成熟(IVM)是IVF的輔助療法，其大大降低了治療期間投藥促性腺激素的需求。 IVM包含從接受低水平促性腺激素或甚至無(wú)促性腺激素的患者體內(nèi)小一些的卵泡中取出卵子。用于獲取卵子的過(guò)程需要修改的病人管理系統(tǒng)和卵子收取步驟。在標(biāo)準(zhǔn)IVF步驟中所用的大劑量促性腺激素能夠?qū)е侣殉策^(guò)度刺激綜合征 (OHSS)的狀況，該病征發(fā)生于進(jìn)行IVF周期的約5%的婦女。OHSS通常是溫和和自我限制的。在某些情況下，需要緊急醫(yī)療救護(hù)。在病情嚴(yán)重時(shí)，病征能具有潛在的生命危險(xiǎn)，需住院治療、靜脈輸液、止痛及其他藥物治療。在極少數(shù)情況下，可能會(huì)發(fā)生自腿部血塊的肺栓塞或嚴(yán)重脫水的并發(fā)癥。具有多囊卵巢綜合征病征的婦女需要IVM優(yōu)先于IVF，以避免施用促性腺激素或任意其他卵巢卵泡刺激劑所導(dǎo)致的卵巢過(guò)度刺激。IVM也適用于在不孕癥治療期間優(yōu)先最小化卵泡刺激的婦女。IVM對(duì)于患者也更為方便，因?yàn)樗枰^少的藥物施用，通?？捎苫颊咦陨硗瓿?。IVM也有成本優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗幬锸褂玫某杀颈蛔钚』?。然而，在?shí)現(xiàn)妊娠和活產(chǎn)方面，IVM相對(duì)于IVF的效率降低。盡管近來(lái)已有一些對(duì)于患者管理的改善，在實(shí)驗(yàn)室技術(shù)中進(jìn)展極少。動(dòng)物胚胎的體外生產(chǎn)(IVP)有許多目的，如家畜和馴化品種的遺傳改良、稀有品種的遺傳拯救、以及用于操作(如自性精子生產(chǎn)性胚胎、或以體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移克隆)的平臺(tái)技術(shù)。在體外生產(chǎn)胚胎中的一個(gè)重要技術(shù)是卵母細(xì)胞的體外成熟(IVM)。IVP具有替代當(dāng)今傳統(tǒng)技術(shù)，如多發(fā)排卵和胚胎移植(MOET)的潛力，其(類似于人類臨床應(yīng)用)需要促性腺激素處理。然而，采用IVP用于育種和其他用途已經(jīng)為生產(chǎn)可移植階段胚胎的低效率、此種胚胎胚胎移植之后的不良結(jié)果及凍融(儲(chǔ)存)此種胚胎之后的不良結(jié)果所防礙。因此，培養(yǎng)卵母細(xì)胞的新方法和新培養(yǎng)基將是重要的。特別是，用于收集和成熟卵母細(xì)胞以改善輔助生殖技術(shù)的新方法和新培養(yǎng)基將是特別合乎需要的。在本說(shuō)明中，任意現(xiàn)有技術(shù)的參考不是(且不應(yīng)被理解為)對(duì)于此現(xiàn)有技術(shù)形成任意國(guó)家內(nèi)普遍共識(shí)的一部分的認(rèn)可或任何形式的暗示。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明起源于卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)基及其組分的研究，該培養(yǎng)基及組分增進(jìn)了一旦從卵巢收獲的卵母細(xì)胞的成熟。一方面，本發(fā)明提供以輔助生殖技術(shù)自卵母細(xì)胞生產(chǎn)胚胎的一種方法，該方法包括(a)在包括第一個(gè)磷酸二酯酶抑制劑和增加卵母細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度的試劑的收集培養(yǎng)基中，自受試者卵巢中收集卵母細(xì)胞；(b)在包括第二個(gè)磷酸二酯酶抑制劑的成熟培養(yǎng)基中，培養(yǎng)卵母細(xì)胞，及(c)以輔助生殖技術(shù)自卵母細(xì)胞生產(chǎn)胚胎。另一方面，本發(fā)明提供卵母細(xì)胞體外成熟的一種方法，該方法包括(a)在包括第一個(gè)磷酸二酯酶抑制劑和增加卵母細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度的試劑的收集培養(yǎng)基中，自受試者卵巢收集卵母細(xì)胞 ’及(b)在包括第二個(gè)磷酸二酯酶抑制劑的成熟培養(yǎng)基中，培養(yǎng)卵母細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明提供一種卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基包括(a) 一個(gè)磷酸二酯酶抑制劑；及(b)用于誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟的一種配體，其中，在卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)基中的配體濃度克服了 cAMP誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯。在另一方面，本發(fā)明提供包括下列組分的組合產(chǎn)物(a)包括第一個(gè)磷酸二酯酶抑制劑和增加卵母細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度試劑的卵母細(xì)胞收集培養(yǎng)基 ’及(b)包括第二個(gè)磷酸二酯酶抑制劑和用于誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟的配體的卵母細(xì)胞成
熟培養(yǎng)基；其中，在卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)基中的配體濃度克服了 cAMP誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯。在另一方面，本發(fā)明提供一種誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟的方法，該方法包括在包括磷酸二酯酶抑制劑和用于誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟的配體的成熟培養(yǎng)基中培養(yǎng)卵母細(xì)胞，其中成熟培養(yǎng)基中的配體濃度克服了 cAMP誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯，因此使卵母細(xì)胞成熟。在另一方面，本發(fā)明提供誘導(dǎo)處于減數(shù)分裂阻滯狀態(tài)卵母細(xì)胞成熟的一種方法， 該方法包括以足量濃度的配體接觸卵母細(xì)胞以克服減數(shù)分裂阻滯。發(fā)明一般說(shuō)明在此說(shuō)明書(包括權(quán)利要求)中使用術(shù)語(yǔ)“包括(comprise) ”、“包括 (comprises) ”、“包括(comprised) ”或“包括(comprising)，，時(shí)，它們將被解釋為指定所說(shuō)明的特征、整體、步驟或組分的存在，但不排除一個(gè)或多個(gè)其他特征、整體、步驟、組分或其群組的存在。如此說(shuō)明書中所使用的，單數(shù)形式“一個(gè)”包括復(fù)數(shù)方面，除非上下文明顯另有規(guī)定。在表達(dá)數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)清楚地理解此范圍涵蓋范圍上限和下限、及在此限制內(nèi)的所有數(shù)值。本發(fā)明涉及一種卵母細(xì)胞體外收集和成熟的改進(jìn)方法。已有確切報(bào)道，當(dāng)把收集的卵母細(xì)胞放置于包括磷酸二酯酶抑制劑和增加卵母細(xì)胞和/或卵母細(xì)胞相關(guān)卵丘細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度的試劑的收集培養(yǎng)基中、然后在也包括磷酸二酯酶抑制劑的成熟培養(yǎng)基中培養(yǎng)卵母細(xì)胞時(shí)，顯著改善了自多種群(包括人類和牛種群)卵巢中收獲的卵母細(xì)胞的成熟。關(guān)于輔助生殖技術(shù)，改進(jìn)的方法允許卵母細(xì)胞受精被推遲直至卵母細(xì)胞的成熟更接近于在生殖周期中天然發(fā)生的情況(與在已知培養(yǎng)基中收集的卵母細(xì)胞的成熟相比)。因此，在本發(fā)明第一個(gè)方面，提供了一種以輔助生殖技術(shù)自卵母細(xì)胞生產(chǎn)胚胎的方法，該方法包括(a)在包括第一個(gè)磷酸二酯酶抑制劑和增加卵母細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度的試劑的收集培養(yǎng)基中，自受試者卵巢收集卵母細(xì)胞；(b)在包括第二個(gè)磷酸二酯酶抑制劑的成熟培養(yǎng)基中，培養(yǎng)卵母細(xì)胞，及(c)以輔助生殖技術(shù)自卵母細(xì)胞生產(chǎn)胚胎。此外，本發(fā)明第二個(gè)方面提供一個(gè)卵母細(xì)胞體外成熟的方法，該方法包括(a)在包括第一個(gè)磷酸二酯酶抑制劑和增加卵母細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度的試劑的收集培養(yǎng)基中，自受試者卵巢收集卵母細(xì)胞；(b)在包括第二個(gè)磷酸二酯酶抑制劑的成熟培養(yǎng)基中，培養(yǎng)卵母細(xì)胞。如上面所討論的，輔助生殖技術(shù)的成功很大程度上取決于受精前卵母細(xì)胞的成熟。自卵巢收獲的卵母細(xì)胞當(dāng)放在培養(yǎng)中時(shí)一般進(jìn)行減數(shù)分裂的自發(fā)恢復(fù)，即進(jìn)展至核成熟。此核成熟可能經(jīng)常發(fā)生在卵母細(xì)胞進(jìn)行完全細(xì)胞質(zhì)成熟之前。這被認(rèn)為最終影響受精成功及可能的隨后胚胎著床和發(fā)育。在這方面，應(yīng)理解術(shù)語(yǔ)“卵母細(xì)胞”包括單獨(dú)的卵母細(xì)胞或與一個(gè)或多個(gè)其他細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的卵母細(xì)胞，如作為卵丘卵母復(fù)合體的部分的卵母細(xì)胞。因此，根據(jù)本發(fā)明的第一和第二方面所述的方法使用用于自受試者卵巢收集卵母細(xì)胞的培養(yǎng)基，在此也被稱作“卵母細(xì)胞收集培養(yǎng)基”、“收集培養(yǎng)基”或其變體，其包括第一個(gè)磷酸二酯酶抑制劑和增加卵母細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度的試劑。此外，根據(jù)本發(fā)明的第一和第二方面所述的方法使用用于隨后培養(yǎng)和成熟收集的卵母細(xì)胞的培養(yǎng)基，在此也被稱作“卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)基”、“成熟培養(yǎng)基”或其變體，其包括第二個(gè)磷酸二酯酶抑制劑。如上文所述，收集和成熟培養(yǎng)基都含有磷酸二酯酶抑制劑。在收集和成熟培養(yǎng)基中磷酸二酯酶抑制劑的存在，以及在收集培養(yǎng)基中增加卵母細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)cAMP的試劑的進(jìn)一步存在，提供了防止收獲卵母細(xì)胞發(fā)生減數(shù)分裂自發(fā)恢復(fù)的優(yōu)勢(shì)。因此，各自的培養(yǎng)基促進(jìn)了核成熟前的卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)成熟和隨后的受精過(guò)程開(kāi)始。應(yīng)理解“磷酸二酯酶抑制劑”意指直接或間接阻斷或抑制磷酸二酯酶(PDE)的試齊U，而其作用導(dǎo)致通過(guò)3'-磷酸二酯鍵水解斷裂的環(huán)核苷酸靶標(biāo)(例如，CAMP和cGMP)的失活，導(dǎo)致特定環(huán)核苷酸的被動(dòng)積累。抑制劑能夠是對(duì)于所有磷酸二酯酶同型非選擇性的， 或是對(duì)于特定同型具選擇性的。“磷酸二酯酶同型”指代負(fù)責(zé)代謝或降解細(xì)胞內(nèi)第二信使(cAMP和cGMP)的同工酶或同型家族。特定的同型能夠具有高選擇性的細(xì)胞內(nèi)和亞細(xì)胞定位。磷酸二酯酶同型的例子包括PDE3和PDE4。能夠被用于本發(fā)明方法的PDE抑制劑包括PDE的任意非毒性抑制劑，無(wú)論性質(zhì)上是選擇性或非選擇性。PDE抑制劑可能是蛋白質(zhì)、抗體、適體、反義核酸、反義寡核苷酸、 siRNAs、多肽、肽、小分子、藥物、多糖、糖蛋白和脂類的形式。例如，合適的PDE抑制劑包括， 但不限于，異丁基甲基黃嘌呤(IBMX)、環(huán)己喹酰胺、茶堿、AH-21-132、0rg-30029 (Organon)、 0rg-20241 (Organon)、Org-9731 (Organon)、扎達(dá)維林、長(zhǎng)春西汀、EHNA(MEP-I)、米利酮、 氰胍佐旦、敏喘寧、SK+F 96231、托拉芬群(Byk Gulden)、和非拉司特(Wyeth-Ayerst Pharmaceuticals)。其他PDE抑制劑在本領(lǐng)域內(nèi)也是已知的。在收集培養(yǎng)基中的PDE抑制劑(“第一個(gè)PDE抑制劑”)可以與成熟培養(yǎng)基中的 PDE抑制劑(“第二個(gè)PDE抑制劑”)相同或不同。在一實(shí)施方案中，收集培養(yǎng)基中的PDE抑制劑是IBMX。在另一實(shí)施方案中，成熟培養(yǎng)基中的PDE抑制劑是環(huán)己喹酰胺。在一特定實(shí)施方案中，收集培養(yǎng)基中的PDE抑制劑是IBMX并且成熟培養(yǎng)基中的 PDE抑制劑是環(huán)己喹酰胺。如上面所述，收集培養(yǎng)基還包含增加收集的卵母細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度或水平和/或增加卵母細(xì)胞相關(guān)卵丘細(xì)胞中cAMP濃度或水平的試劑。該試劑可能直接或間接在卵母細(xì)胞中和/或在卵母細(xì)胞相關(guān)卵丘細(xì)胞中通過(guò)增加cAMP合成或生產(chǎn)、或降低其降解、 或兩者來(lái)發(fā)揮作用。用于測(cè)定cAMP合成、生產(chǎn)或降解水平的方法為本領(lǐng)域所已知。在一實(shí)施方案中，cAMP合成或生產(chǎn)相對(duì)于未處理卵母細(xì)胞可能增加了至少10%、 20 %,30 %,40 %,50 %,60 %,70 %,80 %,90 % UOO %,2 倍、5 倍、10 倍、20 倍、50 倍、或 100 倍。類似地，在另一實(shí)施方案中，cAMP降解相對(duì)于未處理卵母細(xì)胞可能降低了至少10%、 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100。增加細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度或水平的試劑可能是蛋白質(zhì)、抗體、適體、反義核酸、反義寡核苷酸、siRNAs、多肽、肽、小分子、藥物、多糖、糖蛋白和脂類的形式。例如，增加cAMP合成或生產(chǎn)的試劑包括腺苷酸環(huán)化酶的激活劑，如毛喉素。降低cAMP降解的調(diào)節(jié)劑的例子包括磷酸二酯酶抑制劑如茶堿。在一實(shí)施方案中，增加細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度或水平的試劑是一個(gè)或多個(gè)毛喉素、侵入性腺苷酸環(huán)化酶和前列腺素E2。根據(jù)本發(fā)明第一和第二方面所述的方法可能還包括暴露卵母細(xì)胞于誘導(dǎo)卵母細(xì)胞核成熟的配體的步驟。在一實(shí)施方案中，配體的濃度足以克服cAMP誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯。包括的該配體可能作為卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)基組分，或可能是卵母細(xì)胞與之相接觸的分開(kāi)的組分或分開(kāi)的培養(yǎng)基的部分。在后面的情況下，可以在根據(jù)本發(fā)明第一和第二方面所述方法的步驟(b)之后加入該配體。該配體可能是蛋白質(zhì)、抗體、適體、反義核酸、反義寡核苷酸、siRNAs、多肽、肽、 小分子、藥物、多糖、糖蛋白和脂類的形式。例如，該配體可能包括，但不限于，卵泡刺激素 (FSH)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)(包括EGF樣肽雙調(diào)蛋白和上皮調(diào)節(jié)蛋白)或其功能性同型?？梢栽O(shè)想在本發(fā)明方法中可能使用一個(gè)或多個(gè)配體。在一實(shí)施方案中，該配體是FSH。在一實(shí)施方案中，F(xiàn)SH的濃度大于10mIU/ml。例如，F(xiàn)SH濃度可能在10_200mIU/ml 之間的范圍內(nèi)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，該配體是EGF。在一實(shí)施方案中，EGF濃度大于lng/ml。本發(fā)明的第一方面涵蓋“輔助生殖技術(shù)”。本說(shuō)明書中通篇使用的術(shù)語(yǔ)“輔助生殖技術(shù)”應(yīng)理解為意指在人類和動(dòng)物內(nèi)包含分離卵母細(xì)胞和/或分離精子的任意受精技術(shù)，包括使用體外培養(yǎng)的卵母細(xì)胞或胚胎的技術(shù)(例如卵母細(xì)胞體外成熟)、體外受精(IVF ；抽取卵母細(xì)胞、在實(shí)驗(yàn)室受精及移植胚胎至受體)、配子輸卵管內(nèi)移植(GIFT ；放置卵母細(xì)胞和精子入輸卵管)、合子輸卵管內(nèi)轉(zhuǎn)移(ZIFT ；放置受精卵入輸卵管)、輸卵管胚胎移植(ΤΕΤ ； 放置分裂胚胎入輸卵管)、腹膜卵母細(xì)胞和精子轉(zhuǎn)移(POST ；放置卵母細(xì)胞和精子入盆腔)、 胞漿內(nèi)精子注射(ICSI)、睪丸精子提取(TESE)及顯微外科附睪精子抽吸術(shù)(MESA)；或用于在人和/或動(dòng)物內(nèi)生產(chǎn)胚胎的任意其他體外技術(shù)，如核轉(zhuǎn)移、孤雌生殖激活和全能細(xì)胞的使用。在一實(shí)施方案中，輔助生殖技術(shù)用于生產(chǎn)人類胚胎。在另一實(shí)施方案中，輔助生殖技術(shù)用于生產(chǎn)牛胚胎。在根據(jù)本發(fā)明第一和第二方面所述的方法中，首先從受試者卵巢中收獲或收集卵母細(xì)胞。卵母細(xì)胞收集能夠根據(jù)本領(lǐng)域長(zhǎng)久已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行。例如，見(jiàn)Textbook of Assisted Reproduction Laboratory and Clinical Perspectives(2003)Editors Gardner, D. K. , Weissman, A. , Howies, C. M.，Shoham，Z. Martin Dunits Ltd，倫敦，英國(guó)；禾口 Gordon, I. (2003)Laboratory Production of Cattle Embryos 第二片反 GABI Publishing, 牛津郡，英國(guó)。多數(shù)卵母細(xì)胞收集技術(shù)包含使用經(jīng)陰道超聲將吸針插入到卵巢卵泡。通過(guò)管路將吸針連接于材料收集阱，而依次收集阱被連接于吸力源(如手動(dòng)操作注射器或機(jī)電式真空源)。通常從多個(gè)卵泡分離卵母細(xì)胞。照這樣，收獲的卵母細(xì)胞就其發(fā)育潛力而言代表著異源群。在本發(fā)明方法的一實(shí)施方案中，輔助生殖技術(shù)包括IVF。IVF涉及卵母細(xì)胞的體外受精，其中卵母細(xì)胞分離自受試者并在液體培養(yǎng)基中孵育以允許卵母細(xì)胞的受精。如上面所顯示，對(duì)于自合適的雌性收集卵母細(xì)胞和卵母細(xì)胞體外受精的方法為本領(lǐng)域眾所周知?？梢栽O(shè)想卵母細(xì)胞的受精最好發(fā)生在卵母細(xì)胞收集步驟之后的大于M小時(shí)、但不晚于60小時(shí)，以便于卵母細(xì)胞成熟度在足夠的階段而最大化IVF方法中隨后步驟的成功率。通常，在35_39°C、在收集培養(yǎng)基中保持卵母細(xì)胞15-120分鐘。然后通常在帶有合適氣體混合物的37-39°C孵箱中、在成熟培養(yǎng)基中孵育卵母細(xì)胞20-60小時(shí)。合適的氣體混合物的例子包括，但不限于，包括CO2 (體積的1-10% )、以空氣或以維持生物活性的比例的 O2和隊(duì)混合物平衡的氣體混合物。然后在成熟培養(yǎng)基中保持卵母細(xì)胞成熟16到60小時(shí)，通常成熟M-50小時(shí)，而在某些情況下成熟觀-44小時(shí)。將領(lǐng)會(huì)的是，成熟時(shí)間可能在物種間有所不同。通常，成熟時(shí)間將是在這些系統(tǒng)中到達(dá)減數(shù)分裂階段中期II的時(shí)間，而照這樣成熟時(shí)間通常將為到達(dá)減數(shù)分裂中期II階段中間時(shí)間的12小時(shí)前至18小時(shí)后。合適的時(shí)間將為到達(dá)減數(shù)分裂階段中期II的3小時(shí)前至6小時(shí)后。例如，在牛的系統(tǒng)中，不含特異抑制減數(shù)分裂進(jìn)行至中期II的化合物的情況下，IVM時(shí)間一般是在18至M小時(shí)的范圍內(nèi)。在人的系統(tǒng)中，IVM時(shí)間將一般大于30小時(shí)，并且大多數(shù)通常在30-50小時(shí)之間。在一實(shí)施方案中，人的IVM時(shí)間等于或大于36小時(shí)，例如在36_48小時(shí)間。在一特定實(shí)施方案中，人的IVM時(shí)間等于或大于40小時(shí)，例如在40-48小時(shí)間。在一特定實(shí)施方案中，人的IVM時(shí)間等于或大于48小時(shí)，例如在48_50小時(shí)間。在本說(shuō)明書中全篇使用的術(shù)語(yǔ)“受試者”應(yīng)理解為包括任意雌性受試者(包括人類女性或雌性哺乳動(dòng)物)。合適的哺乳動(dòng)物的例子包括靈長(zhǎng)類、牲畜(如，馬、牛、綿羊、豬或山羊)、伴侶動(dòng)物(如狗或貓)、實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)動(dòng)物(如小鼠、大鼠、豚鼠)或任意具獸醫(yī)或經(jīng)濟(jì)意義的動(dòng)物。在一實(shí)施方案中，受試者是瘤牛屬(Bos indicus)奶牛。在另一實(shí)施方案中，受試者是金牛屬(Bos Taurus)奶牛。在本發(fā)明的這些及其他方面，卵母細(xì)胞可能是(例如)部分卵泡、部分卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COC)的卵母細(xì)胞或可能是剝光卵母細(xì)胞。在本發(fā)明方法的一實(shí)施方案中，受試者是人類女性，卵母細(xì)胞是人的卵母細(xì)胞，并且胚胎是人類胚胎。在本發(fā)明方法的另一實(shí)施方案中，受試者是奶牛，卵母細(xì)胞是牛卵母細(xì)胞，并且胚胎是牛的胚胎。應(yīng)領(lǐng)會(huì)磷酸二酯酶抑制劑、增加卵母細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度的試劑及誘導(dǎo)卵母細(xì)胞核成熟的配體可能用作卵母細(xì)胞培養(yǎng)基(包括卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)基)的補(bǔ)充物。因此，在本發(fā)明第三方面提供了一種卵母細(xì)胞培養(yǎng)基，包括(a) 一種磷酸二酯酶抑制劑；及(b) 一種用于誘導(dǎo)卵母細(xì)胞核成熟的配體。在一實(shí)施方案中，卵母細(xì)胞培養(yǎng)基是卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)基。在本發(fā)明的第四方面提供一種卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)基，包括(a) 一種磷酸二酯酶抑制劑；及(b) 一種用于誘導(dǎo)卵母細(xì)胞核成熟的配體。其中卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)基中的配體濃度克服了 cAMP誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯。在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明第三或第四方面所述的成熟培養(yǎng)基中的磷酸二酯酶抑制劑可能是如上文所述。在一特定實(shí)施方案中，該磷酸二酯酶抑制劑可能是環(huán)己喹酰胺。在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明第三或第四方面所述的配體可能是如上文所述。 在特定實(shí)施方案中，該配體可能是FSH或EGF。每種配體的濃度可能是如上文所述。在本發(fā)明第三和第四方面的某些實(shí)施方案中，卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)基是人類卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)基或牛的卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)基。在第五方面，本發(fā)明提供一種組合產(chǎn)物，包括下列組分(a)包括第一個(gè)磷酸二酯酶抑制劑和增加卵母細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度試劑的卵母細(xì)胞收集培養(yǎng)基；及(b)包括第二個(gè)磷酸二酯酶抑制劑和用于誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟的配體的卵母細(xì)胞成
熟培養(yǎng)基；其中卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)基中的配體濃度克服了 cAMP誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯。在本發(fā)明這個(gè)方面的一實(shí)施方案中，試劑增加了卵母細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)cAMP生產(chǎn)。例如，該試劑可能是毛喉素。在另一實(shí)施方案中，該試劑降低了卵母細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)cAMP降解。在某些實(shí)施方案中，成熟培養(yǎng)基中的配體是FSH或EGF。FSH濃度通常大于IOmIU/ ml，而EGF濃度通常大于lng/ml。在本發(fā)明第五方面的某些實(shí)施方案中，第一個(gè)磷酸二酯酶抑制劑和第二個(gè)磷酸二酯酶抑制劑不同。例如，第一個(gè)磷酸二酯酶抑制劑可能是IBMX而第二個(gè)磷酸二酯酶抑制劑可能是環(huán)己喹酰胺。在某些實(shí)施方案中，第一個(gè)磷酸二酯酶抑制劑和第二個(gè)磷酸二酯酶抑制劑相同。在某些實(shí)施方案中，可能根據(jù)本發(fā)明方法的任意一個(gè)使用本發(fā)明的卵母細(xì)胞收集和成熟培養(yǎng)基或其組合產(chǎn)物。例如，它們可用于人類或牛的卵母細(xì)胞的收集和成熟。本發(fā)明的卵母細(xì)胞收集培養(yǎng)基還可能被用于沖洗、洗滌和在從受試者卵巢收獲卵母細(xì)胞期間維持卵母細(xì)胞。卵母細(xì)胞收集培養(yǎng)基可能包括NaCl、KCl、Mg2SO4, KH2PO4, Ca (乳酸鹽)、NaHC03、氨基酸及衍生物、蛋白質(zhì)(如血清白蛋白)、葡萄糖、丙酮酸和抗生素的一個(gè)或多個(gè)。如上文所述，該培養(yǎng)基包括一種PDE抑制劑和一種增加卵母細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度的試劑。在某些實(shí)施方案中，卵母細(xì)胞收集培養(yǎng)基中的PDE抑制劑是IBMX。在一實(shí)施方案中，IBMX濃度是在5-5000 μ M之間的范圍內(nèi)。通常濃度在50-1000 μ M之間范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，增加卵母細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度的試劑是毛喉素。在一實(shí)施方案中，毛喉素濃度是在1-2000 μ M之間的范圍內(nèi)。通常濃度在10-200 μ M之間范圍內(nèi)。本發(fā)明的卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)基使得收集的卵母細(xì)胞成熟至受精前的物理階段，其模擬了在體內(nèi)生殖周期的排卵期期間由卵巢釋放的卵母細(xì)胞的成熟度。可能希望應(yīng)用此培養(yǎng)基的狀況的一個(gè)例子出現(xiàn)在因?yàn)槭茉囌卟荒褪艽思に囟枰隗w外以卵母細(xì)胞成熟激素處理自受試者收集的卵母細(xì)胞的時(shí)候。本發(fā)明涵蓋，在收集卵母細(xì)胞后、保持卵母細(xì)胞于成熟培養(yǎng)基中至少M(fèi)小時(shí)但不超過(guò)60小時(shí)的一段時(shí)期以促進(jìn)受精前發(fā)育。卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)基可能包括NaCl、KCl、Mg2SO4, KH2PO4, Ca (乳酸鹽)、NaHC03、氨基酸及衍生物、蛋白質(zhì)(如血清白蛋白)、葡萄糖、丙酮酸和抗生素的一個(gè)或多個(gè)，并且包括一種PDE抑制劑。成熟培養(yǎng)基還可能包括用于誘導(dǎo)卵母細(xì)胞核成熟的一種配體，其中培養(yǎng)基中的配體濃度克服了 cAMP誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯。然而，如上所述，應(yīng)理解卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)基不需要包含配體，該配體可能是分開(kāi)的組分或分開(kāi)的培養(yǎng)基部分。PDE抑制劑和配體可能如上文所述。在一實(shí)施方案中，成熟培養(yǎng)基中的PDE抑制劑是環(huán)己喹酰胺。通常，以自 0. 01-100 μ M的范圍內(nèi)的濃度使用環(huán)己喹酰胺而通常是在0. 01-50 μ M的范圍內(nèi)。例如，在牛的系統(tǒng)中，合適濃度在10-30 μ M之間，而在人的系統(tǒng)中在0. 1-1. 0 μ M之間。在又一特定實(shí)施方案中，誘導(dǎo)卵母細(xì)胞核成熟的配體是FSH和/或EGF而FSH和 EGF的濃度分別大于10mIU/ml和lng/ml，而分別小于500mIU和50ng/ml，并優(yōu)選分別大于 50mIU 和 5ng/ml 而分別小于 200mIU 和 20ng/ml。本發(fā)明的卵母細(xì)胞收集和成熟培養(yǎng)基的組分及其組合產(chǎn)物可以在合適的(優(yōu)選無(wú)菌的)容器(例如安瓿、瓶、或小瓶)內(nèi)以多用途或以單位形式分開(kāi)包裝?？梢栽谘b填后密封容器。組分可能是分離的形式、或者純化或半純化形式，并且可能包含用于穩(wěn)定性和/ 或組分的使用的另外的添加物。包裝多種組分的方法為本領(lǐng)域已知。本發(fā)明的收集和成熟培養(yǎng)基及其組合產(chǎn)物不僅適用于人類，而且適用于培養(yǎng)來(lái)自其他哺乳動(dòng)物的卵母細(xì)胞和胚胎。因此，本發(fā)明不僅可應(yīng)用在人類輔助生殖技術(shù)，而且可用在非人類哺乳動(dòng)物的輔助生殖技術(shù)，及生產(chǎn)非人類哺乳動(dòng)物胚胎的其他技術(shù)，如孤雌生殖激活、體細(xì)胞核移植的用途和全能干細(xì)胞的用途。在本發(fā)明的第六方面，提供一種誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟的方法，該方法包括在包括磷酸二酯酶(PDE)抑制劑和用于誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟的配體的成熟培養(yǎng)基中培養(yǎng)卵母細(xì)胞，其中成熟培養(yǎng)基中的配體濃度克服了 cAMP誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯，因而使卵母細(xì)胞成熟。根據(jù)本發(fā)明這個(gè)方面，PDE抑制劑和配體及其濃度可能如上文所述。在本發(fā)明這個(gè)方面的一實(shí)施方案中，磷酸二酯酶抑制劑是環(huán)己喹酰胺。在某些實(shí)施方案中，配體是FSH 或EGF。通常，F(xiàn)SH濃度大于10mIU/ml而EGF濃度大于lng/ml。在第七方面，本發(fā)明提供一種誘導(dǎo)處于減數(shù)分裂阻滯狀態(tài)的卵母細(xì)胞成熟的方法，該方法包括用足以克服減數(shù)分裂阻滯的濃度的配體接觸卵母細(xì)胞。本發(fā)明這個(gè)方面的一實(shí)施方案中，減數(shù)分裂阻滯是cAMP誘導(dǎo)的。根據(jù)本發(fā)明這個(gè)方面的配體及其濃度可能如上文所述。在某些實(shí)施方案中，該配體是FSH或EGF。通常，F(xiàn)SH 濃度大于10mIU/ml而EGF濃度大于lng/ml。在本發(fā)明第二、第六和第七方面的一實(shí)施方案中，方法是輔助生殖技術(shù)的一部分。 例如，輔助生殖技術(shù)包括體外受精。將參考下列體現(xiàn)了上述本發(fā)明一般原則的實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例。然而，應(yīng)理解下列說(shuō)明不限制上面說(shuō)明的一般性。因而，本發(fā)明涵蓋明顯作為在此提供的教導(dǎo)結(jié)果的任意及全部變動(dòng)。
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圖1顯示在預(yù)IVM期無(wú)(A)或有(B) IBMX (500 μ Μ)的情況下增加劑量的毛喉素對(duì)于預(yù)IVM期結(jié)束時(shí)總COCs (帶有完整卵丘外衣(cumulus vestments)的卵母細(xì)胞)WcAMP 含量的影響。圖2闡明在以增加濃度的毛喉素和IBMX孵育時(shí)預(yù)IVM期持續(xù)時(shí)間對(duì)于COCcAMP 的影響。圖3顯示預(yù)IVM期持續(xù)時(shí)間對(duì)于收集并孵育具有完整卵丘外衣(COCs)的并在分析前剝光的(DO)那些)卵母細(xì)胞內(nèi)cAMP含量的影響。圖4顯示在一定時(shí)間內(nèi)的各種預(yù)先體外成熟(預(yù)IVM)階段處理對(duì)于兩種不同類型卵母細(xì)胞cAMP含量的影響(A)收集并分析的帶有其完整卵丘外衣的(COCs)卵母細(xì)胞； 及(B)作為COCs收集但在分析前剝光其卵丘外衣的卵母細(xì)胞(DO)。圖5顯示在各種預(yù)先體外成熟(預(yù)IVM)和IVM階段培養(yǎng)基中孵育卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體之后對(duì)于自發(fā)卵母細(xì)胞成熟(GV/GVBD)的影響。圖6是系列圖表，顯示對(duì)于在各種預(yù)IVM和IVM階段培養(yǎng)基中培養(yǎng)的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體的生發(fā)泡(GV)構(gòu)象的影響。圖7顯示在各種預(yù)IVM和IVM階段培養(yǎng)基中孵育卵母細(xì)胞之后對(duì)于卵母細(xì)胞-卵丘細(xì)胞間隙連接通訊的影響。圖8是圖表，顯示卵泡刺激素(FSH)對(duì)于誘導(dǎo)暴露于各種預(yù)IVM和IVM階段培養(yǎng)基的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)的減數(shù)分裂成熟的影響。圖9顯示暴露于各種預(yù)IVM和IVM階段培養(yǎng)基的卵母細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度。圖10顯示表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)抑制劑對(duì)于在3型PDE抑制劑存在時(shí)卵泡刺激素(FSH)誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟的影響。圖11闡明在預(yù)IVM階段IBMX和增加劑量的毛喉素對(duì)于在20 μ M環(huán)己喹酰胺存在時(shí)在IVM階段卵母細(xì)胞成熟時(shí)的卵母細(xì)胞發(fā)育能力的影響。圖12顯示兩張圖，總結(jié)在各種預(yù)IVM和IVM階段培養(yǎng)基中存在的cAMP調(diào)節(jié)劑的存在對(duì)于卵母細(xì)胞發(fā)育能力(即切割并發(fā)育至胚泡階段)的影響。圖13顯示在各種預(yù)IVM和IVM階段培養(yǎng)基中存在的cAMP調(diào)節(jié)劑的存在對(duì)于胚泡細(xì)胞數(shù)目的影響。圖14顯示在以馬絨毛膜促性腺激素(eCG)誘導(dǎo)卵泡生長(zhǎng)后以及人絨毛膜促性腺激素(hCG)誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟之后小鼠卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)中體內(nèi)cAMP濃度的比較(A)與在卵母細(xì)胞體外成熟(IVM)前的預(yù)IVM階段體外培養(yǎng)的COCs中cAMP濃度比較O小時(shí)，包括COC收集和選擇)(B)。圖15顯示在3型PDE抑制劑(環(huán)己喹酰胺；1 μ M(A)或0. 1 μ M(B))存在時(shí)、增加劑量的FSH誘導(dǎo)卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)的減數(shù)分裂成熟的效應(yīng)。圖16顯示在預(yù)IVM和IVM期間cAMP調(diào)節(jié)劑對(duì)于其所需完成卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟的時(shí)間的影響。圖17顯示在培養(yǎng)18和22小時(shí)后在誘導(dǎo)IVM或自發(fā)IVM中成熟的小鼠COCs的減數(shù)分裂成熟。圖18顯示兩張圖，闡明(在自發(fā)或誘導(dǎo)IVM中進(jìn)行18或22小時(shí)IVM的)體外成熟小鼠卵母細(xì)胞對(duì)于以(第2天)切割率(A)和(第5天)胚泡率(B)測(cè)定的卵母細(xì)胞發(fā)育能力的影響。圖19包括圖，顯示自發(fā)IVM與誘導(dǎo)IVM相比對(duì)于小鼠胚泡質(zhì)量的影響。圖20顯示在預(yù)IVM和IVM期間使用不同cAMP調(diào)節(jié)劑對(duì)于小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育能力的影響。圖21顯示體內(nèi)以誘導(dǎo)IVM或以自發(fā)IVM成熟的小鼠卵母細(xì)胞的發(fā)育能力。圖22提供的圖顯示在以源自以誘導(dǎo)IVM或以自發(fā)IVM體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞的胚胎移植的小鼠中，誘導(dǎo)IVM對(duì)于妊娠結(jié)果(A-C)和胎兒發(fā)育(D-E)的影響。圖23是說(shuō)明，總結(jié)誘導(dǎo)IVM與傳統(tǒng)IVF(體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞)和標(biāo)準(zhǔn)自發(fā)IVM相比的關(guān)鍵概念以及這三種方法在生成胎兒中的相對(duì)效率。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1在卵母細(xì)胞的收集和成熟培養(yǎng)基中的cAMP調(diào)節(jié)劑對(duì)于牛卵母細(xì)胞成熟動(dòng)力學(xué)的影響卵母細(xì)胞質(zhì)量對(duì)于胚胎發(fā)育起重要作用。例如，發(fā)明者已顯示體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞導(dǎo)致比體外成熟的卵母細(xì)胞更高的胚泡百分?jǐn)?shù)。不幸的是，目前體外成熟技術(shù)還不完善。在體內(nèi)，卵母細(xì)胞發(fā)育能力是在卵泡的生長(zhǎng)和發(fā)育期間逐漸獲得的。然而，發(fā)明者已顯示了自卵泡收回的卵母細(xì)胞能夠自發(fā)克服減數(shù)分裂阻滯，因而在細(xì)胞質(zhì)完成成熟前進(jìn)展到中期II。盡管在從卵泡分離后未成熟卵母細(xì)胞能恢復(fù)減數(shù)分裂，細(xì)胞質(zhì)成熟滯后于核成熟。發(fā)明者推測(cè)，允許未成熟卵母細(xì)胞有更多的時(shí)間以完成細(xì)胞質(zhì)成熟將改善體外卵母細(xì)胞發(fā)育能力。一個(gè)可能的改善卵母細(xì)胞發(fā)育能力的策略是體外保持其減數(shù)分裂阻滯一段延長(zhǎng)時(shí)期、而不是使其恢復(fù)減數(shù)分裂。不希望為理論所約束，發(fā)明者假定此延遲給予卵母細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)修改(如mRNA和蛋白質(zhì)的儲(chǔ)存、形態(tài)的變化、超結(jié)構(gòu)重構(gòu))的時(shí)間，并且可能增強(qiáng)將被用于下游輔助生殖應(yīng)用的未成熟卵母細(xì)胞起始群落的同步化。在這方面，發(fā)明者測(cè)試了在收集和處理(成熟)培養(yǎng)基中包括cAMP調(diào)節(jié)劑對(duì)于卵母細(xì)胞成熟動(dòng)力學(xué)(如牛卵母細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)cAMP水平、卵母-卵丘細(xì)胞間隙連接通訊、核成熟及胚胎發(fā)育)的影響。材料和方法除非另作說(shuō)明，所以化學(xué)品和試劑購(gòu)自Sigma(圣路易斯市，密蘇里州，美國(guó))。卵母細(xì)胞收集和選擇-預(yù)體外成熟(預(yù)IVM)階段自本地屠宰場(chǎng)收集牛卵巢并在溫鹽水(30_35°C )中轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。匯集并隨機(jī)使用在一天內(nèi)收集的所有卵巢。選擇(直徑在2至8mm的)卵泡腔用于通過(guò)18號(hào)針頭和 IOml注射器吸取。吸取帶有其完整卵丘外衣的卵母細(xì)胞(COCs)。在分析前剝?nèi)ヒ粋€(gè)亞群的COCs的卵丘外衣(DO)。進(jìn)行2個(gè)小時(shí)的吸取和隨后選擇步驟(預(yù)IVM期)，在此，在不同培養(yǎng)基(稱為“預(yù)IVM期培養(yǎng)基”或“預(yù)IVM培養(yǎng)基”)中處理卵母細(xì)胞(COCs和DOs)。這些包括在卵泡液中或在兩類收集培養(yǎng)基中處理卵母細(xì)胞。用于卵母細(xì)胞吸取和選擇的收集培養(yǎng)基包括 (1)添加有50 μ g/ml慶大霉素和0. 2mg/ml無(wú)脂肪酸牛血清白蛋白(FAF-BSA ；ICPbio Ltd, 奧克蘭，新西蘭)的牛卵母細(xì)胞收集培養(yǎng)基(稱為“牛VitroMat”( "Bovine VitroMat”)， Cook Australia,Eight Mile Plains，昆士蘭，澳大利亞)；或( 添加有兩種cAMP調(diào)節(jié)劑 (即腺苷酸環(huán)化酶激活劑，毛喉素(100 μ M)和非特異性PDE抑制劑，3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX) (500 μ M))的同一培養(yǎng)基。c AMP調(diào)節(jié)劑的毫摩爾儲(chǔ)存濃縮物被貯存在-2 0°C，溶解于無(wú)水二甲基亞砜 (DMSO)。對(duì)于每次實(shí)驗(yàn)，新鮮稀釋包含調(diào)節(jié)劑的溶液。在預(yù)IVM期結(jié)束時(shí)，在解剖顯微鏡下選擇具有大于5個(gè)細(xì)胞層的緊湊卵丘外衣及均勻著色胞漿的完整卵母細(xì)胞。在體外成熟(IVM)之前，在各自的預(yù)IVM期培養(yǎng)基中洗滌 COCs兩次，然后在IVM培養(yǎng)基(見(jiàn)下面)中洗滌兩次。卵母細(xì)胞體外成熟(IVM)階段用于IVM階段的基本卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)基(也稱為“ IVM培養(yǎng)基”或“ IVM階段培養(yǎng)基”)是牛的成熟培養(yǎng)基(名為Bovine VitroMat, Cook Australia)，一種配方成接近于復(fù)制牛卵泡液中的離子組合物的培養(yǎng)基。凡有指明，從儲(chǔ)存于-20°C、溶解于DMSO的毫摩爾儲(chǔ)存液中，將3型PDE特異性抑制劑環(huán)己喹酰胺(20 μ M ；Biomol Plymouth Meeting,賓夕法尼亞州)或表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)激酶抑制劑AG1478 (Alexis Biochemicals，圣地亞哥，加利福尼亞州)加入到IVM培養(yǎng)基中。所有IVM處理輔以0. lIU/ml的卵泡刺激素 (FSH) (Puregon, Organon,奧斯，荷蘭)。在覆蓋礦物油的預(yù)平衡的300 μ 1液滴中培養(yǎng)COCs 并在39°C和5% CO2的加濕空氣中孵育。體外受精和胚胎培養(yǎng)在IVM 之后 24 或 30 小時(shí)，用 Bovine Vitroffash (Cook Australia)洗滌 COCs 兩次并轉(zhuǎn)移至包含添加青霉胺(0. 2mM ；Sigma)、亞?；撬?0. ImM ；Sigma)和肝素Qmg/ml ； Sigma)的體外受精(IVF)培養(yǎng)基(Bovine VitroFert, Cook Australia)的授精平板中。 來(lái)自證明有生育力的單個(gè)公牛的冷凍精液被用于人工授精。簡(jiǎn)單講，將解凍精液在不連續(xù) Percoll 梯度(45% 90% ) (Amersham Bioscience)上鋪層并以 700g 離心 20-25 分鐘。 移去上清并以500 μ 1 Bovine Vitroffash洗滌精子沉淀并以200g再離心5分鐘。精子以 IVF培養(yǎng)基(Bovine VitroFert)重懸，然后以終濃度IxlO6個(gè)精子/ml加入至受精培養(yǎng)基液滴(Bovine VitroFert，添加有0. OlmM肝素、0. 2mM青霉胺和0. ImM亞?；撬?中。在 39°C>6% CO2的潮濕空氣中，以10 μ 1 IVF培養(yǎng)基每COC的密度授精給COCs M小時(shí)。在授精后23-Μ小時(shí)以輕柔吹吸移去COCs，并且將五個(gè)推測(cè)的受精卵轉(zhuǎn)移至20 μ 1預(yù)平衡Cook Bovine VitroCleave 培養(yǎng)基(Cook Australia)液滴中并在 38. 5°C、在 7% O2,6% CO2、平衡 N2中、在礦物油之下培養(yǎng)五天(第一至第五天)。在第五天，轉(zhuǎn)移5-6組中的胚胎至20 μ 1預(yù)平衡Bovine VitroBlast (Cook Australia)液滴中，在38. 5°C、以礦物油覆蓋并培養(yǎng)至第八天° 在第 8 天，根據(jù) Stingfellow 禾P Seidel, 1998,Manual of the International Embryo Transfer Society. In. (IETS :薩伏伊，伊利諾斯州，美國(guó))中所示的定義評(píng)估胚胎的質(zhì)量， 而且評(píng)估是由經(jīng)驗(yàn)豐富的牛胚胎學(xué)家獨(dú)立進(jìn)行并盲評(píng)。胚泡差異染色在37°C將胚泡置于0. 5%鏈霉蛋白酶以去除卵，然后在％ig/ml磷酸鹽緩沖液中的聚乙烯醇(PVA) (PBS/PVA)中簡(jiǎn)單洗滌。然后在4°C、在IOmM PBS/PVA中的三硝基苯磺酸中孵育無(wú)卵胚泡10分鐘。隨后以0. lmg/ml抗二硝基酚-牛血清蛋白抗體(Molecular Probes，尤金，俄勒網(wǎng)州，美國(guó))在37°C孵育胚泡10分鐘，并隨后在37°C、置于含碘化丙啶的豚鼠血清中5分鐘。洗滌并在37°C下、在10μ g/ml碘化丙啶中孵育胚泡20分鐘(以染色滋養(yǎng)外胚層)，然后在4°C、以100%乙醇中的雙苯酰亞胺(Hoechst 33342 ； Sigma-Aldrich)孵育過(guò)夜(以染色內(nèi)細(xì)胞群(ICM)和滋養(yǎng)外胚層)。然后將胚泡整體固定在顯微鏡玻片上PBS中的80%甘油液滴內(nèi)，并且用指甲油密封蓋玻片。然后在配置有紫外濾光片和附帶數(shù)碼相機(jī)的400χ熒光顯微鏡(Olympus，東京，日本)下檢查胚泡，以確定總體和間隔細(xì)胞數(shù)，其中內(nèi)細(xì)胞群(ICM)核顯示藍(lán)色而滋養(yǎng)外胚層(TE)核染為粉色。測(cè)定細(xì)胞內(nèi)cAMP用之前描述和驗(yàn)證的放射性免疫分析法(Reddoch等，1986，Endocrinology 119 879-886)測(cè)定COCs和剝光卵母細(xì)胞(DOs)(即那些作為COCs培養(yǎng)但其卵丘外衣在分析前被剝?nèi)サ穆涯讣?xì)胞)的環(huán)AMP量。結(jié)束時(shí)間點(diǎn)后，在VitroCollect (Cook Australia)中洗滌6-10個(gè)COCs和21-24個(gè)DOs，轉(zhuǎn)移至0.5ml乙醇(100% )并在_20°C儲(chǔ)存。在cAMP測(cè)定前，渦旋樣品30秒并隨后在4°C、以3000g離心15分鐘。簡(jiǎn)單講，上清收集、蒸發(fā)、重懸于分析緩沖液(50mM乙酸鈉，pH 5.5)并通過(guò)加入2 1 ν/ν的三乙胺(AJAX Chemicals，悉尼，澳大利亞)和無(wú)水醋酸(BDH Laboratory Supplies，普爾，英國(guó))乙酰化。在適當(dāng)稀釋后一式兩份測(cè)定cAMP。向樣品中加入125I-標(biāo)記的cAMP (特異活性為2175Ci/mM)和cAMP 抗體(如上述Reddoch等所制備的)并在4°C放過(guò)夜。第二天，加入Iml冷100%乙醇并以 3000g離心樣品。移去上清并干燥沉淀，并以、計(jì)數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù)。雙份已知濃度樣本被用于產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線0-1024 fmol cAMP)。卵母細(xì)胞核形態(tài)評(píng)估在孵育結(jié)束時(shí)，剝光COCs并在4%多聚甲醛的PBS(pH 7.4)中固定卵母細(xì)胞 30分鐘。然后在0. 檸檬酸鈉的0. Triton X-100中滲透卵母細(xì)胞1小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移至0.001%4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(核物質(zhì)的熒光染料)中15分鐘。在 PBS+0. 03% BSA中漂洗卵母細(xì)胞，固定于玻片上并用400x Olympus熒光顯微鏡評(píng)價(jià)核狀態(tài)?；谝阎夹g(shù)(Chohan 和 Hunter，2003，Anim. R印rod. Sci. 76 :43-51)對(duì)生發(fā)泡(GV) 和隨后的減數(shù)分裂發(fā)育階段進(jìn)行了評(píng)估。簡(jiǎn)單講，牛卵母細(xì)胞的GV染色質(zhì)分為GV I-核仁和核膜周圍的濃縮絲狀染色質(zhì)；GV II-圍繞核仁的絲狀染色質(zhì)；GV III-絲狀染色質(zhì)團(tuán)塊分布在細(xì)胞核內(nèi)和核仁消失；GV IV-染色質(zhì)凝聚成厚塊；早期終變期-染色質(zhì)開(kāi)始凝聚成一個(gè)團(tuán)塊；終變期-染色質(zhì)已凝聚成一個(gè)團(tuán)塊；中期I-四分體在紡錘體上對(duì)齊；及中期 II-中期染色質(zhì)以及一個(gè)小的含染色質(zhì)極體明顯可見(jiàn)。卵母-卵丘細(xì)胞間隙連接通訊分析如之前所述(Thomas等，2004，In “Biol. R印rod. ”，1142-1149 頁(yè))，以鈣黃綠素轉(zhuǎn)移至卵母細(xì)胞的定量熒光顯微鏡來(lái)測(cè)定卵丘-卵母細(xì)胞間隙連接通訊(GJC)。在2小時(shí)預(yù)IVM期后或在預(yù)IVM期后面是另外3小時(shí)IVM(有或無(wú)20 μ M環(huán)己喹酰胺)之后測(cè)定 GJC0在四個(gè)重復(fù)試驗(yàn)每個(gè)的每個(gè)處理組中使用平均數(shù)10-12個(gè)的卵母細(xì)胞。培養(yǎng)之后， 轉(zhuǎn)移 COCs 至在添加有聚乙烯醇(PVA ;0. ;3mg/ml)的無(wú) BSA Bovine VitroCollect (Cook Australia)中新鮮制備的1 μ M鈣黃綠素-AM(3' ,6' -二(0-乙酰基)_2' ,7' -二 [N，
16N- 二(羧甲基)氨基甲基]-熒光素，四乙酰氧基甲基酯；C-3100 ；分子探針；尤金，俄勒岡州，美國(guó))溶液。COCs與染料一起培養(yǎng)15分鐘，并隨后以在無(wú)鈣黃綠素-AM的Bovine VitroCollect (Cook Australia)中三次洗滌去除未進(jìn)入染料，并且孵育另外25分鐘以使得從卵丘細(xì)胞轉(zhuǎn)移至卵母細(xì)胞。在熒光顯微光度計(jì)之前，用劇烈吸打完全剝?nèi)ヂ涯讣?xì)胞的卵丘細(xì)胞，以便于只有經(jīng)由間隙連接轉(zhuǎn)運(yùn)后限制在剝光卵母細(xì)胞內(nèi)的染料能被測(cè)定。在30 分鐘剝光時(shí)，用熒光光度計(jì)-倒置顯微鏡(Leica，韋茨拉爾，德國(guó))測(cè)定卵母細(xì)胞中的卵母細(xì)胞內(nèi)鈣黃綠素?zé)晒獍l(fā)射。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用 Windows 的 Prism 5. 00 GraphPad (GraphPad Software，圣地亞哥，加利福尼亞州，美國(guó))進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以ANOVA后接Dunnett' s或Bonferroni，s多重比較 post-hoc檢驗(yàn)評(píng)估統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以鑒定平均值間的個(gè)體差異。所有數(shù)值以其對(duì)應(yīng)的平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)來(lái)顯示。結(jié)果預(yù)IVM期間的牛COCs和Dos的cAMP含量圖1至4顯示了經(jīng)一段時(shí)間的不同預(yù)體外成熟(預(yù)IVM)階段處理對(duì)于COCs和卵母細(xì)胞cAMP含量的影響。如圖IA中所示，在2小時(shí)預(yù)IVM之后，毛喉素以劑量依賴性方式顯著提高了 COCs內(nèi)cAMP水平(P<0.05)。與卵泡液對(duì)照相比，只有最高濃度毛喉素 (100 μ M)給出了類似值。然而，無(wú)論0.4μΜ或是2μΜ毛喉素均不顯示任何的cAMP水平提高，其與對(duì)照處理(不含cAMP調(diào)節(jié)劑的收集培養(yǎng)基)無(wú)顯著差異。與IBMX結(jié)合時(shí)，增加濃度的毛喉素以劑量依賴性方式誘導(dǎo)cAMP(在無(wú)IBMX而只有毛喉素的情況下所觀察到水平之上的)20倍增長(zhǎng)(圖1B)。因而，只有毛喉素或IBMX維持但不提高實(shí)質(zhì)上高于對(duì)照的 cAMP水平。圖2中實(shí)驗(yàn)的目的在于檢查當(dāng)以IBMX和增加劑量的毛喉素(10-100 μ M)孵育 COCs時(shí)預(yù)IVM持續(xù)時(shí)間對(duì)于COC cAMP水平的影響。如圖2中所示，在除對(duì)照組(無(wú)cAMP調(diào)節(jié)劑的收集培養(yǎng)基)的所有處理組中，在預(yù)IVM期間維持了 COC cAMP水平。當(dāng)在單獨(dú)收集培養(yǎng)基中孵育COCs時(shí)，30分鐘之后cAMP水平自14到4fmol/C0C顯著下降(P < 0. 05)，并且繼續(xù)隨時(shí)間顯著下降(0. 4fmol/C0C)長(zhǎng)達(dá)孵育2小時(shí)。以IBMX或毛喉素單獨(dú)處理COCs 維持了 cAMP水平2小時(shí)。然而，當(dāng)IBMX和增加劑量的毛喉素存在的情況下孵育COCs時(shí)，顯示cAMP水平高達(dá)20倍的戲劇性誘導(dǎo)，并且此cAMP水平增高明顯與孵育時(shí)間無(wú)關(guān)。當(dāng)IBMX 和50或100 μ M毛喉素存在的情況下孵育COCs時(shí)顯示了最高cAMP水平(大約165fmol/ C0C)。除對(duì)照組(無(wú)cAMP調(diào)節(jié)劑)以夕卜，COC中增加cAMP并無(wú)時(shí)間效應(yīng)。圖3中實(shí)驗(yàn)的目的在于檢查卵母細(xì)胞(在預(yù)IVM后剝光的COCs)中的cAMP水平及在延長(zhǎng)預(yù)IVM階段的孵化時(shí)間、在cAMP調(diào)節(jié)劑存在時(shí)這些水平如何變化。如圖3所示， 在孵育30分鐘后，與對(duì)照(0. 5fmol/卵母細(xì)胞，P < 0. 05)相比，當(dāng)COCs在IBMX和10,50 或100 μ M毛喉素存在的情況下孵育時(shí)，cAMP水平明顯更高(12fmol/卵母細(xì)胞)。2小時(shí)后，與對(duì)照相比(0. Ifmol/卵母細(xì)胞，P < 0. 05)，cAMP水平進(jìn)一步顯著增高達(dá)到34fmol/ 卵母細(xì)胞。看起來(lái)，增加預(yù)IVM階段的孵育時(shí)間，逐漸導(dǎo)致了在IBMX和高濃度毛喉素存在下卵母細(xì)胞內(nèi)cAMP的大幅增加。圖4顯示了一段時(shí)間的不同預(yù)體外成熟(預(yù)IVM)階段處理對(duì)于完整COCs和卵母細(xì)胞內(nèi)cAMP含量的影響(A)收集并分析的具有其完整卵丘外衣的卵母細(xì)胞(COC)；和(B) 作為COCs收集但分析前剝?nèi)テ渎亚鹜庖碌穆涯讣?xì)胞(DO)。在純卵泡液、收集培養(yǎng)基或添加有cAMP調(diào)節(jié)劑(毛喉素和IBMX)的收集培養(yǎng)基中收集并選擇兩種類型卵母細(xì)胞。數(shù)值表示為每個(gè)卵母細(xì)胞或復(fù)合體的平均cAMP濃度士三個(gè)重復(fù)的SEM，每個(gè)處理重復(fù)使用6-10 個(gè)COCs或21- 個(gè)DOs。在帶不同字母(A、a、B、b或c)的同一圖/卵母細(xì)胞類型內(nèi)的平均值顯示不同處理或結(jié)束時(shí)間點(diǎn)之間的顯著不同cAMP量(雙向AN0VA，P < 0. 05)。如圖4A中所見(jiàn)，在5分鐘預(yù)IVM期之后，在cAMP調(diào)節(jié)劑存在時(shí)收集的COCs中的 cAMP水平是對(duì)照組(即無(wú)cAMP調(diào)節(jié)劑或純卵泡液)的9倍高(P < 0. 0001)。在預(yù)IVM期間(30分鐘)和結(jié)束時(shí)O小時(shí))調(diào)整cAMP水平的增加。卵泡液維持了 COCs中的cAMP水平30分鐘；然而，在預(yù)IVM期結(jié)束時(shí)水平下降(20士3至10士3fmol/C0C) (P < 0. 05)。對(duì)于那些無(wú)cAMP調(diào)節(jié)劑時(shí)收集的COCs，在自卵泡中分離卵母細(xì)胞之后不久(30分鐘時(shí)長(zhǎng))， cAMP 水平急劇下降(從 15士4 至 2士 lfmol/COC) (P < 0. 05)。剝光卵母細(xì)胞(DOs)被用于評(píng)價(jià)環(huán)繞卵丘細(xì)胞對(duì)于卵母細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的影響 (圖4B)。在自卵泡分離后5分鐘，所有處理中的卵母細(xì)胞內(nèi)cAMP水平大約是0.9士0. 1。 在預(yù)IVM期培養(yǎng)基中進(jìn)行30分鐘后，以cAMP調(diào)節(jié)劑處理的卵母細(xì)胞中的cAMP水平明顯高于對(duì)照組，而且隨孵育時(shí)間增加(16士0.1)直至預(yù)IVM期結(jié)束O小時(shí))。在整個(gè)預(yù)IVM期間卵泡液維持了卵母細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，而對(duì)于無(wú)cAMP調(diào)節(jié)劑時(shí)收集的卵母細(xì)胞，在30分鐘內(nèi)細(xì)胞內(nèi)cAMP水平顯著下降并且繼續(xù)下降直至預(yù)IVM期結(jié)束(0. 3 士0. 2) (P < 0. 05)。在預(yù)IVM階段的cAMP調(diào)節(jié)劑和3型PDE抑制對(duì)于自發(fā)卵母細(xì)胞成熟(GV/GVBD) 的影響圖5顯示了在不同預(yù)體外成熟(預(yù)IVM)和IVM期培養(yǎng)基中孵育卵丘-卵母復(fù)合體后對(duì)于自發(fā)卵母細(xì)胞成熟(GV/GVBD)的影響。如上文所述，在預(yù)IVM期培養(yǎng)基中孵育牛C0Cs2小時(shí)，然后在有FSH和有或無(wú)環(huán)己喹酰胺(20 μ M)的情況下培養(yǎng)7小時(shí)。然后固定卵母細(xì)胞并評(píng)估減數(shù)分裂進(jìn)展并分類為 GV(生發(fā)泡完整-仍在減數(shù)分裂阻滯中)或GVBD (生發(fā)泡破裂-減數(shù)分裂恢復(fù))。在四個(gè)重復(fù)試驗(yàn)的每一處理組和時(shí)間點(diǎn)中使用平均數(shù)45個(gè)卵母細(xì)胞。每列上存在的字母(a或b) 表明以ANOVA分析后接Bonferrormi，s post hoc檢驗(yàn)所確定的平均值之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異， P < 0. 05。如圖5中所見(jiàn)，與對(duì)照(IVM中環(huán)己喹酰胺(_))相比，在IVM期間培養(yǎng)基中包括 FSH和環(huán)己喹酰胺在所有預(yù)IVM處理中顯著降低了 GVBD率。然而，在培養(yǎng)基中無(wú)環(huán)己喹酰胺時(shí)，除了在預(yù)IVM期間在包括cAMP調(diào)節(jié)劑的收集培養(yǎng)基中加工的那些卵母細(xì)胞以外(其具有明顯的GVBD延遲(P <0.05))，多數(shù)卵母細(xì)胞開(kāi)始GVBD。這些結(jié)果導(dǎo)致發(fā)明者調(diào)查在預(yù)IVM期結(jié)束和IVM期間的GV構(gòu)象變化(見(jiàn)下面)。在預(yù)IVM階段的cAMP調(diào)節(jié)劑和3型PDE抑制對(duì)于卵母細(xì)胞生發(fā)泡構(gòu)象的影響圖6顯示了對(duì)于在不同預(yù)IVM和IVM期培養(yǎng)基中培養(yǎng)的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體生發(fā)泡(GV)構(gòu)象的影響。暴露卵母細(xì)胞于包括純卵泡液、收集培養(yǎng)基或添加有cAMP調(diào)節(jié)劑 (毛喉素與IBMX)的收集培養(yǎng)基㈧的預(yù)IVM期培養(yǎng)基，然后在有(C，E)或無(wú)(B，D) 3型 PDE抑制劑環(huán)己喹酰胺(20 μ M)、加卵泡刺激素的情況下延長(zhǎng)培養(yǎng)。然后固定卵母細(xì)胞并評(píng)估在第2、5和9小時(shí)的GV構(gòu)象。在四個(gè)重復(fù)試驗(yàn)的每個(gè)處理組和時(shí)間點(diǎn)使用平均數(shù)40個(gè)卵母細(xì)胞。如圖6A中所見(jiàn)，在預(yù)IVM期結(jié)束時(shí)O小時(shí))，在卵泡液中培養(yǎng)的(61% 士5)或在添加有cAMP調(diào)節(jié)劑的收集培養(yǎng)基中培養(yǎng)的(67% 士5) (P < 0. 05)多數(shù)卵母細(xì)胞在GV II 階段。然而，在單獨(dú)收集培養(yǎng)基中加工的卵母細(xì)胞具有降低的GV II百分?jǐn)?shù)(P <0.05)并且已經(jīng)進(jìn)展至 GVIII (66% 士5) (P < 0. 001)。5小時(shí)O小時(shí)預(yù)IVM和3小時(shí)IVM+環(huán)己喹酰胺)后，收集的卵母細(xì)胞已經(jīng)在IVM 孵育之前被阻滯在其指定的GV階段(圖6C)。與圖6B相比，這表明了在IVM的最先幾小時(shí)內(nèi)培養(yǎng)基中有FSH和環(huán)己喹酰胺的孵育與培養(yǎng)在只有FSH(IVM-環(huán)己喹酰胺)的COCs相比， 防止了 COCs進(jìn)展至其GV構(gòu)象。如圖6B中所見(jiàn)，在純卵泡液中加工的卵母細(xì)胞進(jìn)展至GV 111(58% 士8)，而多數(shù)在無(wú)cAMP調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)基中加工的卵母細(xì)胞是在GV 111(41% 士 10) 或在GV IV (52% 士 12) (P < 0. 05)。令人吃驚的是，即使在IVM期間培養(yǎng)基中無(wú)環(huán)己喹酰胺，在以cAMP調(diào)節(jié)劑加工時(shí)COCs仍能被阻滯在GVII (55% 士3)(圖6B，右列)。如圖6E、右列中所見(jiàn)，在卵母細(xì)胞培養(yǎng)9小時(shí)后O小時(shí)預(yù)IVM和7小時(shí)IVM+ 環(huán)己喹酰胺)，在包括cAMP調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)基中加工的COCs進(jìn)展至成熟，多數(shù)COCs在GV 11(44 士 3% )或在GV 111(42 士 3%)。這與在純卵泡液中所選擇的卵母細(xì)胞相比，其多數(shù)卵母細(xì)胞是在GV III (63士6)，而與在缺少cAMP調(diào)節(jié)劑的收集培養(yǎng)基中加工的卵母細(xì)胞相比，其卵母細(xì)胞已進(jìn)展至GVIV (51% 士 10) (P < 0.05)(圖6E，分別為左欄和中間欄)。9小時(shí)后并在單獨(dú)FSH存在時(shí)(IVM-環(huán)己喹酰胺)，以cAMP調(diào)節(jié)劑處理的多數(shù)卵母細(xì)胞已進(jìn)展至GV III階段(58% 士4)(圖6D，右欄)，而在純卵泡液中加工的多數(shù)卵母細(xì)胞進(jìn)行至終變期(40% 士4)和M I (38% 士4)(圖6D，左欄)。相反地，以缺少cAMP調(diào)節(jié)劑的收集培養(yǎng)基加工的那些卵母細(xì)胞，23% 士6是在終變期階段而57% 士5已進(jìn)展至M I階段(P < 0. 05) (圖6D，中欄)。在預(yù)IVM和IVM期間的cAMP調(diào)節(jié)劑對(duì)于卵母-卵丘細(xì)胞間隙連接通訊的效應(yīng)在預(yù)IVM階段結(jié)束時(shí)和5小時(shí)卵母細(xì)胞培養(yǎng)O小時(shí)預(yù)IVM和3小時(shí)IVM士環(huán)己喹酰胺)結(jié)束時(shí)進(jìn)行卵母-卵丘間隙連接通訊(GJC)分析。如圖7的1至3列所見(jiàn)，在預(yù) IVM階段O小時(shí))結(jié)束時(shí)，卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞之間的間隙連接通訊水平從約1000(在添加有cAMP調(diào)節(jié)劑的收集培養(yǎng)基中吹吸和加工卵母細(xì)胞時(shí))的熒光強(qiáng)度顯著降低至約 400和600(分別在卵泡液或不加cAMP調(diào)節(jié)劑的收集培養(yǎng)基中吹吸和加工卵母細(xì)胞時(shí))(P < 0. 05)。而且，當(dāng)COCs是在純卵泡液或不含cAMP調(diào)節(jié)劑的收集培養(yǎng)基中收集時(shí)，在3小時(shí)IVM培養(yǎng)(預(yù)IVM期之后)后間隙連接通訊水平大大降低。例外是預(yù)IVM期間在添加有 cAMP調(diào)節(jié)劑的收集培養(yǎng)基中加工的COCs，無(wú)論在IVM期間有或沒(méi)有環(huán)己喹酰胺(P < 0. 05) (圖7，4-9列)。在培養(yǎng)基中包括FSH(及有或沒(méi)有環(huán)己喹酰胺)對(duì)維持卵母細(xì)胞和其周圍卵丘細(xì)胞之間的間隙連接通訊水平?jīng)]有影響。在圖7每一列之上存在的字母(a、b、g、h或χ)表明以ANOVA分析后接 Bonferronni' s post hoc檢驗(yàn)所確定的平均值之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。預(yù)IVM期中的cAMP調(diào)節(jié)劑和3型PDE抑制對(duì)于卵母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)展至MII階段的影響圖8顯示卵泡刺激素(FSH)對(duì)于誘導(dǎo)暴露于不同預(yù)IVM和IVM期培養(yǎng)基的卵
19丘-卵母復(fù)合體(COCs)減數(shù)分裂成熟的影響。如上所示，在卵泡液、收集培養(yǎng)基或添加有 100 μ M毛喉素(FSK)和500 μ M IBMX的收集培養(yǎng)基中吹吸和選擇卵母細(xì)胞2小時(shí)。然后在無(wú)FSH㈧或有FSH(B)的2種培養(yǎng)基(+/_環(huán)己喹酰胺)中培養(yǎng)COCs。然后在20、對(duì)和觀小時(shí)固定卵母細(xì)胞并評(píng)估減數(shù)分裂進(jìn)展。四個(gè)重復(fù)試驗(yàn)的每個(gè)處理組和時(shí)間點(diǎn)中使用平均數(shù)45個(gè)卵母細(xì)胞。如圖8A中所見(jiàn)，無(wú)FSH時(shí)，環(huán)己喹酰胺處理延遲了在M小時(shí)IVM時(shí)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)展至M II階段，無(wú)論在預(yù)IVM培養(yǎng)基中有或沒(méi)有cAMP調(diào)節(jié)劑。然而，在預(yù)IVM階段當(dāng)卵母細(xì)胞是在添加有cAMP調(diào)節(jié)劑的收集培養(yǎng)基中加工時(shí)，在IVM 20小時(shí)時(shí)，83% 士7卵母細(xì)胞是在M I階段，與之相比，當(dāng)卵母細(xì)胞是在缺少cAMP調(diào)節(jié)劑的收集培養(yǎng)基中加工時(shí)， 36% 士 4卵母細(xì)胞是在M I階段(圖8A，分別為第9和第3列)。如圖8B中所見(jiàn)，有FSH時(shí)，環(huán)己喹酰胺在延遲卵母細(xì)胞進(jìn)展到M II階段的抑制效應(yīng)為IVM培養(yǎng)基中存在的FSH所壓制。例如，在有環(huán)己喹酰胺而無(wú)FSH時(shí)檢測(cè)到GV階段卵母細(xì)胞(圖8A)，而在IVM培養(yǎng)基中有FSH的時(shí)候檢測(cè)不到此類卵母細(xì)胞。有趣的是，在20 小時(shí)的IVM+環(huán)己喹酰胺處理后，當(dāng)在預(yù)IVM期間卵母細(xì)胞在添加有cAMP調(diào)節(jié)劑的收集培養(yǎng)基中加工時(shí)、72% 士 5的卵母細(xì)胞處于M I階段(圖8B，第9列)，與之相比，當(dāng)卵母細(xì)胞在單獨(dú)收集培養(yǎng)基中加工時(shí)、21% 士4的卵母細(xì)胞處于MI階段(圖8B，第3列)。在預(yù)IVM和IVM階段后卵母細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度圖9顯示了暴露于不同預(yù)IVM和IVM期培養(yǎng)基的卵母細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度。首先在分析前剝?nèi)チ寺涯讣?xì)胞的卵丘外衣(DOs)，而隨后收集并在三種不同預(yù)IVM期培養(yǎng)基 (卵泡液、單獨(dú)收集培養(yǎng)基和添加有100 μ M毛喉素(FSK)和500 μ M IBMX的收集培養(yǎng)基) 中操作，然后在有或沒(méi)有3型PDE抑制劑環(huán)己喹酰胺QO μ Μ)的情況下延長(zhǎng)培養(yǎng)M小時(shí)。 數(shù)據(jù)代表了每DO的平均cAMP水平士四次重復(fù)的SEM。在M個(gè)DO上進(jìn)行每個(gè)測(cè)定。每一列上面存在的字母(a、b、c或d)表明以ANOVA分析后接Durmett’ s post hoc檢驗(yàn)所確定的平均值間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。如圖9所見(jiàn)，在培養(yǎng)M小時(shí)后，當(dāng)預(yù)IVM期間在添加有cAMP調(diào)節(jié)劑的收集培養(yǎng)基中收集并加工卵母細(xì)胞時(shí)，(與純卵泡液或缺少cAMP調(diào)節(jié)劑的收集培養(yǎng)基中所培養(yǎng)的那些相反)，如果環(huán)己喹酰胺也存在于培養(yǎng)基中，DOs中的cAMP細(xì)胞內(nèi)濃度顯著保持更高(達(dá)到 15 倍)(P < 0. 05)。在3型PDE抑制劑(環(huán)己喹酰胺)存在時(shí)表皮生長(zhǎng)因子受體激酶抑制劑對(duì)于FSH 誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟的影響如圖10所示，環(huán)己喹酰胺對(duì)于卵母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)展的抑制效應(yīng)為培養(yǎng)基中添加FSH所壓制。因此有興趣檢查是否表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的抗血清會(huì)抑制FSH誘導(dǎo)的成熟(減數(shù)分裂誘導(dǎo))，例如通過(guò)檢查EGFR激酶抑制劑AG1478是否能影響此成熟模式。在這方面，圖10顯示，有FSH(IOOmIU)、PDE抑制劑環(huán)己喹酰胺(20 μ Μ)和增加劑量的EGFR抑制劑AG1478存在時(shí)，表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)抑制劑對(duì)于卵泡刺激素(FSH) 誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟的影響。在M小時(shí)時(shí)，隨后固定卵母細(xì)胞并評(píng)估減數(shù)分裂進(jìn)展。三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的每個(gè)處理組和時(shí)間點(diǎn)中使用平均數(shù)40個(gè)卵母細(xì)胞。在每一列或數(shù)據(jù)點(diǎn)上面存在的字母(a、b或c)表明以ANOVA分析后接Durmett’ s post hoc檢驗(yàn)所確定的平均值之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
如圖10所見(jiàn)，在IVM培養(yǎng)基中加入增加劑量的AG1478顯著降低了成熟百分?jǐn)?shù)(從 > 80%到大約5% ) (P < 0. 05)，因而完全抑制了誘導(dǎo)反應(yīng)。這表明在FSH誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟中需要EGF信號(hào)。在預(yù)IVM和IVM階段期間cAMP調(diào)節(jié)劑對(duì)于切割并發(fā)育至胚泡階段的影響如表1中所示，當(dāng)卵母細(xì)胞在含F(xiàn)SH的標(biāo)準(zhǔn)IVM培養(yǎng)基中成熟M小時(shí)時(shí)，在預(yù)IVM 階段的收集培養(yǎng)基中包括cAMP調(diào)節(jié)劑與無(wú)調(diào)節(jié)劑相比，改善了切割率(分別為89士2. 0% 禾口 78士2%，P < 0. 05)，并改善了胚泡發(fā)育(32士3%禾Π 洸士3%，P < 0. 05)。表 1
預(yù)IVM處理卵母細(xì)胞數(shù)切割率％^ ^t^ Wffi
泡％
卵泡液18689.5 ±1.4a38.5 ± 5.7a
收集培養(yǎng)基20577.8±3.6b26.5±4.0b
收集培養(yǎng)基aab
^20088.5 ± 1.9a32.0 ±2. Iab
+cAMP調(diào)節(jié)劑注釋a’b在同一列內(nèi)的帶不同上標(biāo)的數(shù)值代表統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(P < 0. 05)。數(shù)值表示為(平均值士 SEM)。如之前圖8中所示，在預(yù)IVM階段以cAMP調(diào)節(jié)劑預(yù)處理卵母細(xì)胞、并在IVM培養(yǎng)基中包括環(huán)己喹酰胺，在結(jié)合存在FSH時(shí)延遲了卵母細(xì)胞中M II起始發(fā)生4小時(shí)。因此，在卵泡液、收集培養(yǎng)基或添加有100 μ M毛喉素(FSK)和500 μ M IBMX的收集培養(yǎng)基中吸取和選擇卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs) 2小時(shí)。然后通過(guò)在環(huán)己喹酰胺(20 μ Μ)存在的情況下加入FSH使COCs成熟M或30小時(shí)。然后在體外受精后評(píng)估卵母細(xì)胞的發(fā)育能力并以第8 天的切割率和胚泡率評(píng)估胚胎發(fā)育。四個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的每個(gè)處理組中使用平均數(shù)45個(gè)卵母細(xì)胞。在每一列上面存在的字母(a、b、χ、y或ζ)表明以ANOVA分析后接Bonferronni ’ s post hoc檢驗(yàn)所確定的平均值之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表2提供了關(guān)于胚泡形成百分?jǐn)?shù)的此研結(jié)果。表權(quán)利要求
1.一種以輔助生殖技術(shù)自卵母細(xì)胞生產(chǎn)胚胎的方法，該方法包括a)在包括第一個(gè)磷酸二酯酶抑制劑和增加卵母細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度試劑的收集培養(yǎng)基中自受試者卵巢收集卵母細(xì)胞；b)在包括第二個(gè)磷酸二酯酶抑制劑的成熟培養(yǎng)基中培養(yǎng)卵母細(xì)胞；及c)以輔助生殖技術(shù)自卵母細(xì)胞生產(chǎn)胚胎。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中該試劑增加了卵母細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)cAMP生產(chǎn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其中該試劑是毛喉素。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中該試劑降低了卵母細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)cAMP降解。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的方法，其中該方法還包括暴露卵母細(xì)胞于誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟的配體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中配體濃度克服了cAMP誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或權(quán)利要求6所述的方法，其中該配體是卵泡刺激素(FSH)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中FSH濃度大于10mIU/ml。
9.根據(jù)權(quán)利要求5至8任一項(xiàng)所述的方法，其中該配體是表皮生長(zhǎng)因子(EGF)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中EGF濃度大于lng/ml。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)所述的方法，其中第一個(gè)磷酸二酯酶抑制劑和第二個(gè)磷酸二酯酶抑制劑不同。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11任一項(xiàng)所述的方法，其中第一個(gè)磷酸二酯酶抑制劑是IBMX。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12任一項(xiàng)所述的方法，其中第二個(gè)磷酸二酯酶抑制劑是環(huán)己喹酰胺。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)所述的方法，其中第一個(gè)磷酸二酯酶抑制劑和第二個(gè)磷酸二酯酶抑制劑相同。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至14任一項(xiàng)所述的方法，其中輔助生殖技術(shù)包括體外受精。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至15任一項(xiàng)所述的方法，其中胚胎是人類胚胎。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中體外受精發(fā)生在卵母細(xì)胞收集后大于M小時(shí)。
18.根據(jù)權(quán)利要求1至15任一項(xiàng)所述的方法，其中胚胎是牛胚胎。
19.一種體外成熟卵母細(xì)胞的方法，該方法包括a)在包括第一個(gè)磷酸二酯酶抑制劑和增加卵母細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度試劑的收集培養(yǎng)基中自受試者卵巢收集卵母細(xì)胞；b)在包括第二個(gè)磷酸二酯酶抑制劑的成熟培養(yǎng)基中培養(yǎng)卵母細(xì)胞。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中該試劑增加了卵母細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)cAMP生產(chǎn)。
21.根據(jù)權(quán)利要求19或權(quán)利要求20所述的方法，其中該試劑是毛喉素。
22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中該試劑降低了卵母細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)cAMP降解。
23.根據(jù)權(quán)利要求19至22的任一項(xiàng)所述的方法，其中該方法還包括暴露卵母細(xì)胞于誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟的配體。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中配體濃度克服了cAMP誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯。
25.根據(jù)權(quán)利要求23或權(quán)利要求M所述的方法，其中該配體是卵泡刺激素(FSH)。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中FSH濃度大于10mIU/ml。
27.根據(jù)權(quán)利要求23或權(quán)利要求M所述的方法，其中該配體是表皮生長(zhǎng)因子(EGF)。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中EGF濃度大于lng/ml。
29.根據(jù)權(quán)利要求19至觀任一項(xiàng)所述的方法，其中第一個(gè)磷酸二酯酶抑制劑和第二個(gè)磷酸二酯酶抑制劑不同。
30.根據(jù)權(quán)利要求19至四任一項(xiàng)所述的方法，其中第一個(gè)磷酸二酯酶抑制劑是IBMX。
31.根據(jù)權(quán)利要求19至30任一項(xiàng)所述的方法，其中第二個(gè)磷酸二酯酶抑制劑是環(huán)己喹酰胺。
32.根據(jù)權(quán)利要求19至觀任一項(xiàng)所述的方法，其中第一個(gè)磷酸二酯酶抑制劑和第二個(gè)磷酸二酯酶抑制劑相同。
33.一種卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基包括a)一種磷酸二酯酶抑制劑，及b)一種用于誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟的配體，其中在卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)基中的配體濃度克服了 cAMP誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)基，其中該磷酸二酯酶抑制劑是環(huán)己喹酰胺。
35.根據(jù)權(quán)利要求33或權(quán)利要求34所述的卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)基，其中該配體是FSH。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)基，其中FSH濃度大于10mIU/ml。
37.根據(jù)權(quán)利要求33或權(quán)利要求34所述的卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)基，其中該配體是EGF。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)基，其中EGF濃度大于lng/ml。
39.根據(jù)權(quán)利要求33至38任一項(xiàng)所述的卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)基，其中該培養(yǎng)基是人卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)基。
40.根據(jù)權(quán)利要求33至38任一項(xiàng)所述的卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)基，其中該培養(yǎng)基是牛卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)基。
41.一種組合產(chǎn)物，包括下列組分a)包括第一個(gè)磷酸二酯酶抑制劑和增加卵母細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度試劑的卵母細(xì)胞收集培養(yǎng)基 ’及b)包括第二個(gè)磷酸二酯酶抑制劑和用于誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟的配體的卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)基；其中卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)基中的配體濃度克服了 cAMP誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的組合產(chǎn)物，其中收集培養(yǎng)基和成熟培養(yǎng)基是用于人卵母細(xì)胞的收集和成熟。
43.根據(jù)權(quán)利要求41所述的組合產(chǎn)物，其中收集培養(yǎng)基和成熟培養(yǎng)基是用于牛卵母細(xì)胞的收集和成熟。
44.一種誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟的方法，該方法包括在包括磷酸二酯酶抑制劑和用于誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟的配體的成熟培養(yǎng)基中培養(yǎng)卵母細(xì)胞，其中成熟培養(yǎng)基中的配體濃度克服了 cAMP誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯，從而成熟卵母細(xì)胞。
45.一種誘導(dǎo)處于減數(shù)分裂阻滯狀態(tài)的卵母細(xì)胞成熟的方法，該方法包括用足以克服減數(shù)分裂阻滯濃度的配體接觸卵母細(xì)胞。
46.根據(jù)權(quán)利要求19至32、44和45任一項(xiàng)所述的方法，其中該方法是輔助生殖技術(shù)的部分。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中輔助生殖技術(shù)包括體外受精。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以輔助生殖技術(shù)自卵母細(xì)胞生產(chǎn)胚胎的方法。該方法包括(a)在包括第一個(gè)磷酸二酯酶抑制劑和增加卵母細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度的試劑的收集培養(yǎng)基中自受試者卵巢收集卵母細(xì)胞；(b)在包括第二個(gè)磷酸二酯酶抑制劑的成熟培養(yǎng)基中培養(yǎng)卵母細(xì)胞；及(c)以輔助生殖技術(shù)自卵母細(xì)胞生產(chǎn)胚胎。本發(fā)明還涉及誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟的方法。例如描述了一種包括上面步驟(a)和(b)的卵母細(xì)胞體外成熟的方法。本發(fā)明還涉及一種包括磷酸二酯酶抑制劑和用于誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟的配體的卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)基。還描述了一種包括上面提到的卵母細(xì)胞收集和成熟培養(yǎng)基的組合產(chǎn)物。
文檔編號(hào)C12N5/02GK102482644SQ201080030583
公開(kāi)日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月14日
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