專利名稱：：基于免疫的重靶向內(nèi)肽酶活性測(cè)定的制作方法基干免痔的重靶向內(nèi)肽酶活性測(cè)定本專利申請(qǐng)依照美國(guó)法典第35篇第119條(e)款要求2009年3月13日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)第61/160，217號(hào)的優(yōu)先權(quán)，該申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容據(jù)此以引用的方式并入本文。本說(shuō)明書中公開的序列包含在序列表中，其與本說(shuō)明書一起呈遞，其全部?jī)?nèi)容據(jù)此以引用的方式并入本文。梭菌毒素(例如，肉毒桿菌神經(jīng)毒素(Botulinumneurotoxin,BoNT)，BoNT/A、BoNT/B、BoNT/Cl、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F和BoNT/G；以及破傷風(fēng)神經(jīng)毒素(Tetanusneurotoxin,TeNT))抑制神經(jīng)信號(hào)傳遞的能力被使用在很多治療和美容應(yīng)用中，參見(jiàn)例如WilliamJ.Lipham,CosmeticandClinicalApplicationsofBotulinumToxin(Slack,Inc.，2004)?？梢运幬锝M合物形式商購(gòu)的梭菌毒素包括BoNT/A制劑，例如BOTOX(Allergan,Inc.，Irvine,CA)、DYSP0RT/RELOXIN(IpsenLtd.，Slough,England)、PURTOX(MentorCorp.，SantaBarbara,CA)、XEOMIN(MerzPharmaceuticals,GmbH.，F(xiàn)rankfurt,Germany)>NEUR0N0X(Medy-Tox,Inc.,Ochang-myeon,SouthKorea)、BTX-A(Biogen-techLtd.，University,Yantai,Shandong,China)；禾口BoNT/B制劑，例如MY0BL0C/NEUR0BL0C(SolsticeNeurosciences,Inc.，SouthSanFrancisco,CA)。歹ij如，BOTOX目前在一個(gè)或多個(gè)國(guó)家被批準(zhǔn)用于以下適應(yīng)癥弛緩不能、成人痙攣、肛裂、背痛、眼瞼痙攣、夜間磨牙、頸肌張力障礙、原發(fā)性震顫、眉間紋或面部動(dòng)力性皺紋、頭痛、面肌痙攣、膀胱機(jī)能亢進(jìn)、多汗癥、小兒腦性癱瘓、多發(fā)性硬化癥、肌陣攣性病癥、鼻唇線、痙攣性發(fā)音障礙、斜視和顏面神經(jīng)病癥(VIInervedisorder)。梭菌毒素治療法通過(guò)中斷用于將神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)肽分泌到突觸間隙中的胞吐過(guò)程來(lái)抑制神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)肽的釋放。醫(yī)藥工業(yè)迫切需要擴(kuò)展除了當(dāng)前的肌松藥應(yīng)用以外梭菌毒素療法的其它用途，以治療感覺(jué)神經(jīng)疾病，例如各種類型的慢性疼痛、神經(jīng)源性炎癥和泌尿生殖器病癥，以及其它病癥，例如胰腺炎。當(dāng)前用于擴(kuò)展基于梭菌毒素的療法的一種方法涉及修飾梭菌毒素，以使經(jīng)過(guò)修飾的毒素對(duì)相關(guān)神經(jīng)元或非神經(jīng)元細(xì)胞具有改變的細(xì)胞靶向能力。這些稱為重靶向內(nèi)肽酶或靶向囊泡胞吐調(diào)節(jié)蛋白(TargetedVesicularExocytosisModulatorProtein,TVEMP)的分子通過(guò)使用存在于相關(guān)神經(jīng)元或非神經(jīng)元靶細(xì)胞上的靶受體來(lái)實(shí)現(xiàn)其胞吐抑制作用。該重靶向的能力通過(guò)用對(duì)存在于相關(guān)神經(jīng)元或非神經(jīng)元靶細(xì)胞中的非梭菌毒素受體顯示選擇性結(jié)合活性的靶向域替代梭菌毒素的天然結(jié)合域來(lái)實(shí)現(xiàn)。該對(duì)結(jié)合域的修飾產(chǎn)生能夠選擇性結(jié)合靶細(xì)胞上存在的非梭菌毒素受體的分子。重靶向內(nèi)肽酶可結(jié)合靶受體，轉(zhuǎn)位到細(xì)胞質(zhì)中，并對(duì)相關(guān)神經(jīng)元或非神經(jīng)元靶細(xì)胞的SNARE復(fù)合物發(fā)揮其蛋白水解作用。一組重靶向內(nèi)肽酶包含具有阿片靶向域的分子。這些阿片重靶向內(nèi)肽酶包含阿片靶向域、梭菌毒素轉(zhuǎn)位域和梭菌毒素酶域。阿片重靶向內(nèi)肽酶或阿片-TVEMP的非限制性實(shí)例描述于以下專利文獻(xiàn)中例如KeithA.Foster等，ClostridialToxinDerivativesAbleToModifyPeripheralSensoryAfferentFunctions,美國(guó)專利5,989,545；J.OliverDolly等，ActivatableRecombinantNeurotoxins,美國(guó)專利7，132，259；StephanDonovan,ClostridialToxinDerivativesandMethodsForTreatingPain，美國(guó)專禾[I7，244，437;StephanDonovan,ClostridialToxinDerivativesandMethodsForTreatingPain,^IH^^ll7,413,742；StephanDonovan,ClostridialToxinDerivativesandMethodsForTreatingPain,美國(guó)專利7，415，338;LanceΕ·Steward等,MultivalentClostridialToxinDerivativesandMethodsofTheirUse，美國(guó)專禾Ij7，514，088;KeithA.Foster,FusionProteins，美國(guó)專利公開2008/0064092；KeithA.Foster,FusionProteins，美國(guó)專利公開2009/0035822;LanceΕ·Steward等，MultivalentClostridialToxinDerivativesandMethodsofTheirUse，美國(guó)專利公開2009/0048431;KeithA.Foster,Non-CytotoxicProteinConjugates,美國(guó)專利公開2009/0162341；KeithA.Foster等，Re-targetedToxinConjugates，國(guó)際專利公開WO2005/023309；和LanceΕ.Steward,ModifiedClostridialToxinswithEnhancedTranslocationCapabilitiesandAlteredTargetingCapabilitiesforNon-ClostridialToxinTargetCells,國(guó)際專利申請(qǐng)WO2008/008805；各專利的全部?jī)?nèi)容據(jù)此以引用的方式并入本文。重靶向內(nèi)肽酶與梭菌毒素之間的一個(gè)主要差異是，由于重靶向內(nèi)肽酶通常不靶向運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，故如果過(guò)量服用不能完全避免，將在很大程度上使與哺乳動(dòng)物過(guò)量服用重靶向內(nèi)肽酶有關(guān)的死亡減到最少。例如，以治療有效劑量的10，000倍的量施用阿片重靶向內(nèi)肽酶時(shí)，才能觀察到致死的跡象，并且該致死跡象是由分子的被動(dòng)擴(kuò)散而非中毒過(guò)程引起。因此，出于所有實(shí)用的目的，重靶向內(nèi)肽酶是非致死性分子。盡管該非致死特性具有重要的治療意義，但因?yàn)橛糜谥圃旎谒缶舅氐纳镏苿┑臉?biāo)準(zhǔn)活性測(cè)定是小鼠LD5tl生物測(cè)定(一種致死試驗(yàn))，所以會(huì)引起制造方面的問(wèn)題。S.S.Arnon等，JAMA2851059-1070(2001)。目前，所有醫(yī)藥制造商都使用小鼠LD5tl生物測(cè)定來(lái)表示其梭菌毒素制劑的效力。事實(shí)上，梭菌毒素的活性單位是小鼠LD5tl單位。然而，由于重靶向內(nèi)肽酶基本上無(wú)致死性，故無(wú)法使用小鼠LD5tl生物測(cè)定來(lái)評(píng)估這些分子的效力。因此，一種可以評(píng)估重靶向內(nèi)肽酶攝取過(guò)程中所有必要步驟的完整性的簡(jiǎn)單、可靠、經(jīng)過(guò)驗(yàn)證且政府機(jī)構(gòu)可接受的活性測(cè)定將具有重要價(jià)值。本說(shuō)明書提供用于測(cè)定適用于多種工業(yè)(例如制藥工業(yè)和食品工業(yè))的重靶向內(nèi)肽酶的活性的新型組合物、細(xì)胞和方法，并且還提供相關(guān)益處。這些組合物、細(xì)胞和方法不使用活體動(dòng)物或從活體動(dòng)物上獲取的組織，但能評(píng)估重靶向內(nèi)肽酶起作用必需的所有步馬聚ο圖1示出中樞和外周神經(jīng)元中神經(jīng)遞質(zhì)釋放和梭菌毒素中毒的范例的現(xiàn)行示意圖。圖IA示出中樞和外周神經(jīng)元中神經(jīng)遞質(zhì)釋放機(jī)制的示意圖。釋放過(guò)程可描述為包括兩個(gè)步驟1)囊泡?？浚渲泻猩窠?jīng)遞質(zhì)分子的囊泡的囊泡結(jié)合SNARE蛋白與位于質(zhì)膜處的膜結(jié)合SNARE蛋白締合；和2)神經(jīng)遞質(zhì)釋放，其中囊泡與質(zhì)膜融合，并且神經(jīng)遞質(zhì)分子被胞吐。圖IB示出中樞和外周神經(jīng)元中破傷風(fēng)毒素和肉毒毒素活性的中毒機(jī)制的示意圖。該中毒過(guò)程可描述為包括四個(gè)步驟1)受體結(jié)合，其中梭菌毒素結(jié)合梭菌受體復(fù)合物，并開始中毒過(guò)程；2)復(fù)合物內(nèi)化，其中在毒素結(jié)合之后，含有毒素/受體系統(tǒng)復(fù)合物的囊泡通過(guò)胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞中；3)輕鏈轉(zhuǎn)位，其中認(rèn)為發(fā)生了多個(gè)事件，包括囊泡內(nèi)部pH值改變、形成包含梭菌毒素重鏈Hn域的通道孔、梭菌毒素的輕鏈與重鏈分離和輕鏈釋放；以及4)酶促靶修飾，其中梭菌毒素的輕鏈通過(guò)蛋白水解裂解其靶SNARE底物，例如SNAP-25、VAMP或突觸融合蛋白(Syntaxin)，由此阻止囊泡?？亢蜕窠?jīng)遞質(zhì)釋放。圖2示出對(duì)過(guò)表達(dá)0RL-1的0RL-1克隆#6無(wú)性細(xì)胞系中重靶向內(nèi)肽酶Noc/A的全劑量響應(yīng)。Noc/A的特異性攝取可在過(guò)表達(dá)0RL-1的0RL-1克隆#6無(wú)性細(xì)胞系中觀察到。在裂解的SNAP-25197的ECLELISA中，利用Noc/A(LHN/A加結(jié)合配體痛敏肽(nocic印tin)變體)和LHn/A(LC/A和不含任何結(jié)合域的Hn)對(duì)0RL-1穩(wěn)定細(xì)胞系克隆#6進(jìn)行的處理證實(shí)Noc/A攝取對(duì)該無(wú)性細(xì)胞系是特異的。該無(wú)性細(xì)胞系也對(duì)Noc/A顯示出較強(qiáng)敏感性，其中EC5tl為1.2nM。圖3示出對(duì)SK-N-DZ單細(xì)胞源性克隆#3和#22中的Noc/A的全劑量響應(yīng)。與LHn/A相比較，SK-N-DZ克隆#3和#22特異性攝取Noc/A(η=4個(gè)獨(dú)立進(jìn)行的實(shí)驗(yàn))。在RPMISFM+N2+B27+NGF中將細(xì)胞接種到聚D-賴氨酸96孔板上。用配混物處理22小時(shí)。裂解的SNAP-25197的ECLELISA證實(shí)Noc/A攝取對(duì)該無(wú)性細(xì)胞系是特異的。這些無(wú)性細(xì)胞系還對(duì)Noc/A顯示出較強(qiáng)敏感性，其中克隆#3的EC5tl為0.3nM，而克隆#22的EC5tl為0.9nM。圖4示出用重靶向內(nèi)肽酶Noc/A處理的ORLlND7克隆1C11、4B7和4C9得到的ECL夾心ELISA測(cè)定結(jié)果。用Noc/A處理親本ND7和ORLlND7克隆24小時(shí)，隨后孵育2天。由于親本ND7僅達(dá)到約50%SNAP-25197裂解，故無(wú)法計(jì)算出其EC5tl值?？寺?B7和ICll中有超過(guò)80%SNAP-25197裂解。計(jì)算得到三個(gè)克隆的EC5tl值分別為5.7士0.5,6.7士1和8.6士2nM。圖5示出抗痛敏肽多克隆抗體可阻止SK-N-DZ克隆#3、克隆#22和AGNP330RL-1克隆#6細(xì)胞系中重靶向內(nèi)肽酶Noc/A的攝取。在RPMISFM+N2+B27+NGF中將細(xì)胞接種到聚D-賴氨酸96孔板上，并在含有抗痛敏肽多克隆抗體的無(wú)血清培養(yǎng)基中處理22小時(shí)，這些抗痛敏肽多克隆抗體在InMNoc/A稀釋達(dá)到不同濃度(0_3μg/mL)。圖6示出如蛋白印跡(Westernblot)圖像所描述的用濃度為0.017nM到1μM的重靶向內(nèi)肽酶Dyn/A處理來(lái)自SiMa克隆AF4和確立細(xì)胞系PC-12的細(xì)胞。這兩種細(xì)胞系都觀察到劑量依賴性攝取。圖7示出7.8nM抗體2E2A6、1D3B8、3C1A5和2C9B10以及市售MC-6050和MC-6053的歸一化BIAcoreSPR曲線。圖7A示出每種抗體的締合速率(on-rate)的歸一化數(shù)據(jù)。圖7B示出每種抗體的解離速率(off-rate)的歸一化數(shù)據(jù)。詳細(xì)描述本說(shuō)明書提供用于確定樣本中活性重靶向內(nèi)肽酶的存在與否以及用于確定重靶向內(nèi)肽酶的活性/效力的新型測(cè)定法。本說(shuō)明書中公開的基于細(xì)胞的新型測(cè)定法取決于使本測(cè)定法能夠檢測(cè)樣本中納摩爾量的重靶向內(nèi)肽酶的細(xì)胞、試劑和檢測(cè)方法。本說(shuō)明書中公開的基于細(xì)胞的測(cè)定法用于分析重靶向內(nèi)肽酶的多種功能，即，重靶向內(nèi)肽酶與細(xì)胞表面受體的結(jié)合、內(nèi)肽酶-受體復(fù)合物的內(nèi)化、酶域向細(xì)胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)位、底物的酶域裂解。如下文的進(jìn)一步論述，這些新型方法和組合物可用于分析粗制樣本和大塊樣本以及高度純化的雙鏈重靶向內(nèi)肽酶和配制的重靶向內(nèi)肽酶產(chǎn)物，而且還可按照自動(dòng)高通量測(cè)定形式來(lái)測(cè)定。因此，本說(shuō)明書中公開的一方面提供用于產(chǎn)生a-SNAP-25抗體的免疫響應(yīng)誘導(dǎo)組合物，這些α-SNAP-25抗體可選擇性結(jié)合包含在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25裂解產(chǎn)物的表位。免疫響應(yīng)誘導(dǎo)組合物可包含佐劑以及免疫響應(yīng)誘導(dǎo)組合物，該免疫響應(yīng)誘導(dǎo)組合物包括SNAP-25抗原、連接到SNAP-25抗原的載體、或與連接到SNAP-25抗原的柔性間隔子連接的載體，其中柔性連接子插入SNAP-25抗原與載體之間。預(yù)期引發(fā)免疫響應(yīng)從而產(chǎn)生可選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體的任何和所有SNAP-25抗原可用作SNAP-25抗原，包括但不限于，源自天然SNAP-25的SNAP-25抗原、源自非天然SNAP-25的SNAP-25抗原以及包含SNAP-25(即，來(lái)自天然SNAP-25或非天然SNAP-25的SNAP-25)的免疫響應(yīng)性片段的SNAP-25抗原。適用于產(chǎn)生可選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體的SNAP-25抗原包括但不限于，包含具有連接到載體肽的羧基化C-末端谷氨酰胺的SNAP-25肽的SNAP-25抗原，包括但不限于SEQIDNO:38。適用于制備可選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體的其它免疫響應(yīng)誘導(dǎo)組合物包括但不限于，包含與連接到SNAP-25抗原羧基化C-末端谷氨酰胺的柔性連接子連接的載體的免疫響應(yīng)誘導(dǎo)組合物，其中柔性連接子插入SNAP-25抗原與載體之間。預(yù)期任任何和所有佐劑均可適用于此類免疫響應(yīng)誘導(dǎo)組合物中，包括但不限于，聚乙二醇(PEG)、單甲氧基聚乙二醇(mPEG)、聚乙烯醇(PVA)、完全和不完全弗氏佐劑(Freund’sadjuvant)。本說(shuō)明書中公開的另一方面提供用于產(chǎn)生a-SNAP-25抗體的方法，這種α-SNAP-25抗體可選擇性結(jié)合包含在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25裂解產(chǎn)物的表位。該方法的方面包括以下步驟(a)對(duì)動(dòng)物施用本說(shuō)明書中公開的SNAP-25免疫響應(yīng)誘導(dǎo)組合物；(b)從動(dòng)物收集含有α-SNAP-25抗體或α-SNAP-25抗體產(chǎn)生細(xì)胞的樣本；和(c)從樣本中分離出α-SNAP-25抗體。所公開的方法適用于制備可選擇性結(jié)合包含在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25裂解產(chǎn)物的表位的α-SNAP-25單克隆抗體，或可選擇性結(jié)合包含在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25裂解產(chǎn)物的表位的α-SNAP-25多克隆抗體。本說(shuō)明書中公開的另一方面提供α-SNAP-25抗體，其可選擇性結(jié)合包含在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1S基處具有羧基末端的SNAP-25的表位。此類α-SNAP-25抗體包括天然抗體和非天然抗體，以及單克隆α-SNAP-25抗體或多克隆α-SNAP-25抗體。適用作選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25抗原的α-SNAP-25抗體的單克隆α-SNAP-25抗體包括但不限于，由雜交瘤細(xì)胞系1D3B8、2C9B10、2E2A6、3C1A5和3C3E2產(chǎn)生的單克隆α-SNAP-25抗體。本說(shuō)明書中公開的另一方面提供用于檢測(cè)重靶向內(nèi)肽酶活性的基于免疫的方法。該方法的方面包括以下步驟(a)用包含重靶向內(nèi)肽酶的樣本處理來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞，其中來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞對(duì)重靶向內(nèi)肽酶的重靶向內(nèi)肽酶活性敏感；(b)從經(jīng)過(guò)處理的細(xì)胞中分離出SNAP-25組分，所述組分包含在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25裂解產(chǎn)物；(c)使SNAP-25組分與本說(shuō)明書中公開的α-SNAP-25抗體接觸；和(d)檢測(cè)抗體-抗原復(fù)合物的存在，所述抗體-抗原復(fù)合物包含α-SNAP-25抗體和在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25裂解產(chǎn)物；其中抗體-抗原復(fù)合物的檢測(cè)將指示重靶向內(nèi)肽酶活性。步驟(c)中的α-SNAP-25抗體可任選連接到固相載體。本說(shuō)明書中公開的又一方面提供用于檢測(cè)阿片-TVEMP活性的基于免疫的方法。該方法的方面包括以下步驟(a)用包含重靶向內(nèi)肽酶的樣本處理來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞，其中來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞可攝取重靶向內(nèi)肽酶；(b)從經(jīng)過(guò)處理的細(xì)胞中分離出SNAP-25組分，所述SNAP-25組分包含在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25;(c)使SNAP-25組分與本說(shuō)明書中公開的α-SNAP-25抗體接觸；和(d)檢測(cè)抗體_抗原復(fù)合物的存在，所述抗體_抗原復(fù)合物包含α-SNAP-25抗體和在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25；其中抗體-抗原復(fù)合物的檢測(cè)將指示重靶向內(nèi)肽酶活性。步驟(c)中的α-SNAP-25抗體可任選連接到固相載體。本說(shuō)明書中公開的另一方面提供用于測(cè)定哺乳動(dòng)物體內(nèi)的重靶向內(nèi)肽酶免疫抗性的方法。該方法的方面包括以下步驟(a)將重靶向內(nèi)肽酶加入從哺乳動(dòng)物獲得的用于測(cè)試α-重靶向內(nèi)肽酶中和抗體的存在與否的測(cè)試樣本中；(b)用測(cè)試樣本處理來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞，其中來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性敏感；(C)從經(jīng)過(guò)處理的細(xì)胞中分離出SNAP-25組分，所述SNAP-25組分包含在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25裂解產(chǎn)物；(d)使SNAP-25組分與本說(shuō)明書中公開的α-SNAP-25抗體接觸；(e)檢測(cè)抗體_抗原復(fù)合物的存在，所述抗體_抗原復(fù)合物包含α-SNAP-25抗體和在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25裂解產(chǎn)物；(f)用陰性對(duì)照樣本代替測(cè)試樣本，重復(fù)步驟a-e；和(g)將步驟(e)中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合物的量與步驟(f)中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合物的量相比較，其中如果檢測(cè)出步驟(e)中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合物的量少于步驟(f)中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合物的量，就指示存在α-重靶向內(nèi)肽酶中和抗體。步驟(d)中的α-SNAP-25抗體可任選連接到固相載體。步驟(f)中的對(duì)照樣本除包括陰性對(duì)照樣本外，還可包括陽(yáng)性對(duì)照樣本。由肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、破傷風(fēng)梭菌(Clostridiumtetani)、巴氏梭菌(Clostridiumbaratii)和丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)產(chǎn)生的梭菌毒素被廣泛用于人類和其它哺乳動(dòng)物的治療和美容中。肉毒梭菌菌株產(chǎn)生7種抗原性不同的肉毒毒素(BoNT)血清型，這些血清型是通過(guò)研究肉毒中毒在人類(BoNT/A、BoNT/B、BoNT/E和BoNT/F)、動(dòng)物(BoNT/Cl和BoNT/D)中的發(fā)作而鑒別的，或是從土壤(BoNT/G)中分離得到。盡管所有七種肉毒毒素血清型具有類似的結(jié)構(gòu)和生物特性，但其各自也呈現(xiàn)異質(zhì)特征，例如不同的藥理學(xué)特性。相比之下，破傷風(fēng)毒素(TeNT)是由均一的破傷風(fēng)梭菌組產(chǎn)生。其它兩種梭菌屬，即巴氏梭菌和丁酸梭菌，也分別產(chǎn)生類似于BoNT/F和BoNT/E的毒素。每種梭菌毒素被翻譯為約150kDa的單鏈多肽，該單鏈多肽的二硫環(huán)隨后被天然蛋白酶(例如內(nèi)源性梭菌毒素蛋白酶或環(huán)境中產(chǎn)生的天然蛋白酶)通過(guò)蛋白水解切割作用而裂解。這種翻譯后加工產(chǎn)生雙鏈分子，其包含約50kDa輕鏈(LC)和約IOOkDa重鏈(HC)，二者通過(guò)單個(gè)二硫鍵和非共價(jià)相互作用結(jié)合在一起。每個(gè)成熟的雙鏈分子包含三個(gè)功能上不同的域1)酶域，位于包括金屬蛋白酶區(qū)的LC中，該金屬蛋白酶區(qū)含有特異性靶向神經(jīng)遞質(zhì)釋放器官的核心部分的鋅依賴性內(nèi)肽酶活性；2)轉(zhuǎn)位域，包含在HC(Hn)的氨基末端半部分之內(nèi)，其促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)囊泡將LC釋放到靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中；和3)結(jié)合域，發(fā)現(xiàn)于HC(Hc)的羧基末端半部分之內(nèi)，其決定梭菌毒素與位于靶細(xì)胞表面的受體復(fù)合物的結(jié)合活性和結(jié)合特異性。這三個(gè)功能域的結(jié)合、轉(zhuǎn)位和酶活性均是產(chǎn)生毒性所必需的。雖然該過(guò)程的所有細(xì)節(jié)尚未精確獲知，但梭菌毒素進(jìn)入神經(jīng)元并抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放的整個(gè)細(xì)胞中毒機(jī)制都是相似的，而不管是何種血清型或亞型。雖然申請(qǐng)人不希望受以下描述的限制，但是中毒機(jī)制可描述為包括至少4個(gè)步驟1)受體結(jié)合、2)復(fù)合物內(nèi)化、3)輕鏈轉(zhuǎn)位，和4)酶促靶修飾(圖1)。當(dāng)梭菌毒素的HC域結(jié)合位于靶細(xì)胞質(zhì)膜表面上的毒素特異性受體系統(tǒng)時(shí)，開始該過(guò)程。受體復(fù)合物的結(jié)合特異性被認(rèn)為是部分地通過(guò)似乎明顯包含各梭菌毒素受體復(fù)合物的神經(jīng)節(jié)苷脂與蛋白受體的特定組合來(lái)實(shí)現(xiàn)。一旦結(jié)合，毒素/受體復(fù)合物就通過(guò)胞吞作用內(nèi)化，且內(nèi)化的囊泡被歸類為特定細(xì)胞內(nèi)途徑。轉(zhuǎn)位步驟看起來(lái)是由囊泡隔室的酸化所引發(fā)。該過(guò)程似乎會(huì)開始重要的PH依賴性結(jié)構(gòu)重排，從而使疏水性增加、促進(jìn)孔形成、并促使毒素重鏈與輕鏈分離。一旦重鏈與輕鏈分離，毒素的輕鏈內(nèi)肽酶就會(huì)從胞內(nèi)囊泡釋放到細(xì)胞溶質(zhì)中，在細(xì)胞溶質(zhì)中，其似乎會(huì)特異性靶向神經(jīng)遞質(zhì)釋放器官的核心部分。這些核心蛋白，即囊泡相關(guān)膜蛋白(VAMP)/小突觸囊泡蛋白、25kDa的突觸體相關(guān)蛋白(SNAP-25)和突觸融合蛋白，對(duì)于突觸囊泡在神經(jīng)末梢停靠和融合必需的，并構(gòu)成可溶性N-乙基馬來(lái)酰亞胺敏感因子附著蛋白受體(SNARE)家族的成員。BoNT/A和BoNT/E裂解SNAP-25的羧基末端區(qū)，分別釋放出具有9個(gè)或26個(gè)氨基酸的片段，且BoNT/Cl也在羧基末端附近裂解SNAP-25，釋放出含8個(gè)氨基酸的片段。肉毒血清型BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F和BoNT/G以及破傷風(fēng)毒素作用于VAMP的保守中心部分，并將VAMP的氨基末端部分釋放到細(xì)胞溶質(zhì)中。BoNT/Cl在細(xì)胞質(zhì)膜表面附近的單一位點(diǎn)處裂解突觸融合蛋白。突觸SNARE的選擇性蛋白水解將導(dǎo)致封閉體內(nèi)由梭菌毒素引起的神經(jīng)遞質(zhì)釋放。梭菌毒素的SNARE蛋白質(zhì)靶是多種非神經(jīng)元類型中發(fā)生胞吐作用所共有的；在這些細(xì)胞中，如在神經(jīng)元中，輕鏈肽酶活性將抑制胞吐作用，參見(jiàn)例如YannHumeau等，HowBotulinumandTetanusNeurotoxinsBlockNeurotransmitterRelease,82(5)Biochimie.427-446(2000)；KathrynTurton^,BotulinumandTetanusNeurotoxinsStructure,FunctionandTherapeuticUtility,27(11)TrendsBiochem.Sci.552-558.(2002)；GiovannaLalli等，TheJourneyofTetanusandBotulinumNeurotoxinsinNeurons,11(9)TrendsMicrobiol.431-437,(2003)。重靶向內(nèi)肽酶一般用外源性蛋白酶裂解位點(diǎn)取代天然雙鏈環(huán)蛋白酶裂解位點(diǎn)。參見(jiàn)例如，Dolly，J.0.等，ActivatableClostridialToxins，美國(guó)專利7，419，676，該專利以引用的方式并入本文。盡管重靶向內(nèi)肽酶的總分子量因靶向性部分的大小而不同，但活化過(guò)程和其依賴于在外源性裂解位點(diǎn)裂解來(lái)產(chǎn)生雙鏈分子方面與梭菌毒素基本上是相同的。參見(jiàn)例如，Steward，L.E.等，ActivatableClostridialToxins，美國(guó)專利公布2009/0005313;Steward，L.E.等，ModifiedClostridialToxinswithEnhancedTranslocationCapabilitiesandAlteredTargetingActivityForNon-ClostridialToxinTargetCells，美國(guó)專利申請(qǐng)11/776，075;Steward，L.E.等，ModifiedClostridialToxinswithEnhancedTranslocationCapabilitiesandAlteredTargetingActivityforClostridialToxinTargetCells，美國(guó)專利公布2008/0241881，各專利以引用的方式并入本文。本公開的方面部分包括用于產(chǎn)生α-SNAP-25抗體的免疫響應(yīng)誘導(dǎo)組合物，所述α-SNAP-25抗體可選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“免疫響應(yīng)誘導(dǎo)組合物”是指包含SNAP-25抗原的組合物，當(dāng)將其施用于動(dòng)物時(shí)，將刺激對(duì)SNAP-25抗原的免疫響應(yīng)，由此產(chǎn)生可選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1S基處具有羧基末端的SNAP-25的α-SNAP-25抗體。術(shù)語(yǔ)“免疫響應(yīng)”是指動(dòng)物的免疫系統(tǒng)對(duì)免疫響應(yīng)誘導(dǎo)組合物的任何響應(yīng)。示例性免疫響應(yīng)包括但不限于細(xì)胞以及局部和全身性體液免疫，例如CTL響應(yīng)，包括⑶8+CTL的抗原特異性誘導(dǎo)響應(yīng)、輔助性T細(xì)胞響應(yīng)(包括T細(xì)胞增殖響應(yīng)和細(xì)胞因子釋放)和B細(xì)胞響應(yīng)(包括例如產(chǎn)生抗體的響應(yīng))。術(shù)語(yǔ)“誘導(dǎo)免疫響應(yīng)”是指施用免疫響應(yīng)誘導(dǎo)組合物或編碼免疫響應(yīng)誘導(dǎo)組合物的多核苷酸，在此過(guò)程中，免疫響應(yīng)受到影響，即被刺激、引發(fā)或誘導(dǎo)。SNAP-25免疫響應(yīng)誘導(dǎo)組合物包含SNAP-25抗原。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“抗原”是指引發(fā)免疫響應(yīng)的分子，并且包括但不限于肽、多糖以及例如脂蛋白和糖脂等脂質(zhì)的綴合物。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“SNAP-25抗原”是指在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的任何抗原，其可引發(fā)免疫響應(yīng)。免疫響應(yīng)誘導(dǎo)組合物中所用的SNAP-25抗原須大到足以具有顯著獨(dú)特的序列，由此降低產(chǎn)生與除SNAP-25外的抗原發(fā)生交叉反應(yīng)的抗體的可能性。此外，免疫響應(yīng)誘導(dǎo)組合物中所用的SNAP-25抗原還必須小到足以只引發(fā)大致上針對(duì)在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1S基處具有羧基末端的SNAP-25的免疫響應(yīng)，由此增加產(chǎn)生可區(qū)別在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25與在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處沒(méi)有羧基末端的SNAP-25的α-SNAP-25抗體的可能性。而且，還迫切需要產(chǎn)生具有單一氨基酸序列的α-SNAP-25抗體，這些抗體具有良好的產(chǎn)率，可再現(xiàn)選擇性并以可接受的親合力結(jié)合，由此允許設(shè)計(jì)出高靈敏度的測(cè)定法。出現(xiàn)在SNAP-25中的BoNT/A裂解位點(diǎn)周圍的序列表示為P5-P4-P3-P2-P1-P1，_P2，_P3’-P4’-P5’，其中P1-P1'表示易分裂鍵。在重靶向內(nèi)肽酶裂解后，由此產(chǎn)生的裂解產(chǎn)物包含包括P5-P4-P3-P2-P1序列的片段和包括P1'-P2，-P3'-p4，-P5'的片段。因此，本文中使用的術(shù)語(yǔ)“在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25”是指具有作為其羧基末端氨基酸的P1殘基的任何SNAP-25。例如，人SNAP-25(SEQIDNO5)中的Q197-R198代表BoNT/A裂解位點(diǎn)的P1-P/易分裂鍵。因此，“具有BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的羧基末端谷氨酰胺的SNAP-25”就是在其羧基末端氨基酸具有谷氨酰胺的任何SNAP-25裂解產(chǎn)物，其中谷氨酰胺代表易分裂鍵中的Q197。再例如，石紋電鰩(Torpedomarmorata)SNAP-25(SEQIDNO16)中的K2tl4-H2tl5代表BoNT/A裂解位點(diǎn)的P1-P1，易分裂鍵。因此，“具有BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的羧基末端賴氨酸的SNAP-25”就是在其羧基末端氨基酸具有賴氨酸的任何SNAP-25裂解產(chǎn)物，其中賴氨酸代表易分裂鍵中的K2(14。在BoNT/A裂解位點(diǎn)中BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25抗原經(jīng)過(guò)修飾，可增強(qiáng)未結(jié)合修飾的SNAP-25抗原、半抗原或任何其它免疫原性、非免疫原性或弱免疫原性的抗原性化合物的免疫原性。在該實(shí)施方案的一方面，可羧基化來(lái)自SNAP-25抗原的易分裂鍵的羧基末端P1殘基。羧基化將從兩個(gè)方面增加SNAP-25抗原的所需免疫原性。第一，由于帶電氨基酸可增強(qiáng)免疫原性，故將COO—基團(tuán)加入羧基末端殘基將增加SNAP-25抗原的整體免疫原性。第二，由于BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基在裂解時(shí)處于帶電狀態(tài)，故將COO—基團(tuán)加入羧基末端殘基將更好地模擬本說(shuō)明書中公開的α-SNAP-25抗體被設(shè)計(jì)來(lái)選擇性結(jié)合的實(shí)際抗原。在該實(shí)施方案的一方面，可通過(guò)加入適于連接SNAP-25抗原與載體蛋白的氨基酸來(lái)修飾SNAP-25抗原的氨基末端殘基，該載體蛋白為例如匙孔血藍(lán)蛋白(keyholelimpethemacyanin,KLH)、卵清蛋白(ovalbumin，OVA)、甲狀腺球蛋白(thyroglobulin，THY)、牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，BSA)、大豆胰蛋白酶抑制齊[J(soybeantrypsininhibitor,STI)或多連接肽(multipleattachmentpeptide,MAP)例如，半胱氨酸殘基可位于氨基末端，以便綴合載體蛋白KLH。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25抗原的長(zhǎng)度可以是例如至少5個(gè)、至少6個(gè)、至少7個(gè)、至少8個(gè)、至少9個(gè)、至少10個(gè)、至少11個(gè)、至少12個(gè)、至少13個(gè)、至少14個(gè)、至少15個(gè)、至少16個(gè)、至少17個(gè)、至少18個(gè)、至少19個(gè)、至少20個(gè)、至少25個(gè)或至少30個(gè)氨基酸。在另一實(shí)施方案中，在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25抗原的長(zhǎng)度可以是例如最多5個(gè)、最多6個(gè)、最多7個(gè)、最多8個(gè)、最多9個(gè)、最多10個(gè)、最多11個(gè)、最多12個(gè)、最多13個(gè)、最多14個(gè)、最多15個(gè)、最多16個(gè)、最多17個(gè)、最多18個(gè)、最多19個(gè)、最多20個(gè)、最多25個(gè)或最多30個(gè)氨基酸。在又一實(shí)施方案中，在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25抗原的氨基酸數(shù)量可以例如介于7到12個(gè)之間、介于10到15個(gè)之間或介于13到18個(gè)之間。在另一實(shí)施方案中，在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25抗原包含SEQIDNO:33。在該實(shí)施方案的方面，在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25抗原包含SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDN0:36、SEQIDNO37、SEQIDNO38或SEQIDNO:39。在另一實(shí)施方案中，在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25抗原包含SEQIDNO:40。在又一實(shí)施方案中，在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25抗原包含SEQIDNO:41。在該實(shí)施方案的方面，在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25抗原包含SEQIDNO:42、SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、SEQIDN045,SEQIDNO:46。在另一實(shí)施方案中，在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25抗原包含SEQIDNO:47。預(yù)期引發(fā)免疫響應(yīng)，從而產(chǎn)生可選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25的α-SNAP-25抗體的任何和所有SNAP-25抗原都可用作SNAP-25抗原。因此，包含SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO36,SEQIDNO37,SEQIDNO38,SEQIDNO39,SEQIDN0:41、SEQIDNO:42,SEQIDNO43,SEQIDNO44、SEQIDNO:45或SEQIDNO:46的氨基酸序列變體可用作SNAP-25抗原，以引發(fā)免疫響應(yīng)，從而產(chǎn)生可選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25的α-SNAP-25抗體。由此，在一個(gè)實(shí)施方案中，SNAP-25抗原可通過(guò)至少1個(gè)、至少2個(gè)、至少3個(gè)、至少4個(gè)或至少5個(gè)氨基酸的取代、缺失或添加而取代成包含SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO43,SEQIDNO44、SEQIDNO45或SEQIDNO:46的SNAP-25抗原。在另一實(shí)施方案中，SNAP-25抗原與包含SEQIDNO32,SEQIDNO33、SEQIDNO34,SEQIDNO35,SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、SEQIDNO45或SEQIDNO46的SNAP-25抗原可具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的氨基酸同一性。預(yù)期一個(gè)或多個(gè)載體可連接到SNAP-25抗原，以便增強(qiáng)未結(jié)合載體的免疫原性、非免疫原性或弱免疫原性SNAP-25抗原的免疫原性。非限制性實(shí)例包括例如匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)、卵清蛋白(OVA)、甲狀腺球蛋白(THY)、牛血清白蛋白(BSA)、大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)或多連接肽(MAP)。如本領(lǐng)域中眾所周知的，通過(guò)將抗原與載體偶聯(lián)，可使非抗原性或弱抗原性抗原具有抗原性。用于將抗原與載體偶聯(lián)的各種其它載體和方法是本領(lǐng)域中眾所周知的。參見(jiàn)例如，Harlow和Lane，同上文，1998a；Harlow和Lane，同上文，1998b；以及DavidW.Waggoner,Jr.等，Immunogenicity-enhancingcarriersandcompositionsthereofandmethodsofusingthesame，美國(guó)專利公布第20040057958號(hào)(2004年3月25日)。也可通過(guò)將表位表達(dá)成融合蛋白來(lái)產(chǎn)生表位。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知用于表達(dá)多肽融合物的方法，如例如以下文獻(xiàn)中所述=Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology(增刊47)，JohnWiley&Sons，NewYork(1999)。由于SNAP-25抗原的羧基末端必須是BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基，故載體須連接到SNAP-25抗原的氨基末端。預(yù)期一個(gè)或多個(gè)柔性間隔子可連接到SNAP-25抗原，以便增強(qiáng)未結(jié)合柔性連接子的免疫原性、非免疫原性或弱免疫原性SNAP-25抗原的免疫原性。柔性間隔子可增加SNAP-25抗原的總體肽長(zhǎng)度，并提供柔性，從而有助于將SNAP-25抗原適當(dāng)?shù)爻蔬f到免疫細(xì)胞。如非限制性實(shí)例，SNAP-25免疫響應(yīng)誘導(dǎo)組合物可包含與一個(gè)或多個(gè)柔性間隔子串聯(lián)連接的SNAP-25抗原，以更好地將SNAP-25抗原呈遞到免疫細(xì)胞，由此促進(jìn)免疫響應(yīng)。包含肽的柔性間隔子的長(zhǎng)度為至少一個(gè)氨基酸，并且包含帶有小側(cè)鏈R基團(tuán)的不帶電氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸或絲氨酸。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，柔性間隔子的長(zhǎng)度可以是例如至少1個(gè)、至少2個(gè)、至少3個(gè)、至少4個(gè)、至少5個(gè)、至少6個(gè)、至少7個(gè)、至少8個(gè)、至少9個(gè)或至少10個(gè)氨基酸。在另一實(shí)施方案中，柔性間隔子的長(zhǎng)度可以是例如至少1個(gè)、最多2個(gè)、最多3個(gè)、最多4個(gè)、最多5個(gè)、最多6個(gè)、最多7個(gè)、最多8個(gè)、最多9個(gè)或最多10個(gè)氨基酸。在另一實(shí)施方案中，柔性間隔子的氨基酸數(shù)量可例如介于1到3個(gè)之間、介于2到4個(gè)之間、介于3到5個(gè)之間、介于4到6個(gè)之間或介于5到7個(gè)之間。柔性間隔子的非限制性實(shí)例包括例如G間隔子，例如GGG、GGGG(SEQIDNO57)和GGGGS(SEQIDNO58)；或A間隔子，例如AAA、AAAA(SEQIDNO59)禾口AAAAV(SEQIDN0:60)。柔性間隔子框內(nèi)連接到SNAP-25抗原，成為融合蛋白。如上文所論述，使用柔性間隔子將部分增加SNAP-25抗原的總體肽長(zhǎng)度。舉例來(lái)說(shuō)，具有5到10個(gè)氨基酸的SNAP-25抗原可通過(guò)將具有3到5個(gè)氨基酸的柔性間隔子連接至SNAP-25抗原的氨基末端來(lái)增加其總長(zhǎng)度。再例如，具有5到10個(gè)氨基酸的SNAP-25抗原可通過(guò)將具有4到6個(gè)氨基酸的柔性間隔子連接至SNAP-25抗原的氨基末端來(lái)增加其總長(zhǎng)度。再例如，具有5到10個(gè)氨基酸的SNAP-25抗原可通過(guò)將具有7到10個(gè)氨基酸的柔性間隔子連接至SNAP-25抗原的氨基末端來(lái)增加其總長(zhǎng)度。再例如，具有7到12個(gè)氨基酸的SNAP-25抗原可通過(guò)將具有1到3個(gè)氨基酸的柔性間隔子連接至SNAP-25抗原的氨基末端來(lái)增加其總長(zhǎng)度。再例如，具有7到12個(gè)氨基酸的SNAP-25抗原可通過(guò)將具有4到6個(gè)氨基酸的柔性間隔子連接至SNAP-25抗原的氨基末端來(lái)增加其總長(zhǎng)度。利用柔性間隔子增加長(zhǎng)度將允許選擇尺寸較小的SNAP-25抗原，進(jìn)而增加使SNAP-25抗原只引發(fā)大致上針對(duì)在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1S基處具有羧基末端的SNAP-25的免疫響應(yīng)的可能性，由此增加了產(chǎn)生可區(qū)別在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25與在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處沒(méi)有羧基末端的SNAP-25的α-SNAP-25抗體的可能性。預(yù)期本說(shuō)明書中公開的SNAP-25免疫響應(yīng)誘導(dǎo)組合物可任選包含本說(shuō)明書中公開的SNAP-25抗原以及一種或多種佐劑。當(dāng)結(jié)合SNAP-25免疫響應(yīng)誘導(dǎo)組合物使用時(shí)，本文中使用的術(shù)語(yǔ)“佐劑”是指使針對(duì)SNAP-25抗原的免疫響應(yīng)增加或多樣化的任何物質(zhì)或物質(zhì)混合物。免疫響應(yīng)誘導(dǎo)佐劑可例如用于減少保護(hù)性免疫所需的免疫次數(shù)或抗原量。在免疫響應(yīng)誘導(dǎo)組合物中使用免疫響應(yīng)誘導(dǎo)佐劑是眾所周知的。使用這些佐劑的主要目的是使免疫響應(yīng)增強(qiáng)。非限制性佐劑包括例如脂質(zhì)體、油相，包括但不限于，弗氏佐劑，例如弗氏完全佐劑(FCA)；弗氏不完全佐劑(FIA)；皂苷元糖苷(sapogeninglycoside)，例如皂苷；聚羧乙烯(carbopol)；N-乙?；邗；?L-丙氨?；?D-異谷氨酰胺(常稱為胞壁酰二肽或“MDP”)；以及脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)。這樣的佐劑一般是以與水相形成的乳液的形式使用，或者更常見(jiàn)的是，其可由不溶于水的無(wú)機(jī)鹽組成。這些無(wú)機(jī)鹽可由例如氫氧化鋁、硫酸鋅、膠狀氫氧化鐵、磷酸鈣或氯化鈣組成。氫氧化鋁(Al(OH)3)是一種常用佐齊IJ。目前，F(xiàn)DA批準(zhǔn)用于人類的唯一佐劑是鋁鹽(Alum)，其可通過(guò)使抗原沉淀來(lái)“儲(chǔ)積”抗原。上文提供的佐劑只是示例性的。事實(shí)上，任何免疫響應(yīng)誘導(dǎo)佐劑都可用于本說(shuō)明書中公開的免疫響應(yīng)誘導(dǎo)組合物中，只要這種佐劑能滿足誘導(dǎo)免疫響應(yīng)所需要的特征。本說(shuō)明書中公開的載體也可充當(dāng)佐劑。特定佐劑以及其制備和使用方法描述于例如以下文獻(xiàn)中Gupta等，Vaccine,11:993_306，1993；Arnon,R.(編輯)SyntheticVaccines1:83_92,CRCPress,Inc.,BocaRaton,Fla.,1987；禾口DavidW.Waggoner,Jr.等，Immunogenicity-EnhancingCarriersandCompositionsThereofandMethodsofUsingtheSame，美國(guó)專利公布第20040057958號(hào)(2004年3月25日)。其它佐劑包括PlenumPress(NewYork)出版的PharmaceuticalBiotechnology的"VaccineDesign,TheSubunitandAdjuvantApproach"(Powell,M.F.禾口Newman，M.J.編輯)，第6卷，第7章(第141-227頁(yè))中所述的任何化合物。這本書中的實(shí)例包括胞壁酰二肽(MDP)和Montanide720。如聚肌苷胞嘧啶(PolyIC)或含有CpG基元的質(zhì)粒DNA等分子也可作為佐劑與抗原一起封裝在微粒中施用。在另一實(shí)例中，佐劑是有助于使抗原性化合物進(jìn)入細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的試劑，例如李斯特菌素(listeriolysin)、鏈球菌溶血素(str印tolysin)或其混合物。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，SNAP-25免疫響應(yīng)誘導(dǎo)組合物包含具有連接到載體肽的羧基化羧基末端谷氨酰胺的SNAP-25抗原。在該實(shí)施方案的方面，具有羧基化羧基末端谷氨酰胺的SNAP-25抗原包含SEQIDNO32、SEQIDNO33、SEQIDNO34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO38或SEQIDNO:39。在該實(shí)施方案的另一方面，SNAP-25抗原包含SEQIDNO:40。在該實(shí)施方案的方面，載體肽是匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)、卵清蛋白(0VA)、甲狀腺球蛋白(THY)、牛血清白蛋白(BSA)、大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)或多連接肽(MAP)。在另一實(shí)施方案中，SNAP-25免疫響應(yīng)誘導(dǎo)組合物包含具有連接到載體肽的羧基化羧基末端賴氨酸的SNAP-25抗原。在該實(shí)施方案的方面，具有羧基化羧基末端賴氨酸的SNAP-25抗原包含SEQIDNO:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、SEQIDN0:45或SEQIDNO:46。在該實(shí)施方案的另一方面，SNAP-25抗原包含SEQIDNOAl0在該實(shí)施方案的方面，載體肽是匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)、卵清蛋白(OVA)、甲狀腺球蛋白(THY)、牛血清白蛋白(BSA)、大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)或多連接肽(MAP)。在另一實(shí)施方案中，SNAP-25免疫響應(yīng)誘導(dǎo)組合物包含具有連接到一個(gè)或多個(gè)柔性連接子和載體肽的羧基化C末端谷氨酰胺的SNAP-25抗原，其中柔性連接子插入SNAP-25抗原與載體肽之間。在該實(shí)施方案的方面，具有羧基化羧基末端谷氨酰胺的SNAP-25抗原包含SEQIDNO32,SEQIDNO33,SEQIDNO34,SEQIDNO35,SEQIDNO36,SEQIDNO37,SEQIDN0:38或SEQIDNO:39。在另一實(shí)施方案中，SNAP-25抗原包含SEQIDNO:46。在該實(shí)施方案的方面，載體肽是匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)、卵清蛋白(OVA)、甲狀腺球蛋白(THY)、牛血清白蛋白(BSA)、大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)或多連接肽(MAP)。在該實(shí)施方案的方面，柔性連接子是G-間隔子或A-間隔子。在又一實(shí)施方案中，SNAP-25免疫響應(yīng)誘導(dǎo)組合物包含具有連接到柔性連接子和載體肽的羧基化C末端賴氨酸的SNAP-25抗原，其中柔性連接子插入SNAP-25抗原與載體肽之間。在該實(shí)施方案的方面，具有羧基化羧基末端賴氨酸的SNAP-25抗原包含SEQIDNO41、SEQIDNO:42,SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、SEQIDNO:45或SEQIDNO:46。在該實(shí)施方案的另一方面，SNAP-25抗原包含SEQIDNO:47。在該實(shí)施方案的方面，載體肽是匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)、卵清蛋白(OVA)、甲狀腺球蛋白(THY)、牛血清白蛋白(BSA)、大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)或多連接肽(MAP)。在該實(shí)施方案的方面，柔性連接子是G-間隔子或A-間隔子。本公開的方面部分包括用于產(chǎn)生可選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25的α-SNAP-25抗體的方法。可利用本領(lǐng)域中眾所周知的多種方法來(lái)產(chǎn)生選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體。本領(lǐng)域中已知用于制備和使用抗體以及檢測(cè)和測(cè)量抗體結(jié)合特異性、結(jié)合親和力和結(jié)合親合力的特定方案。參見(jiàn)例如，ANTIBODIES:ALAB0RAT0RYMANUAL(EdwardHarlow&DavidLane,編輯，ColdSpringHarborLaboratoryPress,第2版，1998a)；禾口USINGANTIBODIES:ALABORATORYMANUALPORTABLEPROTOCOLNo.I(EdwardHarlow&DavidLane,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1998b)；MolecularCloning,ALaboratoryManual,2001；以及CurrentProtocolsinMolecularBiology,2004；DavidAnderson等，TherapeuticPolypeptides,NucleicAcidsEncodingSame,andMethodsofUse，美國(guó)專利7，034，132(2005年4月25日)；和BeatrizM.Carreno等，AntibodiesAgainstCTLA4，美國(guó)專利7，034，121(2006年4月25日)。在非限制性實(shí)例中，可通過(guò)對(duì)動(dòng)物(例如兔、山羊、小鼠或其它哺乳動(dòng)物)注射本說(shuō)明書中公開的免疫響應(yīng)誘導(dǎo)組合物的一種或多種注射劑，來(lái)產(chǎn)生選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25的α-SNAP-25多克隆抗體。在另一非限制性實(shí)例中，可通過(guò)對(duì)卵(例如雞蛋)注射本說(shuō)明書中公開的免疫響應(yīng)誘導(dǎo)組合物的一種或多種注射劑，來(lái)產(chǎn)生選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25的α-SNAP-25多克隆抗體?？衫脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如使用固定抗原的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)或基于細(xì)胞的活性測(cè)定法)隨時(shí)間監(jiān)測(cè)免疫動(dòng)物體內(nèi)的抗體滴度。必要時(shí)，可從哺乳動(dòng)物體內(nèi)(例如血液)分離出選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體的多克隆抗體，并利用眾所周知的技術(shù)(例如用于獲得IgG部分的蛋白質(zhì)A親和色譜法，或?qū)τ糜诋a(chǎn)生抗體的肽的親和純化法)進(jìn)行進(jìn)一步純化。在另一非限制性實(shí)例中，可以使用雜交瘤方法產(chǎn)生選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1S基處具有羧基末端的SNAP-25的CI-SNAP-25單克隆抗體。參見(jiàn)例如，第6章MonoclonalAntibodies，第196-244頁(yè)，Harlow和Lane，同上文，1998a；和第7章GrowingHybridomas，第245-282頁(yè)，Harlow和Lane,同上文，1998a；和Goding，第59-103頁(yè)，MonoclonalAntibodiesPrinciplesandPractice,AcademicPress,(1986)。在該方法中，通常將宿主動(dòng)物(例如小鼠、倉(cāng)鼠或另一適合的宿主動(dòng)物)暴露于本說(shuō)明書中公開的SNAP-25抗原的一種或一種以上注射劑下，以引出產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生α-SNAP-25抗體的淋巴細(xì)胞，所述α-SNAP-25抗體將特異性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25?？衫脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如使用固定抗原的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)或基于細(xì)胞的活性測(cè)定法)隨時(shí)間監(jiān)測(cè)免疫動(dòng)物體內(nèi)的抗體滴度?；蛘撸梢栽隗w外使用適合的細(xì)胞培養(yǎng)系使淋巴細(xì)胞免疫。在免疫后一段合適時(shí)間的時(shí)候，例如當(dāng)抗體滴度達(dá)到最大時(shí)，從動(dòng)物體內(nèi)分離出產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。一般說(shuō)來(lái)，如果需要人類來(lái)源的細(xì)胞，則使用外周血淋巴細(xì)胞；而如果需要非人類哺乳動(dòng)物來(lái)源的細(xì)胞，則使用脾細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞。使用適合的融合劑(例如聚乙二醇)將分離出的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞與永生細(xì)胞系融合，以形成雜交瘤細(xì)胞。永生化細(xì)胞系通常是經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，尤其是嚙齒動(dòng)物、牛和人類來(lái)源的骨髓瘤細(xì)胞。通常，將鼠類骨髓瘤細(xì)胞系與從經(jīng)過(guò)適當(dāng)免疫的小鼠收獲的脾細(xì)胞融合，以產(chǎn)生雜交瘤。優(yōu)選永生細(xì)胞系為對(duì)含有次黃嘌呤(hypoxanthine)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸苷(thymidine)(HAT)的培養(yǎng)基敏感的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，多種骨髓瘤細(xì)胞系中的任一種都可用作融合配偶體，例如P3-NSl/l-Ag4-l、P3-x63-Ag8.653或Sp2/0-Agl4骨髓瘤細(xì)胞系。然后使用HAT培養(yǎng)基選擇通過(guò)融合得到的雜交瘤細(xì)胞，這種培養(yǎng)基會(huì)殺死未融合和無(wú)效融合的骨髓瘤細(xì)胞(未融合的脾細(xì)胞在孵育數(shù)天后死亡，因?yàn)槠錄](méi)有經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化)。然后可測(cè)定雜交瘤細(xì)胞所生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的&殘基處具有羧基末端的SNAP-25的α-SNAP-25單克隆抗體的存在。例如，在免疫沉淀測(cè)定、體外結(jié)合測(cè)定(例如放射免疫測(cè)定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA))或基于細(xì)胞的活性測(cè)定中，可以使用α-SNAP-25陽(yáng)性培養(yǎng)基來(lái)篩選雜交瘤上清液。這些技術(shù)和測(cè)定是本領(lǐng)域中已知的。參見(jiàn)例如，第11章，Immunoprecipitation，第421-470頁(yè)，Harlow和Lane，同上文，1998a；第12章，Immunoblotting,第471-510頁(yè)，Harlow與Lane，同上文，1998a；第14章，Immunoassays,第553-612頁(yè)，Harlow禾口Lane,同上文，1998a。然后可以進(jìn)行其它研究來(lái)確定這種抗體是否也對(duì)在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處沒(méi)有羧基末端的SNAP-25不具反應(yīng)性。α-SNAP-25單克隆抗體的結(jié)合親合力也可例如通過(guò)Scatchard分析法(Scatchardanalysis)來(lái)確定。參見(jiàn)例如，PeterJ.Munson禾口DavidRodbard,Ligand:AVersatileComputerizedApproachForCharacterizationofLigand-BindingSystems,107(1)Anal.Biochem.220-239(1980)。在鑒別出所需雜交瘤細(xì)胞后，使用限制性稀釋程序分離來(lái)源于單個(gè)細(xì)胞的克隆，直到獲得表達(dá)所需單克隆抗體的無(wú)性細(xì)胞系。選擇對(duì)在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25具有足夠選擇性且結(jié)合親合力足夠高的那些抗體進(jìn)行進(jìn)一步表征和研究。用于制備選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25的α-SNAP-25單克隆抗體的另一替代性方法是用SNAP-25肽篩選重組組合免疫球蛋白文庫(kù)(例如抗體噬菌體展示文庫(kù))，并分離免疫球蛋白文庫(kù)中結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1S基處具有羧基末端的SNAP-25的成員。用于產(chǎn)生和篩選噬菌體展示文庫(kù)的試劑盒可以商購(gòu)獲得，例如重組噬菌體抗體系統(tǒng)(RecombinantPhageAntibodySystem)(AmershamGEHealthcare,Piscataway,NJ)；和SurfZAP噬菌體展示試劑盒(Stratagene,LaJolla,CA)0此外，適用于產(chǎn)生和篩選抗體展示文庫(kù)的方法和試劑的實(shí)例可見(jiàn)于例如Ladner等，美國(guó)專利5，223，409；Borrebaeck等，美國(guó)專利5，712,089；Griffiths等，美國(guó)專利5，885，793；Griffiths等，美國(guó)專利5，962，255；McCafferty等，美國(guó)專禾Ij5，969，108；Griffiths等，美國(guó)專利6，010，884Jespers等，美國(guó)專利6，017，732；Borrebaeck等，美國(guó)專利6，027,930Johnson等，美國(guó)專利6，140,471；McCafferty等，美國(guó)專利6，172，197，各專利的全部?jī)?nèi)容據(jù)此以引用的方式并入本文。本公開的方面部分包括收集含有α-SNAP-25抗體或產(chǎn)生α-SNAP-25抗體的細(xì)胞的樣本。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“含有α-SNAP-25抗體或產(chǎn)生α-SNAP-25抗體的細(xì)胞的樣本”是指含有或可能含有至少一種選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體的任何生物物質(zhì)。預(yù)期本方法中可以使用可含有選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體的任何和所有樣本，包括但不限于，血液、血漿、血清和淋巴液。還預(yù)期本方法中可以使用能夠產(chǎn)生選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體的任何細(xì)胞，包括但不限于，⑶8細(xì)胞、CTL細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞和B細(xì)胞。多種眾所周知的方法可用于從個(gè)體收集含有α-SNAP-25抗體或產(chǎn)生α-SNAP-25抗體的細(xì)胞的樣本，參見(jiàn)例如，Harlow和Lane，同上文，1998a；以及Harlow和Lane，同上文，1998b。類似地，也可以使用多種眾所周知的方法處理樣本，以分離出選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體。可以根據(jù)欲分離的抗體的類型選擇用于收集樣本的程序。在非限制性實(shí)例中，當(dāng)分離選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25的α-SNAP-25多克隆抗體時(shí)，適合的樣本可以是含有此類α-SNAP-25抗體的血液樣本，而當(dāng)分離選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25的α-SNAP-25單克隆抗體時(shí)，適合的樣本可以是產(chǎn)生α-SNAP-25抗體的細(xì)胞，例如脾細(xì)胞或雜交瘤。本公開的方面部分包括從樣本中分離出選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1S基處具有羧基末端的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體。本領(lǐng)域中的技術(shù)人員眾所周知用于分離此類α-SNAP-25抗體的方法，這些抗體例如為選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25的α-SNAP-25多克隆抗體或選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25的α-SNAP-25單克隆抗體。參見(jiàn)例如，Harlow和Lane，同上文，1998a；以及Harlow和Lane，同上文，1998b。例如，可以利用眾所周知的技術(shù)(例如使用蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G的親和色譜法(該方法主要提供免疫血清中的IgG部分))從樣本中分離出此類α-SNAP-25多克隆抗體。隨后或可選地，可將特定SNAP-25抗原固定于柱或磁珠上，以通過(guò)免疫親和層法純化選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25的α-SNAP-25多克隆抗體?？赏ㄟ^(guò)例如蛋白質(zhì)A-瓊脂糖凝膠(kpharose)法、羥磷灰石色譜法、凝膠電泳法、透析法或親和色譜法等常規(guī)免疫球蛋白純化程序?qū)⑦x擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25的α-SNAP-25單克隆抗體從培養(yǎng)基或腹水液中分離。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生可選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25的α-SNAP-25抗體的方法包括以下步驟(a)對(duì)動(dòng)物施用SNAP-25免疫響應(yīng)誘導(dǎo)組合物，這種組合物包含具有連接到載體肽的羧基化C末端谷氨酰胺的SNAP-25抗原；(b)從動(dòng)物收集含有α-SNAP-25抗體或產(chǎn)生α-SNAP-25抗體的細(xì)胞的樣本；以及(c)從樣本中分離出α-SNAP-25抗體組分。在該實(shí)施方案的一方面，可選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25的α-SNAP-25抗體為多克隆抗體。在該實(shí)施方案的另一方面，可選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25的α-SNAP-25抗體為單克隆抗體。在該實(shí)施方案的又一方面，產(chǎn)生的可選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25的α-SNAP-25單克隆抗體為IgG亞型。在該實(shí)施方案的其它方面，SNAP-25免疫響應(yīng)誘導(dǎo)組合物還包含佐劑，例如聚乙二醇(PEG)、單甲氧基聚乙二醇(mPEG)或聚乙烯醇(PVA)。在另一實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生可選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25的α-SNAP-25抗體的方法包括以下步驟(a)對(duì)動(dòng)物施用SNAP-25免疫響應(yīng)誘導(dǎo)組合物，這種組合物包含具有連接到柔性連接子和載體肽的羧基化C末端谷氨酰胺的SNAP-25肽，其中柔性連接子插入SNAP-25肽與載體肽之間；(b)從動(dòng)物收集含有α-SNAP-25抗體或產(chǎn)生α-SNAP-25抗體的細(xì)胞的樣本；以及(c)從樣本中分離出α-SNAP-25抗體。在該實(shí)施方案的一方面，可選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1S基處具有羧基末端的SNAP-25的α-SNAP-25抗體為多克隆抗體。在該實(shí)施方案的另一方面，可選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25的α-SNAP-25抗體為單克隆抗體。在該實(shí)施方案的又一方面，產(chǎn)生的可選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25的α-SNAP-25單克隆抗體為IgG亞型。在該實(shí)施方案的其它方面，SNAP-25免疫響應(yīng)誘導(dǎo)組合物還包含佐劑，例如聚乙二醇(PEG)、單甲氧基聚乙二醇(mPEG)或聚乙烯醇(PVA)。本公開發(fā)明的方面部分包括分離的α-SNAP-25抗體，所述分離的α-SNAP-25抗體選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25表位。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”是指免疫系統(tǒng)對(duì)特定抗原起反應(yīng)而產(chǎn)生的特異性結(jié)合該抗原的分子，且其包括天然抗體和非天然抗體。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“分離的”是指利用人類的介入使分子脫離其天然環(huán)境。例如，抗體可以為多克隆抗體、單克隆抗體、二聚體、多聚體、多特異性抗體、人源化抗體、嵌合抗體、雙功能抗體、締合細(xì)胞的抗體(如Ig受體)、線性抗體、微型雙功能抗體(diabody)或微抗體，只要片段呈現(xiàn)所需的生物活性，還可以是這些抗體的單鏈衍生物?？贵w可以是包含Vh域和\域以及輕鏈恒定域(CJ和重鏈恒定域CH1、Ch2和Ch3的全長(zhǎng)免疫球蛋白分子，或全長(zhǎng)免疫球蛋白分子的免疫活性片段，例如Fab片段、F(ab')2片段、Fc片段、Fd片段、Fv片段?？贵w可源自于任何脊椎動(dòng)物物種(例如，人類、山羊、馬、驢、鼠類、大鼠、兔或雞)，且可以屬于任何類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、類另Ij(例如，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)或亞類(IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)。有關(guān)天然抗體、非天然抗體和其抗原性化合物結(jié)合片段的結(jié)構(gòu)的總的公開內(nèi)容，參見(jiàn)例如，PluckthuninThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,第113卷，Rosenburg禾口Moore編輯，Springer-Verlag,NewYork,第269-315頁(yè)(1994)；Borrabeck,AntibodyEngineering,第2版(OxfordUniversityPress1995)，各文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容據(jù)此以引用的方式并入本文。天然抗體常常是約150，000道爾頓的異四聚體糖蛋白，由兩個(gè)相同的輕(L)鏈和兩個(gè)相同的重(H)鏈構(gòu)成。每一輕鏈都借助一個(gè)共價(jià)二硫鍵連接到一個(gè)重鏈，但不同免疫球蛋白同種型的重鏈中二硫鍵的數(shù)量不同。每一重鏈和輕鏈還具有規(guī)則間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。每一重鏈的一端具有一個(gè)可變域(Vh)，隨后是多個(gè)恒定域。每一輕鏈的一端具有一個(gè)可變域(VJ，且在其另一端具有一個(gè)恒定域。輕鏈的恒定域與重鏈的第一個(gè)恒定域?qū)?zhǔn)，且輕鏈可變域與重鏈可變域?qū)?zhǔn)。據(jù)悉，特定的氨基酸殘基形成了輕鏈可變域與重鏈可變域之間的界面。完整的抗原識(shí)別和抗原結(jié)合位點(diǎn)包含在抗體可變域內(nèi)，即Fv片段。該片段包括由一個(gè)重鏈可變域(Vh)與一個(gè)輕鏈可變域緊密、非共價(jià)締合形成的二聚體。每一域包含由三個(gè)高變區(qū)連接的四個(gè)框架區(qū)(frameworkregion,FR)，主要采用β折疊構(gòu)型，三個(gè)高變區(qū)形成環(huán)連接，且在一些情況下形成β折疊結(jié)構(gòu)的一部分。每一高變區(qū)包含對(duì)應(yīng)于互補(bǔ)決定區(qū)(complementaritydeterminingregion,CDR)的氨基酸序列?？偟恼f(shuō)來(lái)，6個(gè)CDR區(qū)的三維構(gòu)型界定了Vh-Vl二聚體表面上的抗原結(jié)合位點(diǎn)，從而賦予抗原結(jié)合特異性°參見(jiàn)例如，CyrusChothia,等，ConformationsofImmunoglobulinHypervariableRegions,Nature342(6252):877-883(1989)；ElvinA.Kabatφ,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.(1991)，各文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容以引用的方式并入本文。抗體的恒定域不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但呈現(xiàn)各種效應(yīng)功能，例如抗體參與抗體依賴性細(xì)胞毒性過(guò)程。靶抗原一般具有一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，又稱表位，可由CDR形成的抗原結(jié)合位點(diǎn)識(shí)別。本文中使用的“表位”與“抗原決定簇”同義，意思指例如肽、多糖或含脂質(zhì)分子等靶抗原上能夠特異性結(jié)合免疫球蛋白或T細(xì)胞受體，或者以其它方式與分子相互作用的位點(diǎn)。特異性結(jié)合不同表位的每一抗體具有不同結(jié)構(gòu)。因此，一個(gè)抗原可具有一種以上的對(duì)應(yīng)抗體。多克隆抗體是指含有至少兩種能夠結(jié)合特定抗原的抗體的異質(zhì)抗體分子群。根據(jù)定義，多克隆抗體包括結(jié)合至少兩個(gè)不同表位的兩種不同的抗體。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”是指只含有一種能夠結(jié)合特定抗原的抗體的大致上均一的抗體分子群，即，包含所述群體的個(gè)體抗體除可能少量存在的天然突變外其余都相同。根據(jù)定義，單克隆抗體結(jié)合單一表位。單克隆抗體針對(duì)單一抗原位點(diǎn)具有高度特異性。此外，相比多克隆抗體，每一單克隆抗體都針對(duì)抗原上的單一決定簇。除特異性外，單克隆抗體的優(yōu)勢(shì)還在于，其合成不會(huì)受到其它抗體的污染。修飾語(yǔ)“單克隆的”表示從大致上均一的抗體群獲得的抗體的性質(zhì)，且不應(yīng)解釋為需要通過(guò)任何特定方法產(chǎn)生抗體。例如，根據(jù)本公開使用的單克隆抗體可通過(guò)雜交瘤方法(最先由Kohler等(197在Nature256:495中描述)制備；或者可通過(guò)重組DNA方法(參見(jiàn)例如，美國(guó)專利第4，816，567號(hào)；美國(guó)專利第5，807，715號(hào))制備。還可以使用例如Clackson等(1991)Nature,352:624-628和Marks等(1991)J.Mol.Biol.，222=581-597中所描述的技術(shù)從噬菌體抗體文庫(kù)中分離單克隆抗體。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，α-SNAP-25抗體包含重鏈可變域(Vh)和輕鏈可變域(Vl)，其選擇性結(jié)合在ΒοΝΤ/Α裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25。在該實(shí)施方案的一方面，重鏈可變域(Vh)為SEQIDNO:72、SEQIDNO:74、SEQIDNO:76、SEQIDNO80,SEQIDNO82或SEQIDN0:133。在該實(shí)施方案的另一方面，輕鏈可變域(Vl)為SEQIDNO:84、SEQIDNO:86、SEQIDNO:88、SEQIDNO90或SEQIDNO:92。在另一實(shí)施方案中，核酸序列編碼包含重鏈可變域(Vh)和輕鏈可變域(VJ且選擇性結(jié)合在ΒοΝΤ/Α裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25的α-SNAP-25抗體。在該實(shí)施方案的一方面，重鏈可變域(Vh)由核酸序列SEQIDNO:71,SEQIDNO:73、SEQIDNO75,SEQIDNO77,SEQIDNO79,SEQIDNO:81或SEQIDNO:132編碼。在該實(shí)施方案的另一方面，重鏈可變域(Vh)由與SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、SEQIDNO75、SEQIDNO:77、SEQIDNO:79、SEQIDNO81或SEQIDNO:132具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性的核酸序列編碼。在該實(shí)施方案的另一方面，輕鏈可變域由SEQIDNO83,SEQIDNO85,SEQIDNO:87、SEQIDNO:89或SEQIDNO:91編碼。在該實(shí)施方案的又一方面，輕鏈可變域(Vl)由與SEQIDNO83,SEQIDNO85、SEQIDNO87、SEQIDNO:89或SEQIDNO:91具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性的核酸序列編碼。在另一實(shí)施方案中，α-SNAP-25抗體包含重鏈可變域(Vh)的⑶Rl區(qū)、⑶R2區(qū)、CDR3區(qū)或其任何組合，該抗體選擇性結(jié)合在ΒοΝΤ/Α裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25。在該實(shí)施方案的一方面，重鏈可變域(Vh)的⑶Rl區(qū)為SEQIDNO:93、SEQIDNO:94、SEQIDNO:95、SEQIDNO:118、SEQIDNO:119或SEQIDNO:120。在該實(shí)施方案的另一方面，重鏈可變域(Vh)的CDR2區(qū)為SEQIDNO96、SEQIDNO:97、SEQIDNO:98,SEQIDNO:99、SEQIDNO:121、SEQIDNO:122或SEQIDN0:123。在該實(shí)施方案的又一方面，重鏈可變域(Vh)的CDR3區(qū)為SEQIDNO:100、SEQIDNO:101、SEQIDNO102、SEQIDN0:124、SEQIDNO:134或SEQIDNO:135。在另一實(shí)施方案中，α-SNAP-25抗體包含輕鏈可變域的⑶Rl區(qū)、⑶R2區(qū)、CDR3區(qū)或其任何組合，該抗體選擇性結(jié)合在ΒοΝΤ/Α裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25。在該實(shí)施方案的一方面，輕鏈可變域的⑶Rl區(qū)為SEQIDNO:103、SEQIDNO:104,SEQIDNO105,SEQIDNO106,SEQIDNO107,SEQIDNO125,SEQIDNO:126,SEQIDNO:127、SEQIDNO:128或SEQIDNO:129。在該實(shí)施方案的另一方面，輕鏈可變域(\)的CDR2區(qū)為SEQIDNO108、SEQIDNO109、SEQIDNO110、SEQIDNO111或SEQIDN0:112。在該實(shí)施方案的又一方面，輕鏈可變域(Vl)的⑶R3區(qū)為SEQIDNO:113,SEQIDNO114,SEQIDNO115,SEQIDNO:116或SEQIDN0:117。在另一實(shí)施方案中，α-SNAP-25抗體特異性結(jié)合表位，該表位包含在ΒοΝΤ/Α裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25。在該實(shí)施方案的一方面，表位包含SEQIDNO32,SEQIDNO:33、SEQIDNO34,SEQIDNO35,SEQIDNO36或SEQIDNO:37。在該實(shí)施方案的一方面，表位包含SEQIDNO39,SEQIDNO40、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO43或SEQIDNO:44。如上文所論述，存在于SNAP-25中的BoNT/A裂解位點(diǎn)周圍的序列表示為P5-P4-P3-P2-P1-P1IP/-P/-P/-P5，，其中P1-P1'表示易分裂鍵。在BoNT/A裂解后，由此產(chǎn)生的裂解產(chǎn)物包含包括P5-P4-P3-P2-P1序列的片段和包括P1'-P2'-P/-P4'-P5'的片段。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25的α-SNAP-25抗體”是指選擇性結(jié)合包含P5-P4-P3-P2-P1序列的任何SNAP-25裂解產(chǎn)物片段，但不結(jié)合包含P1'-P2'-P/-P4'-P5'序列的任何SNAP-25裂解產(chǎn)物片段或具有完整BoNT/A裂解位點(diǎn)的P1-P1'易分裂鍵的任何SNAP-25的α-SNAP-25抗體。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“α-SNAP-25197抗體”是指選擇性結(jié)合羧基末端P1殘基對(duì)應(yīng)于SEQIDNO5中的谷氨酰胺197的SNAP-25的抗體。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“α-SNAP-25204抗體”是指選擇性結(jié)合羧基末端P1殘基對(duì)應(yīng)于SEQIDNO16中的賴氨酸204的SNAP-25的抗體。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“選擇性”是指具有獨(dú)特作用或影響，或者只按一種方式或只與一種物質(zhì)反應(yīng)。當(dāng)用于抗體時(shí)，本文中使用的術(shù)語(yǔ)“選擇性結(jié)合”是指抗體與指定靶表位有差別地結(jié)合，以致抗體大致上不與非靶表位交叉反應(yīng)。本文中定義的肽表位的最小尺寸為約5個(gè)氨基酸，且肽表位通常包含至少5個(gè)、至少6個(gè)、至少7個(gè)、至少8個(gè)、至少9個(gè)、至少10個(gè)、至少15個(gè)或至少20個(gè)氨基酸。肽表位可以是非連續(xù)的，即，其包含的氨基酸殘基在肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)中不相鄰，但借助于肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)或四級(jí)結(jié)構(gòu)連在一起成為表位。此外，還應(yīng)注意，表位可能包含除氨基酸序列外的分子的一部分，例如碳水化合物部分、如脂蛋白或糖脂等脂質(zhì)部分，或如磷酸化氨基酸等經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的氨基酸部分。在該實(shí)施方案的方面，選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體可選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25表位，該表位包含至少5個(gè)、至少6個(gè)、至少7個(gè)、至少8個(gè)、至少9個(gè)、至少10個(gè)、至少15個(gè)或至少20個(gè)氨基酸。在該實(shí)施方案其它方面，選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體可選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25表位，該表位包含最多5個(gè)、最多6個(gè)、最多7個(gè)、最多8個(gè)、最多9個(gè)、最多10個(gè)、最多15個(gè)或最多20個(gè)氨基酸。選擇性結(jié)合包括例如結(jié)合親和力、結(jié)合特異性和結(jié)合親合力等結(jié)合特性。參見(jiàn)DavidJ.King，ApplicationsandEngineeringofMonoclonalAntibodies，第240頁(yè)(1998)。結(jié)合親和力是指抗體在其表位結(jié)合位點(diǎn)停留的時(shí)間長(zhǎng)度，并且可以視為抗體結(jié)合其表位的強(qiáng)度。結(jié)合親和力可以用抗體的平衡解離常數(shù)(dissociationconstant,KD)來(lái)描述，平衡解離常數(shù)定義為平衡時(shí)Kd/Ka的比。其中Ka是抗體的締合速率常數(shù)，kd是抗體的解離速率常數(shù)。結(jié)合親和力是由締合作用和解離作用一起決定，且僅有高締合作用或低解離作用都無(wú)法確保高親和力。締合速率常數(shù)(associationrateconstant，Ka)，或結(jié)合速率常數(shù)(on-rateconstant,Kon)是單位時(shí)間內(nèi)結(jié)合事件的數(shù)量，或抗體與抗原可逆締合形成其抗體-抗原復(fù)合物的傾向的量度。締合速率常數(shù)是以Μ—、—1為單位表示，且用符號(hào)表示如下[Ab]X[Ag]XKon。締合速率常數(shù)越大，則抗體與其抗原的結(jié)合就越快，或者抗體與抗原之間的結(jié)合親和力越高。解離速率常數(shù)(dissociationrateconstant,Kd)或分解速率常數(shù)(off-rateconstant,Koff)是單位時(shí)間內(nèi)解離事件的數(shù)量，或抗體-抗原復(fù)合物可逆分離(解離)成其組分分子(即抗體和抗原)的傾向的量度。解離速率常數(shù)是以s—1為單位表示，且用符號(hào)表示如下[Ab+Ag]XKofT。解離速率常數(shù)越小，抗體與其抗原的結(jié)合就越緊密，或者抗體與抗原之間的結(jié)合親和力越高。平衡解離常數(shù)(KD)是平衡時(shí)形成新抗體-抗原復(fù)合物的速率等于抗體-抗原復(fù)合物解離的速率的量度。平衡解離常數(shù)是以M為單位表示，且定義為Koff/Kon=[Ab]X[Ag]/[Ab+Ag]，其中[Ab]是抗體的摩爾濃度，[Ag]是抗原的摩爾濃度，且[Ab+Ag]是抗體-抗原復(fù)合物的摩爾濃度，其中所有濃度都是當(dāng)系統(tǒng)達(dá)到平衡時(shí)這些組分的濃度。平衡解離常數(shù)越小，則抗體與其抗原的結(jié)合就越緊密，或抗體與抗原之間的結(jié)合親和力越高。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體的結(jié)合親和力可具有例如小于IXIO5M-1S^小于IXIO6M4s—1、小于IXIOl1iT1或小于IXIO8M4iT1的締合速率常數(shù)。在另一實(shí)施方案中，選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體的結(jié)合親和力可具有例如大于1XIO5M.1s—1、大于1XΙΟΙ、—1、大于1XIO7M-1S-1或大于1XIO8M-1S-1的締合速率常數(shù)。在其它方面，選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體的結(jié)合親和力可具有介于1XIO5IT1S-1至1XIO8IT1S-1UXIOf5MY1至1XIO8IT1s人1XIO5IT1S-1至1XIO7IT1S-1或1XIO6M-1S-1至1XIO7M-1S-1之間的締合速率常數(shù)。在另一實(shí)施方案中，選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體的結(jié)合親和力可具有小于1X10_3S_\小于IXlO-4S-1或小于IXlO-5S-1的解離速率常數(shù)。在該實(shí)施方案的其它方面，選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體的結(jié)合親和力可具有例如小于1.OxΙΟΛΓ1、小于2.OxΙΟ、—1、小于3.OxΙΟ、—1、小于4.Oxl(T4s入小于5.Oxl(T4s人小于6.OxΙΟΛΓ1、小于7.OxΙΟΛΓ1、小于8.Ox或小于9.OxΙΟΛΓ1的解離速率常數(shù)。在另一實(shí)施方案中，選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體的結(jié)合親和力可具有例如大于1X10_3S_\大于1Χ10ΛΓ1或大于IXKT5iT1的解離速率常數(shù)。在該實(shí)施方案其它方面，選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體的結(jié)合親和力可具有例如大于1.OxΙΟ、-1、大于2.OxΙΟ、—1、大于3.Oxl(T4s入大于4.OxΙΟΛΓ1、大于5.ΟχΙΟΛΓ1、大于6.Oxl(T4s人大于7.Oxl(T4s入大于8.OxΙΟ、—1或大于9.OxΙΟΛΓ1的解離速率常數(shù)。在另一實(shí)施方案中，選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體的結(jié)合親和力可具有小于0.500nM的平衡解離常數(shù)。在該實(shí)施方案的方面，選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體的結(jié)合親和力可具有例如小于0.500nM、小于0.450nM、小于0.400nM、小于0.!350nM、小于0.300nM、小于0.250nM、小于0.200nM、小于0.150nM、小于0.IOOnM或小于0.050nM的平衡解離常數(shù)。在另一實(shí)施方案中，選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體的結(jié)合親和力可具有大于0.500nM的平衡解離常數(shù)。在該實(shí)施方案的方面，選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體的結(jié)合親和力可具有例如大于0.500nM、大于0.450nM、大于0.400nM、大于0.350nM、大于0.300nM、大于0.250nM、大于0.200nM、大于0.150nM、大于0.IOOnM或大于0.050nM的平衡解離常數(shù)。在另一實(shí)施方案中，選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體的結(jié)合親和力可具有例如小于1XIO0M"1s—1、小于IXIO1IT1s入小于IXIO2IT1s入小于IXIO3IT1S-1或小于IXlO4Ir1s1的針對(duì)完整SNAP-25的締合速率常數(shù)。在另一實(shí)施方案中，選擇性結(jié)合在ΒοΝΤ/Α裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體的結(jié)合親和力可具有例如最多1XΚΛ^Γ1、最多1X愈、-1、最多1XΙΟΙ、—1、最多1XIO3M-1S-1或最多1XIO4M^1s"1的針對(duì)完整SNAP-25的締合速率常數(shù)。結(jié)合特異性是抗體區(qū)分含其表位的分子與不含該表位的分子的能力。測(cè)量結(jié)合特異性的一種方式是將抗體對(duì)含其表位的分子的Kon締合速率與抗體對(duì)不含該表位的分子的Kon締合速率相比較。例如，比較α-SNAP-25抗體對(duì)在ΒοΝΤ/Α裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1S基處具有羧基末端的SNAP-25表位的締合速率常數(shù)(Ka)與對(duì)不包含該表位的SNAP-25(例如在ΒοΝΤ/Α裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處沒(méi)有羧基末端的SNAP-25表位或具有ΒοΝΤ/Α裂解位點(diǎn)的完整P1-P1'易分裂鍵的SNAP-25表位)的締合速率常數(shù)(Ka)。在該實(shí)施方案的方面，選擇性結(jié)合在ΒοΝΤ/Α裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體對(duì)不包含其表位的SNAP-25的締合速率常數(shù)(Ka)例如小于IXΚΛΓ、—1、小于IXIO1IT1s人小于IXIO2M-1S—1、小于1XIO3M-1S-1或小于IXIO4IT1S人在該實(shí)施方案的其它方面，選擇性結(jié)合在ΒοΝΤ/Α裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體對(duì)不包含其表位的SNAP-25締合速率常數(shù)(Ka)為例如最多1XIOciIT1s入最多1XIO1IT1s人最多1XIO2IT1S^最多1XIO3IT1S-1或最多1XIO4IT1s人在該實(shí)施方案的另一方面，選擇性結(jié)合在ΒοΝΤ/Α裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體對(duì)其表位的締合速率常數(shù)(Ka)是對(duì)不包含該表位的SNAP-25的Ka的例如至少2倍以上、至少3倍以上、至少4倍以上、至少5倍以上、至少6倍以上、至少7倍以上、至少8倍以上或至少9倍以上。在該實(shí)施方案的其它方面，選擇性結(jié)合在ΒοΝΤ/Α裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體對(duì)其表位的締合速率常數(shù)(Ka)是對(duì)不包含該表位的SNAP-25的Ka的例如至少10倍多、至少100倍多、至少1，000倍多或至少10，000倍多。在該實(shí)施方案的其它方面，選擇性結(jié)合在ΒοΝΤ/Α裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體對(duì)其表位的締合速率常數(shù)(Ka)是對(duì)不包含該表位的SNAP-25的Ka的例如最多1倍以上、最多2倍以上、最多3倍以上、最多4倍以上、最多5倍以上、最多6倍以上、最多7倍以上、最多8倍以上或最多9倍以上。在該實(shí)施方案的其它方面，選擇性結(jié)合在ΒοΝΤ/Α裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體對(duì)其表位的締合速率常數(shù)(Ka)是對(duì)不包含該表位的SNAP-25的Ka的例如最多10倍以上、最多100倍以上、最多1，000倍以上或最多10，000倍以上。選擇性結(jié)合在ΒοΝΤ/Α裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體的結(jié)合特異性也可以比率形式表征，致使此類α-SNAP-25抗體可區(qū)分其SNAP-25表位與不包含該表位的SNAP-25(例如在ΒοΝΤ/Α裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處沒(méi)有羧基末端的SNAP-25表位或具有ΒοΝΤ/Α裂解位點(diǎn)的完整P1-P1，易分裂鍵的SNAP-25表位)。在該實(shí)施方案的方面，選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體對(duì)其SNAP-25表位與對(duì)不包含該表位的SNAP-25的結(jié)合特異性比率為例如至少21、至少31、至少41、至少51、至少641、至少71、至少81、至少91、至少101、至少151、至少201、至少251、至少301、至少351或至少401。在該實(shí)施方案的其它方面，選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體對(duì)其SNAP-25表位與對(duì)在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處沒(méi)有羧基末端的SNAP-25的結(jié)合特異性比率為例如至少21、至少31、至少41、至少51、至少61、至少71、至少81、至少91、至少101、至少151、至少201、至少251、至少301、至少351或至少401。在該實(shí)施方案的其它方面，選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體對(duì)其SNAP-25表位與對(duì)具有BoNT/A裂解位點(diǎn)的完整P1-P1'易分裂鍵的SNAP-25的結(jié)合特異性比率為例如至少21、至少31、至少41、至少51、至少641、至少71、至少81、至少91、至少101、至少151、至少201、至少251、至少301、至少351或至少401。結(jié)合親合力，又稱功能性親和力，是指多價(jià)抗體與其抗原之間功能性結(jié)合強(qiáng)度的總和?？贵w分子可具有一個(gè)以上結(jié)合位點(diǎn)(例如，對(duì)于IgG是2個(gè)，對(duì)于IgM是10個(gè))，而且許多抗原含有一個(gè)以上抗原位點(diǎn)。盡管抗體的結(jié)合親合力取決于個(gè)體抗體結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合親和力，但由于所有抗體-抗原相互作用必須在抗體完全解離的同時(shí)破壞，故結(jié)合親合力大于結(jié)合親和力。預(yù)期選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體可選擇性結(jié)合該抗體的任何和所有表位。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，α-SNAP-25抗體為選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1S基處具有羧基末端的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體。在該實(shí)施方案的方面，α-SNAP-25抗體為選擇性結(jié)合具有羧基末端谷氨酰胺的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體，或選擇性結(jié)合具有羧基末端賴氨酸的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體。在該實(shí)施方案的其它方面，α-SNAP-25抗體為選擇性結(jié)合具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO5中的谷氨酰胺197的羧基末端P1殘基的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體，或選擇性結(jié)合具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO16中的賴氨酸204的羧基末端P1殘基的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體。在該實(shí)施方案的其它方面，α-SNAP-25抗體為選擇性結(jié)合具有SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、SEQIDNO45或SEQIDNO46的羧基末末端氨基酸序列的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體。本公開的方面部分包括用于檢測(cè)重靶向內(nèi)肽酶活性的基于免疫的方法。本說(shuō)明書中公開的基于免疫的方法可以通過(guò)幾個(gè)參數(shù)來(lái)評(píng)估，這些參數(shù)包括例如準(zhǔn)確度、精確度、檢測(cè)限(limitofdetection，L0D)、定量限(limitsofquantitation，L0Q)、范圍、特異性、選擇性、線性、重現(xiàn)性和系統(tǒng)適應(yīng)性。方法的準(zhǔn)確度是分析方法的正確性或測(cè)量值與作為公認(rèn)的常規(guī)真值或公認(rèn)參考值的值之間的一致接近度的量度。方法的精確度是當(dāng)對(duì)同種樣本的多次取樣試樣重復(fù)應(yīng)用本程序時(shí)個(gè)別測(cè)試結(jié)果之間的一致程度。因此，精確度將評(píng)估1)測(cè)定法內(nèi)可變性；2)日內(nèi)可變性(可重復(fù)性)；以及3)日間可變性(中間精確度)；和4)實(shí)驗(yàn)室間可變性(可再現(xiàn)性)。變異系數(shù)(CV%)是相對(duì)于觀察平均值或理論平均值所表達(dá)的精確度的定量度量。本說(shuō)明書中公開的基于免疫的方法須能夠在背景上檢測(cè)包含在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25的α-SNAP-25抗體-抗原復(fù)合物的存在。方法的檢測(cè)限(LOD)是指分析物產(chǎn)生與陰性對(duì)照物或空白明顯不同的信號(hào)的濃度，并且表示可與背景相區(qū)別的分析物的最低濃度。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本說(shuō)明書中公開的基于免疫的方法可檢測(cè)重靶向內(nèi)肽酶的L0D，其中重靶向內(nèi)肽酶的量明顯不同于陰性對(duì)照物或空白的量。在該實(shí)施方案的一方面，本說(shuō)明書中公開的基于免疫的方法的LOD為例如IOng或更少、9ng或更少、8ng或更少、7ng或更少、6ng或更少、5ng或更少、4ng或更少、3ng或更少、2ng或更少、Ing或更少的重靶向內(nèi)肽酶。在該實(shí)施方案的其它方面，本說(shuō)明書中公開的基于免疫的方法的LOD為例如900pg或更少、800pg或更少、700pg或更少、600pg或更少、500pg或更少、400pg或更少、300pg或更少、200pg或更少、IOOpg或更少的重靶向內(nèi)肽酶。在該實(shí)施方案的其它方面，本說(shuō)明書中公開的基于免疫的方法的LOD為例如90pg或更少、80pg或更少、70pg或更少、60pg或更少、50pg或更少、40pg或更少、30pg或更少、20pg或更少、IOpg或更少的重靶向內(nèi)肽酶。在該實(shí)施方案的其它方面，本說(shuō)明書中公開的基于免疫的方法的LOD為例如9pg或更少、8pg或更少、7pg或更少、6pg或更少、5pg或更少、4pg或更少、3pg或更少、2pg或更少、Ipg或更少的重靶向內(nèi)肽酶。在該實(shí)施方案的其它方面，本說(shuō)明書中公開的基于免疫的方法的LOD為例如0.9pg或更少、0.8pg或更少、0.7pg或更少、0.6pg或更少、0.5pg或更少、0.4pg或更少、0.3pg或更少、0.2pg或更少、0.Ipg或更少的重靶向內(nèi)肽酶。在該實(shí)施方案的另一方面，本說(shuō)明書中公開的基于免疫的方法的LOD為例如IOOnM或更少、90nM或更少、80nM或更少、70nM或更少、60nM或更少、50nM或更少、40nM或更少、30nM或更少、20nM或更少、IOnM或更少、9nM或更少、8nM或更少、7nM或更少、6nM或更少、5nM或更少、4nM或更少、3nM或更少、2nM或更少或InM或更少的重靶向內(nèi)肽酶。在該實(shí)施方案的其它方面，本說(shuō)明書中公開的基于免疫的方法的LOD為例如900pM或更少、SOOpM或更少、700pM或更少、600pM或更少、500pM或更少、400pM或更少、300pM或更少、200pM或更少或IOOpM或更少的重靶向內(nèi)肽酶。在該實(shí)施方案的其它方面，本說(shuō)明書中公開的基于免疫的方法的LOD為例如IOOpM或更少、90pM或更少、80pM或更少、70pM或更少、60pM或更少、50pM或更少、40pM或更少、30pM或更少、20pM或更少或IOpM或更少的重靶向內(nèi)肽酶。在該實(shí)施方案的其它方面，本說(shuō)明書中公開的基于免疫的方法的LOD為例如IOpM或更少的重靶向內(nèi)肽酶、9pM或更少、8pM或更少、7pM或更少、6pM或更少、5pM或更少、4pM或更少、3pM或更少、2pM或更少或IpM或更少的重靶向內(nèi)肽酶。定量限(LOQ)為可以可接受的準(zhǔn)確度和精確度水平測(cè)量的樣本或試樣中分析物的最低濃度和最高濃度。定量下限是指檢測(cè)方法始終能從背景中測(cè)量到的最低劑量。定量上限為在信號(hào)出現(xiàn)飽和前檢測(cè)方法始終能檢測(cè)到的最高濃度。方法的線性范圍為定量下限與定量上限之間的區(qū)域。線性范圍是通過(guò)用定量上限減去定量下限計(jì)算得到的。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“下漸近線的信噪比”是指本方法在檢測(cè)下限檢測(cè)到的信號(hào)與背景信號(hào)的比率。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“上漸近線的信噪比”是指本方法在檢測(cè)上限檢測(cè)到的信號(hào)與背景信號(hào)的比率。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本說(shuō)明書中公開的基于免疫的方法可檢測(cè)重靶向內(nèi)肽23酶的L0Q，其中重靶向內(nèi)肽酶的量明顯不同于陰性對(duì)照物或空白的量。在該實(shí)施方案的一方面，本說(shuō)明書中公開的基于免疫的方法的LOQ為例如IOng或更少、9ng或更少、8ng或更少、7ng或更少、6ng或更少、5ng或更少、4ng或更少、3ng或更少、2ng或更少、Ing或更少的重靶向內(nèi)肽酶。在該實(shí)施方案的其它方面，本說(shuō)明書中公開的基于免疫的方法的LOQ為例如900pg或更少、800pg或更少、700pg或更少、600pg或更少、500pg或更少、400pg或更少、300pg或更少、200pg或更少、IOOpg或更少的重靶向內(nèi)肽酶。在該實(shí)施方案的其它方面，本說(shuō)明書中公開的基于免疫的方法的LOQ為例如90pg或更少、80pg或更少、70pg或更少、60pg或更少、50pg或更少、40pg或更少、30pg或更少、20pg或更少、IOpg或更少的重靶向內(nèi)肽酶。在該實(shí)施方案的其它方面，本說(shuō)明書中公開的基于免疫的方法的LOQ為例如9pg或更少、8pg或更少、7pg或更少、6pg或更少、5pg或更少、4pg或更少、3pg或更少、2pg或更少、Ipg或更少的重靶向內(nèi)肽酶。在該實(shí)施方案的其它方面，本說(shuō)明書中公開的基于免疫的方法的LOQ為例如0.9pg或更少、0.8pg或更少、0.7pg或更少、0.6pg或更少、0.5pg或更少、0.4pg或更少、0.3pg或更少、0.2pg或更少、0.Ipg或更少的重靶向內(nèi)肽酶。在該實(shí)施方案的另一方面，本說(shuō)明書中公開的基于免疫的方法的LOQ為例如IOOnM或更少、90nM或更少、80nM或更少、70nM或更少、60nM或更少、50nM或更少、40nM或更少、30nM或更少、20nM或更少、IOnM或更少、9nM或更少、8nM或更少、7nM或更少、6nM或更少、5nM或更少、4nM或更少、3nM或更少、2nM或更少或InM或更少的重靶向內(nèi)肽酶。在該實(shí)施方案的其它方面，本說(shuō)明書中公開的基于免疫的方法的LOQ為例如900pM或更少、SOOpM或更少、700pM或更少、600pM或更少、500pM或更少、400pM或更少、300pM或更少、200pM或更少或IOOpM或更少的重靶向內(nèi)肽酶。在該實(shí)施方案的其它方面，本說(shuō)明書中公開的基于免疫的方法的LOQ為例如IOOpM或更少、90pM或更少、80pM或更少、70pM或更少、60pM或更少、50pM或更少、40pM或更少、30pM或更少、20pM或更少或IOpM或更少的重靶向內(nèi)肽酶。在該實(shí)施方案的其它方面，本說(shuō)明書中公開的基于免疫的方法的LOQ為例如IOpM或更少的重靶向內(nèi)肽酶、9pM或更少、8pM或更少、7pM或更少、6pM或更少、5pM或更少、4pM或更少、3pM或更少、2pM或更少或IpM或更少的重靶向內(nèi)肽酶。適用于所公開的方法的實(shí)踐方面的基于免疫的測(cè)定的精確度須不超過(guò)50%。在該實(shí)施方案的方面，基于免疫的測(cè)定的精確度不超過(guò)50%、不超過(guò)40%、不超過(guò)30%或不超過(guò)20%。在該實(shí)施方案的其它方面，基于免疫的測(cè)定的精確度不超過(guò)15%、不超過(guò)10%或不超過(guò)5%。在該實(shí)施方案的其它方面，基于免疫的測(cè)定的精確度不超過(guò)4%、不超過(guò)3%、不超過(guò)2%或不超過(guò)1%。適用于所公開的方法的實(shí)踐方面的基于免疫的測(cè)定的準(zhǔn)確度須為至少50%。在該實(shí)施方案的方面，基于免疫的測(cè)定的準(zhǔn)確度為至少50%、至少60%、至少70%或至少80%。在該實(shí)施方案的其它方面，基于免疫的測(cè)定的準(zhǔn)確度為至少85%、至少90%或至少95%。在該實(shí)施方案的其它方面，基于免疫的測(cè)定的準(zhǔn)確度為至少96%、至少97%、至少98%或至少99%。本說(shuō)明書中公開的基于免疫的方法須具有統(tǒng)計(jì)上顯著的下漸近線的信噪比以及統(tǒng)計(jì)上顯著的上漸近線的信噪比。在該實(shí)施方案的方面，本說(shuō)明書中公開的基于免疫的方法在下漸近線的信噪比為例如至少31、至少41、至少51、至少61、至少71、至少81、至少91、至少101、至少151或至少201。在該實(shí)施方案的其它方面，基于免疫的方法在上漸近線的信噪比為例如至少101、至少151、至少201、至少251、至少301、至少351、至少401、至少451、至少501、至少601、至少701、至少801、至少901或至少1001、至少1501、至少2001、至少2501、至少3001、至少；3501、至少4001、至少4501、至少5001、至少5501或至少6001。方法的特異性定義為這種方法排除其它相關(guān)組分(例如部分活性或無(wú)活性分析物)測(cè)量相關(guān)分析物的能力。方法的選擇性將描述分析方法區(qū)別樣本中各種物質(zhì)的能力。方法的線性是其引起直接或通過(guò)明確確定的數(shù)學(xué)變換與樣本中分析物的濃度成比例的結(jié)果的能力。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本說(shuō)明書中公開的基于免疫的方法可將具有完全活性的重靶向內(nèi)肽酶與活性是具有完全活性的重靶向內(nèi)肽酶的例如70%或更少、60%或更少、50%或更少、40%或更少、30%或更少、20%或更少或者10%或更少的具有部分活性的重靶向內(nèi)肽酶區(qū)分開來(lái)。方法的重現(xiàn)性為在正常(但可變化)的測(cè)試條件下由相同樣本得到的測(cè)試結(jié)果的可再現(xiàn)性。一種程序的穩(wěn)健性是其在方法參數(shù)較小但有意的變動(dòng)下仍保持不受影響的能力的量度，并且提供了其在正常使用中的可靠性的指示。因此，重現(xiàn)性評(píng)估不能避免的變化，而穩(wěn)健性則評(píng)估有意的變化。利用重現(xiàn)性和穩(wěn)健性評(píng)估的典型參數(shù)包括冷凍/解凍、孵育時(shí)間、孵育溫度、試劑使用期限、樣本制備、樣本儲(chǔ)存、細(xì)胞傳代數(shù)、重靶向內(nèi)肽酶批次、純化之間的變化性以及切口反應(yīng)之間的變化性的影響?；诩?xì)胞的測(cè)定的穩(wěn)健性參數(shù)包括細(xì)胞庫(kù)(冷凍開始、期間和結(jié)束)、細(xì)胞傳代水平、細(xì)胞接種密度、細(xì)胞儲(chǔ)備液密度(在培養(yǎng)液中孵育多少天)、燒瓶中的胞齡(等待接種的時(shí)間)、孵育時(shí)間、不同的板、過(guò)量血清和試劑來(lái)源。方法的系統(tǒng)適應(yīng)性是通過(guò)參照標(biāo)準(zhǔn)或參照分子的分析隨時(shí)間進(jìn)行的測(cè)定性能(包括試劑和儀器的性能)的測(cè)定，包括試劑和儀器的性能。系統(tǒng)適應(yīng)性在FDA指南中提到設(shè)備、電子儀器、測(cè)定性能和欲分析的樣本構(gòu)成完整系統(tǒng)的事實(shí)時(shí)強(qiáng)調(diào)過(guò)。系統(tǒng)適應(yīng)性可通過(guò)進(jìn)行平行測(cè)試來(lái)評(píng)估，平行測(cè)試是指，當(dāng)將對(duì)數(shù)劑量相對(duì)于響應(yīng)作圖時(shí)，參照物的連續(xù)稀釋與樣本的連續(xù)稀釋應(yīng)產(chǎn)生平行曲線。本公開的方面部分包括來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞”是指對(duì)重靶向內(nèi)肽酶的重靶向內(nèi)肽酶活性敏感的任何真核細(xì)胞，或可攝取重靶向內(nèi)肽酶的任何真核細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)細(xì)胞涵蓋來(lái)自多種生物體的細(xì)胞，例如鼠類、大鼠、豬、牛、馬、靈長(zhǎng)類動(dòng)物和人類的細(xì)胞；來(lái)自多種細(xì)胞類型的細(xì)胞，例如神經(jīng)元和非神經(jīng)元細(xì)胞；且這些細(xì)胞可從異質(zhì)細(xì)胞群、組織或生物體分離，或者作為異質(zhì)細(xì)胞群、組織或生物體的一部分。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“確立細(xì)胞系”與“永生細(xì)胞系”或“轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系”同義，且是指為由源自于某一生物體、組織或器官來(lái)源的細(xì)胞群的無(wú)限繁殖而選擇的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物。根據(jù)定義，確立細(xì)胞系不包括原代細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“原代細(xì)胞”是直接從新鮮組織或器官收獲的細(xì)胞，并且這些細(xì)胞沒(méi)有發(fā)生無(wú)限繁殖的潛能。確立細(xì)胞系可以包含異質(zhì)細(xì)胞群或均一細(xì)胞群。源自于單個(gè)細(xì)胞的確立細(xì)胞系稱為無(wú)性細(xì)胞系。確立細(xì)胞系可以是所含細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)使細(xì)胞經(jīng)歷整個(gè)細(xì)胞機(jī)制，由此使重靶向內(nèi)肽酶蛋白水解裂解SNAP-25底物所需的所有組分的細(xì)胞系，所述細(xì)胞機(jī)制涵蓋重靶向內(nèi)肽酶與其受體的結(jié)合、內(nèi)肽酶/受體復(fù)合物的內(nèi)化、重靶向內(nèi)肽酶輕鏈由細(xì)胞內(nèi)囊泡轉(zhuǎn)位到細(xì)胞質(zhì)中以及SNAP-25的蛋白水解裂解?；蛘?，確立細(xì)胞系可以是所含細(xì)胞從外源性來(lái)源引入至少一種使細(xì)胞經(jīng)歷整個(gè)細(xì)胞機(jī)制，由此使重靶向內(nèi)肽酶蛋白水解裂解SNAP-25底物所需的組分的細(xì)胞系，所述細(xì)胞機(jī)制涵蓋重靶向內(nèi)肽酶與其受體的結(jié)合、內(nèi)肽酶/受體復(fù)合物的內(nèi)化、重靶向內(nèi)肽酶輕鏈由細(xì)胞內(nèi)囊泡轉(zhuǎn)位到細(xì)胞質(zhì)中以及SNAP-25的蛋白水解裂解。確立細(xì)胞系又稱為遺傳工程改造的細(xì)胞系，來(lái)自此類確立細(xì)胞系的細(xì)胞可例如表達(dá)外源性重靶向內(nèi)肽酶，例如外源性O(shè)RLl、外源性DOR、外源性K0R、外源性M0R、外源性甘丙肽受體1、外源性甘丙肽受體2、外源性甘丙肽受體3或其任何組合。本公開的方面部分包括來(lái)自確立細(xì)胞系的對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性敏感的細(xì)胞。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性敏感的細(xì)胞”、“對(duì)重靶向內(nèi)肽酶的重靶向內(nèi)肽酶活性敏感的細(xì)胞”或“來(lái)自確立細(xì)胞系的對(duì)重靶向內(nèi)肽酶的重靶向內(nèi)肽酶活性敏感的細(xì)胞”是指可經(jīng)歷整個(gè)細(xì)胞機(jī)制，由此使重靶向內(nèi)肽酶蛋白水解裂解SNAP-25底物，從而抑制胞吐作用的細(xì)胞，所述細(xì)胞機(jī)制涵蓋重靶向內(nèi)肽酶與其受體的結(jié)合、內(nèi)肽酶/受體復(fù)合物的內(nèi)化、重靶向內(nèi)肽酶活性鏈由細(xì)胞內(nèi)囊泡轉(zhuǎn)位到細(xì)胞質(zhì)中以及SNAP-25的蛋白水解裂解。根據(jù)定義，對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性敏感的細(xì)胞必須表達(dá)，或被工程改造成表達(dá)至少一種重靶向內(nèi)肽酶受體和至少一種SNAP-25底物。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“可攝取重靶向內(nèi)肽酶的細(xì)胞”或“構(gòu)成確立細(xì)胞系的可攝取重靶向內(nèi)肽酶的細(xì)胞”是指可經(jīng)歷經(jīng)歷整個(gè)細(xì)胞機(jī)制，由此使重靶向內(nèi)肽酶蛋白水解裂解SNAP-25底物，從而抑制胞吐作用的細(xì)胞，所述細(xì)胞機(jī)制涵蓋靶向內(nèi)肽酶與其受體的結(jié)合、內(nèi)肽酶/受體復(fù)合物的內(nèi)化、重靶向內(nèi)肽酶輕鏈由細(xì)胞內(nèi)囊泡轉(zhuǎn)位到細(xì)胞質(zhì)中以及SNAP-25的蛋白水解裂解。根據(jù)定義，可攝取重靶向內(nèi)肽酶的細(xì)胞必須表達(dá)，或被工程改造成表達(dá)至少一種重靶向內(nèi)肽酶受體和至少一種SNAP-25底物。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性敏感。在該實(shí)施方案的方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞對(duì)例如約IOOnM或更少、約90nM或更少、約80nM或更少、約70nM或更少、約60nM或更少、約50nM或更少、約40nM或更少、約30nM或更少、約20nM或更少、約IOnM或更少的重靶向內(nèi)肽酶的重靶向內(nèi)肽酶活性敏感。在其它方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞對(duì)例如約9nM或更少、約8nM或更少、約7nM或更少、約6nM或更少、約5nM或更少、約4nM或更少、約3nM或更少、約2nM或更少或者約InM或更少的重靶向內(nèi)肽酶的重靶向內(nèi)肽酶活性敏感。在其它方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞對(duì)例如約0.9nM或更少、約0.8nM或更少、約0.7nM或更少、約0.6nM或更少、約0.5nM或更少、約0.4nM或更少、約0.3nM或更少、約0.2nM或者約0.InM或更少的重靶向內(nèi)肽酶的重靶向內(nèi)肽酶活性敏感。當(dāng)定量指定項(xiàng)目、數(shù)字、百分比或術(shù)語(yǔ)的值時(shí)，本文中使用的術(shù)語(yǔ)“約”是指該指定項(xiàng)目、百分比、參數(shù)或術(shù)語(yǔ)的值士10%的范圍。在另一實(shí)施方案中，構(gòu)成確立細(xì)胞系的細(xì)胞可攝取重靶向內(nèi)肽酶。在該實(shí)施方案的方面，構(gòu)成確立細(xì)胞系的細(xì)胞可攝取例如約IOOnM或更少、約90nM或更少、約80nM或更少、約70nM或更少、約60nM或更少、約50nM或更少、約40nM或更少、約30nM或更少、約20nM或更少、約IOnM或更少的重靶向內(nèi)肽酶。在其它方面，構(gòu)成確立細(xì)胞系的細(xì)胞能夠攝取約9nM或更少、約8nM或更少、約7nM或更少、約6nM或更少、約5nM或更少、約4nM或更少、約3nM或更少、約2nM或更少或者約InM或更少的重靶向內(nèi)肽酶。在其它方面，構(gòu)成確立細(xì)胞系的細(xì)胞能夠攝取約0.9nM或更少、約0.8nM或更少、約0.7nM或更少、約0.6nM或更少、約0.5nM或更少、約0.4nM或更少、約0.3nM或更少、約0.2nM或更少或者約0.InM或更少的重靶向內(nèi)肽酶。本公開的方面部分包括來(lái)自確立細(xì)胞系的對(duì)本說(shuō)明書中公開的重靶向內(nèi)肽酶呈現(xiàn)選擇性結(jié)合的細(xì)胞。當(dāng)提到重靶向內(nèi)肽酶時(shí)，本文中使用的術(shù)語(yǔ)“選擇性結(jié)合”是指重靶向內(nèi)肽酶與指定靶受體有差別地結(jié)合，以致重靶向內(nèi)肽酶大致上不結(jié)合非靶受體。來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞對(duì)重靶向內(nèi)肽酶呈現(xiàn)選擇性結(jié)合的程度可通過(guò)這些細(xì)胞對(duì)不含重靶向內(nèi)肽酶的靶向域的分子呈現(xiàn)非選擇性攝取的程度來(lái)測(cè)量。評(píng)估對(duì)不含重靶向內(nèi)肽酶的靶向域的分子的非選擇性攝取的一種方式是測(cè)量LHn片段的非選擇性攝取。LHn片段是包含梭菌毒素轉(zhuǎn)位域和梭菌毒素酶域，但完全缺乏任何靶向域的片段。LHn片段的非限制性實(shí)例包括LHn/A片段、LHn/B片段、LHn/C片段、LHn/D片段、LHn/E片段、LHn/F片段和LHn/G片段。示例性LHn/A片段為SEQIDNO146，該序列由多核苷酸分子SEQIDNO:147編碼。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞對(duì)重靶向內(nèi)肽酶呈現(xiàn)選擇性結(jié)合。在該實(shí)施方案的方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞對(duì)表現(xiàn)出活性為例如活性是所測(cè)定的總活性的至少75%、所測(cè)定的總活性的至少80%、所測(cè)定的總活性的至少85%、所測(cè)定總活性的至少90%或所測(cè)定的總活性的至少95%的重靶向內(nèi)肽酶呈現(xiàn)選擇性結(jié)合。在該實(shí)施方案的其它方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞對(duì)表現(xiàn)出活性為例如所測(cè)定的總活性的約75%到約100%、所測(cè)定的總活性的約80%到約100%、所測(cè)定的總活性的約85%到約100%、所測(cè)定的總活性的約90%到約100%的重靶向內(nèi)肽酶呈現(xiàn)選擇性結(jié)合。在另一實(shí)施方案中，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞呈現(xiàn)最少的對(duì)LHn片段的非選擇性攝取。在該實(shí)施方案的方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞呈現(xiàn)的對(duì)LHn片段的非選擇性攝取量為例如所測(cè)量的總攝取量的最多25%、所測(cè)量的總攝取量的最多20%、所測(cè)量的總攝取量的最多15%、所測(cè)量的總攝取量的最多10%或所測(cè)量的總攝取量的最多5%。在該實(shí)施方案的其它方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞呈現(xiàn)的對(duì)LHn片段的非選擇性攝取量為例如所測(cè)量的總攝取量的約0%到約25%、所測(cè)量的總攝取量的約0%到約20%、所測(cè)量的總攝取量的約0%到約15%、所測(cè)量的總攝取量的約0%到約10%或所測(cè)量的總攝取量的約0%到約5%。在另一實(shí)施方案中，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞呈現(xiàn)最少的對(duì)LHN/A片段的非選擇性攝取。在該實(shí)施方案的方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞呈現(xiàn)的對(duì)LHn/A片段的非選擇性攝取量為例如所測(cè)量的總攝取量的最多25%、所測(cè)量的總攝取量的最多20%、所測(cè)量的總攝取量的最多15%、所測(cè)量的總攝取量的最多10%或所測(cè)量的總攝取量的最多5%。在該實(shí)施方案的其它方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞呈現(xiàn)的對(duì)LHn/A片段的非選擇性攝取量為例如所測(cè)量的總攝取量的約0%到約25%、所測(cè)量的總攝取量的約0%到約20%、所測(cè)量的總攝取量的約0%到約15%、所測(cè)量的總攝取量的約0%到約10%或所測(cè)量的總攝取量的約0%到約5%。本公開的方面部分包括來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞，這些細(xì)胞在質(zhì)膜上呈現(xiàn)足量的受體結(jié)合位點(diǎn)，以賦予對(duì)重靶向內(nèi)肽酶的敏感性和選擇性結(jié)合。平衡飽和結(jié)合測(cè)定將測(cè)量各種濃度的配體的總的非特異性結(jié)合。針對(duì)配體的平衡解離常數(shù)(Kd)以及受體結(jié)合位點(diǎn)的最大數(shù)量Bmax可以使用非線性回歸分析由特異性結(jié)合計(jì)算得到。特異性結(jié)合是通過(guò)用觀察到的總結(jié)合減去配體的非特異性結(jié)合計(jì)算。Kd為達(dá)到半數(shù)最大結(jié)合所需的配體濃度，并且是以摩爾濃度來(lái)度量。Bmax為質(zhì)膜上存在的結(jié)合位點(diǎn)的最大數(shù)量，并且是以pmol/mg、pmol/細(xì)胞、fmol/細(xì)胞或位點(diǎn)/細(xì)胞來(lái)度量。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞在質(zhì)膜上呈現(xiàn)足量的受體結(jié)合位點(diǎn)，以賦予對(duì)重靶向內(nèi)肽酶的敏感性和選擇性結(jié)合。在該實(shí)施方案的方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞針對(duì)重靶向內(nèi)肽酶的靶向配體呈現(xiàn)出的Bmax值為例如至少0.Ifmol/細(xì)胞、至少0.2fmol/細(xì)胞、至少0.3fmol/細(xì)胞、至少0.4fmol/細(xì)胞、至少0.5fmol/細(xì)胞、至少0.6fmol/細(xì)胞、至少0.7fmol/細(xì)胞、至少0.8fmol/細(xì)胞、至少0.9fmol/細(xì)胞或至少l.Ofmol/細(xì)胞。在該實(shí)施方案的其它方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞針對(duì)重靶向內(nèi)肽酶的靶向配體呈現(xiàn)出的^iiax值為例如至少lfmol/細(xì)胞、至少2fmol/細(xì)胞、至少3fmol/細(xì)胞、至少4fmol/細(xì)胞、至少5fmol/細(xì)胞、至少6fmol/細(xì)胞、至少7fmol/細(xì)胞、至少8fmol/細(xì)胞、至少9fmol/細(xì)胞或至少IOfmol/細(xì)胞。本公開的方面部分包括來(lái)自確立無(wú)性細(xì)胞系的對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性敏感的細(xì)胞，這些細(xì)胞比來(lái)自衍生無(wú)性細(xì)胞系的親本細(xì)胞系的細(xì)胞穩(wěn)定。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定的”是指來(lái)自確立無(wú)性細(xì)胞系的細(xì)胞經(jīng)過(guò)特定傳代數(shù)所呈現(xiàn)的針對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性的相對(duì)EC5tl、敏感性、功效、明確界定的上漸近線和/或明確界定的劑量-響應(yīng)曲線類似于來(lái)自衍生無(wú)性細(xì)胞系的親本細(xì)胞系的細(xì)胞經(jīng)過(guò)相同或類似傳代數(shù)所呈現(xiàn)的相對(duì)EC5tl、敏感性、功效、明確界定的上漸近線和/或明確界定的劑量-響應(yīng)曲線值，其中兩種測(cè)定中使用相同的測(cè)定條件和相同的重靶向內(nèi)肽酶。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，來(lái)自確立無(wú)性細(xì)胞系的細(xì)胞比來(lái)自衍生無(wú)性細(xì)胞系的親本細(xì)胞系的細(xì)胞穩(wěn)定。在該實(shí)施方案的一方面，來(lái)自確立無(wú)性細(xì)胞系的細(xì)胞比親本SK-N-DZ細(xì)胞系穩(wěn)定。在該實(shí)施方案的另一方面，來(lái)自確立無(wú)性細(xì)胞系的細(xì)胞比親本SK-N-DZ細(xì)胞系A(chǔ)TCCCRL-2149穩(wěn)定。在該實(shí)施方案的其它方面，來(lái)自確立無(wú)性細(xì)胞系的細(xì)胞經(jīng)過(guò)例如至少5次以上傳代、至少10次以上傳代、至少15次以上傳代、至少20次以上傳代、至少25次以上傳代或至少30次以上傳代比來(lái)自獲得無(wú)性細(xì)胞系的親本細(xì)胞系的細(xì)胞穩(wěn)定。在該實(shí)施方案的其它方面，來(lái)自確立無(wú)性細(xì)胞系的細(xì)胞經(jīng)過(guò)例如至少5次以上傳代、至少10次以上傳代、至少15次以上傳代、至少20次以上傳代、至少25次以上傳代或至少30次以上傳代比來(lái)自衍生無(wú)性細(xì)胞系的親本細(xì)胞系的細(xì)胞穩(wěn)定。本公開的方面部分包括來(lái)自確立無(wú)性細(xì)胞系的對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性敏感的細(xì)胞，這些細(xì)胞經(jīng)過(guò)多次細(xì)胞傳代仍保持穩(wěn)定。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定”是指來(lái)自確立無(wú)性細(xì)胞系的細(xì)胞經(jīng)過(guò)特定傳代數(shù)所呈現(xiàn)的針對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性的相對(duì)EC5tl、敏感性、功效、明確界定的上漸近線和/或明確界定的劑量-響應(yīng)曲線類似于來(lái)自一次或多次傳代前的同一種確立無(wú)性細(xì)胞系的細(xì)胞所呈現(xiàn)的相對(duì)EC5tl、敏感性、功效、明確界定的上漸近線和/或明確界定的劑量-響應(yīng)曲線值，其中，兩種測(cè)定中使用相同的測(cè)定條件和相同的重靶向內(nèi)肽酶。本說(shuō)明書中公開的來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞經(jīng)過(guò)多次細(xì)胞傳代可對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性呈現(xiàn)一致的敏感性。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性的敏感性”是指測(cè)定中能始終測(cè)量到高于由未處理的對(duì)照檢測(cè)的信號(hào)或背景信號(hào)的最低劑量。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)過(guò)任一指定傳代數(shù)，來(lái)自確立無(wú)性細(xì)胞系的細(xì)胞對(duì)例如IOOnM或更少、約80nM或更少、約70nM或更少、約60nM或更少、約50nM或更少、約40nM或更少、約30nM或更少、約20nM或更少、約IOnM或更少、約InM或更少、約0.9nM或更少、約0.8nM或更少、約0.7nM或更少、約0.6nM或更少、約0.5nM或更少、約0.4nM或更少、約0.3nM或更少、約0.2nM或更少或者約0.InM或更少的重靶向內(nèi)肽酶的重靶向內(nèi)肽酶活性呈現(xiàn)敏感性。在該實(shí)施方案的方面，經(jīng)過(guò)任一指定傳代數(shù)，來(lái)自確立無(wú)性細(xì)胞系的細(xì)胞對(duì)例如約0.OlnM到約ΙΟΟηΜ、約0.OlnM到約75nM、約0.OlnM到約50nM、約0.OlnM到約25nM、約0.OlnM到約20nM、約0.OlnM到約15nM、約0.OlnM到約ΙΟηΜ、約0.OlnM到約5nM、約0.OOlnM到約ΙΟΟηΜ、約0.OOlnM到約75nM、約0.OOlnM到約50nM、約0.OOlnM到約25nM、約0.OOlnM到約20nM、約0.OOlnM到約15nM、約0.OOlnM到約IOnM或者約0.OOlnM到約5nM的重靶向內(nèi)肽酶的重靶向內(nèi)肽酶活性呈現(xiàn)敏感性。在另一實(shí)施方案中，經(jīng)過(guò)例如5次或多次細(xì)胞傳代、10次或多次細(xì)胞傳代、15次或多次細(xì)胞傳代、20次或多次細(xì)胞傳代、25次或多次細(xì)胞傳代、30次或多次細(xì)胞傳代、35次或多次細(xì)胞傳代、40次或多次細(xì)胞傳代、45次或多次細(xì)胞傳代或者50次或多次細(xì)胞傳代，來(lái)自確立無(wú)性細(xì)胞系的細(xì)胞對(duì)約IOOnM或更少、約75nM或更少、約50nM或更少、約25nM或更少、小于約20nM或更少、約15nM或更少、約IOnM或更少或約InM或更少的重靶向內(nèi)肽酶活性呈現(xiàn)敏感性。在該實(shí)施方案的其它方面，經(jīng)過(guò)例如約15到約60次傳代、約20到約60次傳代、約25到約60次傳代、約30到約60次傳代、約35到約60次傳代、約40到約60次傳代、約45到約60次傳代、約50到約60次傳代、約15到約50次傳代、約20到約50次傳代、約25到約50次傳代、約30到約50次傳代、約35到約50次傳代、約40到約50次傳代、約15到約40次傳代、約20到約40次傳代、約25到約40次傳代或約30到約40次傳代，來(lái)自確立無(wú)性細(xì)胞系的細(xì)胞對(duì)約IOOnM或更少、約75nM或更少、約50nM或更少、約25nM或更少、小于約20nM或更少、約15nM或更少、約IOnM或更少或者約InM或更少的重靶向內(nèi)肽活性呈現(xiàn)敏感性。本說(shuō)明書中公開的來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞經(jīng)過(guò)多次細(xì)胞傳代可對(duì)重靶向內(nèi)肽酶攝取或重靶向內(nèi)肽酶活性呈現(xiàn)一致的相對(duì)功效。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“相對(duì)功效”是指在執(zhí)行本測(cè)定時(shí)檢測(cè)到的重靶向內(nèi)肽酶活性的上漸近線與在該測(cè)定中利用參照標(biāo)準(zhǔn)、參照分子或參照傳代數(shù)檢測(cè)到的重靶向內(nèi)肽酶活性的上漸近線的對(duì)比程度。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“上漸近線的信噪比”是指在測(cè)定中于檢測(cè)上限檢測(cè)到的信號(hào)與由未處理的對(duì)照檢測(cè)的信號(hào)或背景信號(hào)的比率。檢測(cè)上限是在信號(hào)出現(xiàn)飽和前測(cè)定始終能測(cè)量到的最大劑量。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本說(shuō)明書中公開的來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞經(jīng)過(guò)多次細(xì)胞傳代可呈現(xiàn)明確界定的上漸近線，并在測(cè)定中保持一致且適宜的信噪比。在該實(shí)施方案的方面，經(jīng)過(guò)例如5次或多次細(xì)胞傳代、10次或多次細(xì)胞傳代、15次或多次細(xì)胞傳代、20次或多次細(xì)胞傳代、25次或多次細(xì)胞傳代、30次或多次細(xì)胞傳代、35次或多次細(xì)胞傳代、40次或多次細(xì)胞傳代、45次或多次細(xì)胞傳代或者50次或多次細(xì)胞傳代，本說(shuō)明書中公開的來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞針對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性的上漸近線的明確界定的信噪比須為例如至少31、至少41、至少51、至少61、至少71、至少81、至少91、至少101、至少151、至少201、至少251、至少301、至少351、至少401、至少451、至少501、至少601、至少701、至少801、至少901或至少1001、至少1501、至少2001、至少2501、至少3001、至少；3501、至少4001、至少4501、至少5001、至少5501或至少6001。在該實(shí)施方案的其它方面，經(jīng)過(guò)例如約15到約60次傳代、約20到約60次傳代、約25到約60次傳代、約30到約60次傳代、約35到約60次傳代、約40到約60次傳代、約45到約60次傳代、約50到約60次傳代、約15到約50次傳代、約20到約50次傳代、約25到約50次傳代、約30到約50次傳代、約35到約50次傳代、約40到約50次傳代、約15到約40次傳代、約20到約40次傳代、約25到約40次傳代或約30到約40次傳代，本說(shuō)明書中公開的來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞針對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性的上漸近線的明確界定的信噪比須為例如至少31、至少41、至少51、至少61、至少71、至少81、至少91、至少101、至少151、至少201、至少251、至少301、至少351、至少401、至少451、至少501、至少601、至少701、至少801、至少901或至少1001、至少1501、至少2001、至少2501、至少3001、至少；3501、至少4001、至少4501、至少5001、至少5501或至少6001。本說(shuō)明書中公開的來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞經(jīng)過(guò)多次細(xì)胞傳代可針對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性呈現(xiàn)明確界定的劑量-響應(yīng)曲線。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“劑量-響應(yīng)曲線”是指原始數(shù)據(jù)與所選用于本測(cè)定的統(tǒng)計(jì)模型的擬合程度。在非限制性實(shí)例中，利用四參數(shù)邏輯斯蒂擬合法(fourparameterlogisticsfit)得到的S形曲線是用于例如效力測(cè)定等酶促活性測(cè)定的劑量-響應(yīng)曲線。在另一非限制性實(shí)例中，利用單位點(diǎn)飽和擬合(onesitesaturationfit)的配體結(jié)合是配體/抗體結(jié)合測(cè)定的劑量-響應(yīng)曲線。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本說(shuō)明書中公開的來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞經(jīng)過(guò)多次細(xì)胞傳代仍針對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性呈現(xiàn)明確界定的劑量-響應(yīng)曲線。在該實(shí)施方案的方面，經(jīng)過(guò)例如5次或多次細(xì)胞傳代、10次或多次細(xì)胞傳代、15次或多次細(xì)胞傳代、20次或多次細(xì)胞傳代、25次或多次細(xì)胞傳代、30次或多次細(xì)胞傳代、35次或多次細(xì)胞傳代、40次或多次細(xì)胞傳代、45次或多次細(xì)胞傳代或者50次或多次細(xì)胞傳代，本說(shuō)明書中公開的來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性仍呈現(xiàn)明確界定的劑量-響應(yīng)曲線。在該實(shí)施方案的其它方面，經(jīng)過(guò)例如約15到約60次傳代、約20到約60次傳代、約25到約60次傳代、約30到約60次傳代、約35到約60次傳代、約40到約60次傳代、約45到約60次傳代、約50到約60次傳代、約15到約50次傳代、約20到約50次傳代、約25到約50次傳代、約30到約50次傳代、約35到約50次傳代、約40到約50次傳代、約15到約40次傳代、約20到約40次傳代、約25到約40次傳代或約30到約40次傳代，本說(shuō)明書中公開的來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性仍呈現(xiàn)明確界定的劑量-響應(yīng)曲線。本說(shuō)明書中公開的來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞經(jīng)過(guò)多次細(xì)胞傳代可對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性呈現(xiàn)一致的相對(duì)EC5tl值。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“相對(duì)EC5tl”或“相對(duì)EC5tl值”是指針對(duì)經(jīng)過(guò)計(jì)算的本測(cè)定中所用的參照標(biāo)準(zhǔn)、參照分子或參照傳代數(shù)的EC5tl而歸一化的重靶向內(nèi)肽酶活性的EC5tl值。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，來(lái)自確立無(wú)性細(xì)胞系的細(xì)胞經(jīng)過(guò)多次細(xì)胞傳代仍對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性呈現(xiàn)一致的相對(duì)EC5tl值。在該實(shí)施方案的方面，經(jīng)過(guò)例如5次或多次細(xì)胞傳代、10次或多次細(xì)胞傳代、15次或多次細(xì)胞傳代、20次或多次細(xì)胞傳代、25次或多次細(xì)胞傳代、30次或多次細(xì)胞傳代、35次或多次細(xì)胞傳代、40次或多次細(xì)胞傳代、45次或多次細(xì)胞傳代或者50次或多次細(xì)胞傳代，來(lái)自確立無(wú)性細(xì)胞系的細(xì)胞對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性呈現(xiàn)一致的相對(duì)EC5tl值，即例如為針對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性的相對(duì)EC5tl值的約士10%、約士20%、約士30%、約士40%、約士50%、約士60%、約士70%或約士75%。在該實(shí)施方案的其它方面，經(jīng)過(guò)例如5次或多次細(xì)胞傳代、10次或多次細(xì)胞傳代、15次或多次細(xì)胞傳代、20次或多次細(xì)胞傳代、25次或多次細(xì)胞傳代、30次或多次細(xì)胞傳代、35次或多次細(xì)胞傳代、40次或多次細(xì)胞傳代、45次或多次細(xì)胞傳代或者50次或多次細(xì)胞傳代，來(lái)自確立無(wú)性細(xì)胞系的細(xì)胞對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性呈現(xiàn)的相對(duì)EC5tl值是針對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性的相對(duì)EC5tl值的例如約士10%到約75%、約士10%到約70%、約士10%到約60%、約士10%到約50%、約士10%到約40%、約士10%到約30%或者士10%到約20%。本發(fā)明的方面部分包括重靶向內(nèi)肽酶。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“重靶向內(nèi)肽酶”與“靶向囊泡胞吐調(diào)節(jié)蛋白”或者“TVEMP”同義。重靶向內(nèi)肽酶的非限制性實(shí)例公開于例如以下文獻(xiàn)中KeithA.Foster等，ClostridialToxinDerivativesAbleToModifyPeripheralSensoryAfferentFunctions,美國(guó)專利5，989，545;CliffordC.Shone等，RecombinantToxinFragments,美國(guó)專利6，461，617;ConradP.Quinn等，MethodsandCompoundsfortheTreatmentofMucusHypersecretion,美國(guó)專利6，632，440;LanceΕ.Steward等，MethodsAndCompositionsForTheTreatmentOfPancreatitis,美國(guó)專禾ll6,843,998；StephanDonovan,ClostridialToxinDerivativesandMethodsForTreatingPain，美國(guó)專利公布2002/0037833;KeithA.Foster等，InhibitionofSecretionfromNon-neuralCells,美國(guó)專利公布2003/0180289;J.OliverDollyφ,ActivatableRecombinantNeurotoxins,WO2001/014570；KeithA.Fosterφ,Re-targetedToxinConjugates，國(guó)際專利公布WO2005/023309；LanceΕ.Stewardφ,MultivalentClostridialToxinDerivativesandMethodsofTheirUse,美國(guó)專利申請(qǐng)第11/376，696號(hào)；Steward,L.Ε·等，ModifiedClostridialToxinswithEnhancedTranslocationCapabilitiesandAlteredTargetingActivityForNon-ClostridialToxinTargetCells,美國(guó)專利申請(qǐng)第11/776，075號(hào)；Dolly,J.0.等，ActivatableClostridialToxins,美國(guó)專利申請(qǐng)第11/829,475號(hào)；Foster，K.Α·等，F(xiàn)usionProteins，國(guó)際專利公布WO2006/059093；以及Foster，K.Α.等，Non-CytotoxicProteinConjugates,國(guó)際專利公布WO2006/059105，各專利的全部?jī)?nèi)容以引用的方式并入本文。重靶向內(nèi)肽酶的非限制性實(shí)例包括SEQIDNO=USEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:130和SEQIDNO:131。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所檢測(cè)的重靶向內(nèi)肽酶活性來(lái)自重靶向內(nèi)肽酶。在該實(shí)施方案的方面，所檢測(cè)的重靶向內(nèi)肽酶活性是來(lái)自以下文獻(xiàn)中公開的重靶向內(nèi)肽酶=KeithA.Foster等，ClostridialToxinDerivativesAbleToModifyPeripheralSensoryAfferentFunctions，美國(guó)專利5，989，545；CliffordC.Shone等，RecombinantToxinFragments，美國(guó)專利6，461，617；ConradP.Quinn等，MethodsandCompoundsfortheTreatmentofMucusHypersecretion，美國(guó)專利6，632，440;LanceΕ·Steward等，MethodsAndCompositionsForTheTreatmentOfPancreatitis，美國(guó)專利6，843，998;StephanDonovan,ClostridialToxinDerivativesandMethodsForTreatingPain，美國(guó)專利公布2002/0037833;KeithA.Foster等，InhibitionofSecretionfromNon-neuralCells，美國(guó)專利公布2003/0180289;J.OliverDolly等，ActivatableRecombinantNeurotoxins,WO2001/014570；KeithA.Foster等，Re-targetedToxinConjugates，國(guó)際專利公布WO2005/023309；LanceΕ·Steward等，MultivalentClostridialToxinDerivativesandMethodsofTheirUse，美國(guó)專利申請(qǐng)第11/376，696號(hào)；Steward，L.Ε.等，ModifiedClostridialToxinswithEnhancedTranslocationCapabilitiesandAlteredTargetingActivityForNon-ClostridialToxinTargetCells，美國(guó)專利申請(qǐng)第11/776，075號(hào)；Dolly，J.0.等，ActivatableClostridialToxins，美國(guó)專利申請(qǐng)第11/829,475號(hào)；Foster,K.Α.等，F(xiàn)usionProteins，國(guó)際專利公布WO2006/059093；以及Foster，K.A.等，Non-CytotoxicProteinConjugates，國(guó)際專利公布WO2006/059105，各專利的全部?jī)?nèi)容以引用的方式并入本文。在該實(shí)施方案的方面，重靶向內(nèi)肽酶為SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:130或SEQIDNO:131。在另一實(shí)施方案中，所檢測(cè)的重靶向內(nèi)肽酶活性來(lái)自與以下文獻(xiàn)中公開的重靶向內(nèi)肽酶具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一'性的重靴向內(nèi)肽酶KeithA.Foster等，ClostridialToxinDerivativesAbleToModifyPeripheralSensoryAfferentFunctions,美國(guó)專利5，989，545;CliffordC.Shone等，RecombinantToxinFragments,美國(guó)專利6，461，617;ConradP.Quinn等，MethodsandCompoundsfortheTreatmentofMucusHypersecretion,美國(guó)專禾1J6,632,440；LanceΕ.Steward等，MethodsAndCompositionsForTheTreatmentOfPancreatitis,^15^6,843,998；StephanDonovan,ClostridialToxinDerivativesandMethodsForTreatingPain，美國(guó)專利公布2002/0037833;KeithA.Foster等，InhibitionofSecretionfromNon-neuralCells,美國(guó)專利公布2003/0180289；J.OliverDolly等，ActivatableRecombinantNeurotoxins,WO2001/014570；KeithA.Foster等，Re-targetedToxinConjugates,國(guó)際專利公布WO2005/023309；LanceΕ.Steward等，MultivalentClostridialToxinDerivativesandMethodsofTheirUse，美國(guó)專利申請(qǐng)第11/376,696號(hào)；Steward，L.E.等，ModifiedClostridialToxinswithEnhancedTranslocationCapabilitiesandAlteredTargetingActivityForNon-ClostridialToxinTargetCells，美國(guó)專利申請(qǐng)第11/776，075號(hào)；Dolly，J.0.等，ActivatableClostridialToxins，美國(guó)專利申請(qǐng)第11/8,475號(hào)；Foster，K.Α.等，F(xiàn)usionProteins，國(guó)際專利公布WO2006/059093；以及Foster，K.Α.等，Non-CytotoxicProteinConjugates，國(guó)際專利公布WO2006/059105，各專利的全部?jī)?nèi)容以引用的方式并入本文。在另一實(shí)施方案中，所檢測(cè)的重靶向內(nèi)肽酶活性來(lái)自與SEQIDNO=USEQIDN0:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:130或SEQIDNO:131的重靶向內(nèi)肽酶具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的重靶向內(nèi)肽酶。在該實(shí)施方案的其它方面，所檢測(cè)的重靶向內(nèi)肽酶活性來(lái)自相對(duì)于以下文獻(xiàn)中公開的重靶向內(nèi)肽酶具有例如1個(gè)或多個(gè)、2個(gè)或多個(gè)、3個(gè)或多個(gè)、4個(gè)或多個(gè)、5個(gè)或多個(gè)、6個(gè)或多個(gè)、7個(gè)或多個(gè)、8個(gè)或多個(gè)、9個(gè)或多個(gè)、10個(gè)或多個(gè)、20個(gè)或多個(gè)、30個(gè)或多個(gè)、40個(gè)或多個(gè)、50個(gè)或多個(gè)或者100個(gè)或多個(gè)非連續(xù)氨基酸取代、缺失或添加的重革巴向內(nèi)肽酶KeithA.Foster等，ClostridialToxinDerivativesAbleToModifyPeripheralSensoryAfferentFunctions,美國(guó)專利5，989，545;CliffordC.Shone等，RecombinantToxinFragments,美國(guó)專利6，461，617;ConradP.Quinn等，MethodsandCompoundsfortheTreatmentofMucusHypersecretion,美國(guó)專利6，632，440;LanceΕ.Steward等，MethodsAndCompositionsForTheTreatmentOfPancreatitis,美國(guó)專禾ll6,843,998；StephanDonovan,ClostridialToxinDerivativesandMethodsForTreatingPain，美國(guó)專利公布2002/0037833;KeithA.Foster等，InhibitionofSecretionfromNon-neuralCells,美國(guó)專利公布2003/0180289;J.OliverDollyφ,ActivatableRecombinantNeurotoxins,WO2001/014570；KeithA.Fosterφ,Re-targetedToxinConjugates，國(guó)際專利公布WO2005/023309；LanceΕ.Stewardφ,MultivalentClostridialToxinDerivativesandMethodsofTheirUse,美國(guó)專利申請(qǐng)第11/376，696號(hào)；Steward,L.Ε·等，ModifiedClostridialToxinswithEnhancedTranslocationCapabilitiesandAlteredTargetingActivityForNon-ClostridialToxinTargetCells,美國(guó)專利申請(qǐng)第11/776，075號(hào)；Dolly,J.0.等，ActivatableClostridialToxins,美國(guó)專利申請(qǐng)第11/829,475號(hào)；Foster，K.Α.等，F(xiàn)usionProteins，國(guó)際專利公布WO2006/059093；以及Foster，K.Α.等，Non-CytotoxicProteinConjugates,國(guó)際專利公布WO2006/059105，各專利的全部?jī)?nèi)容以引用的方式并入本文。在該實(shí)施方案的其它方面，所檢測(cè)的重靶向內(nèi)肽酶活性來(lái)自相對(duì)于SEQIDNO=USEQIDN02、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:130或SEQIDNO:131的重靶向內(nèi)肽酶具有例如1個(gè)或多個(gè)、2個(gè)或多個(gè)、3個(gè)或多個(gè)、4個(gè)或多個(gè)、5個(gè)或多個(gè)、6個(gè)或多個(gè)、7個(gè)或多個(gè)、8個(gè)或多個(gè)、9個(gè)或多個(gè)、10個(gè)或多個(gè)、20個(gè)或多個(gè)、30個(gè)或多個(gè)、40個(gè)或多個(gè)、50個(gè)或多個(gè)或者100個(gè)或多個(gè)非連續(xù)氨基酸取代、缺失或添加的重靶向內(nèi)肽酶。在該實(shí)施方案的其它方面，所檢測(cè)的重靶向內(nèi)肽酶活性來(lái)自相對(duì)于以下文獻(xiàn)中公開的重靶向內(nèi)肽酶具有例如1個(gè)或多個(gè)、2個(gè)或多個(gè)、3個(gè)或多個(gè)、4個(gè)或多個(gè)、5個(gè)或多個(gè)、6個(gè)或多個(gè)、7個(gè)或多個(gè)、8個(gè)或多個(gè)、9個(gè)或多個(gè)、10個(gè)或多個(gè)、20個(gè)或多個(gè)、30個(gè)或多個(gè)、40個(gè)或多個(gè)、50個(gè)或多個(gè)或者100個(gè)或多個(gè)連續(xù)氨基酸取代、缺失或添加的非天然重革巴向內(nèi)肽酶變體KeithA.Foster等，ClostridialToxinDerivativesAbleToModifyPeripheralSensoryAfferentFunctions,美國(guó)專利5，989，545;CliffordC.Shone等，RecombinantToxinFragments,美國(guó)專利6,461,617；ConradP.Quinn等，MethodsandCompoundsfortheTreatmentofMucusHypersecretion,美國(guó)專禾1J6,632,440；LanceΕ.Steward等，MethodsAndCompositionsForTheTreatmentOfPancreatitis,^15^6,843,998；StephanDonovan,ClostridialToxinDerivativesandMethodsForTreatingPain，美國(guó)專利公布2002/0037833;KeithA.Foster等，InhibitionofSecretionfromNon-neuralCells,美國(guó)專利公布2003/0180289；J.OliverDollyφ,ActivatableRecombinantNeurotoxins,WO2001/014570；KeithA.Foster等，Re-targetedToxinConjugates,國(guó)際專利公布WO2005/023309；LanceΕ.Steward等，MultivalentClostridialToxinDerivativesandMethodsofTheirUse，美國(guó)專利申請(qǐng)第11/376，696號(hào)；Steward，L.E.等，ModifiedClostridialToxinswithEnhancedTranslocationCapabilitiesandAlteredTargetingActivityForNon-ClostridialToxinTargetCells，美國(guó)專利申請(qǐng)第11/776，075號(hào)；Dolly，J.0.等，ActivatableClostridialToxins，美國(guó)專利申請(qǐng)第11/8,475號(hào)；Foster，K.Α.等，F(xiàn)usionProteins，國(guó)際專利公布WO2006/059093；以及Foster，K.Α.等，Non-CytotoxicProteinConjugates，國(guó)際專利公布WO2006/059105，各專利的全部?jī)?nèi)容以引用的方式并入本文。在該實(shí)施方案的其它方面，所檢測(cè)的重靶向內(nèi)肽酶活性來(lái)自相對(duì)于SEQIDNO=USEQIDNO2,SEQIDN0:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:130或SEQIDNO:131的重靴向內(nèi)肽酶具有例如1個(gè)或多個(gè)、2個(gè)或多個(gè)、3個(gè)或多個(gè)、4個(gè)或多個(gè)、5個(gè)或多個(gè)、6個(gè)或多個(gè)、7個(gè)或多個(gè)、8個(gè)或多個(gè)、9個(gè)或多個(gè)、10個(gè)或多個(gè)、20個(gè)或多個(gè)、30個(gè)或多個(gè)、40個(gè)或多個(gè)、50個(gè)或多個(gè)或者100個(gè)或多個(gè)連續(xù)氨基酸取代、缺失或添加的非天然重靶向內(nèi)肽酶變體。在另一實(shí)施方案中，所檢測(cè)的重靶向內(nèi)肽酶活性來(lái)自阿片重靶向內(nèi)肽酶。阿片重靶向內(nèi)肽酶或阿片-TVEMP的非限制性實(shí)例描述于例如以下文獻(xiàn)中KeithA.Foster等，ClostridialToxinDerivativesAbleToModifyPeripheralSensoryAfferentFunctions,美國(guó)專禾Ij5，989，545;J.OliverDolly等，ActivatableRecombinantNeurotoxins,^15^7,132,259；StephanDonovan,ClostridialToxinDerivativesandMethodsForTreatingPain,^15^7,244,437；StephanDonovan,ClostridialToxinDerivativesandMethodsForTreatingPain,^H^^1J7,413,742；StephanDonovan,ClostridialToxinDerivativesandMethodsForTreatingPain,^15利7,415,338；LanceΕ.Steward等，MultivalentClostridialToxinDerivativesandMethodsofTheirUse，美國(guó)專利7，514，088;KeithA.Foster,FusionProteins,美國(guó)專利公布2008/0064092；KeithA.Foster,FusionProteins,美國(guó)專利公布2009/0035822；LanceΕ·Steward等，MultivalentClostridialToxinDerivativesandMethodsofTheirUse，美國(guó)專利公布2009/0048431;KeithA.Foster,Non-CytotoxicProteinConjugates,美國(guó)專利公布2009/0162341；KeithA.Foster等，Re-targetedToxinConjugates,國(guó)際專利公布WO2005/023309；以及LanceΕ.Steward,ModifiedClostridialToxinswithEnhancedTranslocationCapabilitiesandAlteredTargetingCapabilitiesforNon-ClostridialToxinTargetCells，15際專禾公布ffO2008/008805；各專利的全部?jī)?nèi)容以引用的方式并入本文。在另一實(shí)施方案中，所檢測(cè)的重靶向內(nèi)肽酶活性來(lái)自甘丙肽重靶向內(nèi)肽酶。甘丙肽重靶向內(nèi)肽酶或甘丙肽-TVEMP的非限制性實(shí)例描述于例如以下文獻(xiàn)中Ateward，L.Ε.等，ModifiedClostridialToxinswithEnhancedTranslocationCapabilityandEnhancedTargetingActivity,美國(guó)專利申請(qǐng)第11/776，043號(hào)(2007年7月11日)；Steward,L.Ε.等，ModifiedClostridialToxinswithEnhancedTranslocationCapabilitiesandAlteredTargetingActivityForClostridialToxinTargetCells,美國(guó)專利申請(qǐng)第11/776，052號(hào)(2007年7月11日)；以及Steward，L.Ε.等，ModifiedClostridialToxinswithEnhancedTranslocationCapabilitiesandAlteredTargetingActivityForNon-ClostridialToxinTargetCells,美國(guó)專禾Ij串請(qǐng)第11/776，075號(hào)(2007年7月11日)，各專利的全部?jī)?nèi)容以引用的方式并入本文。本發(fā)明的方面部分包括SNAP-25。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“SNAP-25”是指優(yōu)先被重靶向內(nèi)肽酶裂解的天然SNAP-25或非天然SNAP-25。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“優(yōu)先裂解”是指重靶向內(nèi)肽酶裂解SNAP-25的速率比重靶向內(nèi)肽酶裂解任何其它底物的速率高至少一個(gè)數(shù)量級(jí)。在該實(shí)施方案的方面，重靶向內(nèi)肽酶裂解SNAP-25的速率比重靶向內(nèi)肽酶裂解任何其它底物的速率高至少兩個(gè)數(shù)量級(jí)、至少三個(gè)數(shù)量級(jí)、至少四個(gè)數(shù)量級(jí)或至少五個(gè)數(shù)量級(jí)。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“天然SNAP-25”是指由天然過(guò)程產(chǎn)生的任何SNAP-25，包括但不限于由翻譯后修飾、替代剪接的轉(zhuǎn)錄物或自發(fā)突變產(chǎn)生的SNAP-25同種型以及SNAP-25亞型。天然SNAP-25包括但不限于SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDN0:7、SEQIDNO:8,SEQIDNO:9,SEQIDNO:10,SEQIDNO=IUSEQIDNO:12、SEQIDNO:13,SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO20,SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23或SEQIDN0:24，或者SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO23或SEQIDNO:24中取代、缺失或添加例如1個(gè)或多個(gè)、2個(gè)或多個(gè)、3個(gè)或多個(gè)、4個(gè)或多個(gè)、5個(gè)或多個(gè)、6個(gè)或多個(gè)、7個(gè)或多個(gè)、8個(gè)或多個(gè)、9個(gè)或多個(gè)、10個(gè)或多個(gè)、20個(gè)或多個(gè)、30個(gè)或多個(gè)、40個(gè)或多個(gè)、50個(gè)或多個(gè)或者100個(gè)或多個(gè)氨基酸得到的SNAP-25。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“非天然SNAP-25”是指結(jié)構(gòu)借助于人類操作進(jìn)行修飾的任何SNAP-25，包括但不限于通過(guò)使用隨機(jī)誘變或合理設(shè)計(jì)進(jìn)行遺傳工程改造而產(chǎn)生的SNAP-25，以及通過(guò)體外化學(xué)合成而產(chǎn)生的SNAP-25。非天然SNAP-25的非限制性實(shí)例描述于以下文獻(xiàn)中例如Steward,L.E.等，F(xiàn)RETProteaseAssaysforClostridialToxins,美國(guó)專利7,332,567；Fernandez-Salas等，LipohilicDye-basedFRETAssaysforClostridialToxinActivity，美國(guó)專利公布2008/0160561，各專利的全部?jī)?nèi)容以引用的方式并入本文。非天然SNAP-25可由SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO8,SEQIDN0:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO=IUSEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14,SEQIDNO:15,SEQIDNO:16、SEQIDNO:17,SEQIDNO:18,SEQIDNO:19,SEQIDNO:20,SEQIDN0:21、SEQIDNO:22,SEQIDNO:23或SEQIDNO:24取代、缺失或添加例如1個(gè)或多個(gè)、2個(gè)或多個(gè)、3個(gè)或多個(gè)、4個(gè)或多個(gè)、5個(gè)或多個(gè)、6個(gè)或多個(gè)、7個(gè)或多個(gè)、8個(gè)或多個(gè)、9個(gè)或多個(gè)、10個(gè)或多個(gè)、20個(gè)或多個(gè)、30個(gè)或多個(gè)、40個(gè)或多個(gè)、50個(gè)或多個(gè)或者100個(gè)或多個(gè)氨基酸。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，SNAP-25是天然SNAP-25。在該實(shí)施方案的方面，SNAP-25是SNAP-25同種型或SNAP-25亞型。在該實(shí)施方案的方面，天然SNAP-25是SEQIDNO5,SEQIDN0:6、SEQIDN0:7、SEQIDN0:8、SEQIDN0:9、SEQIDNO:10,SEQIDNO:11,SEQIDNO:12,SEQIDNO:13,SEQIDNO:14,SEQIDNO:15、SEQIDNO:16,SEQIDNO:17,SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23或SEQIDNO:24的天然SNAP-25。在該實(shí)施方案的其它方面，SNAP-25是與SEQIDNO:5,SEQIDN0:6、SEQIDN0:7、SEQIDN0:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10,SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22,SEQIDNO:23或SEQIDNO:具有例如至少70%氨基酸同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的天然SNAP-25。在另一實(shí)施方案中，SNAP-25是非天然SNAP-25。在該實(shí)施方案的其它方面，SNAP-25是與SEQIDNO=USEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的非天然SNAP-25。在該實(shí)施方案的其它方面，SNAP-25是相對(duì)于SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO8,SEQIDNO:9、SEQIDNO10,SEQIDNO=IUSEQIDNO12,SEQIDN0:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20,SEQIDNO:21、SEQIDNO:22,SEQIDNO:23或SEQIDNO:24具有例如1個(gè)或多個(gè)、2個(gè)或多個(gè)、3個(gè)或多個(gè)、4個(gè)或多個(gè)、5個(gè)或多個(gè)、6個(gè)或多個(gè)、7個(gè)或多個(gè)、8個(gè)或多個(gè)、9個(gè)或多個(gè)、10個(gè)或多個(gè)、20個(gè)或多個(gè)、30個(gè)或多個(gè)、40個(gè)或多個(gè)、50個(gè)或多個(gè)或者100個(gè)或多個(gè)非連續(xù)氨基酸取代、缺失或添加的非天然SNAP-25。在該實(shí)施方案的其它方面，SNAP-25是相對(duì)于SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO21,SEQIDNO:22、SEQIDNO23或SEQIDNO24具有例如1個(gè)或多個(gè)、2個(gè)或多個(gè)、3個(gè)或多個(gè)、4個(gè)或多個(gè)、5個(gè)或多個(gè)、6個(gè)或多個(gè)、7個(gè)或多個(gè)、8個(gè)或多個(gè)、9個(gè)或多個(gè)、10個(gè)或多個(gè)、20個(gè)或多個(gè)、30個(gè)或多個(gè)、40個(gè)或多個(gè)、50個(gè)或多個(gè)或者100個(gè)或多個(gè)連續(xù)氨基酸取代、缺失或添加的非天然SNAP-25。SNAP-25可以是內(nèi)源性SNAP-25或外源性SNAP-25。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“內(nèi)源性SNAP-25”是指因?yàn)樵诩?xì)胞基因組內(nèi)被自然編碼而天然地存在于細(xì)胞中的SNAP-25，使得細(xì)胞固有地表達(dá)SNAP-25，無(wú)需外部來(lái)源的SNAP-25或外部來(lái)源的編碼SNAP-25的遺傳物質(zhì)。內(nèi)源性SNAP-25的表達(dá)可以利用或不利用環(huán)境刺激，例如細(xì)胞分化。根據(jù)定義，內(nèi)源性SNAP-25只能是天然SNAP-25或其變體。例如，以下各確立細(xì)胞系將表達(dá)內(nèi)源性SNAP-25BE(2)-Ml7,Kelly、LAl_55n、N1E—115、N4TG3、N18、Neuro_2a、NG108—15、PC12、SH—SY5Y、SiMa,SK-N-DZ和SK-N-BE(2)-C。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“外源性SNAP-25”是指通過(guò)人類操作引入外部來(lái)源的SNAP-25或外部來(lái)源的編碼SNAP-25的遺傳物質(zhì)而在細(xì)胞中表達(dá)的SNAP-25。外源性SNAP-25的表達(dá)可以利用或不利用環(huán)境刺激，例如細(xì)胞分化。在非限制性實(shí)例中，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞可通過(guò)SNAP-25的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染來(lái)表達(dá)外源性SNAP-25。作為另一非限制性實(shí)例中，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞可通過(guò)SNAP-25的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染來(lái)表達(dá)外源性SNAP-25。外源性SNAP-25可以是天然SNAP-25或其變體，或是非天然SNAP-25或其變體。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞表達(dá)內(nèi)源性SNAP-25。在該實(shí)施方案的方面，由來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞表達(dá)的內(nèi)源性SNAP-25是天然SNAP-25。在該實(shí)施方案的其它方面，由來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞表達(dá)的內(nèi)源性SNAP-25是SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO18,SEQIDNO19,SEQIDNO20,SEQIDNO:21、SEQIDNO22,SEQIDNO:23或SEQIDNO:24。在該實(shí)施方案的其它方面，由來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞表達(dá)的內(nèi)源性SNAP-25是天然SNAP-25，例如SNAP-25同種型或SNAP-25亞型。在該實(shí)施方案的其它方面，由來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞表達(dá)的內(nèi)源性SNAP-25是與SEQIDN0:5、SEQIDN0:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8,SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO=IUSEQIDNO:12,SEQIDNO:13,SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20,SEQIDNO:21、SEQIDNO:22,SEQIDNO:23或SEQIDNO:24具有例如至少70%氨基酸同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的天然SNAP-25。在另一實(shí)施方案中，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)地或穩(wěn)定地工程改造成表達(dá)外源性SNAP-25。在該實(shí)施方案的一方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)地或穩(wěn)定地工程改造成表達(dá)天然SNAP-25。在該實(shí)施方案的其它方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)地或穩(wěn)定地工程改造成表達(dá)SEQIDNO5,SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO15,SEQIDN0:16、SEQIDN0:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19,SEQIDNO:20、SEQIDNO:21,SEQIDNO:22、SEQIDNO:23或SEQIDNO:24的天然SNAP-25。在該實(shí)施方案的其它方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)地或穩(wěn)定地工程改造成表達(dá)天然SNAP-25，例如SNAP-25同種型或SNAP-25亞型。在該實(shí)施方案的其它方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)地或穩(wěn)定地工程改造成表達(dá)與SEQIDNO5,SEQIDN0:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8,SEQIDNO:9,SEQIDNO:10、SEQIDNO=IUSEQIDNO:12,SEQIDNO:13,SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20,SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23或SEQIDNO:24具有例如至少70%氨基酸同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的天然SNAP-250在該實(shí)施方案另一方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)或穩(wěn)定地工程改造成表達(dá)非天然SNAP-25。在該實(shí)施方案的其它方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)或穩(wěn)定地工程改造成表達(dá)與SEQIDNO5,SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10,SEQIDN0:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13,SEQIDNO:14,SEQIDNO:15,SEQIDNO:16,SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23或SEQIDNO:24具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的非天然SNAP-25。在該實(shí)施方案的其它方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)或穩(wěn)定地工程改造成表達(dá)相對(duì)于SEQIDNO5,SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO12,SEQIDNO13、SEQIDN0:14、SEQIDN0:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17,SEQIDNO:18,SEQIDNO:19、SEQIDNO:20,SEQIDN0:21、SEQIDNO:22,SEQIDNO:23或SEQIDNO:具有例如1個(gè)或多個(gè)、2個(gè)或多個(gè)、3個(gè)或多個(gè)、4個(gè)或多個(gè)、5個(gè)或多個(gè)、6個(gè)或多個(gè)、7個(gè)或多個(gè)、8個(gè)或多個(gè)、9個(gè)或多個(gè)、10個(gè)或多個(gè)、20個(gè)或多個(gè)、30個(gè)或多個(gè)、40個(gè)或多個(gè)、50個(gè)或多個(gè)或者100個(gè)或多個(gè)非連續(xù)氨基酸取代、缺失或添加的非天然SNAP-25。在該實(shí)施方案的其它方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)或穩(wěn)定地工程改造成表達(dá)相對(duì)于SEQIDNO5,SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10,SEQIDNO:11,SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20,SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23或SEQIDNO:具有例如1個(gè)或多個(gè)、2個(gè)或多個(gè)、3個(gè)或多個(gè)、4個(gè)或多個(gè)、5個(gè)或多個(gè)、6個(gè)或多個(gè)、7個(gè)或多個(gè)、8個(gè)或多個(gè)、9個(gè)或多個(gè)、10個(gè)或多個(gè)、20個(gè)或多個(gè)、30個(gè)或多個(gè)、40個(gè)或多個(gè)、50個(gè)或多個(gè)或者100個(gè)或多個(gè)連續(xù)氨基酸取代、缺失或添加的非天然SNAP-25?？梢允褂脵z測(cè)SNAP-25在暴露于重靶向內(nèi)肽酶之后的裂解情況的測(cè)定來(lái)評(píng)估細(xì)胞是表達(dá)內(nèi)源性SNAP-25還是外源性SNAP-25。在這些測(cè)定中，經(jīng)過(guò)重靶向內(nèi)肽酶處理之后，在表達(dá)SNAP-25的細(xì)胞中將檢測(cè)到SNAP-25裂解產(chǎn)物的產(chǎn)生。特定蛋白印跡分析(Westernblotanalysis)的非限制性實(shí)例以及充分表征的試劑、條件和方案易于從供應(yīng)商獲得，這些供應(yīng)商包括但不限于AmershamBiosciences,Piscataway,NJ；Bio-RadLaboratories,Hercules,CA；PierceBiotechnology,Inc.,Rockford,IL；PromegaCorporation,Madison,WI，和Stratagene，Inc.，LaJolla,CA。應(yīng)了解，這些以及類似的針對(duì)SNAP-25裂解的測(cè)定都可用于鑒別表達(dá)內(nèi)源性SNAP-25或外源性SNAP-25的細(xì)胞。在非限制性實(shí)例中，可以使用蛋白印跡分析來(lái)測(cè)定重靶向內(nèi)肽酶的攝取，該分析方法是使用可識(shí)別SNAP-25裂解產(chǎn)物或者裂解和未裂解形式的SNAP-25的抗體進(jìn)行。適用于這些測(cè)定的α-SNAP-25抗體的實(shí)例包括但不限于α-SNAP-25小鼠單克隆抗體SMI-8KSternbergerMonoclonalsInc.，Lutherville，MD)、小鼠α-SNAP-25單克隆抗體CI71.1(SynapticSystems,Goettingen，Germany)、α-SNAP-25小鼠單克隆抗體CI71.2(SynapticSystems,Goettingen,Germany)、α-SNAP-25/Mt(Abeam,Cambridge,MA)、α-SNAP-25^,^^Hiilifiiyf(SynapticSystems,Goettingen,Germany)、α-SNAP-25兔多克隆抗血清(Abcam，Cambridge,MA)和α-SNAP-25兔多克隆抗血清S9684(Sigma,StLouis,MO)。本公開的方面部分包括重靶向內(nèi)肽酶受體。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“重靶向內(nèi)肽酶受體”是指以引起重靶向內(nèi)肽酶活性響應(yīng)的方式優(yōu)先與重靶向內(nèi)肽酶按相互作用的天然重靶向內(nèi)肽酶受體或非天然重靶向內(nèi)肽酶受體。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“優(yōu)先相互作用”是指重靶向內(nèi)肽酶對(duì)重靶向內(nèi)肽酶受體的平衡解離常數(shù)(KD)比重靶向內(nèi)肽酶對(duì)細(xì)胞表面上的任何其它受體的KD低至少一個(gè)數(shù)量級(jí)。平衡解離常數(shù)，一種度量重靶向內(nèi)肽酶重靶向的內(nèi)肽酶受體復(fù)合物可逆分離(解離)成其組分分子(即重靶向內(nèi)肽酶和重靶向內(nèi)肽酶受體)的傾向的特定類型的平衡常數(shù)，定義為平衡時(shí)KD=Ka/Kd0締合常數(shù)(Ka)定義為Ka=[C]/[L][R]，且解離常數(shù)(Kd)定義為Kd=[L][R]/[C]，其中[L]等于重靶向內(nèi)肽酶的摩爾濃度，[R]是重靶向內(nèi)肽酶受體的摩爾濃度，且[C]是內(nèi)肽酶-受體復(fù)合物的摩爾濃度，且其中所有這些濃度都是當(dāng)系統(tǒng)達(dá)到平衡時(shí)這些組分的濃度。解離常數(shù)越小，則重靶向內(nèi)肽酶與其受體結(jié)合得越緊密，或者重靶向內(nèi)肽酶與重靶向內(nèi)肽酶受體之間的結(jié)合親和力越高。在該實(shí)施方案的方面，重靶向內(nèi)肽酶對(duì)其受體的解離常數(shù)比重靶向內(nèi)肽酶對(duì)任何其它受體的解離常數(shù)低至少兩個(gè)數(shù)量級(jí)、至少三個(gè)數(shù)量級(jí)、至少四個(gè)數(shù)量級(jí)或至少五個(gè)數(shù)量級(jí)。在該實(shí)施方案的其它方面，重靶向內(nèi)肽酶優(yōu)先與其受體相互作用的結(jié)合親和力的平衡解離常數(shù)(KD)可以是例如500nM或更少、400nM或更少、300nM或更少、200nM或更少、IOOnM或更少。在該實(shí)施方案的其它方面，重靶向內(nèi)肽酶優(yōu)先與其受體相互作用的結(jié)合親和力的平衡解離常數(shù)(KD)可以是例如90nM或更少、80nM或更少、70nM或更少、60nM、50nM或更少、40nM或更少、30nM或更少、20nM或更少、IOnM或更少。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“引起重靶向內(nèi)肽酶活性響應(yīng)”是指重靶向內(nèi)肽酶受體與重靶向內(nèi)肽酶相互作用形成內(nèi)肽酶/受體復(fù)合物且隨后該復(fù)合物內(nèi)化到細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的能力。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“天然重靶向內(nèi)肽酶受體”是指由天然過(guò)程產(chǎn)生的任何重靶向內(nèi)肽酶受體，包括但不限于由翻譯后修飾、替代性剪接的轉(zhuǎn)錄物或自發(fā)突變產(chǎn)生的重靶向內(nèi)肽酶受體同種型，以及重靶向內(nèi)肽酶受體亞型。天然重靶向內(nèi)肽酶受體包括但不限于天然阿片受體，如阿片樣受體(opiate-likereceptor1，0RL1)、δ-阿片受體(DOR)、κ-阿片受體(KOR)和μ-阿片受體(MOR)，例如以下文獻(xiàn)中描述的阿片受體ChristopherEvans等，OpioidReceptorGenes,美國(guó)專利6，265，563;ChristopherEvansMethodsofScreeningModulatorsofOpiodReceptorActivity,美國(guó)專利6，432，652;ChristopherEvans等，OpioidReceptorsandMethodsofUse，美國(guó)專利7，282，563；以及ChristopherEvans等，DeltaOpioidReceptorProteins，美國(guó)專利公布2008/0219925，各專利的全部?jī)?nèi)容據(jù)此以引用的方式并入本文。天然重靶向內(nèi)肽酶受體的其它實(shí)例包括但不限于甘丙肽受體1、甘丙肽受體2和甘丙肽受體3。本領(lǐng)域中已知來(lái)自其它脊椎動(dòng)物物種，例如來(lái)自靈長(zhǎng)類動(dòng)物、母牛、狗、小鼠、大鼠、雞和魚等的天然阿片受體，并且其可用于本說(shuō)明書的各方面。天然ORL1包括但不限于SEQIDNO:25禾口SEQIDN0:26，或在SEQIDNO25或SEQIDNOJ6中取代、缺失或添加例如1個(gè)或多個(gè)、2個(gè)或多個(gè)、3個(gè)或多個(gè)、4個(gè)或多個(gè)、5個(gè)或多個(gè)、6個(gè)或多個(gè)、7個(gè)或多個(gè)、8個(gè)或多個(gè)、9個(gè)或多個(gè)、10個(gè)或多個(gè)、20個(gè)或多個(gè)、30個(gè)或多個(gè)、40個(gè)或多個(gè)、50個(gè)或多個(gè)或者100個(gè)或多個(gè)氨基酸得到的天然0RL1。天然DOR包括但不限于SEQIDNO:27和SEQIDN0:28，或在SEQIDN0:27或SEQIDNOJ8中取代、缺失或添加例如1個(gè)或多個(gè)、2個(gè)或多個(gè)、3個(gè)或多個(gè)、4個(gè)或多個(gè)、5個(gè)或多個(gè)、6個(gè)或多個(gè)、7個(gè)或多個(gè)、8個(gè)或多個(gè)、9個(gè)或多個(gè)、10個(gè)或多個(gè)、20個(gè)或多個(gè)、30個(gè)或多個(gè)、40個(gè)或多個(gè)、50個(gè)或多個(gè)或者100個(gè)或多個(gè)氨基酸得到的天然D0R。天然KOR包括但不限于SEQIDN0:29和SEQIDN0:30，或在SEQIDN0:29或SEQIDNO:30中取代、缺失或添加例如1個(gè)或多個(gè)、2個(gè)或多個(gè)、3個(gè)或多個(gè)、4個(gè)或多個(gè)、5個(gè)或多個(gè)、6個(gè)或多個(gè)、7個(gè)或多個(gè)、8個(gè)或多個(gè)、9個(gè)或多個(gè)、10個(gè)或多個(gè)、20個(gè)或多個(gè)、30個(gè)或多個(gè)、40個(gè)或多個(gè)、50個(gè)或多個(gè)或者100個(gè)或多個(gè)氨基酸得到的天然K0R。天然MOR包括但不限于SEQIDN0:31，或在SEQIDN031中取代、缺失或添加例如1個(gè)或多個(gè)、2個(gè)或多個(gè)、3個(gè)或多個(gè)、4個(gè)或多個(gè)、5個(gè)或多個(gè)、6個(gè)或多個(gè)、7個(gè)或多個(gè)、8個(gè)或多個(gè)、9個(gè)或多個(gè)、10個(gè)或多個(gè)、20個(gè)或多個(gè)、30個(gè)或多個(gè)、40個(gè)或多個(gè)、50個(gè)或多個(gè)或者100個(gè)或多個(gè)氨基酸得到的天然M0R。天然甘丙肽受體1包括但不限于:SEQIDNO:136,SEQIDNO:137和SEQIDNO138，或在SEQIDN0:136、SEQIDNO:137或SEQIDNO138中取代、缺失或添加例如1個(gè)或多個(gè)、2個(gè)或多個(gè)、3個(gè)或多個(gè)、4個(gè)或多個(gè)、5個(gè)或多個(gè)、6個(gè)或多個(gè)、7個(gè)或多個(gè)、8個(gè)或多個(gè)、9個(gè)或多個(gè)、10個(gè)或多個(gè)、20個(gè)或多個(gè)、30個(gè)或多個(gè)、40個(gè)或多個(gè)、50個(gè)或多個(gè)或者100個(gè)或多個(gè)氨基酸得到的天然甘丙肽受體1。天然甘丙肽受體2包括但不限于SEQIDNO139，或在SEQIDNO:139中取代、缺失或添加例如1個(gè)或多個(gè)、2個(gè)或多個(gè)、3個(gè)或多個(gè)、4個(gè)或多個(gè)、5個(gè)或多個(gè)、6個(gè)或多個(gè)、7個(gè)或多個(gè)、8個(gè)或多個(gè)、9個(gè)或多個(gè)、10個(gè)或多個(gè)、20個(gè)或多個(gè)、30個(gè)或多個(gè)、40個(gè)或多個(gè)、50個(gè)或多個(gè)或者100個(gè)或多個(gè)氨基酸得到的天然甘丙肽受體2。天然甘丙肽受體3包括但不限于SEQIDNO:140，或在SEQIDNO:140中取代、缺失或添加例如1個(gè)或多個(gè)、2個(gè)或多個(gè)、3個(gè)或多個(gè)、4個(gè)或多個(gè)、5個(gè)或多個(gè)、6個(gè)或多個(gè)、7個(gè)或多個(gè)、8個(gè)或多個(gè)、9個(gè)或多個(gè)、10個(gè)或多個(gè)、20個(gè)或多個(gè)、30個(gè)或多個(gè)、40個(gè)或多個(gè)、50個(gè)或多個(gè)或者100個(gè)或多個(gè)氨基酸得到的天然甘丙肽受體3。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“非天然靶向內(nèi)肽酶受體變體”是指借助于人類操作或設(shè)計(jì)產(chǎn)生的任何重靶向內(nèi)肽酶受體，包括但不限于通過(guò)使用隨機(jī)誘變或合理設(shè)計(jì)進(jìn)行基因工程改造而產(chǎn)生的重靶向內(nèi)肽酶受體，以及通過(guò)化學(xué)合成而產(chǎn)生的重靶向內(nèi)肽酶受體。非天然重靶向內(nèi)肽酶受體變體的非限制性實(shí)例包括例如保守重靶向內(nèi)肽酶受體變體、非保守重靶向內(nèi)肽酶受體變體、重靶向內(nèi)肽酶受體嵌合變體和活性重靶向內(nèi)肽酶受體片段。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“非天然重靶向內(nèi)肽酶受體”是指結(jié)構(gòu)借助于人類操作進(jìn)行修飾的任何重靶向內(nèi)肽酶受體，包括但不限于通過(guò)使用隨機(jī)誘變或合理設(shè)計(jì)通過(guò)基因工程改造而產(chǎn)生的重靶向內(nèi)肽酶受體，以及通過(guò)體外化學(xué)合成而產(chǎn)生的重靶向內(nèi)肽酶受體。非天然重靶向內(nèi)肽酶受體可在SEQIDNO25,SEQIDNO26、SEQIDNO27、SEQIDNO:28、SEQIDNO29,SEQIDNO30、SEQIDNO:31、SEQIDNO136,SEQIDNO137,SEQIDNO:138、SEQIDNO:139或SEQIDNO:140中取代、缺失或添加例如1個(gè)或多個(gè)、2個(gè)或多個(gè)、3個(gè)或多個(gè)、4個(gè)或多個(gè)、5個(gè)或多個(gè)、6個(gè)或多個(gè)、7個(gè)或多個(gè)、8個(gè)或多個(gè)、9個(gè)或多個(gè)、10個(gè)或多個(gè)、20個(gè)或多個(gè)、30個(gè)或多個(gè)、40個(gè)或多個(gè)、50個(gè)或多個(gè)或者100個(gè)或多個(gè)氨基酸。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，重靶向內(nèi)肽酶受體是天然重靶向內(nèi)肽酶受體，例如ORLUDOR,KOR或M0R。在該實(shí)施方案的方面，重靶向內(nèi)肽酶受體是重靶向內(nèi)肽酶受體同種型或重靶向內(nèi)肽酶受體亞型。在該實(shí)施方案的方面，天然重靶向內(nèi)肽酶受體是SEQIDNO25,SEQIDNO26,SEQIDNO27、SEQIDNO28、SEQIDNO29、SEQIDNO30或SEQIDNO:31的天然重靶向內(nèi)肽酶受體。在該實(shí)施方案的其它方面，重靶向內(nèi)肽酶受體是與SEQIDNO25,SEQIDNO26,SEQIDNO:27、SEQIDNO28,SEQIDNO29,SEQIDNO30或SEQIDNO31具有例如至少70%氨基酸同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的天然重靶向內(nèi)肽酶受體。在另一實(shí)施方案中，重靶向內(nèi)肽酶受體是非天然重靶向內(nèi)肽酶受體，例如經(jīng)過(guò)基因工程改造的ORLl、經(jīng)過(guò)遺傳工程改造的DOR、經(jīng)過(guò)遺傳工程改造的KOR或經(jīng)過(guò)遺傳工程改造的M0R。在該實(shí)施方案的其它方面，重靶向內(nèi)肽酶受體是與SEQIDNO25,SEQIDNO:26、SEQIDNO27,SEQIDNO28,SEQIDNO29,SEQIDNO30或SEQIDNO:31具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的非天然重靶向內(nèi)肽酶受體。在該實(shí)施方案的其它方面，重靶向內(nèi)肽酶受體是相對(duì)于SEQIDN025,SEQIDNO26,SEQIDNO27、SEQIDNO28、SEQIDNO29、SEQIDNO30或SEQIDNO31具有例如1個(gè)或多個(gè)、2個(gè)或多個(gè)、3個(gè)或多個(gè)、4個(gè)或多個(gè)、5個(gè)或多個(gè)、6個(gè)或多個(gè)、7個(gè)或多個(gè)、8個(gè)或多個(gè)、9個(gè)或多個(gè)、10個(gè)或多個(gè)、20個(gè)或多個(gè)、30個(gè)或多個(gè)、40個(gè)或多個(gè)、50個(gè)或多個(gè)或者100個(gè)或多個(gè)非連續(xù)氨基酸取代、缺失或添加的非天然重靶向內(nèi)肽酶受體。在該實(shí)施方案的其它方面，重靶向內(nèi)肽酶受體是相對(duì)于SEQIDNO25,SEQIDNO26,SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO30或SEQIDNO31具有例如1個(gè)或多個(gè)、2個(gè)或多個(gè)、3個(gè)或多個(gè)、4個(gè)或多個(gè)、5個(gè)或多個(gè)、6個(gè)或多個(gè)、7個(gè)或多個(gè)、8個(gè)或多個(gè)、9個(gè)或多個(gè)、10個(gè)或多個(gè)、20個(gè)或多個(gè)、30個(gè)或多個(gè)、40個(gè)或多個(gè)、50個(gè)或多個(gè)或者100個(gè)或多個(gè)連續(xù)氨基酸取代、缺失或添加的非天然重靶向內(nèi)肽酶受體。在另一實(shí)施方案中，重靶向內(nèi)肽酶受體是天然重靶向內(nèi)肽酶受體，例如甘丙肽受體1、甘丙肽受體2或甘丙肽受體3。在該實(shí)施方案的方面，重靶向內(nèi)肽酶受體是重靶向內(nèi)肽酶受體同種型或重靶向內(nèi)肽酶受體亞型。在該實(shí)施方案的方面，天然重靶向內(nèi)肽酶受體是SEQIDN0:136、SEQIDNO:137、SEQIDNO:138、SEQIDNO:139或SEQIDNO:140的天然重靶向內(nèi)肽酶受體。在該實(shí)施方案的其它方面，重靶向內(nèi)肽酶受體是與SEQIDNO136,SEQIDN0:137、SEQIDNO:138、SEQIDNO:139或SEQIDNO:140具有例如至少70%氨基酸同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的天然重靶向內(nèi)肽酶受體。在另一實(shí)施方案中，重靶向內(nèi)肽酶受體是非天然重靶向內(nèi)肽酶受體，例如經(jīng)過(guò)遺傳工程改造的甘丙肽受體1、經(jīng)過(guò)遺傳工程改造的甘丙肽受體2或經(jīng)過(guò)遺傳工程改造的甘丙肽受體3。在該實(shí)施方案的其它方面，重靶向內(nèi)肽酶受體是與SEQIDNO:136,SEQIDNO:137,SEQIDNO138,SEQIDNO:139或SEQIDNO:140具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的非天然重靶向內(nèi)肽酶受體。在該實(shí)施方案的其它方面，重靶向內(nèi)肽酶受體是相對(duì)于SEQIDNO:136,SEQIDNO:137、SEQIDNO:138,SEQIDNO:139或SEQIDNO:140具有例如1個(gè)或多個(gè)、2個(gè)或多個(gè)、3個(gè)或多個(gè)、4個(gè)或多個(gè)、5個(gè)或多個(gè)、6個(gè)或多個(gè)、7個(gè)或多個(gè)、8個(gè)或多個(gè)、9個(gè)或多個(gè)、10個(gè)或多個(gè)、20個(gè)或多個(gè)、30個(gè)或多個(gè)、40個(gè)或多個(gè)、50個(gè)或多個(gè)或者100個(gè)或多個(gè)非連續(xù)氨基酸取代、缺失或添加的非天然重靶向內(nèi)肽酶受體。在該實(shí)施方案的其它方面，重靶向內(nèi)肽酶受體是相對(duì)于SEQIDNO:136,SEQIDNO:137、SEQIDNO138、SEQIDNO:139或SEQIDNO:140具有例如1個(gè)或多個(gè)、2個(gè)或多個(gè)、3個(gè)或多個(gè)、4個(gè)或多個(gè)、5個(gè)或多個(gè)、6個(gè)或多個(gè)、7個(gè)或多個(gè)、8個(gè)或多個(gè)、9個(gè)或多個(gè)、10個(gè)或多個(gè)、20個(gè)或多個(gè)、30個(gè)或多個(gè)、40個(gè)或多個(gè)、50個(gè)或多個(gè)或者100個(gè)或多個(gè)連續(xù)氨基酸取代、缺失或添加的非天然重靶向內(nèi)肽酶受體。重靶向內(nèi)肽酶受體可以是內(nèi)源性重靶向內(nèi)肽酶受體或外源性重靶向內(nèi)肽酶受體。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“內(nèi)源性重靶向內(nèi)肽酶受體”是指因?yàn)樵诩?xì)胞基因組中被天然編碼而存在于細(xì)胞中的天然重靶向內(nèi)肽酶受體，使得細(xì)胞固有地表達(dá)重靶向內(nèi)肽酶受體，而無(wú)需外部來(lái)源的重靶向內(nèi)肽酶受體或外部來(lái)源的編碼重靶向內(nèi)肽酶受體的遺傳物質(zhì)。內(nèi)源性重靶向內(nèi)肽酶受體的表達(dá)可以利用或不利用環(huán)境刺激，例如細(xì)胞分化或啟動(dòng)子活化。例如，以下確立細(xì)胞系將表達(dá)至少一種內(nèi)源性重靶向內(nèi)肽酶受體AGNP33、Neuro-2a、SiMa和SK-N-DZ0內(nèi)源性重靶向內(nèi)肽酶受體只能是天然重靶向內(nèi)肽酶受體或其天然變體。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“外源性重靶向內(nèi)肽酶受體”是指利用人類操作通過(guò)引入外部來(lái)源的重靶向內(nèi)肽酶受體或外部來(lái)源的編碼重靶向內(nèi)肽酶受體的遺傳物質(zhì)而在細(xì)胞中表達(dá)的重靶向內(nèi)肽酶受體。外源性重靶向內(nèi)肽酶受體的表達(dá)可以利用或不利用環(huán)境刺激，例如細(xì)胞分化或啟動(dòng)子活化。在非限制性實(shí)例中，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞可通過(guò)編碼例如0RL1、D0R、K0R、M0R、甘丙肽受體1、甘丙肽受體2或甘丙肽受體3等重靶向內(nèi)肽酶受體的多核苷酸分子的瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染來(lái)表達(dá)一種或多種外源性重靶向內(nèi)肽酶受體。在另一非限制性實(shí)例中，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞可通過(guò)例如0RL1、D0R、K0R、M0R、甘丙肽受體1、甘丙肽受體2或甘丙肽受體3等重靶向內(nèi)肽酶受體的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染來(lái)表達(dá)一種或多種外源性重靶向內(nèi)肽酶受體。外源性重靶向內(nèi)肽酶受體可以是天然重靶向內(nèi)肽酶受體或其天然變體，或者非天然重靶向內(nèi)肽酶受體或其非天然變體。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞表達(dá)內(nèi)源性重靶向內(nèi)肽酶受體。在該實(shí)施方案的方面，由來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞表達(dá)的內(nèi)源性重靶向內(nèi)肽酶受體是天然重靶向內(nèi)肽酶受體。在該實(shí)施方案的其它方面，由來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞表達(dá)的內(nèi)源性重靶向內(nèi)肽酶受體是SEQIDNO25,SEQIDNO26、SEQIDNO27、SEQIDNO28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:136、SEQIDNO:137、SEQIDNO:138、SEQIDNO:139或SEQIDNO:140。在該實(shí)施方案的其它方面，由來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞表達(dá)的內(nèi)源性重靶向內(nèi)肽酶受體是天然重靶向內(nèi)肽酶受體，例如重靶向內(nèi)肽酶受體同種型或重靶向內(nèi)肽酶受體亞型。在該實(shí)施方案的其它方面，由來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞表達(dá)的內(nèi)源性重靴向內(nèi)肽酶受體是與SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:136、SEQIDNO:137、SEQIDNO:138、SEQIDNO:139或SEQIDNO140具有例如至少70%氨基酸同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的天然重靶向內(nèi)肽酶受體。在另一實(shí)施方案中，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)地或穩(wěn)定地工程改造成表達(dá)外源性重靶向內(nèi)肽酶受體。在該實(shí)施方案的一方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)地或穩(wěn)定地工程改造成表達(dá)天然重靶向內(nèi)肽酶受體。在該實(shí)施方案的其它方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)地或穩(wěn)定地工程改造成表達(dá)SEQIDNO25,SEQIDNO26,SEQIDNO27、SEQIDNO28,SEQIDNO29、SEQIDNO30、SEQIDNO:31、SEQIDNO136,SEQIDNO:137、SEQIDNO:138,SEQIDNO:139或SEQIDNO140的天然重靶向內(nèi)肽酶受體。在該實(shí)施方案的其它方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)地或穩(wěn)定地工程改造成表達(dá)天然重靶向內(nèi)肽酶受體，例如重靶向內(nèi)肽酶受體同種型或重靶向內(nèi)肽酶受體亞型。在該實(shí)施方案的其它方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)地或穩(wěn)定地工程改造成表達(dá)與SEQIDNO25,SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:136、SEQIDNO:137、SEQIDNO:138、SEQIDNO:139或SEQIDNO:140具有例如至少70%氨基酸同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的天然重靶向內(nèi)肽酶受體。在該實(shí)施方案另一方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)或穩(wěn)定地工程改造成表達(dá)非天然重靶向內(nèi)肽酶受體。在該實(shí)施方案的其它方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)或穩(wěn)定工程改造成表達(dá)與SEQIDNO25,SEQIDNO26、SEQIDNO27、SEQIDNO28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:136、SEQIDNO:137、SEQIDNO:138、SEQIDNO:139或SEQIDNO:140具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的非天然重靶向內(nèi)肽酶受體。在該實(shí)施方案的其它方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)或穩(wěn)定地工程改造成表達(dá)相對(duì)于SEQIDNO25,SEQIDN0:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:136,SEQIDNO:137、SEQIDNO138,SEQIDNO:139或SEQIDNO:140具有例如1個(gè)或多個(gè)、2個(gè)或多個(gè)、3個(gè)或多個(gè)、4個(gè)或多個(gè)、5個(gè)或多個(gè)、6個(gè)或多個(gè)、7個(gè)或多個(gè)、8個(gè)或多個(gè)、9個(gè)或多個(gè)、10個(gè)或多個(gè)、20個(gè)或多個(gè)、30個(gè)或多個(gè)、40個(gè)或多個(gè)、50個(gè)或多個(gè)或者100個(gè)或多個(gè)非連續(xù)氨基酸取代、缺失或添加的非天然重靶向內(nèi)肽酶受體。在該實(shí)施方案的其它方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)或穩(wěn)定地工程改造成表達(dá)相對(duì)于SEQIDNO25,SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDN0:136、SEQIDNO:137、SEQIDNO:138、SEQIDNO:139或SEQIDNO:140具有例如1個(gè)或多個(gè)、2個(gè)或多個(gè)、3個(gè)或多個(gè)、4個(gè)或多個(gè)、5個(gè)或多個(gè)、6個(gè)或多個(gè)、7個(gè)或多個(gè)、8個(gè)或多個(gè)、9個(gè)或多個(gè)、10個(gè)或多個(gè)、20個(gè)或多個(gè)、30個(gè)或多個(gè)、40個(gè)或多個(gè)、50個(gè)或多個(gè)或者100個(gè)或多個(gè)連續(xù)氨基酸取代、缺失或添加的非天然重靶向內(nèi)肽酶受體。在另一實(shí)施方案中，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)或穩(wěn)定地工程改造成表達(dá)外源性O(shè)RLl、外源性D0R、外源性K0R、外源性MOR或其任何組合。在該實(shí)施方案的方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)或穩(wěn)定地工程改造成表達(dá)天然0RL1、天然D0R、天然K0R、天然MOR或其任何組合。在該實(shí)施方案的其它方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)或穩(wěn)定地工程改造成表達(dá)非天然0RL1、非天然DOR、非天然K0R、非天然MOR或其任何組合。在該實(shí)施方案的其它方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)或穩(wěn)定地工程改造成表達(dá)天然ORLl或非天然0RL1、天然DOR或非天然DOR、天然KOR或非天然K0R、天然MOR或非天然M0R，或其任何組合。在另一實(shí)施方案中，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)或穩(wěn)定地工程改造成表達(dá)外源性甘丙肽受體1、外源性甘丙肽受體2、外源性甘丙肽受體3或其任何組合。在該實(shí)施方案的方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)或穩(wěn)定地工程改造成表達(dá)天然甘丙肽受體1、天然甘丙肽受體2、天然甘丙肽受體3或其任何組合。在該實(shí)施方案的其它方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)或穩(wěn)定地工程改造成表達(dá)非天然甘丙肽受體1、非天然甘丙肽受體2、非天然甘丙肽受體3或其任何組合。在該實(shí)施方案的其它方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)或穩(wěn)定地工程改造成表達(dá)天然甘丙肽受體1或非天然甘丙肽受體1、天然甘丙肽受體2或非天然甘丙肽受體2、天然甘丙肽受體3或非天然甘丙肽受體3或其任何組合。表達(dá)一種或多種內(nèi)源性重靶向內(nèi)肽酶受體或外源性重靶向內(nèi)肽酶受體的細(xì)胞可以借助常規(guī)方法來(lái)鑒別，所述常規(guī)方法包括針對(duì)重靶向內(nèi)肽酶攝取的直接測(cè)定和間接測(cè)定。可以使用測(cè)定重靶向內(nèi)肽酶的結(jié)合或攝取特性的測(cè)定來(lái)評(píng)估細(xì)胞是否表達(dá)重靶向內(nèi)肽酶受體。這些測(cè)定包括但不限于使用例如[1251]重靶向內(nèi)肽酶等標(biāo)記重靶向內(nèi)肽酶進(jìn)行的交聯(lián)測(cè)定，參見(jiàn)例如，NorikoYokosawa等，BindingofClostridiumbotulinumtypeCneurotoxintodifferentneuroblastomacelllines,57(1)Infect.Immun.272-277(1989)；NorikoYokosawa等，BindingofbotulinumtypeCl,DandEneurotoxinstoneuronalcelllinesandsynaptosomes,29(2)Toxicon261-264(1991)；以及！"ei-ichiNishiki等，IdentificationofproteinreceptorforClostridiumbotulinumtypeBneurotoxininratbrainsynaptosomes,269(14)J.Biol.Chem.10498-10503(1994)。其它非限制性測(cè)定包括免疫細(xì)胞化學(xué)測(cè)定，其使用經(jīng)過(guò)標(biāo)記或未標(biāo)記過(guò)的抗體來(lái)檢測(cè)重靶向內(nèi)肽酶的結(jié)合，參見(jiàn)例如，AtsushiNishikawa等，ThereceptorandtransporterforinternalizationofClostridiumbotulinumtypeCprogenitortoxinintoHT-29cells,319(2)Biochem.Biophys.Res.Commun.327-333(2004)；以及免疫沉淀測(cè)定，參見(jiàn)例如，YukakoFujinaga等，MolecularcharacterizationofbindingsubcomponentsofClostridiumbotulinumtypeCprogenitortoxinforintestinalepithelialcellsanderythrocytes,150(Pt5)Microbiology15^-1538(2004)，其使用經(jīng)過(guò)標(biāo)記或未標(biāo)記過(guò)的抗體來(lái)檢測(cè)結(jié)合的重靶向內(nèi)肽酶。適用于這些測(cè)定的抗體包括但不限于針對(duì)重靶向內(nèi)肽酶選擇的抗體和/或針對(duì)重靶向內(nèi)肽酶受體選擇的抗體，例如0RL1、D0R、K0R、M0R、甘丙肽受體1、甘丙肽受體2或甘丙肽受體3。如果抗體經(jīng)過(guò)標(biāo)記，那么可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)，通過(guò)各種方式來(lái)檢測(cè)分子的結(jié)合，包括蛋白印跡分析、抗體細(xì)胞定位的直接顯微鏡觀察、洗滌步驟后細(xì)胞或底物結(jié)合的抗體的測(cè)量、流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)、電泳或毛細(xì)管電泳。如果抗體未標(biāo)記過(guò)，那么可以采用標(biāo)記二抗間接檢測(cè)結(jié)合的分子，而且該檢測(cè)可以參照標(biāo)記抗體的方式進(jìn)行。應(yīng)了解，這些和類似的測(cè)定重靶向內(nèi)肽酶攝取特性或特征的測(cè)定可用于鑒別表達(dá)內(nèi)源性重靶向內(nèi)肽酶受體或外源性或重靶向內(nèi)肽酶受體的細(xì)胞。還可以使用監(jiān)測(cè)暴露于重靶向內(nèi)肽酶之后的分子釋放情況的測(cè)定來(lái)評(píng)估細(xì)胞是否表達(dá)一種或多種內(nèi)源性重靶向內(nèi)肽酶受體或外源性重靶向內(nèi)肽酶受體。在這些測(cè)定中，在重靶向內(nèi)肽酶處理之后，表達(dá)重靶向內(nèi)肽酶受體的細(xì)胞中分子的釋放將受到抑制。眾所周知的測(cè)定包括測(cè)量神經(jīng)元中放射標(biāo)記的兒茶酚胺釋放(例如[3H]去甲腎上腺素或[3H]多巴胺釋放)的抑制的方法，參見(jiàn)例如，A!^ssio等，Evidenceforcalcium-dependentvesiculartransmitterreleaseinsensitivetotetanustoxinandbotulinumtoxintypeF,90(3)Neuroscience893-902(1999)；禾口SaraStigliani等，ThesensitivityofcatecholaminereleasetobotulinumtoxinClandEsuggestsselectivetargetingofvesiclessetintothereadilyreleasablepool,85(2)J.Neurochem.409-421(2003)；或使用熒光測(cè)定程序測(cè)量?jī)翰璺影丰尫诺姆椒?，參?jiàn)例如，AntondePaiva等，ArolefortheinterchaindisulfideoritsparticipatingthiolsintheinternalizationofbotulinumneurotoxinArevealedbyatoxinderivativethatbindstoecto-acceptorsandinhibitstransmitterreleaseintracellularly,268(28)J.Biol.Chem.20838-20844(1993)；GaryW.Lawrence等，Distinctexocytoticresponsesofintactandpermeabilisedchromaffincellsaftercleavageofthe25~kDasynaptosomal-associatedprotein(SNAP-25)orsynaptobrevinbybotulinumtoxinAorB,236(3)Eur.J.Biochem.877-886(1996)；禾口PatrickForan等，BotulinumneurotoxinClcleavesbothsyntaxinandSNAP-25inintactandpermeabilizedchromaffincells!correlationwithitsblockadeofcatecholaminerelease,35(8)Biochemistry2630-2636(1996)其它非限制性實(shí)例包括測(cè)量如垂體前葉細(xì)胞或卵巢細(xì)胞等內(nèi)分泌細(xì)胞中激素釋放的抑制的測(cè)定。應(yīng)了解，這些和類似的針對(duì)分子釋放的測(cè)定都可用于鑒別表達(dá)內(nèi)源性重靶向內(nèi)肽酶受體或外源性重靶向內(nèi)肽酶受體或重靶向內(nèi)肽酶受體的細(xì)胞。也可以使用檢測(cè)SNAP-25底物暴露于重靶向內(nèi)肽酶之后的裂解情況的測(cè)定來(lái)評(píng)估細(xì)胞是否表達(dá)一種或多種內(nèi)源性重靶向內(nèi)肽酶受體或外源性重靶向內(nèi)肽酶受體。在這些測(cè)定中，經(jīng)過(guò)重靶向內(nèi)肽酶處理后，在表達(dá)重靶向內(nèi)肽酶受體的細(xì)胞中將檢測(cè)到SNAP-25裂解產(chǎn)物的產(chǎn)生或完整SNAP-25的消失。特定蛋白印跡分析的非限制性實(shí)例以及充分表征的試劑、條件和方案易于從供應(yīng)商獲得，包括但不限于=AmershamBiosciences,Piscataway,NJ；Bio-RadLaboratories,Hercules,CA；PierceBiotechnology,Inc.,Rockford,IL；PromegaCorporation,Madison,WI；禾口Stratagene,Inc.,LaJolla,CA。應(yīng)了解，這些和類似的針對(duì)SNAP-25裂解的測(cè)定都可用于鑒別表達(dá)內(nèi)源性重靶向內(nèi)肽酶受體或外源性重靶向內(nèi)肽酶受體的細(xì)胞。在非限制性實(shí)例中，可以使用蛋白印跡分析來(lái)測(cè)定重靶向內(nèi)肽酶的攝取，該分析方法是使用可識(shí)別SNAP-25裂解產(chǎn)物或者SNAP-25的裂解和未裂解形式的抗體進(jìn)行。適用于這些測(cè)定的α-SNAP-25抗體的實(shí)例包括但不限于SMI_81α-SNAP-25小鼠單克隆抗體(SternbergerMonoclonalsInc.，Lutherville,MD)、CI71.1小鼠α-SNAP-25單克隆抗體(SynapticSystems,Goettingen,Germany)、CI71.2α-SNAP-25小鼠單克隆抗#(SynapticSystems,Goettingen,Germany)、SP12α-SNAP-25(Abeam,Cambridge,MA)、α-SNAP-25^,^^Hiilifiiyf(SynapticSystems,Goettingen,Germany)、α-SNAP-25兔多克隆抗血清S9684(Sigma，St.Louis,M0)和α-SNAP-25兔多克隆抗血清(Abeam,Cambridge,ΜΑ)。本公開的方面提供通過(guò)遺傳操作或重組工程改造而表達(dá)外源性SNAP-25和/或一種或多種外源性重靶向內(nèi)肽酶受體的細(xì)胞。適用于通過(guò)遺傳操作或重組工程改造而表達(dá)外源性SNAP-25和/或一種或多種外源性重靶向內(nèi)肽酶受體的細(xì)胞包括可能表達(dá)或不表達(dá)內(nèi)源性SNAP-25和/或一種或多種內(nèi)源性重靶向內(nèi)肽酶受體的神經(jīng)元細(xì)胞和非神經(jīng)元細(xì)胞。還應(yīng)了解，這些經(jīng)過(guò)基因操作或重組工程改造的細(xì)胞可以在構(gòu)成性、組織特異性、細(xì)胞特異性或可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子元件、增強(qiáng)子元件或二者的控制下表達(dá)外源性SNAP-25以及一種或多種外源性重靶向內(nèi)肽酶受體。應(yīng)了解，任何細(xì)胞都可以使用，只要細(xì)胞經(jīng)過(guò)遺傳操作或重組工程改造，能夠表達(dá)外源性SNAP-25和/或一種或多種外源性重靶向內(nèi)肽酶受體，并且能夠經(jīng)受重靶向內(nèi)肽酶活性。適用于將某種外源性多核苷酸分子引入細(xì)胞中的方法包括但不限于化學(xué)物質(zhì)介導(dǎo)的遞送方法，例如磷酸鈣介導(dǎo)的遞送方法、二乙基氨乙基(DEAE)葡聚糖介導(dǎo)的遞送方法、脂質(zhì)介導(dǎo)的遞送方法、聚乙烯亞胺(PEI)介導(dǎo)的遞送方法、聚賴氨酸介導(dǎo)的遞送方法和聚凝胺介導(dǎo)的遞送方法；物理方式介導(dǎo)的遞送方法，例如基因槍遞送、顯微注射、原生質(zhì)體融合和電穿孔；和病毒介導(dǎo)的遞送方法，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，參見(jiàn)例如，IntroducingClonedGenesintoCulturedMammalianCells,第16.1-16.62頁(yè)(Sambrook禾口尺ussell|||，MolecularCloningALaboratoryManual,H33IK,2001年)；AlessiaColosimo等，TransferandExpressionofForeignGenesinMammalianCells,29(2)Biotechniques314—318，320—322，324(2000)；PhilipWashbourne禾口A.KimberleyMcAllister,TechniquesforGeneTransferintoNeurons,12(5)Curr.Opin.Neurobiol.566-573(2002)；禾口CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons,pp9.16.4-9.16.11頁(yè)(2000)，各文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容以引用的方式并入本文；本方法中的外源性多核苷酸分子將編碼使細(xì)胞經(jīng)歷整個(gè)細(xì)胞機(jī)制，由此使重靶向內(nèi)肽酶蛋白水解裂解如SNAP-25、0RL1、D0R、K0R或MOR等SNAP-25底物所需的組分。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，將多核苷酸分子引入細(xì)胞中特定方法的選擇將部分取決于細(xì)胞是暫時(shí)還是穩(wěn)定地含有使細(xì)胞經(jīng)歷整個(gè)細(xì)胞機(jī)制，由此使重靶向內(nèi)肽酶通過(guò)蛋白水解裂解SNAP-25底物所需的組分。編碼使細(xì)胞經(jīng)歷整個(gè)細(xì)胞機(jī)制，由此使重靶向內(nèi)肽通過(guò)酶蛋白水解裂解SNAP-25底物所需的組分的多核苷酸分子的非限制性實(shí)例如下0RL1多核苷酸分子SEQIDNO61或SEQIDNO62；DOR多核苷酸分子SEQIDNO63或SEQIDNO64；KOR多核苷酸分子SEQIDNO65或SEQIDNO66；MOR多核苷酸分子SEQIDNO67；甘丙肽受體1多核苷酸分子SEQIDNO:141、SEQIDNO:142或SEQIDNO:143；甘丙肽受體2多核苷酸分子SEQIDNO144或甘丙肽受體3多核苷酸分子SEQIDNO:145；以及SNAP-25多核苷酸分子SEQIDNO68或SEQIDNO:69。本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知化學(xué)物質(zhì)介導(dǎo)的遞送方法，且這些方法描述于例如MartinJordan禾口FlorianWorm,TransfectionofAdherentandSuspendedCellsbyCalciumPhosphate,33(2)Methods136-143(2004)；ChunZhangPolyethylenimineStrategiesforPlasmidDeliverytoBrain-DerivedCells,33(2)Methods144-150(2004)，各文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容據(jù)此以引用的方式并入本文。這些化學(xué)物質(zhì)介導(dǎo)的遞送方法可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)程序制備，并且可以商購(gòu)獲得，參見(jiàn)例如，CellPhect轉(zhuǎn)染試劑盒(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)；哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)染試劑盒、磷酸鈣和DEAE葡聚糖(Stratagene，Inc.,LaJolla,CA)；LipofectamineTM轉(zhuǎn)染i式齊[J(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)；ExGen500轉(zhuǎn)染試劑盒(Fermentas,Inc.，Hanover,MD)；和SuperFect和Effectene轉(zhuǎn)染試劑盒(Qiagen,Inc.,Valencia,CA)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員眾所周知物理方式介導(dǎo)的遞送方法，且這些方法描述于例如JeikeE.Biewenga等，Plasmid-MediatedGeneTransferinNeuronsusingtheBiolisticsTechnique,71(1)J.Neurosci.Methods.67-75(1997)；John0，Brien禾口SarahC.R.Lummis,BiolisticandDiolisticTransfection:UsingtheGeneGuntoDeliverDNAandLipophilicDyesintoMammalianCells,33(2)Methods121-125(2004)；Μ.Golzio等，InVitroandInVivoElectricField-MediatedPermeabilization,GeneTransfer，andExpression，33(2)Methods，126-135(2004)；禾口OliverGresch等，NewNon-ViralMethodforGeneTransferintoPrimaryCells，33(2)Methods，151-163(2004)，各文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容據(jù)此以引用的方式并入本文。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員眾所周知病毒介導(dǎo)的遞送方法，且這些方法描述于例如ChooiM.Lai等，AdenovirusandAdeno-AssociatedVirusVectors,21(12)DNACellBiol.895-913(2002)；IlyaFrolovAlphavirus-BasedExpressionVectorsStrategiesandApplications,93(21)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.11371-11377(1996)；RolandWolkowicz等，LentiviralVectorsfortheDeliveryofDNAintoMammalianCells，246，MethodsMol.Biol.391-411(2004)；A.Huser禾口C.Hofmann，BaculovirusVectors:NovelMammalianCellGene-DeliveryVehiclesandTheirApplications，3(I)Am.J.Pharmacogenomics53-63(2003)；TizianaTonini等，TransientProductionofRetroviral-andLentiviral-BasedVectorsfortheTransductionofMammalianCells，285，MethodsMol.Biol.141-148(2004)；ManfredGossen禾口HermannBujard，TightControlofGeneExpressioninEukaryoticCellsbyTetracycline-ResponsivePromoters,美國(guó)專利第5，464，758號(hào)；HermannBujard禾口ManfredGossen，MethodsforRegulatingGeneExpression,美國(guó)專禾丨J第5，814，618號(hào)；DavidS.Hogness,PolynucleotidesEncodingInsectSteroidHormoneReceptorPolypeptidesandCellsTransformedWithSame，美國(guó)專利第5，514，578號(hào)；DavidS.Hogness，PolynucleotidesEncodingInsectEcdysoneReceptor，美國(guó)專利6，245，531；ElisabettaVegeto等，ProgesteroneReceptorHavingC.TerminalHormoneBindingDomainTruncations，美國(guó)專利第5，364，791號(hào)；ElisabettaVegeto等，MutatedSteroidHormoneReceptors，MethodsforTheirUseandMolecularSwitchforGeneTherapy，美國(guó)專利第5，874，534號(hào)，各專利文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容據(jù)此以引用的方式并入本文。這些病毒介導(dǎo)的遞送方法可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)程序制備，并且可以商購(gòu)獲得，參見(jiàn)例如ViraPower腺病毒表達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen，Inc.，Carlsbad,CA)和ViraPower腺病毒表達(dá)系統(tǒng)使用說(shuō)明25-0543A版，InvitrogenInc.，(2002年7月15日)；以及AdEasyTM腺病毒載體系統(tǒng)(Stratagene，he.，LaJolla，CA)和AdEasy腺病毒載體系統(tǒng)使用說(shuō)明064004f，Stratagene,Inc0此外，這些病毒遞送系統(tǒng)也可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法制備，并且可以商購(gòu)獲得，參見(jiàn)例如，BDTet-Off和Tet-On基因表達(dá)系統(tǒng)(BDBiosciences-Clonetech,PaloAlto,CA)和BDTet-Off和Tet-On基因表達(dá)系統(tǒng)使用說(shuō)明PT3001-1，BDBiosciencesClonetech(2003年3月14日)、GeneSwitch系統(tǒng)(InvitrogenJnc.,Carlsbad,CA)和GeneSwitch系統(tǒng)A米非司酮調(diào)控的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)D版，25-0313，InvitrogenInc.，(2002年11月4日)；ViraPower慢病毒表達(dá)系統(tǒng)anvitrogenjnc.,Carlsbad,CA)和ViraPower慢病毒表達(dá)系統(tǒng)使用說(shuō)明25-0501E版，InvitrogenInc.，(2003年12月8日)；以及CompleteControl逆轉(zhuǎn)錄病毒誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)(Stratagene，LaJolla,CA)和CompleteControl逆轉(zhuǎn)錄病毒誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)使用說(shuō)明，064005e。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，來(lái)自確立細(xì)胞系的對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性敏感的細(xì)胞暫時(shí)含有編碼使細(xì)胞經(jīng)歷整個(gè)細(xì)胞機(jī)制，由此使重靶向內(nèi)肽酶蛋白水解裂解SNAP-25底物所需的組分的多核苷酸分子。在另一實(shí)施方案中，來(lái)自確立細(xì)胞系的對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性敏感的細(xì)胞暫時(shí)含有編碼使細(xì)胞經(jīng)歷整個(gè)細(xì)胞機(jī)制，由此使重靶向內(nèi)肽酶蛋白水解裂解SNAP-25底物所需的多個(gè)組分的多核苷酸分子。在該實(shí)施方案的方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性敏感的細(xì)胞暫時(shí)含有編碼ORLl、DOR、K0R、MOR或SNAP-25的多核苷酸分子。在該實(shí)施方案的方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性敏感的細(xì)胞暫時(shí)含有編碼ORLl的多核苷酸分子SEQIDN0:61或SEQIDNO:62。在該實(shí)施方案的其它方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性敏感的細(xì)胞暫時(shí)含有編碼DOR的多核苷酸分子SEQIDN0:63或SEQIDNO:64。在該實(shí)施方案的其它方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性敏感的細(xì)胞暫時(shí)含有編碼KOR的多核苷酸分子SEQIDN0:65或SEQIDNO:66。在該實(shí)施方案的其它方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性敏感的細(xì)胞暫時(shí)含有編碼MOR的多核苷酸分子SEQIDN0:67。在該實(shí)施方案的其它方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性敏感的細(xì)胞暫時(shí)含有編碼甘丙肽受體1的多核苷酸分子SEQIDNO:141,SEQIDNO:142或SEQIDNO143。在該實(shí)施方案的其它方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性敏感的細(xì)胞暫時(shí)含有編碼甘丙肽受體2的多核苷酸分子SEQIDNO:144。在該實(shí)施方案的其它方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性敏感的細(xì)胞暫時(shí)含有編碼甘丙肽受體3的多核苷酸分子SEQIDNO:145。在該實(shí)施方案的其它方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性敏感的細(xì)胞暫時(shí)含有編碼SNAP-25的多核苷酸分子SEQIDNO68或SEQIDNO:69。在另一實(shí)施方案中，來(lái)自確立細(xì)胞系的對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性敏感的細(xì)胞穩(wěn)定含有編碼使細(xì)胞經(jīng)歷整個(gè)細(xì)胞機(jī)制，由此使重靶向內(nèi)肽酶蛋白水解裂解SNAP-25底物所需的組分的多核苷酸分子。在另一實(shí)施方案中，來(lái)自確立細(xì)胞系的對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性敏感的細(xì)胞穩(wěn)定含有編碼使細(xì)胞經(jīng)歷整個(gè)細(xì)胞機(jī)制，由此使重靶向內(nèi)肽酶蛋白水解裂解SNAP-25底物所需的多個(gè)組分的多核苷酸分子。在該實(shí)施方案的方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性敏感的細(xì)胞穩(wěn)定含有編碼0RL1、DOR、K0R、MOR或SNAP-25的多核苷酸分子。在該實(shí)施方案的方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性敏感的細(xì)胞穩(wěn)定含有編碼ORLl的多核苷酸分子SEQIDN0:61或SEQIDNO:62。在該實(shí)施方案的其它方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性敏感的細(xì)胞穩(wěn)定含有編碼DOR的多核苷酸分子SEQIDN0:63或SEQIDN0:64。在該實(shí)施方案的其它方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性敏感的細(xì)胞穩(wěn)定含有編碼KOR的多核苷酸分子SEQIDN0:65或SEQIDNO:66。在該實(shí)施方案的其它方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性敏感的細(xì)胞穩(wěn)定含有編碼MOR的多核苷酸分子SEQIDNO:67ο在該實(shí)施方案的其它方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性敏感的細(xì)胞穩(wěn)定含有編碼甘丙肽受體1的多核苷酸分子SEQIDNO:141,SEQIDNO:142或SEQIDNO143。在該實(shí)施方案的其它方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性敏感的細(xì)胞穩(wěn)定含有編碼甘丙肽受體2的多核苷酸分子SEQIDNO:144。在該實(shí)施方案的其它方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性敏感的細(xì)胞穩(wěn)定含有編碼甘丙肽受體3的多核苷酸分子SEQIDNO:145。在該實(shí)施方案的其它方面，來(lái)自確立細(xì)胞系的對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性敏感的細(xì)胞穩(wěn)定含有編碼SNAP-25的多核苷酸分子SEQIDNO68或SEQIDNO:69。如上文所提到的，可以在細(xì)胞中引入本說(shuō)明書中公開的使細(xì)胞經(jīng)歷整個(gè)細(xì)胞機(jī)制，由此使重靶向內(nèi)肽酶通過(guò)蛋白水解裂解如SNAP-25、0RL1、D0R、K0R、M0R、甘丙肽受體1、甘丙肽受體2或甘丙肽受體3等SNAP-25底物所需的外源性組分?？梢允褂萌魏魏退杏糜诶眠f送劑將此類外源性組分引入細(xì)胞群的方法，前提條件是此方法可暫時(shí)將本說(shuō)明書中公開的外源性組分引入給定細(xì)胞群內(nèi)至少50%的細(xì)胞中。因此，該實(shí)施方案的方面可包括細(xì)胞群，其中給定細(xì)胞群中例如至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%暫時(shí)含有本說(shuō)明書中公開的使細(xì)胞經(jīng)歷整個(gè)細(xì)胞機(jī)制，由此使重靶向內(nèi)肽酶通過(guò)蛋白水解裂解如SNAP-25、0RL1、D0R、K0R、M0R、甘丙肽受體1、甘丙肽受體2或甘丙肽受體3等SNAP-25底物所需的外源性組分。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“遞送劑”是指使共價(jià)連接、非共價(jià)連接或以任何其它方式締合的多肽內(nèi)化到細(xì)胞中能夠?qū)崿F(xiàn)或增加的任何分子。因此，術(shù)語(yǔ)“遞送劑”涵蓋但不限于，(不限于)將共價(jià)或非共價(jià)連接的分子運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核的蛋白質(zhì)、肽、擬肽、小分子、多核苷酸分子、脂質(zhì)體、脂質(zhì)、病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和細(xì)胞。還應(yīng)了解，術(shù)語(yǔ)“遞送劑”涵蓋通過(guò)任何機(jī)制內(nèi)化的分子，包括通過(guò)受體介導(dǎo)的胞吞作用起效的遞送劑，以及不依靠受體介導(dǎo)的胞吞作用的遞送劑。遞送劑還可以是例如通過(guò)化學(xué)綴合或通過(guò)基因方法產(chǎn)生的融合蛋白，使如SNAP-25、ORLl、DOR、KOR、M0R、甘丙肽受體1、甘丙肽受體2或甘丙肽受體3等共價(jià)連接的組分的細(xì)胞攝取能夠?qū)崿F(xiàn)或增加的試劑。共價(jià)連接遞送劑的方法和這些試劑的使用方法描述于例如以下專利文獻(xiàn)中:StevenF.Dowdy,ProteinTransductionSystemandMethodsofUseThereof，國(guó)際公布第WO00/34308號(hào)；G6rardChassaing和AlainProchiantz,PeptideswhichcanbeUsedasVectorsfortheIntracellularAddressingofActiveMolecules，美國(guó)專利第6，080，724號(hào)；AlanFrankel等，F(xiàn)usionProteinComprisingTAT-derivedTransportMoiert，美國(guó)專利第5，674，980號(hào)；AlanFrankel等，TAT-derivedTransportPolypeptideConjugates，美國(guó)專利第5，747，641號(hào)；AlanFrankel等，TAT-derivedTransportPolypeptidesandFusionProteins，美國(guó)專利第5，804，604號(hào)；PeterF.J.0，Hare等，UseofTransportProteins，美國(guó)專利第6，734，167號(hào)；Yao-ZhongLin禾口JackJ.Hawiger,MethodforImportingBiologicallyActiveMoleculesintoCells，美國(guó)專利第5，807，746號(hào)；Yao-ZhongLin和JackJ.HawigeriMethodforlmportingBiologicallyActiveMoleculesintoCells，美國(guó)專利第6，043，339號(hào)；Yao-ZhongLin等，SequenceandMethodforGeneticEngineeringofProteinswithCellMembraneTranslocatingActivity,美國(guó)專利第6，248，558號(hào)；Yao-ZhongLin等，SequenceandMethodforGeneticEngineeringofProteinswithCellMembraneTranslocatingActivity,美國(guó)專利第6，432，680號(hào)JackJ.Hawiger等，MethodforImportingBiologicallyActiveMoleculesintoCells，美國(guó)專利第6，495，518號(hào)；Yao-ZhongLin等，SequenceandMethodforGeneticEngineeringofProteinswithCellMembraneTranslocatingActivity,美國(guó)專利第6，780，843號(hào)JonathanB.Rothbard禾口PaulAWender,MethodandCompositionforEnhancingTransportAcrossBiologicalMembranes，美國(guó)專利第6，306，993號(hào)JonathanB.Rothbard禾口PaulAWender,MethodandCompositionforEnhancingTransportAcrossBiologicalMembranes，美15專禾第6，495，663號(hào)；以及PamelaB.Davis等，F(xiàn)usionProteinsforProteinDelivery,美國(guó)專利第6，287,817號(hào)，各專利的全部?jī)?nèi)容以引用的方式并入本文。遞送劑也可以是使如SNAP-25、ORLUDOR、K0R、M0R、甘丙肽受體1、甘丙肽受體2或甘丙肽受體3等非共價(jià)締合的組分的細(xì)胞攝取能夠?qū)崿F(xiàn)或增加的試劑。在不存在共價(jià)鍵的情況下起作用的方法以及這些試劑的使用方法描述于例如以下文獻(xiàn)中=GillesDivita等，Peptide-MediatedTransfectionAgentsandMethodsofUse，美國(guó)專利第6，841，535號(hào)；PhilipLFeigner禾口OlivierZelphati，IntracellularProteinDeliveryCompositionsandMethodsofUse，美國(guó)專利公布第2003/0008813號(hào)；以及MichaelKaras，IntracellularDeliveryofSmallMolecules，ProteinsandNucleicAcids，美國(guó)專利公布2004/0209797，各專利的全部?jī)?nèi)容以引用的方式并入本文。這些肽遞送劑可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法制備和使用，并且可商購(gòu)獲得，參見(jiàn)例如CHARIOT試劑(ActiveMotif,Carlsbad,CA)；BI0-P0RTER試劑(GeneTherapySystems,Inc.，SanDiego,CA)、BIOTREK蛋白質(zhì)遞送劑(Stratagene，LaJolla,CA)和PRO-JECT蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染劑(PierceBiotechnologyInc.,Rockford,IL)。本發(fā)明的方面部分包括含重靶向內(nèi)肽酶的樣本。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“含重靶向內(nèi)肽酶的樣本”是指含有或可能含有活性重靶向內(nèi)肽酶的任何生物物質(zhì)。根據(jù)本說(shuō)明書中公開的方法，可以測(cè)定多種樣本，包括但不限于純化、部分純化或未純化的重靶向內(nèi)肽酶；具有天然或非天然序列的重組單鏈或雙鏈重靶向內(nèi)肽酶；具有經(jīng)修改的蛋白酶特異性的重組重靶向內(nèi)肽酶；具有變化的細(xì)胞特異性的重組重靶向內(nèi)肽酶；大量重靶向內(nèi)肽酶；經(jīng)過(guò)配制的重靶向內(nèi)肽酶產(chǎn)物；以及例如細(xì)菌、酵母、昆蟲或哺乳動(dòng)物來(lái)源的細(xì)胞或粗制的、分級(jí)分離的或部分純化的細(xì)胞裂解物；血液、血漿或血清；生食、半熟食、熟食或加工過(guò)的食物；飲料；動(dòng)物飼料；土壤樣本；水樣本；塘底泥；洗劑；化妝品；和臨床制劑。應(yīng)了解，術(shù)語(yǔ)樣本涵蓋組織樣本，包括但不限于哺乳動(dòng)物組織樣本、家畜組織樣本，例如綿羊、奶牛和豬的組織樣本；靈長(zhǎng)類動(dòng)物的組織樣本；和人類的組織樣本。這些樣本涵蓋但不限于腸樣本，例如嬰兒腸樣本，以及從創(chuàng)口獲得的組織樣本。在非限制性實(shí)例中，可以使用檢測(cè)皮摩爾量的重靶向內(nèi)肽酶活性的方法來(lái)確定食物或飲料樣本中重靶向內(nèi)肽酶的存在或活性，測(cè)定例如暴露于重靶向內(nèi)肽酶或出現(xiàn)一種或多種肉毒中毒癥狀的人或動(dòng)物的樣本，在大量重靶向內(nèi)肽酶生產(chǎn)和純化期間跟蹤活性，測(cè)定醫(yī)藥或化妝品應(yīng)用中使用的經(jīng)過(guò)配制的重靶向內(nèi)肽酶產(chǎn)物，或測(cè)定受試者血清中中和α-重靶向內(nèi)肽酶抗體的存在與否。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，含重靶向內(nèi)肽酶的樣本是包含任何量的重靶向內(nèi)肽酶的樣本。在該實(shí)施方案的方面，含重靶向內(nèi)肽酶的樣本包含約IOOng或更少、約IOng或更少、約Ing或更少、約IOOpg或更少、約IOpg或更少或約Ipg或更少的重靶向內(nèi)肽酶。在該實(shí)施方案的其它方面，含重靶向內(nèi)肽酶的樣本包含約1μM或更少、約IOOnM或更少、約IOnM或更少、約InM或更少、約IOOnM或更少、約IOnM或更少、約InM或更少的重靶向內(nèi)肽酶。本發(fā)明的方面部分包括從經(jīng)過(guò)處理的細(xì)胞中分離出包含在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25的SNAP-25組分。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“包含在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25的SNAP-25組分”是指含有SNAP-25裂解產(chǎn)物的細(xì)胞組分。預(yù)期適于富集或分離SNAP-25組分的任何方法都可以使用，包括但不限于細(xì)胞裂解方案、旋轉(zhuǎn)柱純化方案、免疫沉淀法、親和純化法和蛋白質(zhì)色譜法。本公開的方面部分包括連接到固相載體的α-SNAP-25抗體。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“固相載體”與“固相”同義，意思指可用于固定本說(shuō)明書中公開的α-SNAP-25抗體的任何基質(zhì)。固相載體的非限制性實(shí)例包括例如試管；板；柱；針或“測(cè)驗(yàn)片(dipstick)，，；磁性粒子、珠?；蛘咂渌蛐位蚶w維性色譜分離介質(zhì)，例如瓊脂糖、瓊脂糖凝膠、二氧化硅和塑料；以及薄片或膜，例如硝基纖維素和聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride,PVDF)?？梢允褂萌绮Ａ?、碳、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍(nylon)、重氮纖維素或淀粉等多種材料構(gòu)造固相載體。所選固相載體的物理特性應(yīng)使其易于與可溶性或未結(jié)合材料分開，且一般應(yīng)使如過(guò)量試劑、反應(yīng)副產(chǎn)物或溶劑等未結(jié)合材料能與結(jié)合固相載體的測(cè)定組分分開或以其它方式移除(例如通過(guò)洗滌、過(guò)濾、離心等)。制備和使用固相載體的方法的非限制性實(shí)例描述于例如MolecularCloning,ALaboratoryManual，同上文，(2001)；和CurrentProtocolsinMolecularBiology，同上文，(2004)中，各文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容據(jù)此以引用的方式并入本文。本發(fā)明的方面部分包括檢測(cè)抗體-抗原復(fù)合物的存在，這種抗體-抗原復(fù)合物包含選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體和在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25裂解產(chǎn)物。預(yù)期任何檢測(cè)系統(tǒng)都可以用來(lái)實(shí)行該公開的基于免疫的方法的方面，前提是信噪比可達(dá)到使來(lái)自抗體-抗原復(fù)合物的信號(hào)與背景信號(hào)相區(qū)分的統(tǒng)計(jì)上顯著程度?；诿庖叩臋z測(cè)系統(tǒng)的非限制性實(shí)例包括免疫分析法，如蛋白印跡和斑點(diǎn)印跡法(dot-blotting)、免疫沉淀分析法、酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)和夾心ELISA。可以使用結(jié)合成像或光成像的放射自顯影法(AU)、化學(xué)發(fā)光(chemiluminescense，CL)、電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence,ECL)、生物發(fā)光(bioluminescence,BL)、焚光、共振會(huì)邑量轉(zhuǎn)移、平面極化、比色或流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)(flowcytometry,FC)實(shí)現(xiàn)信號(hào)的檢測(cè)?；诿庖叩臋z測(cè)系統(tǒng)的描述公幵于例如以下文獻(xiàn)中MichaelΜ.Rauhut，Chemiluminescence,Kirk-OthmerConciseEncyclopediaofChemicalTechnology(Grayson編，第3片反，JohnWileyandSons，1985)；A.W.Knight,AReviewofRecentTrendsinAnalyticalApplicationsofElectrogeneratedChemiluminescence,TrendsAnal.Chem.18(1)47-62(1999)；K.A.Fahnrich,等，RecentApplicationsofElectrogeneratedChemiluminescenceinChemicalAnalysis,Talanta54(4):531-559(2001)；CommonIyUsedTechniquesinMolecularCloning，第A8.1-A8-55頁(yè)(Sambrook禾口Russell編，MolecularCloningALaboratoryManual，第3卷，第3片反，2001)；DetectionSystems,第Α9·1-A9-49頁(yè)(Sambrook禾口Russell編，MolecularCloningALaboratoryManual，第3卷，第3片反，2001)；ElectrogeneratedChemiluminescence(AllenJ.Bard編，MarcelDekkerInc.，2004)，各文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容據(jù)此以引用的方式并入本文。夾心ELISA(或夾心免疫測(cè)定)是一種基于兩種抗體的方法，這兩種抗體將結(jié)合抗原上的不同表位。對(duì)相關(guān)抗原具有高結(jié)合特異性的捕捉抗體結(jié)合于固體表面。然后加入抗原，隨后加入稱為檢測(cè)抗體的第二抗體。檢測(cè)抗體結(jié)合抗原上與捕捉抗體所結(jié)合不同的表位?？乖虼恕氨粖A在”兩種抗體之間?？贵w對(duì)抗原的結(jié)合親合力通常是免疫測(cè)定靈敏度的主要決定因素。隨著抗原濃度增加，檢測(cè)抗體的量也增加，由此產(chǎn)生較高的測(cè)量響應(yīng)。為定量結(jié)合程度，可以使用不同報(bào)告系統(tǒng)，例如連接第二抗體的酶，和在酶促響應(yīng)中形成被視為檢測(cè)信號(hào)的讀數(shù)的報(bào)告子底物。產(chǎn)生的信號(hào)與樣本中存在的靶抗原的量成比例。用于測(cè)量結(jié)合事件的報(bào)告子底物將決定檢測(cè)模式。測(cè)量光譜光度的讀板器用于比色檢測(cè)。已經(jīng)開發(fā)出了化學(xué)發(fā)光和電化學(xué)發(fā)光底物，其進(jìn)一步擴(kuò)大了信號(hào)，并且可以在發(fā)光讀取器上讀出。報(bào)告子還可以是熒光讀出器，其中該測(cè)定的酶步驟被替換為熒光團(tuán)，且隨后使用熒光讀取器測(cè)量讀出信號(hào)。進(jìn)行ECL夾心ELISA所需的試劑和方案可商購(gòu)獲得，包括但不限于MSD夾心ELISA-ECL檢測(cè)平臺(tái)(MesoScaleDiscovery,Gaithersburg,MD)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用免疫印跡分析法、免疫沉淀分析法、ELISA或夾心ELISA來(lái)檢測(cè)抗體-抗原復(fù)合物的存在，這種抗體-抗原復(fù)合物包含選擇性結(jié)合在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25表位的α-SNAP-25抗體，以及在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25裂解產(chǎn)物。在該實(shí)施方案的方面，該檢測(cè)是使用AU、CL、ECL或BL免疫印跡分析法；AU、CL、ECL、BL或FC免疫沉淀分析法；AU、CL、ECL、BL或FCELISA；或者AU、CL、ECL、BL或FC夾心ELISA進(jìn)行的。本公開的方面可以按單重或多重方式實(shí)行。按單重方式實(shí)行的用于檢測(cè)重靶向內(nèi)肽酶活性的基于免疫的方法是一種只能檢測(cè)包含α-SNAP-25抗體和在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25裂解產(chǎn)物的抗體-抗原復(fù)合物的存在的方法。按多重方式實(shí)行的用于檢測(cè)重靶向內(nèi)肽酶活性的基于免疫的方法是一種同時(shí)檢測(cè)兩種或兩種以上抗體-抗原復(fù)合物的存在的方法；其中一種抗體-抗原復(fù)合物是包含α-SNAP-25抗體和在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25裂解產(chǎn)物的抗體-抗原復(fù)合物；而另一種(其它)抗體-抗原復(fù)合物是針對(duì)第二、第三、第四等不同蛋白質(zhì)的抗體-抗原復(fù)合物。第二蛋白質(zhì)可以例如作為內(nèi)對(duì)照，以通過(guò)針對(duì)所檢測(cè)的針對(duì)第二種蛋白質(zhì)的抗體-抗原復(fù)合物的量將所檢測(cè)的α-SNAP-25/SNAP-25抗體-抗原復(fù)合物的量歸一化，來(lái)使樣本間的變化減到最少。因此，第二蛋白質(zhì)通常是始終由細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)，例如管家蛋白(house-ke印ingprotein)0適用的第二蛋白質(zhì)的非限制性實(shí)例包括例如3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、突觸融合蛋白、細(xì)胞因子。按多重方式進(jìn)行基于免疫的測(cè)定的方法描述于例如以下文獻(xiàn)中:U.B.Nielsen和B.H.Geierstanger,MultiplexedSandwichAssaysinMicroarrayFormat,J.Immunol.Methods.290(1~2)107-1202004)；R.Barry禾口Μ,Soloviev,QuantitativeProteinProfilingusingAntibodyArrays,Proteomics,4(12):3717-3726(2004)；Μ.Μ.Ling等，MultiplexingMolecularDiagnosticsandImmunoassaysusingEmergingMicroarrayTechnologies,ExpertRevMolDiagn.7(1):87-98(2007)；S.X.Leng等，ELISAandMultiplexTechnologiesforCytokineMeasurementinInflammationandAgingResearch,JGerontolABiolSciMedSci.63(8):879-884^008)，各文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容據(jù)此以引用的方式并入本文。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，按單重方式實(shí)行的用于檢測(cè)重靶向內(nèi)肽酶活性的基于51免疫的方法只檢測(cè)包含α-SNAP-25抗體和在ΒοΝΤ/Α裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25裂解產(chǎn)物的抗體-抗原復(fù)合物的存在。在另一實(shí)施方案中，按多重方式實(shí)行的用于檢測(cè)重靶向內(nèi)肽酶活性的基于免疫的方法同時(shí)檢測(cè)包含α"SNAP-25抗體和在ΒοΝΤ/Α裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25裂解產(chǎn)物以及至少一種針對(duì)除SNAP-25外的蛋白質(zhì)(例如GAPDH或突觸融合蛋白)的其它抗體_抗原復(fù)合物的抗體-抗原復(fù)合物存在。本公開的方面部分提供用于測(cè)定重靶向內(nèi)肽酶免疫抗性的方法。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“重靶向內(nèi)肽酶免疫抗性”是指由于哺乳動(dòng)物的免疫響應(yīng)直接或間接降低了重靶向內(nèi)肽酶療法的功效，使得這種哺乳動(dòng)物不對(duì)重靶向內(nèi)肽酶療法充分起反應(yīng)，或顯示出降低的重靶向內(nèi)肽酶療法的有益作用。功效降低的非限制性實(shí)例將出現(xiàn)在具有至少一種中和α-重靶向內(nèi)肽酶抗體的哺乳動(dòng)物中，這種抗體以降低或阻止重靶向內(nèi)肽酶的特異性或活性的方式結(jié)合重靶向內(nèi)肽酶。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“重靶向內(nèi)肽酶療法”是指以治療、改善、治愈、愈合、康復(fù)或任何其它方式對(duì)抗需要使用重靶向內(nèi)肽酶進(jìn)行的神經(jīng)調(diào)節(jié)的哺乳動(dòng)物發(fā)生的不合需要的事件，或者對(duì)哺乳動(dòng)物施用一種或多種控制劑量的具有醫(yī)療、治療、治愈、化妝、補(bǔ)救和任何其它有益作用的重靶向內(nèi)肽酶的藥物、制劑或混合物。重靶向內(nèi)肽酶療法涵蓋但不限于使用其任何天然存在或經(jīng)過(guò)修飾的片段組合任何載體或活性成分的任何制劑，并通過(guò)任何施用途徑施用。本公開的方面部分提供從哺乳動(dòng)物中獲得的用于測(cè)試α-重靶向內(nèi)肽酶中和抗體的存在與否的測(cè)試樣本。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“測(cè)試樣本”是指含有或可能含有至少一種α-重靶向內(nèi)肽酶抗體的任何生物物質(zhì)。α-重靶向內(nèi)肽酶抗體可以是中和α-重靶向內(nèi)肽酶抗體或非中和α-重靶向內(nèi)肽酶抗體。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“中和α-重靶向內(nèi)肽酶抗體”是指在生理?xiàng)l件下將以一定方式結(jié)合重靶向內(nèi)肽酶某一區(qū)域，從而降低或阻止重靶向內(nèi)肽酶發(fā)揮其在重靶向內(nèi)肽酶療法中的作用的任何α-重靶向內(nèi)肽酶抗體。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“非中和α-重靶向內(nèi)肽酶抗體”是指在生理?xiàng)l件下將結(jié)合重靶向內(nèi)肽酶某一區(qū)域，但不阻止重靶向內(nèi)肽酶發(fā)揮其在重靶向內(nèi)肽酶療法中的作用的任何α-重靶向內(nèi)肽酶抗體。預(yù)期可含有α-重靶向內(nèi)肽酶抗體的任何和所有樣本都可以用于本方法中，包括但不限于血液、血漿、血清和淋巴液。此外，能夠產(chǎn)生針對(duì)重靶向內(nèi)肽酶的α-重靶向內(nèi)肽酶抗體的任何和所有生物體都可用作樣本來(lái)源，包括但不限于鳥類和哺乳動(dòng)物類，包括小鼠、大鼠、山羊、綿羊、馬、驢、奶牛、靈長(zhǎng)類動(dòng)物和人類。有關(guān)血液采集和血清制備的具體方案的非限制性實(shí)例描述于例如以下文獻(xiàn)中MarjorieSchaubDiLorenzo和SusanKingStrasinger,BloodCollectioninHealthcare(F.A.DavisCompany,2001)；以及DianaGarza禾口KathleenBecan-McBride,PhlebotomyHandbook:BloodCollectionEssentials(PrenticeHall，第6版，2002)。這些方案屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員技能范圍且是本文中教導(dǎo)的常規(guī)程序。測(cè)試樣本可以在生物體暴露于重靶向內(nèi)肽酶之前、單次重靶向內(nèi)肽酶治療后、多次重靶向內(nèi)肽酶治療后、重靶向內(nèi)肽酶療法抗性發(fā)生前或重靶向內(nèi)肽酶療法抗性發(fā)生后獲得。本公開的方面部分提供對(duì)照樣本。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“對(duì)照樣本”是指已知存在或不存在測(cè)試樣本的任何樣本，并且包括陰性對(duì)照樣本和陽(yáng)性對(duì)照樣本。對(duì)于中和α-重靶向內(nèi)肽酶抗體，陰性對(duì)照樣本可以從未曾暴露于重靶向內(nèi)肽酶的個(gè)體獲得，且可包括但不限于在經(jīng)歷重靶向內(nèi)肽酶治療前從提供測(cè)試樣本的同一個(gè)體取得的樣本；從未曾暴露于重靶向內(nèi)肽酶的不同個(gè)體取得的樣本；從未曾暴露于BoNT/A的多個(gè)不同個(gè)體取得的合并樣本。對(duì)于中和α-重靶向內(nèi)肽酶抗體，陽(yáng)性對(duì)照樣本可以從表現(xiàn)重靶向內(nèi)肽酶免疫抗性的個(gè)體獲得，且包括但不限于在基于患者的測(cè)試測(cè)定中測(cè)試呈陽(yáng)性的個(gè)體；在體內(nèi)生物測(cè)定中測(cè)試呈陽(yáng)性的個(gè)體；和顯示高免疫性的個(gè)體，例如接種過(guò)重靶向內(nèi)肽酶的個(gè)體。還預(yù)期α-重靶向內(nèi)肽酶抗體可以由樣本純化得到。α-重靶向內(nèi)肽酶抗體可以使用多種程序由樣本純化得到，這些程序包括但不限于蛋白質(zhì)A/G色譜法和親和色譜法。用于純化樣本中的抗體的具體方案的非限制性實(shí)例描述于例如以下文獻(xiàn)中ANTIB0DIES=ALABORATORYMANUAL(EdwardHarlow禾口DavidLane編，ColdSpringHarborLaboratoryPress,第2版，199；USINGANTIBODIES:ALABORATORYMANUALPORTABLEPROTOCOLNo.I(EdwardHarlow禾口DavidLane,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1998)；和MOLECULARCLONING,ALABORATORYMANUAL，同上文，(2001)，這些文獻(xiàn)據(jù)此以引用的方式并入本文。此外，抗體純化方法以及充分表征的試劑、條件和方案的非限制性實(shí)例易于從供應(yīng)商獲得,包括但不限于PierceBiotechnologyInc.,Rockford,IL)；和ZymedLaboratoriesInc.,SouthSanFrancisco，CA。這些方案是本領(lǐng)域技術(shù)人員技能范圍內(nèi)的常規(guī)程序。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，樣本包含血液。在該實(shí)施方案的一方面，樣本包含小鼠血、大鼠血、山羊血、綿羊血、馬血、驢血、奶牛血、靈長(zhǎng)類動(dòng)物血或人血。在另一實(shí)施方案中，樣本包含血漿。在該實(shí)施方案的一方面，測(cè)試樣本包含小鼠血漿、大鼠血漿、山羊血漿、綿羊血漿、馬血漿、驢血漿、奶牛血漿、靈長(zhǎng)類動(dòng)物血漿或人血漿。在另一實(shí)施方案中，樣本包含血清。在該實(shí)施方案的一方面，樣本包含小鼠血清、大鼠血清、山羊血清、綿羊血清、馬血清、驢血清、奶牛血清、靈長(zhǎng)類動(dòng)物血清或人血清。在另一實(shí)施方案中，樣本包含淋巴液。在該實(shí)施方案的一方面，樣本包含小鼠淋巴液、大鼠淋巴液、山羊淋巴液、綿羊淋巴液、馬淋巴液、驢淋巴液、奶牛淋巴液、靈長(zhǎng)類動(dòng)物淋巴液或人淋巴液。在另一實(shí)施方案中，樣本為測(cè)試樣本。在另一實(shí)施方案中，樣本為對(duì)照樣本。在該實(shí)施方案的方面，對(duì)照樣本為陰性對(duì)照樣本或陽(yáng)性對(duì)照樣本，本發(fā)明的方面部分提供在步驟(d)中檢測(cè)到的在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25的量與在步驟(e)中檢測(cè)到的在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1S基處具有羧基末端的SNAP-25的量的比較。在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣本中SNAP-25裂解產(chǎn)物的量高于對(duì)照樣本中SNAP-25裂解產(chǎn)物的量。在該實(shí)施方案的一方面，測(cè)試樣本中SNAP-25裂解產(chǎn)物的量高于陽(yáng)性對(duì)照樣本表明，哺乳動(dòng)物具有較低重靶向內(nèi)肽酶免疫抗性或缺乏重靶向內(nèi)肽酶免疫抗性。在該實(shí)施方案的另一方面，測(cè)試樣本中SNAP-25裂解產(chǎn)物的量與陰性對(duì)照樣本相當(dāng)表明，哺乳動(dòng)物具有較低重靶向內(nèi)肽酶免疫抗性或缺乏重靶向內(nèi)肽酶免疫抗性。在另一實(shí)施方案中，測(cè)試樣本中SNAP-25裂解產(chǎn)物的量低于對(duì)照樣本中SNAP-25裂解產(chǎn)物的量。在該實(shí)施方案的一方面，測(cè)試樣本中SNAP-25裂解產(chǎn)物的量比陽(yáng)性對(duì)照樣本低或與之相當(dāng)將表明，哺乳動(dòng)物具有增加的重靶向內(nèi)肽酶免疫抗性或存在重靶向內(nèi)肽酶免疫抗性。在該實(shí)施方案的另一方面，測(cè)試樣本中SNAP-25裂解產(chǎn)物的量低于陰性對(duì)照樣本表明，哺乳動(dòng)物具有較高重靶向內(nèi)肽酶免疫抗性或存在重靶向內(nèi)肽酶免疫抗性。預(yù)期適于檢測(cè)樣本中中和α-重靶向內(nèi)肽酶抗體的存在的任何和所有測(cè)定條件都可用于本說(shuō)明書中公開的方法，例如線性測(cè)定條件和非線性測(cè)定條件。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些分析測(cè)定呈線性。在該實(shí)施方案的一方面，重靶向內(nèi)肽酶的測(cè)定量是過(guò)量的。在該實(shí)施方案的另一方面，重靶向內(nèi)肽酶的測(cè)定量是限速的。在該實(shí)施方案的另一方面，測(cè)試樣本的測(cè)定量是限速的。本公開的方面也可描述如下1.一種用于檢測(cè)重靶向內(nèi)肽酶活性的方法，所述方法包括以下步驟a)用包含重靶向內(nèi)肽酶的樣本處理來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞，其中來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞對(duì)重靶向內(nèi)肽酶的重靶向內(nèi)肽酶活性敏感；b)從經(jīng)過(guò)處理的細(xì)胞中分離出SNAP-25組分，所述SNAP-25組分包含在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25裂解產(chǎn)物；c)使SNAP-25組分與α-SNAP-25抗體接觸，其中α-SNAP-25抗體結(jié)合SNAP-25裂解產(chǎn)物中在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處包含羧基末端的表位；和d)檢測(cè)抗體-抗原復(fù)合物的存在，所述抗體-抗原復(fù)合物包含α-SNAP-25抗體和SNAP-25裂解產(chǎn)物；其中抗體-抗原復(fù)合物的檢測(cè)將指示重靶向內(nèi)肽酶活性。2.一種用于檢測(cè)重靶向內(nèi)肽酶活性的方法，所述方法包括以下步驟a)用包含重靶向內(nèi)肽酶的樣本處理來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞，其中來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞對(duì)重靶向內(nèi)肽酶的重靶向內(nèi)肽酶活性敏感；b)從經(jīng)過(guò)處理的細(xì)胞中分離出SNAP-25組分，所述SNAP-25組分包含在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25裂解產(chǎn)物；c)使SNAP-25組分與連接到固相載體的α-SNAP-25抗體接觸，其中α-SNAP-25抗體結(jié)合SNAP-25裂解產(chǎn)物中在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處包含羧基末端的表位；和d)檢測(cè)抗體-抗原復(fù)合物的存在，所述抗體-抗原復(fù)合物包含α-SNAP-25抗體和SNAP-25裂解產(chǎn)物；其中抗體-抗原復(fù)合物的檢測(cè)將指示重靶向內(nèi)肽酶活性。3.一種用于檢測(cè)重靶向內(nèi)肽酶活性的方法，所述方法包括以下步驟a)用包含重靶向內(nèi)肽酶的樣本處理來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞，其中來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞對(duì)重靶向內(nèi)肽酶的重靶向內(nèi)肽酶活性敏感；b)從經(jīng)過(guò)處理的細(xì)胞中分離出SNAP-25組分，所述SNAP-25組分包含在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25裂解產(chǎn)物；c)將SNAP-25組分固定于固相載體；d)使SNAP-25組分與α-SNAP-25抗體接觸，其中α-SNAP-25抗體結(jié)合SNAP-25裂解產(chǎn)物中在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處包含羧基末端的表位；和e)檢測(cè)抗體-抗原復(fù)合物的存在，所述抗體-抗原復(fù)合物包含α-SNAP-25抗體和SNAP-25裂解產(chǎn)物；其中抗體-抗原復(fù)合物的檢測(cè)將指示重靶向內(nèi)肽酶活性。4.一種用于檢測(cè)重靶向內(nèi)肽酶活性的方法，所述方法包括以下步驟a)用包含重靶向內(nèi)肽酶的樣本處理來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞，其中來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞可攝取重靶向內(nèi)肽酶；b)從經(jīng)過(guò)處理的細(xì)胞中分離出SNAP-25組分，所述SNAP-25組分包含在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25裂解產(chǎn)物；c)使SNAP-25組分與α-SNAP-25抗體接觸，其中α-SNAP-25抗體結(jié)合SNAP-25裂解產(chǎn)物中在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處包含羧基末端的表位；和d)檢測(cè)抗體-抗原復(fù)合物的存在，所述抗體-抗原復(fù)合物包含α-SNAP-25抗體和SNAP-25裂解產(chǎn)物；其中抗體-抗原復(fù)合物的檢測(cè)將指示重靶向內(nèi)肽酶活性。5.一種用于檢測(cè)重靶向內(nèi)肽酶活性的方法，所述方法包括以下步驟a)用包含重靶向內(nèi)肽酶的樣本處理來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞，其中來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞可攝取重靶向內(nèi)肽酶；b)從經(jīng)過(guò)處理的細(xì)胞中分離出SNAP-25組分，所述SNAP-25組分包含在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25裂解產(chǎn)物；c)使SNAP-25組分與連接到固相載體的α-SNAP-25抗體接觸，其中α-SNAP-25抗體結(jié)合SNAP-25裂解產(chǎn)物中在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處包含羧基末端的表位；和d)檢測(cè)抗體-抗原復(fù)合物的存在，所述抗體-抗原復(fù)合物包含α-SNAP-25抗體和SNAP-25裂解產(chǎn)物；其中抗體-抗原復(fù)合物的檢測(cè)將指示重靶向內(nèi)肽酶活性。6.一種用于檢測(cè)重靶向內(nèi)肽酶活性的方法，所述方法包括以下步驟a)用包含重靶向內(nèi)肽酶的樣本處理來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞，其中來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞可攝取重靶向內(nèi)肽酶；b)從經(jīng)過(guò)處理的細(xì)胞中分離出SNAP-25組分，所述SNAP-25組分包含在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25裂解產(chǎn)物；c)將SNAP-25組分固定于固相載體；d)使SNAP-25組分與α-SNAP-25抗體接觸，其中α-SNAP-25抗體結(jié)合SNAP-25裂解產(chǎn)物中在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處包含羧基末端的表位；和e)檢測(cè)抗體-抗原復(fù)合物的存在，所述抗體-抗原復(fù)合物包含α-SNAP-25抗體和SNAP-25裂解產(chǎn)物；其中抗體-抗原復(fù)合物的檢測(cè)將指示重靶向內(nèi)肽酶活性。7.一種用于測(cè)定哺乳動(dòng)物的重靶向內(nèi)肽酶免疫抗性的方法，其包括以下步驟a)將重靶向內(nèi)肽酶加入從哺乳動(dòng)物中獲得的用于測(cè)試α-重靶向內(nèi)肽酶中和抗體的存在與否的測(cè)試樣本中；b)用測(cè)試樣本處理來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞，其中來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性敏感；c)從經(jīng)過(guò)處理的細(xì)胞中分離出SNAP-25組分，所述SNAP-25組分包含在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25裂解產(chǎn)物；d)使SNAP-25組分與α-SNAP-25抗體接觸，其中所述α-SNAP-25抗體結(jié)合SNAP-25裂解產(chǎn)物中在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處包含羧基末端的表位；e)檢測(cè)抗體_抗原復(fù)合物的存在，所述抗體-抗原復(fù)合物包含α-SNAP-25抗體和SNAP-25裂解產(chǎn)物；f)用陰性對(duì)照樣本代替測(cè)試樣本，重復(fù)步驟b-e，陰性對(duì)照樣本包含重靶向內(nèi)肽酶以及已知不含α-重靶向內(nèi)肽酶中和抗體的血清；和g)將步驟e中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合物的量與步驟f中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合物的量相比較，其中檢測(cè)出步驟e中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合物的量少于步驟f中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合物的量，就指示存在α-重靶向內(nèi)肽酶中和抗體。8.一種用于測(cè)定哺乳動(dòng)物的重靶向內(nèi)肽酶免疫抗性的方法，其包括以下步驟a)將重靶向內(nèi)肽酶加入從哺乳動(dòng)物中獲得的用于測(cè)試α-重靶向內(nèi)肽酶中和抗體的存在與否的測(cè)試樣本中；b)用測(cè)試樣本處理來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞，其中來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性敏感；c)從經(jīng)過(guò)處理的細(xì)胞中分離出SNAP-25組分，所述SNAP-25組分包含在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25裂解產(chǎn)物；d)使SNAP-25組分與連接到固相載體的α-SNAP-25抗體接觸，其中所述α-SNAP-25抗體結(jié)合SNAP-25裂解產(chǎn)物中在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處包含羧基末端的表位；e)檢測(cè)抗體-抗原復(fù)合物的存在，所述抗體-抗原復(fù)合物包含α-SNAP-25抗體和SNAP-25裂解產(chǎn)物；f)用陰性對(duì)照樣本代替測(cè)試樣本，重復(fù)步驟b-e，陰性對(duì)照樣本包含重靶向內(nèi)肽酶以及已知不含α-重靶向內(nèi)肽酶中和抗體的血清；和g)將步驟e中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合物的量與步驟f中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合物的量相比較，其中檢測(cè)出步驟e中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合物的量少于步驟f中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合物的量，就指示存在α-重靶向內(nèi)肽酶中和抗體。9.一種用于測(cè)定哺乳動(dòng)物的重靶向內(nèi)肽酶免疫抗性的方法，其包括以下步驟a)將重靶向內(nèi)肽酶加入從哺乳動(dòng)物中獲得的用于測(cè)試α-重靶向內(nèi)肽酶中和抗體的存在與否的測(cè)試樣本中；b)用測(cè)試樣本處理來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞，其中來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞對(duì)重靶向內(nèi)肽酶活性敏感；c)從經(jīng)過(guò)處理的細(xì)胞中分離出SNAP-25組分，所述SNAP-25組分包含在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25裂解產(chǎn)物；d)將SNAP-25組分固定于固相載體；e)使SNAP-25組分與α-SNAP-25抗體接觸，其中所述α-SNAP-25抗體結(jié)合SNAP-25裂解產(chǎn)物中在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處包含羧基末端的表位；f)檢測(cè)抗體-抗原復(fù)合物的存在，所述抗體-抗原復(fù)合物包含a-SNAP-25抗體和SNAP-25裂解產(chǎn)物；g)用陰性對(duì)照樣本代替測(cè)試樣本，重復(fù)步驟b-f，陰性對(duì)照樣本包含重靶向內(nèi)肽酶以及已知不含α-重靶向內(nèi)肽酶中和抗體的血清；和h)將步驟f中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合物的量與步驟g中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合物的量相比較，其中檢測(cè)出步驟f中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合物的量少于步驟g中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合物的量，就指示存在α-重靶向內(nèi)肽酶中和抗體。10.一種用于測(cè)定哺乳動(dòng)物的重靶向內(nèi)肽酶免疫抗性的方法，其包括以下步驟a)將重靶向內(nèi)肽酶加入從哺乳動(dòng)物中獲得的用于測(cè)試α-重靶向內(nèi)肽酶中和抗體的存在與否的測(cè)試樣本中；b)用測(cè)試樣本處理來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞，其中來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞可攝取重靶向內(nèi)肽酶；c)從經(jīng)過(guò)處理的細(xì)胞中分離出SNAP-25組分，所述SNAP-25組分包含在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25裂解產(chǎn)物；d)使SNAP-25組分與α-SNAP-25抗體接觸，其中所述α-SNAP-25抗體結(jié)合SNAP-25裂解產(chǎn)物中在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處包含羧基末端的表位；e)檢測(cè)抗體_抗原復(fù)合物的存在，所述抗體-抗原復(fù)合物包含α-SNAP-25抗體和SNAP-25裂解產(chǎn)物；f)用陰性對(duì)照樣本代替測(cè)試樣本，重復(fù)步驟b-e，陰性對(duì)照樣本包含重靶向內(nèi)肽酶以及已知不含α-重靶向內(nèi)肽酶中和抗體的血清；和g)將步驟e中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合物的量與步驟f中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合物的量相比較，其中檢測(cè)出步驟e中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合物的量少于步驟f中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合物的量，就指示存在α-重靶向內(nèi)肽酶中和抗體。11.一種用于測(cè)定哺乳動(dòng)物的重靶向內(nèi)肽酶免疫抗性的方法，其包括以下步驟a)將重靶向內(nèi)肽酶加入從哺乳動(dòng)物中獲得的用于測(cè)試α-重靶向內(nèi)肽酶中和抗體的存在與否的測(cè)試樣本中；b)用測(cè)試樣本處理來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞，其中來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞可攝取重靶向內(nèi)肽酶；c)從經(jīng)過(guò)處理的細(xì)胞中分離出SNAP-25組分，所述出SNAP-25組分包含在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25裂解產(chǎn)物；d)使SNAP-25組分與連接到固相載體的α-SNAP-25抗體接觸，其中所述α-SNAP-25抗體結(jié)合SNAP-25裂解產(chǎn)物中在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處包含羧基末端的表位；e)檢測(cè)抗體-抗原復(fù)合物的存在，所述抗體-抗原復(fù)合物包含α-SNAP-25抗體和SNAP-25裂解產(chǎn)物；f)用陰性對(duì)照樣本代替測(cè)試樣本，重復(fù)步驟b-e，陰性對(duì)照樣本包含重靶向內(nèi)肽酶以及已知不含α-重靶向內(nèi)肽酶中和抗體的血清；和g)將步驟e中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合物的量與步驟f中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合物的量相比較，其中檢測(cè)出步驟e中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合物的量少于步驟f中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合物的量，就指示存在α-重靶向內(nèi)肽酶中和抗體。12.一種用于測(cè)定哺乳動(dòng)物的重靶向內(nèi)肽酶免疫抗性的方法，其包括以下步驟a)將重靶向內(nèi)肽酶加入從哺乳動(dòng)物獲得的用于測(cè)試α-重靶向內(nèi)肽酶中和抗體的存在與否的測(cè)試樣本中；b)用測(cè)試樣本處理來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞，其中來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞可攝取重靶向內(nèi)肽酶；c)從經(jīng)過(guò)處理的細(xì)胞中分離出SNAP-25組分，所述SNAP-25組分包含在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25裂解產(chǎn)物；d)將SNAP-25組分固定于固相載體；e)使SNAP-25組分與α-SNAP-25抗體接觸，其中所述α-SNAP-25抗體結(jié)合SNAP-25裂解產(chǎn)物中在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處包含羧基末端的表位；f)檢測(cè)抗體-抗原復(fù)合物的存在，所述抗體-抗原復(fù)合物包含a-SNAP-25抗體和SNAP-25裂解產(chǎn)物；g)用陰性對(duì)照樣本代替測(cè)試樣本，重復(fù)步驟b-f，陰性對(duì)照樣本包含重靶向內(nèi)肽酶以及已知不含α-重靶向內(nèi)肽酶中和抗體的血清；和h)將步驟f中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合物的量與步驟g中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合物的量相比較，其中檢測(cè)出步驟f中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合物的量少于步驟g中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合物的量，就指示存在α-重靶向內(nèi)肽酶中和抗體。13.根據(jù)1至3和7至9所述的方法，其中所述細(xì)胞對(duì)約500nM或更少、約400nM或更少、約300nM或更少、約200nM或更少、約IOOnM或更少的重靶向內(nèi)肽酶的重靶向內(nèi)肽酶活性敏感。14.根據(jù)4至6和10至12所述的方法，其中所述細(xì)胞可攝取約500nM或更少、約400nM或更少、約300nM或更少、約200nM或更少、約IOOnM或更少的重靶向內(nèi)肽酶。15.根據(jù)1至6所述的方法，其中所述樣本包含約IOOng或更少、約IOng或更少、約Ing或更少、IOOfg或更少、IOfg或更少或者Ifg或更少的重靶向內(nèi)肽酶。16.根據(jù)1至6所述的方法，其中所述樣本包含約IOOnM或更少、約IOnM或更少、約InM或更少、約IOOnM或更少、約IOnM或更少、約InM或更少、約0.5nM或更少或者約0.InM或更少的重靶向內(nèi)肽酶。17.根據(jù)1至12所述的方法，其中所述抗體-抗原復(fù)合物的存在是通過(guò)免疫印跡分析法、免疫沉淀分析法、ELISA或夾心ELISA檢測(cè)。18.根據(jù)1至12所述的方法，其中所述方法在下漸近線的信噪比為至少31、至少51、至少101、至少201、至少501或至少1001。19.根據(jù)1至12所述的方法，其中所述方法在上漸近線的信噪比為至少101、至少201、至少501、至少1001、至少2001、至少3001、至少4001、至少5001或至少6001。20.根據(jù)1至12所述的方法，其中所述方法可檢測(cè)例如至少lOOng、至少50ng、至少10ng、至少5ng、至少100pg、至少50pg、至少10pg、至少5pg、至少100fg、至少50fg、至少IOfg或至少5fg的重靶向內(nèi)肽酶的EC5tl活性。21.根據(jù)1至12所述的方法，其中所述方法可檢測(cè)例如至少ΙΟηΜ、至少5nM、至少ΙΟΟηΜ、至少50nM、至少ΙΟηΜ、至少5nM、至少InM、至少0.5nM或至少0.InM的重靶向內(nèi)肽酶的EC50活性。22.根據(jù)1至12所述的方法，其中所述方法的LOD為例如IOpg或更少、9pg或更少、8pg或更少、7pg或更少、6pg或更少、5pg或更少、4pg或更少、3pg或更少、2pg或更少、Ipg或更少的重靶向內(nèi)肽酶。23.根據(jù)1至12所述的方法，其中所述方法的LOD為例如IOOnM或更少、90nM或更少、80nM或更少、70nM或更少、60nM或更少、50nM或更少、40nM或更少、30nM或更少、20nM或更少或者IOnM或更少的重靶向內(nèi)肽酶。24.根據(jù)1至12所述的方法，其中所述方法的LOQ為例如IOpg或更少、9pg或更少、8pg或更少、7pg或更少、6pg或更少、5pg或更少、4pg或更少、3pg或更少、2pg或更少、Ipg或更少的重靶向內(nèi)肽酶。25.根據(jù)1至12所述的方法，其中所述方法的LOQ為例如IOOnM或更少、90nM或更少、80nM或更少、70nM或更少、60nM或更少、50nM或更少、40nM或更少、30nM或更少、20nM或更少或者IOnM或更少的重靶向內(nèi)肽酶。26.根據(jù)1至12所述的方法，其中所述方法可將具有完全活性的重靶向內(nèi)肽酶與活性是具有完全活性的重靶向內(nèi)肽酶A的70%或更少、60%或更少、50%或更少、40%或更少、30%或更少、20%或更少或者10%或更少的具有部分活性的重靶向內(nèi)肽酶區(qū)分開來(lái)。27.根據(jù)1至12所述的方法，其中所述α-SNAP-25抗體結(jié)合SNAP-25裂解產(chǎn)物中在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處包含羧基末端的表位。28.根據(jù)27所述的方法，其中所述α-SNAP-25抗體對(duì)SNAP-25裂解產(chǎn)物中不包含所述BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的羧基末端谷氨酰胺的表位的締合速率常數(shù)小于1XIO1M-1S"1；且其中所述α-SNAP-25抗體對(duì)所述表位的平衡解離常數(shù)小于0.450nM。29.根據(jù)27所述的方法，其中所述分離的a-SNAP-25抗體具有包含選自由SEQIDNO72,SEQIDNO74、SEQIDNO76,SEQIDNO80禾口SEQIDNO:82組成的組的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和包含選自由SEQIDNO:84、SEQIDNO:86、SEQIDNO:88、SEQIDNO90和SEQIDNO92組成的組的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。30.根據(jù)27所述的方法，其中所述分離的α-SNAP-25抗體至少包含具有SEQIDNO93的VhCDRl、具有SEQIDNO94的VhCDRl、具有SEQIDNO95的VhCDRl、具有SEQIDNO118的VhCDRl、具有SEQIDNO:119的VhCDRl或具有SEQIDNO:120的VhCDRl。32.根據(jù)27所述的方法，其中所述分離的α-SNAP-25抗體至少包含具有SEQIDNO96的VhCDR2、具有SEQIDNO97的VhCDR2、具有SEQIDNO98的VhCDR2、具有SEQIDNO99的VhCDR2、具有SEQIDNO:121的VhCDR2、具有SEQIDNO:122的VhCDR2或具有SEQIDNO123的VhCDR2。33.根據(jù)27所述的方法，其中所述分離的α-SNAP-25抗體至少包含具有SEQIDNO100的VhCDR3、具有SEQIDNO:101的VhCDR3、具有SEQIDNO:102的VhCDR3或具有SEQIDNO124的VhCDR3。34.根據(jù)27所述的方法，其中所述分離的α-SNAP-25抗體至少包含具有SEQIDNO:103的VlCDR1、具有SEQIDNO:104的V1CDR1、具有SEQIDNO:105的V1CDR1、具有SEQIDNO106的\CDRl、具有SEQIDNO:107的\CDRl、具有SEQIDNO:125的\CDR1、具有SEQIDNO:1的八CDR1、具有SEQIDNO:127的八CDRl、具有SEQIDNO:128的VlCDRl或具有SEQIDNO:129的VlCDRl。35.根據(jù)27所述的方法，其中所述分離的α-SNAP-25抗體至少包含具有SEQIDNO108的VlCDR2、具有SEQIDNO:109的VlCDR2、具有SEQIDNO:110的VlCDR2、具有SEQIDNO:111的八CDR2或具有SEQIDNO:112的\CDR2。36.根據(jù)27所述的方法，其中所述分離的α-SNAP-25抗體至少包含具有SEQIDNO113的VlCDR3、具有SEQIDNO:114的VlCDR3、具有SEQIDNO:115的VlCDR3、具有SEQIDNO116的\CDR3或具有SEQIDNO:117的\CDR3。37.根據(jù)27所述的方法，其中所述分離的α-SNAP-25抗體包含重鏈可變區(qū)，其包含SEQIDNO93,SEQIDNO:121禾口SEQIDNO100；和輕鏈可變區(qū)，其包含SEQIDNO:105、SEQIDNO:110禾口SEQIDNO:115。38.根據(jù)27所述的方法，其中所述分離的α-SNAP-25抗體選擇性結(jié)合具有SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO147或SEQIDNO:148的SNAP-25表位。39.根據(jù)27所述的方法，其中所述分離的α-SNAP-25抗體選擇性結(jié)合具有SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO43或SEQIDNO44的SNAP-25表位。實(shí)施例實(shí)施例I篩選用于表達(dá)內(nèi)源性重靶向內(nèi)肽酶受體的候選細(xì)胞系以下實(shí)施例說(shuō)明如何鑒別擁有開發(fā)基于細(xì)胞的效力測(cè)定所需的重靶向內(nèi)肽酶攝取能力的確立細(xì)胞系。1.候選細(xì)胞系儲(chǔ)備培養(yǎng)物的生長(zhǎng).為生長(zhǎng)細(xì)胞系，將適合密度的來(lái)自所測(cè)試的細(xì)胞系的細(xì)胞接種于含有30mL適合的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(參見(jiàn)表1)的162cm2組織培養(yǎng)燒瓶中，并使其在37°C培養(yǎng)箱中于5%或10%二氧化碳下生長(zhǎng)，直到細(xì)胞達(dá)到所需密度。I表1.細(xì)胞系篩選中所用的培養(yǎng)基.權(quán)利要求1.一種檢測(cè)重靶向內(nèi)肽酶活性的方法，所述方法包括以下步驟a.用包含重靶向內(nèi)肽酶的樣本處理來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞，其中所述來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞對(duì)約500pM或更少的重靶向內(nèi)肽酶的重靶向內(nèi)肽酶活性敏感；b.從所述經(jīng)過(guò)處理的細(xì)胞中分離出SNAP-25組分，所述SNAP-25組分包含具有BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的羧基末端谷氨酰胺的SNAP-25裂解產(chǎn)物；c.使所述SNAP-25組分與連接到固相載體的α-SNAP-25抗體接觸，其中所述α-SNAP-25抗體結(jié)合SNAP-25裂解產(chǎn)物中包含所述BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的羧基末端谷氨酰胺的表位，所述α-SNAP-25抗體對(duì)SNAP-25裂解產(chǎn)物中不包含所述BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的羧基末端谷氨酰胺的SNAP-25的表位的締合速率常數(shù)小于1XIO1M-1S-1；且所述α-SNAP-25抗體對(duì)所述表位的平衡解離常數(shù)小于0.450nM；d.檢測(cè)抗體-抗原復(fù)合物的存在，所述抗體_抗原復(fù)合物包含所述α-SNAP-25抗體和具有來(lái)自所述BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的羧基末端谷氨酰胺的所述SNAP-25裂解產(chǎn)物；其中通過(guò)所述抗體-抗原復(fù)合物的檢測(cè)指示重靶向內(nèi)肽酶活性。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述SNAP-25裂解產(chǎn)物為SNAP-25197。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中使用夾心ELISA檢測(cè)抗體-抗原復(fù)合物的存在。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法在下漸近線的信噪比為至少31且在上漸近線的信噪比為至少101。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣本包含最多IOOpM的重靶向內(nèi)肽酶。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述來(lái)自確立細(xì)胞系的細(xì)胞對(duì)約IOOpM或更少的重靶向內(nèi)肽酶對(duì)胞吐作用的重靶向內(nèi)肽酶抑制作用敏感。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中按單重方式或多重方式進(jìn)行所述方法。全文摘要本發(fā)明公開SNAP-25免疫響應(yīng)誘導(dǎo)組合物；制備α-SNAP-25抗體的方法，所述α-SNAP-25抗體選擇性結(jié)合包含在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25的表位；α-SNAP-25抗體，所述α-SNAP-25抗體選擇性結(jié)合包含在BoNT/A裂解位點(diǎn)易分裂鍵的P1殘基處具有羧基末端的SNAP-25的表位；檢測(cè)重靶向內(nèi)肽酶活性的方法；以及檢測(cè)中和α-重靶向內(nèi)肽酶抗體的方法。文檔編號(hào)C12Q1/37GK102422158SQ201080020198公開日2012年4月18日申請(qǐng)日期2010年3月12日優(yōu)先權(quán)日2009年3月13日發(fā)明者D·D·霍奇斯,E·費(fèi)爾南德斯-薩拉斯,J·王,朱宏申請(qǐng)人:阿勒根公司