專利名稱：抑制光感受器凋亡的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供防止光感受器死亡的方法。特別是，本發(fā)明提供防止FAS介導(dǎo)的光感受器凋亡的肽。
背景技術(shù)：
凋亡(程序性細(xì)胞死亡)在所有多細(xì)胞生物的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)中起主導(dǎo)作用。凋亡途徑的改變牽涉多種人體病理學(xué)類型，其包括發(fā)育障礙、癌癥、自身免疫性疾病和神經(jīng)退行性疾病以及視網(wǎng)膜變性。它是控制各個(gè)細(xì)胞死亡過程的緊密調(diào)節(jié)途徑并可外源地或內(nèi)源地啟動(dòng)。后者為由線粒體觸發(fā)的胞內(nèi)機(jī)制，而前者包括“死亡受體”與在細(xì)胞膜處的其相應(yīng)的配體的相互作用。因此，程序性細(xì)胞死亡途徑已變成治療藥物開發(fā)中的具有吸引力的目標(biāo)。特別是， 由于在概念上來講，殺死細(xì)胞比維持細(xì)胞更容易，因此人們把注意力集中在使用促凋亡劑的抗癌療法，例如傳統(tǒng)的放療和化療。這些治療通常被認(rèn)為觸發(fā)了線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑的活化。但是，這些療法缺乏分子特異性，并且需要更具體的分子靶標(biāo)。視網(wǎng)膜脫離(RD)被定義為感覺神經(jīng)視網(wǎng)膜與底下的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE) 的分離，其導(dǎo)致感光細(xì)胞的凋亡(Cook等人，1995年第36卷第6期第990-996頁(yè)；Hisatomi 等人，Curr Eye Res，2002 年第 M 卷第 3 期第 161-172 頁(yè)；Zacks 等人，Invest Ophthalmol Vis Sci，2003 年第 44 卷第 3 期第 1262-1267 頁(yè)；Yang 等人，Invest Ophthalmol Vis Sci， 2004年第45卷第2期第648-6M頁(yè)；通過引用以其整體結(jié)合到本文中)。RD的嚙齒動(dòng)物和貓科動(dòng)物模型表明，在視網(wǎng)膜與RPE分離后，促凋亡途徑幾乎立即活化(Cook等人，1995 年第36卷第6期第990-996頁(yè)；Hisatomi等人，Curr Eye Res, 2002年第M卷第3期第 161-172 頁(yè)；Zacks 等人，Invest Ophthalmol Vis Sci，2003 年第 44 卷第 3 期第 1262-U67 頁(yè)；Yang 等人，Invest Ophthalmol Vis Sci，2004 年第 45 卷第 2 期第 648-6 頁(yè)；通過引用以其整體結(jié)合到本文中)。凋亡的組織學(xué)標(biāo)記例如末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶缺口末端標(biāo)記 (TUNEL)染色在RD后約3天達(dá)到峰值，其中凋亡活性和漸進(jìn)性細(xì)胞死亡在脫離期間持續(xù)。 但是，視網(wǎng)膜脫離修復(fù)的臨床經(jīng)驗(yàn)表明，存在修復(fù)并維持良好視力的機(jī)會(huì)窗?；仡櫺缘牟±盗斜砻鳎罅吭诿撾x發(fā)生后5-10日內(nèi)修復(fù)的黃斑脫離RD患者可保持好的視覺功能，但隨著脫離和修復(fù)之間的時(shí)間延長(zhǎng)，視力下降顯著(Burton，Trans Am Ophthalmol Soc，1982年第 80 卷第 475-497 頁(yè)；Ross 等人，Ophthalmology, 1998 年第 105 卷第 11 期第 2149-2153 頁(yè)；Hassan等人，Ophthalmology，2002年第109卷第1期第146-152頁(yè)；通過引用以其整體結(jié)合到本文中)。促凋亡途徑的活化和視力喪失的臨床發(fā)生之間的延遲時(shí)間提示，內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)因子可在神經(jīng)視網(wǎng)膜內(nèi)被活化，并可有助于制衡由視網(wǎng)膜-RPE分離活化的促凋亡途徑的影響。
概述在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抑制光感受器凋亡的方法，其包括給予光感受器保護(hù)組合物。在一些實(shí)施方案中，光感受器保護(hù)組合物包含光感受器保護(hù)多肽或編碼光感受器保護(hù)多肽的核酸。在一些實(shí)施方案中，光感受器保護(hù)多肽包括IL-6或其片段。在一些實(shí)施方案中，光感受器保護(hù)多肽包括XIAP或其片段。在一些實(shí)施方案中，光感受器保護(hù)多肽包括MET或其片段。在一些實(shí)施方案中，MET的片段包括MET12。在一些實(shí)施方案中，MET 的片段包含與MET12至少70% (例如，至少80%、85%、90%、95% )的序列相似性。在一些實(shí)施方案中，光感受器凋亡包括FAS介導(dǎo)的光感受器凋亡。在一些實(shí)施方案中，將光感受器保護(hù)組合物給予細(xì)胞群。在一些實(shí)施方案中，將光感受器保護(hù)組合物以足以減少細(xì)胞群內(nèi)的細(xì)胞死亡的量給予。在一些實(shí)施方案中，將光感受器保護(hù)多肽給予受試者。在一些實(shí)施方案中，受試者患有視網(wǎng)膜脫離。在一些實(shí)施方案中，受試者具有視網(wǎng)膜脫離的風(fēng)險(xiǎn)。在一些實(shí)施方案中，將光感受器保護(hù)組合物以足以減少受試者內(nèi)的細(xì)胞死亡的量給予。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供增加光感受器存活率的方法，包括給予光感受器保護(hù)組合物。在一些實(shí)施方案中，增加光感受器存活率包括抑制光感受器凋亡。在一些實(shí)施方案中，光感受器保護(hù)組合物包含光感受器保護(hù)多肽或編碼光感受器保護(hù)多肽的核酸。在一些實(shí)施方案中，光感受器保護(hù)多肽包括IL-6或其片段。在一些實(shí)施方案中，光感受器保護(hù)多肽包括XIAP或其片段。在一些實(shí)施方案中，光感受器保護(hù)多肽包括MET或其片段。在一些實(shí)施方案中，MET的片段包括MET12。在一些實(shí)施方案中，MET的片段包含與MET12至少 70%的序列相似性。在一些實(shí)施方案中，光感受器凋亡包括FAS介導(dǎo)的光感受器凋亡。在一些實(shí)施方案中，將光感受器保護(hù)組合物給予細(xì)胞群。在一些實(shí)施方案中，將光感受器保護(hù)組合物以足以減少所述細(xì)胞群內(nèi)的細(xì)胞死亡的量給予。在一些實(shí)施方案中，將光感受器保護(hù)組合物以足以增加所述細(xì)胞群中的光感受器存活率的量給予。在一些實(shí)施方案中，將光感受器保護(hù)組合物給予受試者。在一些實(shí)施方案中，受試者患有眼部病況、疾病或者影響眼部健康的病況或疾病。在一些實(shí)施方案中，受試者處于眼部病況、疾病或者影響眼部健康的病況或疾病的風(fēng)險(xiǎn)中。在一些實(shí)施方案中，眼部病況、疾病或者影響眼部健康的病況或疾病包括視網(wǎng)膜脫離、黃斑變性、視網(wǎng)膜色素變性、眼部炎癥、自身免疫性視網(wǎng)膜病變、創(chuàng)傷、癌癥、 腫瘤、葡萄膜炎、遺傳性視網(wǎng)膜變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變、脈絡(luò)膜新血管形成、視網(wǎng)膜缺血、 病理性近視、血管樣條紋癥、黃斑水腫或中心性漿液性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變。在一些實(shí)施方案中，眼部病況、疾病或者影響眼部健康的病況或疾病包括視網(wǎng)膜脫離。在一些實(shí)施方案中， 眼部病況、疾病或者影響眼部健康的病況或疾病包括黃斑變性。在一些實(shí)施方案中，將光感受器保護(hù)組合物以足以減少所述受試者內(nèi)的細(xì)胞死亡的量給予。在一些實(shí)施方案中，將光感受器保護(hù)組合物以足以增加所述受試者內(nèi)的光感受器存活率的量給予。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種組合物，其包含光感受器保護(hù)組合物以及配置用于眼部遞送的藥用載體。在一些實(shí)施方案中，光感受器保護(hù)組合物包含光感受器保護(hù)多肽或編碼光感受器保護(hù)多肽的核酸。在一些實(shí)施方案中，光感受器保護(hù)多肽包括IL-6或其片段。在一些實(shí)施方案中，光感受器保護(hù)多肽包括XIAP或其片段。在一些實(shí)施方案中， 光感受器保護(hù)多肽包括MET或其片段。在一些實(shí)施方案中，MET的片段包括MET12。在一些實(shí)施方案中，MET的片段包含與MET12至少70% (例如，至少80%、85%、90%、95% )的序列相似性。在一些實(shí)施方案中，光感受器凋亡包括FAS介導(dǎo)的光感受器凋亡。在一些實(shí)施方案中，配置藥用載體用于注射入受試者眼內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，配置藥用載體用于視網(wǎng)膜下注射。在一些實(shí)施方案中，配置藥用載體用于局部施用于受試者眼睛上。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括試劑盒，其包含光感受器保護(hù)組合物以及一種或多種其它組合物。在一些實(shí)施方案中，其它組合物包含光感受器保護(hù)組合物、藥用載體、藥物、止痛藥、麻醉藥、抗凋亡劑等。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包含一種或多種光感受器保護(hù)組合物以及配置用于共同給藥至細(xì)胞或受試者的其它物質(zhì)。附圖簡(jiǎn)述當(dāng)結(jié)合附圖閱讀時(shí)，更好地理解前面的概述和詳細(xì)的說明，通過舉例方式而非限制方式包括附圖。
圖1顯示了附著和脫離視網(wǎng)膜中STATl和STAT3活化形式的水平的蛋白質(zhì)印跡分析。最左邊的2條泳道脫離后一天。中間的2條泳道脫離后三天。最右邊的2條泳道 脫離后七天。視網(wǎng)膜-RPE分離在左眼產(chǎn)生。附著的視網(wǎng)膜從相同動(dòng)物的對(duì)側(cè)眼獲得。在所有泳道內(nèi)校驗(yàn)相等加樣。圖2顯示了脫離后3天采集的野生型對(duì)比IL6-/-小鼠視網(wǎng)膜的TUNEL染色。A、B 野生型小鼠。C、D:IL-6-/_小鼠。A、C:TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的異硫氰酸熒光素(FITC)熒光。B、 D 所有核的碘化丙錠(PI)熒光。E 脫離后三天野生型和IL-6-/-小鼠視網(wǎng)膜TUNEL染色的概述圖。結(jié)果為均值士均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖3顯示了視網(wǎng)膜脫離后野生型對(duì)比IL6-/-小鼠的外核層細(xì)胞計(jì)數(shù)。A-C:野生型小鼠。D-F:IL-6-/_小鼠。A、D 附著的視網(wǎng)膜。B、E 脫離產(chǎn)生后1個(gè)月采集的視網(wǎng)膜。C、F:脫離產(chǎn)生后2個(gè)月采集的視網(wǎng)膜。G 視網(wǎng)膜脫離后1個(gè)月和2個(gè)月野生型和IL-6-/-小鼠中ONL細(xì)胞計(jì)數(shù)/總視網(wǎng)膜厚度的概述圖。結(jié)果為均值士均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖4顯示了用IL-6中和抗體或外源性IL-6處理的脫離大鼠視網(wǎng)膜的TUNEL染色。 A、B 在脫離產(chǎn)生時(shí)僅于視網(wǎng)膜下注射溶媒。C、D 在脫離產(chǎn)生時(shí)于視網(wǎng)膜下注射0. 15 μ g抗 IL-6NAB。E、F 在脫離產(chǎn)生時(shí)于視網(wǎng)膜下注射15ng外源性IL-6。A、C、E TUNEL陽(yáng)性核的 FITC熒光。B、D、F 所有核的PI熒光。G 脫離后3天視網(wǎng)膜下抗IL-6NAB和外源性IL-6 對(duì)大鼠視網(wǎng)膜TUNEL染色的影響的概述圖。結(jié)果為均值士均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖5顯示了 IL-6中和抗體對(duì)比外源性IL-6對(duì)大鼠視網(wǎng)膜外核層細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響。A 附著的視網(wǎng)膜。B、C:在脫離產(chǎn)生時(shí)僅于視網(wǎng)膜下注射溶媒后1和2個(gè)月分別采集的視網(wǎng)膜。D、E 脫離產(chǎn)生時(shí)在視網(wǎng)膜下注射0. 15 μ g抗IL-6NAB后1和2個(gè)月分別采集的視網(wǎng)膜。F、G 脫離產(chǎn)生時(shí)在視網(wǎng)膜下注射15ng外源性IL-6后1和2個(gè)月分別采集的視網(wǎng)膜。H 視網(wǎng)膜脫離后1和2個(gè)月視網(wǎng)膜下抗IL-6NAB和外源性IL-6對(duì)大鼠視網(wǎng)膜外核層細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響的概述圖。結(jié)果為均值士均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖6顯示了經(jīng)GFP和XIAP處理的視網(wǎng)膜中視網(wǎng)膜脫離后的胱天蛋白酶3和9試驗(yàn)。視網(wǎng)膜下注射rAAV-GFP或rAAV-XIAP后在動(dòng)物的左眼(OS)進(jìn)行視網(wǎng)膜脫離。右眼 (OD)用作完好的對(duì)照。圖7顯示了用GFP抗體㈧和XIAP的HA標(biāo)記抗體⑶的免疫組織化學(xué)，XIAP被證實(shí)在來自兩個(gè)rAAV構(gòu)建體的光感受器的細(xì)胞體及內(nèi)區(qū)段(IS)和外區(qū)段(OS)中強(qiáng)烈過量表達(dá)。C和D中分別顯示無GFP和XIAP的初級(jí)抗體對(duì)照。TUNEL分析證實(shí)，經(jīng)GFP處理的視網(wǎng)膜比經(jīng)XIAP處理的視網(wǎng)膜具有更多的凋亡核(E、F中的褐色色素以及插圖的黑色箭號(hào))。TUNEL陽(yáng)性像素計(jì)數(shù)(盒圖，G)支持免疫組織化學(xué)的結(jié)果。每個(gè)盒包括第25至第75 百分位之間的值，并且盒內(nèi)的線代表中值。每個(gè)盒上面和下面的棒形線分別指示第90和第 10百分位。該盒圖用SigmaPlot，8. 0版本(SPSS，Inc.)產(chǎn)生。0NL，外核層。圖8顯示了 GFP(A、B)和XIAP(D、E)的免疫組織化學(xué)，其證實(shí)了脫離后2個(gè)月的持續(xù)表達(dá)。因?yàn)樵S多表達(dá)病毒轉(zhuǎn)基因的光感受器已死亡，所以GFP信號(hào)(綠色)微弱。相反， XIAP信號(hào)(紅色)明亮，并且伴隨光感受器數(shù)目的增加。注意，在XIAP信號(hào)減弱(箭頭) 的視網(wǎng)膜區(qū)域，光感受器大量損失。GFP注射(C)和XIAP注射(F)的視網(wǎng)膜中的視紫紅質(zhì)染色(紅色)顯示，保留下來的光感受器能夠合成功能蛋白質(zhì)。外核層由箭號(hào)指示?？s放比例條=50謹(jǐn)。圖9顯示了經(jīng)XIAP和GFP處理的動(dòng)物中附著(A、C)和脫離(B、D)視網(wǎng)膜之間的比較。脫離后2個(gè)月，經(jīng)XIAP處理的視網(wǎng)膜⑶始終比經(jīng)GFP處理的視網(wǎng)膜⑶厚，并且其內(nèi)外區(qū)段更有條理。通過將眼睛脫離區(qū)域ONL中的核層數(shù)目除以相同眼睛附著視網(wǎng)膜ONL 中的核層數(shù)目獲得比率(E)?？s放比例條=50mm。圖10顯示了 MET對(duì)視網(wǎng)膜脫離后TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目的影響圖。圖11顯示了 MET對(duì)由視網(wǎng)膜脫離引起的胱天蛋白酶活性的影響圖。圖12顯示了 661W細(xì)胞中，F(xiàn)as誘導(dǎo)的胱天蛋白酶8的活化被Metl2阻斷。A)用不同濃度的Fas活化抗體(Fas-Ab)處理661W細(xì)胞。胱天蛋白酶8的活性在48小時(shí)測(cè)定。 與未處理相比，胱天蛋白酶8活性的增加對(duì)所有濃度的!^as-Ab在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是顯著的。B)用 500ng/ml的!^is-Ab處理661W細(xì)胞，并且在不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定胱天蛋白酶8的活性。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，將數(shù)據(jù)針對(duì)未經(jīng)處理的對(duì)照進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。C)在Metl2、mMet或溶媒(DMSO)存在下用500ng/ml Fas-Ab處理66IW細(xì)胞。對(duì)照組不用!^as-Ab處理。在48小時(shí)測(cè)定胱天蛋白酶8的活性。圖13顯示Metl2抑制胱天蛋白酶的活化。A)將Metl2注射入脫離視網(wǎng)膜的視網(wǎng)膜下間隙降低了胱天蛋白酶8的活性。在Metl2 (50 μ g)、mMet (50 μ g)或溶媒(DMSO)存在下脫離大鼠視網(wǎng)膜。測(cè)定如所描述脫離對(duì)小時(shí)后采集的視網(wǎng)膜中的胱天蛋白酶8活性。數(shù)據(jù)以脫離視網(wǎng)膜相對(duì)于附著視網(wǎng)膜的胱天蛋白酶活性的增加倍數(shù)給出。蛋白質(zhì)印跡顯示， 在Metl2的存在下，胱天蛋白酶8的裂解降低(插圖)。顯示了包含無裂解物樣品(空白) 的試驗(yàn)對(duì)照和重組胱天蛋白酶8。B)在視網(wǎng)膜脫離期間通過Metl2處理顯著降低胱天蛋白酶3的活性。C)胱天蛋白酶9的活性也被Metl2顯著降低。數(shù)據(jù)以脫離視網(wǎng)膜相對(duì)于附著視網(wǎng)膜的胱天蛋白酶活性的增加倍數(shù)給出。顯示了包含無裂解物樣品(空白)的試驗(yàn)對(duì)照和重組胱天蛋白酶8或胱天蛋白酶9。圖14顯示了 Fas途徑信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的Metl2介導(dǎo)性抑制防止光感受器進(jìn)入凋亡級(jí)聯(lián)。 在MetU(SOyg)、mMetGOyg)或溶媒(DMSO)的存在下脫離大鼠視網(wǎng)膜。72小時(shí)后摘眼并將視網(wǎng)膜切片用于TUNEL染色。A)視網(wǎng)膜脫離72小時(shí)后TUNEL染色光感受器的代表性顯微照片。視網(wǎng)膜細(xì)胞的核用碘化丙啶(PI)染色。INL:內(nèi)核層，0NL:外核層。B)0NL中 TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的定量，均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差，η = 3-6。附著視網(wǎng)膜的ONL中無TUNEL染色細(xì)胞。圖15顯示了胱天蛋白酶活化的減少，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目對(duì)應(yīng)于光感受器長(zhǎng)期存活率的增加。在臨丨12(5(^0、!111討(5(^0或溶媒(DMSO)的存在下脫離視網(wǎng)膜，Metl2(50yg) ,mMet(50yg)或溶媒(DMSO)在脫離時(shí)注入視網(wǎng)膜下的間隙。脫離2個(gè)月后摘眼并將石蠟切片用0.5%甲苯胺藍(lán)染色。A)代表性顯微照片，INL:內(nèi)核層，0NL:外核層， B)標(biāo)準(zhǔn)化至視網(wǎng)膜厚度的ONL細(xì)胞計(jì)數(shù)，C)標(biāo)準(zhǔn)化至視網(wǎng)膜厚度的ONL厚度。定義如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“核酸分子”是指任何包含核酸的分子，包括但不限于DNA或 RNA。該術(shù)語(yǔ)包括含有DNA和RNA的任何已知堿基類似物的序列，所述類似物包括但不限于4-乙酰胞嘧啶、8-羥基-N6-甲基腺苷、吖丙啶胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-(羧基羥基甲基) 尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、肌苷、N6-異戊烯腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鳥嘌呤、 1-甲基肌苷、2，2_ 二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖辮苷(beta-D-mannosylqueosine)、5'-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、 5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-乙醇酸甲酯、尿嘧啶-5-乙醇酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、辮苷(queosine)、2_硫胞嘧啶、5-甲基_2_硫尿嘧啶、2_硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-乙醇酸甲酯、尿嘧啶-5-乙醇酸、假尿嘧啶、辮苷、2-硫胞嘧啶及2，6- 二氨基嘌呤。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”是指長(zhǎng)度短的單鏈多核苷酸鏈。寡核苷酸長(zhǎng)度通常小于200個(gè)(例如，在15與100個(gè)之間)殘基，但是，如本文所用，該術(shù)語(yǔ)也意圖包括較長(zhǎng)的多核苷酸鏈。寡核苷酸常用其長(zhǎng)度來提及。例如12殘基寡核苷酸稱為“12-聚體”。寡核苷酸可通過自雜交或與其它多核苷酸雜交形成二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。這類結(jié)構(gòu)可包括但不限于雙鏈體、發(fā)夾、十字形、轉(zhuǎn)角和三鏈體。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“有效量”是指足以引起有益或所需結(jié)果的組合物(例如，光感受器保護(hù)組合物)的量。有效量可以以一個(gè)或多個(gè)給藥、施用或劑量進(jìn)行給予，并不意圖限制為特定的制劑或給予途徑。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“給予”是指給予受試者(例如，受試者或體內(nèi)、體外或離體細(xì)胞、組織和器官)藥物、前藥或其它物質(zhì)或治療性處理(例如，本發(fā)明組合物)的行為。給予至人體的示范性途徑可通過注射(例如，靜脈內(nèi)、皮下、瘤內(nèi)、腹膜內(nèi)注射等)等經(jīng)眼睛 (眼)、嘴(口腔)、皮膚(經(jīng)皮)、鼻(鼻部)、肺(吸入)、口腔粘膜(含服)、耳、直腸給予。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“共同給予”和“共給予”是指至少兩種物質(zhì)(例如，光感受器保護(hù)肽、編碼光感受器保護(hù)組合物的寡核苷酸以及一種或多種其它物質(zhì))或治療給予至受試者。在一些實(shí)施方案中，兩種或更多種物質(zhì)或治療的共同給予是并行的。在其它實(shí)施方案中，第一物質(zhì)/治療在第二物質(zhì)/治療前給予。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的是，所用各種物質(zhì)或治療的制劑和/或給藥途徑可不同。共同給予的合適劑量可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。在一些實(shí)施方案中，共同給予物質(zhì)或治療時(shí)，各物質(zhì)或治療以低于其合適的單獨(dú)給藥劑量給予。因此，當(dāng)物質(zhì)或治療的共同給予降低潛在有害(例如，毒性)物質(zhì)的必要?jiǎng)┝繒r(shí)在實(shí)施方案中尤其需要共同給予。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“藥物組合物”是指活性劑(例如，光感受器保護(hù)組合物)與惰性或活性載體的組合，該組合使組合物尤其適合用于體外、體內(nèi)或離體診斷或治療應(yīng)用。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的”或“藥理學(xué)上可接受的”是指給予受試者時(shí)基本上不產(chǎn)生不良反應(yīng)(例如，毒性、過敏或免疫反應(yīng))的組合物。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”是指任何標(biāo)準(zhǔn)藥用載體，包括但不限于磷酸緩沖鹽溶液、水、乳劑(例如，油/水或水/油乳劑)以及各種類型的濕潤(rùn)劑、 任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣材料、十二烷基硫酸鈉、等滲劑和延緩吸收劑、崩解劑 (disintigrantM例如，馬鈴薯淀粉或羥乙酸淀粉鈉)等。組合物還可包含穩(wěn)定劑和防腐劑° 例如載體、穩(wěn)定劑禾口佐劑(見例如，Martin,Remington' s Pharmaceutical Sciences, 第十五版，Mack Publ. Co.，Easton，Pa. (1975)，通過引用結(jié)合到本文中)。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的鹽”是指目標(biāo)受試者(例如，哺乳動(dòng)物受試者和/或體內(nèi)或離體細(xì)胞、組織或器官)生理學(xué)上耐受的本發(fā)明化合物的任何鹽(例如，通過與酸或堿反應(yīng)而獲得)。本發(fā)明化合物的“鹽”可由無機(jī)或有機(jī)酸和堿獲得。酸的實(shí)例包括但不限于鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、反丁烯二酸、馬來酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水楊酸、琥珀酸、對(duì)甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸、甲磺酸、乙磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、磺酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。其它酸例如草酸，雖然其本身并非藥學(xué)上可接受的，但是可在獲取本發(fā)明化合物及其藥學(xué)上可接受的酸加成鹽中用于制備可用作中間體的鹽。實(shí)施方案的詳細(xì)描述在開發(fā)本發(fā)明實(shí)施方案的過程中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明，IL-6是感覺神經(jīng)視網(wǎng)膜與底下的RPE分離后光感受器凋亡的控制者。用基因缺損或通過給予IL-6中和抗體抑制IL-6，顯著增加光感受器的凋亡率。脫離后一個(gè)月，與其各自的對(duì)照相比，接受視網(wǎng)膜下IL-6NAB的 IL-6-/-小鼠和大鼠兩者的ONL細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著降低。這些數(shù)據(jù)表明，IL-6對(duì)于與RPE脫離后光感受器的存活是必需的。在開發(fā)本發(fā)明實(shí)施方案的過程中進(jìn)行了研究漸增的IL-6水平的作用的實(shí)驗(yàn)， IL-6水平具有混合作用，這取決于研究的時(shí)間點(diǎn)和所測(cè)定的試驗(yàn)。當(dāng)與僅注射溶媒相比時(shí)， RD后3天，在視網(wǎng)膜下注射外源性IL-6并不顯著地影響TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的百分比，但卻顯著增加在較長(zhǎng)期脫落中幸存的光感受器數(shù)目。RD患者中的視網(wǎng)膜下IL-6水平高于對(duì)照的玻璃體，并且RD患者中視網(wǎng)膜下IL-6的量在RD后5-8周最高(Bakunowicz-Lazarczyk等人，Ophthalmologica, 1999年第213卷第1期第25- 頁(yè)，通過引用以其整體結(jié)合到本文中)。IL-6通過其配體結(jié)合亞基(gp80，也稱為IL-6R)與普通信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)亞基(gpl30)的結(jié)合發(fā)出信號(hào)(Heinrich等人，Ann N Y Acad Sci.，1995年第762卷第222-236頁(yè)，通過引用以其整體結(jié)合到本文中)。單獨(dú)給予外源性IL-6所具有的抗凋亡活性比不上IL-6與IL6-R 可溶形式聯(lián)合給予所具有的抗凋亡活性(Inomata等人，Biochem Biophys Res Commun., 2003年第302卷第2期第2沈-232頁(yè)；Curnow等人，J Immunol.，2004年第173卷第8期第5290-5297頁(yè)，通過引用以其整體結(jié)合到本文中)。盡管內(nèi)源性IL-6的活化，仍然存在相對(duì)線性的細(xì)胞損失率。該死亡率被外源性 IL-6的加入顯著降低。RD后1個(gè)月，與對(duì)照組相比，在脫離時(shí)用外源性IL-6處理的大鼠組中存在顯著較高的光感受器保存，該差別在RD后2個(gè)月由于第二個(gè)月外源性IL-6組中光感受器的加速損失而消失。在一個(gè)月時(shí)間點(diǎn)重注射外源性IL-6提示，可通過允許更大的治療性“機(jī)會(huì)窗口”延長(zhǎng)IL-6的作用持續(xù)時(shí)間，以達(dá)到視網(wǎng)膜-RPE重附著。在呈現(xiàn)給眼科醫(yī)師前視網(wǎng)膜脫離常已存在未知的一段時(shí)間。與對(duì)照相比，自脫離產(chǎn)生延遲2周首次視網(wǎng)膜下注射外源性IL-6，仍然允許光感受器在脫離后1個(gè)月的顯著較大的保存，表明盡管患者的延遲呈現(xiàn)，IL-6可在保存光感受器方面仍然有用。視網(wǎng)膜-RPE 分離2周后單次注射IL-6的作用持續(xù)2周。已知IL-6為詹納斯(Janus)激酶(JAK)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的強(qiáng)活化劑以及轉(zhuǎn)錄 (STAT)途徑的活化劑(Samardzija等人，F(xiàn)ASEB J.，2006年第20卷第13期第Ml 1-2413頁(yè)， 通過引用以其整體結(jié)合到本文中)。視網(wǎng)膜-RPE分離有效地活化STATl和STAT3。STATl與腫瘤抑制和促凋亡活性相關(guān)，而STAT3主要與細(xì)胞增殖相關(guān)并被認(rèn)為抗凋亡(Samardzi ja 等人，F(xiàn)ASEB J.，2006 年第 20 卷第 13 期第 2411-2413 頁(yè)；Aaronson 等人，Science，2002 年第 296 卷第 5573 期第 1653-1655 頁(yè) ft 印 hanou 等人，Int J Exp Pathol.，2003 年第 84 卷第 6 期第 239-244 頁(yè) Jtephanou 等人，Growth Factors, 2005 年第 23 卷第 3 期第 177-182 頁(yè)；Battle等人，Curr Mol Med，2002年第2卷第4期第381-392頁(yè)，通過引用以其整體結(jié)合到本文中)。IL-6的作用主要通過STAT3而非STATl介導(dǎo)。通過STAT對(duì)凋亡途徑的調(diào)節(jié)可通過下游轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)觸發(fā)細(xì)胞死亡的因子(例如FAS和胱天蛋白酶)或促進(jìn)細(xì)胞存活的因子(例如Bcl-xL和FLICE(FADD(Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域)樣白細(xì)胞介素_1 β -轉(zhuǎn)換酶)抑制蛋白質(zhì)(FLIP)來進(jìn)行(Haga等人，J Clin Invest, 2003年第112卷第7期第989-998頁(yè)； Budd等人，Nat Rev Immunol，2006年第6卷第3期第196-204頁(yè)，通過引用以其整體結(jié)合到本文中)。FLIP是胱天蛋白酶8的酶促無活性同源物，其可與胱天蛋白酶8競(jìng)爭(zhēng)募集至誘導(dǎo)死亡信號(hào)傳遞復(fù)合物(DISC)，并因此作為顯著的凋亡負(fù)抑制劑。34IL-6可穩(wěn)定FLIP 的蛋白質(zhì)水平，因?yàn)镕LIP在IL-6-/"小鼠中較快速降解(Kovalovich等人，J Biol Chem, 2001年第276卷第28期第2660546613頁(yè)，通過引用以其整體結(jié)合到本文中)。研究顯示，IL-6可防止由多種損傷引起的視網(wǎng)膜變性，所述損傷包括缺血再灌注損傷、NDMA毒性、壓力誘導(dǎo)性死亡和視網(wǎng)膜脫離(Sanchez等人，Invest Ophthalmol Vis Sci，2003 年第 44 卷第 9 期第 4006-4011 頁(yè)；Inomata 等人，Biochem Biophys Res Commun, 2003 年第 302 卷第 2 期第 M6-232 頁(yè)；Sappington 等人，Invest Ophthalmol Vis Sci, 2006年第47卷第7期第四32-2942頁(yè)，通過引用以其整體結(jié)合到本文中)。IL-6在視網(wǎng)膜-RPE分離的情形中的光感受器保護(hù)作用提示，這是治療性干預(yù)的有價(jià)值之處，用于改善患有該種類型視網(wǎng)膜損傷的患者中的視力結(jié)果。為在視網(wǎng)膜脫離后獲得良好的視力結(jié)果，迫切需要進(jìn)行快速重附著。動(dòng)物研究表明，胱天蛋白酶(凋亡的執(zhí)行者)在脫離后對(duì)小時(shí)內(nèi)被活化。如果視網(wǎng)膜脫離持續(xù)時(shí)間維持5天或更長(zhǎng)，患者通常不能恢復(fù)20/20的視力(BurtonJrans Am Ophthalmol Soc, 1982 年第80卷第475-497頁(yè)，通過引用以其整體結(jié)合到本文中)。在許多疾病過程中，不能很快地實(shí)現(xiàn)視網(wǎng)膜與RPE的重新附著(reapposition)，導(dǎo)致光感受器連續(xù)凋亡。使用光感受器保護(hù)劑可潛在地限制光感受器死亡的程度直至可進(jìn)行重附著。在開發(fā)本發(fā)明實(shí)施方案的過程中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明，X連鎖凋亡抑制劑(X-Iinked inhibitor of apoptosis，XIAP)可保護(hù)光感受器達(dá)至少2個(gè)月的持續(xù)脫離。經(jīng)XIAP處理的視網(wǎng)膜在ONL中維持較大數(shù)目的核層，并且其內(nèi)外區(qū)段較有條理。另外，它們被視紫紅質(zhì)的抗體強(qiáng)烈染色，提示它們維持有活力的。XIAP的保護(hù)作用提示，阻斷胱天蛋白酶在阻斷細(xì)胞死亡途徑中是有效的。但是，我們并不排除XIAP具有胱天蛋白酶抑制以外的其它作用的可能性，但實(shí)施本發(fā)明不需要理解特定的作用機(jī)制并且本發(fā)明不限于任何具體的作用機(jī)制。據(jù)顯示，XIAP通過其它機(jī)制阻抑細(xì)胞死亡。通過其RING鋅指結(jié)構(gòu)域，XIAP具有E3遍在蛋白連接酶活性并可促進(jìn)凋亡前體蛋白的降解(綜述于10)。XIAP也通過TAKl參與促存活途徑的轉(zhuǎn)錄激活(Hofer-Warbinek 等人，J Biol Chem，2000 年第 275 卷第 22064-22068 頁(yè)；Sanna 等人，Mol Cell Biol, 2002 年第22卷第17M-1766頁(yè)，通過引用以其整體結(jié)合到本文中)。TAKl是促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAPKKK)，其參與NF-kB和JNKl兩個(gè)促存活途徑的活化。因此，XIAP保護(hù)光感受器高達(dá)2個(gè)月的能力可部分歸因于多種途徑的活化或抑制。但是，XIAP轉(zhuǎn)染眼中胱天蛋白酶活性的抑制和TUNEL計(jì)數(shù)的降低確實(shí)支持胱天蛋白酶抑制其作為XIAP發(fā)揮光感受器保護(hù)作用的主要機(jī)制。在開發(fā)本發(fā)明實(shí)施方案期間進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明XIAP在治療視網(wǎng)膜脫離中的功效。 XIAP快速遞送至視網(wǎng)膜脫離部位具有限制光感受器受到急性損害的潛在性，因此可為患者贏取至關(guān)重要的時(shí)間直至成功重附著。在開發(fā)本發(fā)明實(shí)施方案期間進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)提供在視網(wǎng)膜脫離后抑制Fas信號(hào)傳導(dǎo)和防止光感受器凋亡的方法。例如，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)as死亡受體的小肽抑制劑在視網(wǎng)膜-RPE分離后阻斷胱天蛋白酶的活化并增加光感受器的存活率。例如，在視錐光感受器的體外模型中，小肽Metl2防止胱天蛋白酶8的Fas依賴性活化。實(shí)驗(yàn)性視網(wǎng)膜脫離的體內(nèi)模型中，Metl2顯著降低Fas信號(hào)傳導(dǎo)和光感受器凋亡。視網(wǎng)膜脫離活化Fas受體(Zacks等人，Arch Ophthalmol, 2007年第125卷第 1389-1395頁(yè)；Zacks等人，I0VS，2004年第45卷第12期第4563-4569. 8.頁(yè)，通過引用以其整體結(jié)合到本文中)，并且該事件控制光感受器中內(nèi)源性細(xì)胞死亡途徑的活化?？墒褂么蠓肿永缰泻涂贵w以抑制Fas受體，或通過用抑制性RNA防止!^as-受體轉(zhuǎn)錄的脫離誘導(dǎo)性增加，來防止光感受器凋亡。在開發(fā)本發(fā)明實(shí)施方案期間進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明利用小肽Metl2 的相同顯著水平的光感受器保存。使用嚙齒動(dòng)物模型來研究調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜脫離后的光感受器死亡的分子機(jī)制。另外， Fas-Ab處理以劑量和時(shí)間依賴的方式活化體外661W細(xì)胞中的胱天蛋白酶8，表明Fas受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在這些細(xì)胞中完好。661W細(xì)胞系是由Fas信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)的光感受器凋亡的功能性體外模型。本文的方法表明在Metl2介導(dǎo)的Fas抑制后顯著水平的光感受器存活。因此，通過 Metl2的Fas抑制導(dǎo)致體內(nèi)感光細(xì)胞的顯著保存。使用本文公開的方法可優(yōu)化在視網(wǎng)膜脫離時(shí)注射入視網(wǎng)膜下間隙的Metl2劑量用于完全的保護(hù)。在661W細(xì)胞中，在Metl2到達(dá)所有的細(xì)胞時(shí)，Metl2處理導(dǎo)致胱天蛋白酶8活化的完全抑制。視網(wǎng)膜下的Metl2可能不能充分到達(dá)凋亡的脫離光感受器。預(yù)期肽的改進(jìn)給予獲得改進(jìn)的光感受器存活率。Metl2僅在視網(wǎng)膜/RPE分離產(chǎn)生期間視網(wǎng)膜下注射。視網(wǎng)膜下間隙可利用的Metl2的量最可能隨時(shí)間減少，從而增加可用于i^asL結(jié)合的Fas受體數(shù)目。這類似于另一神經(jīng)保護(hù)劑IL_6的情形。外源性IL-6增加脫離光感受器的存活率(Chong等人，Invest Ophthalmol Vis Sci, 2008年第49卷第7期第3193-3200頁(yè)，通過引用以其整體結(jié)合到本文中)。當(dāng)IL-6在脫離時(shí)被注射入視網(wǎng)膜下間隙時(shí)，其對(duì)脫離的光感受器的保護(hù)作用持續(xù)一個(gè)月。但是，在一個(gè)月的時(shí)間點(diǎn)重注射外源性IL-6延長(zhǎng)了視網(wǎng)膜/RPE分離后光感受器的存活持續(xù)時(shí)間。預(yù)期最佳處理策略和Metl2增加的促存活作用允許較大的治療性“機(jī)會(huì)窗口”，以在視網(wǎng)膜-RPE 重附著后達(dá)到最高的光感受器存活率。
考慮光感受器群執(zhí)行獨(dú)立于Fas死亡受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的凋亡。分離引起的線粒體凋亡途徑的活化僅部分地被Fas的活化控制(Zacks等人，Arch Ophthalmol，2007年第125卷第1389-1395頁(yè)，通過引用以其整體結(jié)合到本文中)?？紤]第二和替代的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可在刺激光感受器的內(nèi)源性死亡途徑中發(fā)揮作用。內(nèi)源性途徑胱天蛋白酶在視網(wǎng)膜脫離引起的光感受器凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用(Zadro-Lamoureux等人，Invest Ophthalmol Vis Sci,2009 年第50卷第3期第1448-1453頁(yè)，通過引用以其整體結(jié)合到本文中)。用重組腺伴隨病毒遞送X連鎖凋亡抑制劑(XIAP)可抑制胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9的活性并保護(hù)光感受器免受脫離引起的凋亡。除了線粒體凋亡途徑，獨(dú)立于胱天蛋白酶的死亡途徑可在視網(wǎng)膜脫離后的光感受器損失中發(fā)揮作用。凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)活化依賴性死亡在視網(wǎng)膜-RPE 分離實(shí)驗(yàn)大鼠模型中導(dǎo)致凋亡(Hisatomi等人，Am J Pathol，2001年4月，第158卷第4期第 1271-1278 頁(yè)；Hisatomi 等人，2008 年，J Clin Invest，第 118 卷第 2025-2038 頁(yè)，通過引用以其整體結(jié)合到本文中)。視網(wǎng)膜脫離引起的光感受器死亡在攜帶編碼AIF基因的減效突變的小鼠中減少(Hisatomi等人，2008 J Clin Invest，第118卷第2025-2038頁(yè)，通過引用以其整體結(jié)合到本文中)。在臨床實(shí)踐中，患者通常以已經(jīng)發(fā)生脫離呈現(xiàn)。視網(wǎng)膜-RPE分離的動(dòng)物模型顯示，F(xiàn)as途徑活化在早期發(fā)生并在整個(gè)脫離期間維持上升(Zacks等人，Arch Ophthalmol, 2007 年第 125 期第 1389-1395 頁(yè)；Zacks 等人，10VS, 2004 年第 45 卷第 12 期 4563-4569. 8 頁(yè))。考慮光感受器保護(hù)性治療的一個(gè)應(yīng)用可以是幫助防止進(jìn)一步的光感受器損失直至視網(wǎng)膜可重附著(例如，手術(shù)地)以及恢復(fù)正常的視網(wǎng)膜-RPE穩(wěn)態(tài)。視網(wǎng)膜和RPE的分離還在大范圍的視網(wǎng)膜疾病中遇到。考慮抗Fas治療在光感受器存活方面的臨床相關(guān)性不限于視網(wǎng)膜脫離。例如，F(xiàn)as介導(dǎo)的凋亡可在年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)的感光細(xì)胞死亡中發(fā)揮作用(Dunaief等人，Arch Ophthalmol，2002年第120卷第11期第1435-1442頁(yè)，通過引用以其整體結(jié)合到本文中)。年齡相關(guān)性黃斑變性的特征在于RPE的進(jìn)行性變性并導(dǎo)致外視網(wǎng)膜變性和類似視網(wǎng)膜脫離后發(fā)生的重組(Jager等人，N Engl J Med，2008年第358卷第 2606-2617 頁(yè) Johnson等人，Invest Ophthalmol Vis Sci，2003年第 44卷第 4481-448.頁(yè)， 通過引用以其整體結(jié)合到本文中)。在AMD新生血管形成中，視網(wǎng)膜下還存在液體滲出，產(chǎn)生該組織與下層RPE的實(shí)際分離(Jager等人，N Engl J Med, 2008年第358卷第沈06_17. 頁(yè)，通過引用以其整體結(jié)合到本文中)。新生血管AMD可導(dǎo)致視網(wǎng)膜-RPE分離和Fas途徑活化時(shí)期的延長(zhǎng)?？笷as治療的應(yīng)用最有可能是作為在治療基礎(chǔ)病癥時(shí)針對(duì)延長(zhǎng)光感受器的存活的輔助(Brown等人，N Engl J Med，2006年10月5日，第355卷第14期第1432-44. 頁(yè)，通過引用以其整體結(jié)合到本文中)。盡管另外的凋亡途徑可在視網(wǎng)膜-RPE分離后被活化，但在開發(fā)本發(fā)明實(shí)施方案期間進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明，可觀量的光感受器通過抑制Fas死亡受體得以保存?？紤]將Metl2處理與另一抗凋亡例如XIAP或者與促存活分子例如IL-6結(jié)合，增加光感受器存活的效率。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供組合物、試劑盒、系統(tǒng)和/或方法，以防止、抑制、 阻斷和/或減少感光細(xì)胞的死亡。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明抑制光感受器的凋亡。在一些實(shí)施方案中，光感受器死亡和/或凋亡由視網(wǎng)膜脫離、年齡相關(guān)性黃斑變性、創(chuàng)傷、癌癥、 腫瘤、炎癥、葡萄膜炎、糖尿病、遺傳性視網(wǎng)膜變性和/或影響感光細(xì)胞的疾病引起。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提高光感受器的生存能力和/或抑制光感受器的死亡(例如在視網(wǎng)膜脫離期間和/或?yàn)椴话ㄒ暰W(wǎng)膜脫離的眼部病況)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明在多種病況和/或疾病中在提高光感受器生存能力和/或抑制光感受器死亡方面具有應(yīng)用，所述病況和/或疾病包括但不限于黃斑變性(例如干、濕、非滲出性或滲出性/新生血管黃斑變性)、 眼瘤、遺傳性視網(wǎng)膜變性(例如視網(wǎng)膜色素變性、斯塔加特病(Margardt' s disease)、烏斯赫爾綜合征(Usher Syndrome)等)、眼部炎性疾病(例如葡萄膜炎)、眼部感染(例如細(xì)菌、真菌、病毒感染)、自身免疫性視網(wǎng)膜炎(例如由感染觸發(fā)的)、創(chuàng)傷、糖尿病視網(wǎng)膜病變、脈絡(luò)膜新血管形成、視網(wǎng)膜缺血、視網(wǎng)膜血管阻塞性疾病(例如視網(wǎng)膜靜脈分枝阻塞、 視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞、視網(wǎng)膜動(dòng)脈分枝阻塞、視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈阻塞等)、病理性近視、血管樣條紋癥、黃斑水腫(例如任何病因的)、中心性漿液性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括給予組合物以抑制光感受器死亡(例如凋亡)。在一些實(shí)施方案中，組合物包括藥劑、小分子、肽、核酸、分子復(fù)合體等。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供光感受器保護(hù)多肽的給予以抑制光感受器凋亡。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽可用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法制備。例如，要求保護(hù)的多肽可用固相多肽合成技術(shù)(例如Fmoc)合成?；蛘?，多肽可用重組DNA技術(shù)(例如，使用細(xì)菌或真核表達(dá)系統(tǒng))合成。因此，為促進(jìn)使用這些方法，本發(fā)明提供包含編碼本發(fā)明多肽的序列的遺傳載體(例如，質(zhì)粒)和包含所述載體的宿主細(xì)胞。此外，本發(fā)明提供通過重組方法產(chǎn)生的多肽。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供光感受器保護(hù)組合物(例如光感受器保護(hù)肽、多肽、小分子、核酸、編碼保護(hù)肽的核酸等)的給予。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抑制感光細(xì)胞凋亡的多肽(例如IL-6、XIAP、MET、其片段等)的給予。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼抑制感光細(xì)胞凋亡的多肽(例如IL-6、XIAP, MET、其片段等)的核酸的給予。在一些實(shí)施方案中，給予的組合物抑制凋亡途徑。在一些實(shí)施方案中，MET多肽作為凋亡抑制劑和/或光感受器保護(hù)肽給予(例如給予至受試者、一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞)。在一些實(shí)施方案中， 給予MET12多肽。在一些實(shí)施方案中，給予與MET或MET12具有至少50%同源性(例如至少60%同源性、至少70%同源性、至少80%同源性、至少90%同源性、至少95%同源性、至少99%同源性等)的多肽。在一些實(shí)施方案中，給予與IL-6具有至少50%同源性(例如至少60%同源性、至少70%同源性、至少80%同源性、至少90%同源性、至少95%同源性、 至少99%同源性等)的多肽。在一些實(shí)施方案中，給予與XIAP具有至少50%同源性(例如至少60%同源性、至少70%同源性、至少80%同源性、至少90%同源性、至少95%同源性、至少99%同源性等)的多肽。在一些實(shí)施方案中，將肽、核酸或藥物樣小分子給予受試者或細(xì)胞，抑制凋亡途徑、抑制凋亡和/或針對(duì)光感受器死亡提供保護(hù)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明多肽為分離和/或純化的(或基本分離和/或基本純化的)。因此，本發(fā)明提供基本分離形式的多肽。在一些實(shí)施方案中，例如，多肽因固相蛋白質(zhì)合成所致而與其它多肽分離?；蛘撸嚯目稍谥亟M產(chǎn)生的細(xì)胞裂解后與其它蛋白質(zhì)基本分離。可用蛋白質(zhì)純化的標(biāo)準(zhǔn)方法(例如，HPLC)來基本純化多肽。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明根據(jù)所需用途提供許多配方中的多肽的制劑。例如，在多肽為基本分離的(或甚至幾乎與其它蛋白質(zhì)完全分離)時(shí)，其可配制于合適的介質(zhì)溶液中用于儲(chǔ)存(例如，在冷凍條件或在凍結(jié)條件下)。這種制劑可包含保護(hù)制劑，例如緩沖液、 防腐劑、冷凍保護(hù)劑(例如，糖類如海藻糖)等。這種制劑的形式可為溶液劑、凝膠劑等，并且本發(fā)明多肽可在一些實(shí)施方案中以冷凍干燥的形式制備。此外，若需要的話，這種制劑可包含其它所需物質(zhì)，例如小分子或甚至其它多肽和蛋白質(zhì)。事實(shí)上，本發(fā)明提供這樣的制劑，其包含本發(fā)明多肽不同實(shí)施方案的混合物(例如，多種本文描述的多肽種類)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供藥物組合物，其包含一種或多種多肽(包括其混合物)及藥學(xué)上可接受的載體。任何可提供多肽而不破壞載體內(nèi)的運(yùn)載體的載體是合適的載體，并且這類載體在本領(lǐng)域中熟知。該組合物可配制用于胃腸外、口腔或局部給予。例如，胃腸外配方可由即時(shí)或緩慢釋放液體制劑、干粉、乳劑、混懸劑或任何其它標(biāo)準(zhǔn)制劑構(gòu)成。藥物組合物的口腔制劑可以是，例如，液體溶液劑例如溶解于稀釋劑(例如，水、鹽水、 汁液等)中的有效量組合物、合適的液體中的混懸劑或合適的乳劑?？谇恢苿┮部梢砸云瑒┬问竭f送，并且可包括賦形劑、著色劑、稀釋劑、緩沖劑、潤(rùn)濕劑、防腐劑、調(diào)味劑以及藥理學(xué)上相容的賦形劑。局部制劑可包含提高活性成分通過皮膚或其它受影響區(qū)域的吸收或滲透的化合物，例如二甲亞砜和相關(guān)類似物。藥物組合物也可用透皮裝置局部遞送，例如膏藥，其可包括在合適的溶劑系統(tǒng)中的組合物和粘附系統(tǒng)，例如丙烯酸乳劑和聚酯膏藥。組合物可通過滴眼劑或其它局部眼部遞送方法遞送。組合物可在眼內(nèi)遞送(在眼內(nèi)的任何地方，包括例如玻璃體腔、前房等)。組合物可在玻璃體內(nèi)遞送，如玻璃體內(nèi)注射Lucentis (雷珠單抗)、Avastin (貝伐單抗)、曲安奈德、抗生素等通常的做法一樣。組合物可在眼周遞送(例如至眼球(球狀物)周圍但在骨性眶內(nèi)的組織)。組合物可通過眼內(nèi)植入(例如更昔洛韋植入、氟輕松植入等)來遞送。在眼內(nèi)植入遞送中，手術(shù)植入包含本發(fā)明組合物的裝置(例如在玻璃體腔內(nèi))，并釋放藥物到眼中(例如以預(yù)定的速率)。組合物可利用包囊化細(xì)胞技術(shù)(例如通過Neurotech)給予，其中遺傳修飾細(xì)胞經(jīng)改造以生產(chǎn)和分泌本發(fā)明組合物(例如Met^)。組合物可使用縫合或置于眼球鄰近的裝置通過經(jīng)鞏膜(transcleral)藥物遞送來遞送，所述裝置會(huì)緩慢流出藥物，藥物接著擴(kuò)散入眼中。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供采用多肽減少一個(gè)或多個(gè)TNFR超家族成員(理想的是光感受器和/或視網(wǎng)膜中的Fas和/或TNFR)的活化的方法。在一些實(shí)施方案中，應(yīng)用這類方法以例如抑制細(xì)胞和組織中的細(xì)胞死亡(例如，凋亡)，并且其可在體內(nèi)、離體或體外應(yīng)用。因此，根據(jù)這類方法，本發(fā)明提供本發(fā)明多肽在減少細(xì)胞死亡(例如視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡)方面的用途。對(duì)于體外應(yīng)用，將本發(fā)明多肽以足以抑制細(xì)胞內(nèi)的凋亡或足以抑制炎癥的量和時(shí)程內(nèi)提供給細(xì)胞，通常是細(xì)胞群(例如，在合適的制劑例如緩沖溶液中)。若需要的話，可觀察未用本發(fā)明多肽處理的對(duì)照群以證實(shí)本發(fā)明多肽在細(xì)胞相似群內(nèi)減少細(xì)胞死亡或炎癥的抑制的作用。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法在體內(nèi)應(yīng)用。在一些實(shí)施方案中，將多肽以足以抑制或減少患者內(nèi)(例如，所需組織內(nèi))的凋亡或炎癥的量和部位遞送給人或動(dòng)物受試者。 多肽可配制成合適的藥物組合物(例如，如上所述或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的其它組合物)用于遞送到受試者內(nèi)。遞送可為局部的(例如，通過在待治療的所需組織內(nèi)注射或植入)或系統(tǒng)的(例如，通過靜脈或胃腸外注射)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療患這類視網(wǎng)膜脫離和或視網(wǎng)膜病癥以及需要治療的患者的方法。在一些實(shí)施方案中，包含至少一種本發(fā)明多肽的藥物組合物以足以治療病癥或疾病的量和部位遞送給這類患者。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明多肽(或包含這類多肽的藥物組合物)可系統(tǒng)地或局部地遞送給患者，并且確定對(duì)治療最合適的遞送途徑、時(shí)程和劑量在治療這類患者的醫(yī)學(xué)專業(yè)人員的普通技能范圍內(nèi)。理解的是，治療患者的本發(fā)明方法的應(yīng)用，最優(yōu)選基本緩解或甚至消除這類癥狀；但是，如許多醫(yī)療處理一樣，如果在本發(fā)明方法期間、之后或者以其它方式作為本發(fā)明方法的結(jié)果，患者中疾病或病癥的癥狀下降至可確定的程度，則認(rèn)為本發(fā)明方法的應(yīng)用是成功的。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于增加光感受器存活率的方法，包括給予光感受器保護(hù)藥物組合物。藥物化合物可以以組合物的形式給予，該組合物按照良好藥物實(shí)踐用藥學(xué)上可接受載體和任選賦形劑、佐劑等配制成。光感受器保護(hù)藥物組合物可呈固體、半固體或液體劑型形式例如散劑、溶液劑、酏劑、糖漿劑、混懸劑、乳膏、滴劑、糊劑和噴霧劑。 本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，根據(jù)選定的給予途徑(例如滴眼劑、注射等)，確定組合物的形式。 一般來說，優(yōu)選使用本發(fā)明抑制劑的單位劑型以實(shí)現(xiàn)活性藥物化合物的容易和準(zhǔn)確給予。 一般來說，治療上有效的藥物化合物以濃度水平范圍為總組合物的約0. 5% -約99%重量的這樣的劑型存在即，以足以提供所需單位劑量的量。在一些實(shí)施方案中，藥物組合物可以以單劑量或多劑量給予。特定的給予途徑和劑量方案由協(xié)調(diào)待治療個(gè)體的病況和所述個(gè)體對(duì)治療的反應(yīng)的技術(shù)人員確定。在一些實(shí)施方案中，用于給予受試者的單位劑型中的光感受器保護(hù)藥物組合物包含藥物化合物和一種或多種無毒的藥學(xué)上可接受的載體、佐劑或溶媒。如上所述，可與這類材料組合以產(chǎn)生單一劑型的活性成分的量可根據(jù)不同的因素而改變。如在藥物領(lǐng)域可獲得的，多種材料可在本發(fā)明組合物中用作載體、佐劑和溶媒?？勺⑸渲苿├缬托匀芤簞⒒鞈覄┗蛉閯┛砂凑招枰褂煤线m的分散劑或濕潤(rùn)劑和助懸劑， 如本領(lǐng)域所知進(jìn)行配制。無菌可注射制劑可采用無毒胃腸外可接受的稀釋劑或溶劑例如無菌無熱源水或1，3_ 丁二醇。可使用的其它可接受的溶媒和溶劑有5%右旋糖注射液、林格氏注射液和等滲氯化鈉注射液(如USP/NF中所描述)。另外，可常規(guī)地采用無菌固定油作為溶劑或懸浮介質(zhì)。對(duì)于該目的，可使用任何溫和的固定油，包括合成的甘油單酯、甘油二酯或甘油三酯。脂肪酸例如油酸也可用于制備可注射組合物。在一些實(shí)施方案中，將本發(fā)明光感受器保護(hù)組合物例如使用本文描述的技術(shù)和/ 或其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)(例如注射、局部給予等)眼部地(optically)給予(參見，例如 Janoria 等人，Expert Opinion on Drug Delivery，2007 年 7 月，第 4 卷第 4 期第 371-388 頁(yè)；Ghate & Edelhauser,Expert Opin Drug Deliv，2006 年 3 月第 3 卷第 2 期第 275-87.頁(yè)；Bourges 等人，Adv Drug Deliv Rev，2006 年 11 月 15 日第 58 卷第 11 期第 1182-202.頁(yè)，Epub 2006 年 9 月 22 日；Gomes Dos Santos 等人，Curr Pharm Biotechnol， 2005年2月第6卷第1期第7-15.頁(yè)；通過引用以其整體結(jié)合到本文中)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明光感受器保護(hù)組合物作為試劑盒的一部分提供。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒包括一種或多種光感受器保護(hù)組合物和/或光感受器保護(hù)藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，配置包括光感受器保護(hù)組合物的試劑盒用于與一種或多種另外的組合物(例如藥物組合物)共同給予。在一些實(shí)施方案中，一種或多種光感受器保護(hù)組合物與一種或多種用于有效保護(hù)光感受器和/或抑制凋亡的其它物質(zhì)共同給予。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1組合物及方法視網(wǎng)膜脫離實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ退性陂_發(fā)本發(fā)明實(shí)施方案期間進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)都根據(jù)關(guān)于動(dòng)物在眼科和視覺研究中的使用的ARVO聲明和由密執(zhí)安大學(xué)動(dòng)物使用與護(hù)理大學(xué)委員會(huì)(the University Committee on Use and Care of Animals of the University of Michigan)建立的指 It。Kl 個(gè)生 Brown—Norway 力鼠(300_400g) (Charles River Laboratories,
Wilmington, MA)、野生型 C57BL 小鼠(3-6 周齡)(Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine)，和 C57BL 背景的 IL-6-/-小鼠(3-6 周齡)(Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine)中產(chǎn)生脫離(Zacks 等人，Arch Ophthalmol，2007 年第 125 卷第 10 期第 1389-1395 頁(yè)；通過引用以其整體結(jié)合到本文中)。用50 50混合的氯胺酮(lOOmg/mL)和賽拉嗪 (20mg/mL)麻醉嚙齒動(dòng)物，并用局部去氧腎上腺素)和托吡卡胺(1 % )擴(kuò)瞳。使用20規(guī)微玻璃體視網(wǎng)膜刀(Walcott Scientific, Marmora, NJ)在緣后2mm產(chǎn)生鞏膜切開術(shù)，小心避免晶狀體損壞。將Glaser視網(wǎng)膜下注射器(32規(guī)尖；BD Ophthalmic Systems, Sarasota, FL)，通過鞏膜切開術(shù)引入玻璃體腔，然后通過外周視網(wǎng)膜切開術(shù)引入視網(wǎng)膜下間隙。緩慢注射透明質(zhì)酸鈉(10mg/mL) (Pharmacia and Upjohn Co. , Kalamazoo, MI)以從底下的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞分離感覺神經(jīng)視網(wǎng)膜。大約三分之一至二分之一的感覺神經(jīng)視網(wǎng)膜被脫離。在左眼產(chǎn)生脫離，留下右眼作為對(duì)照。在一些眼中，在脫離產(chǎn)生時(shí)或在隨后的時(shí)間點(diǎn)，將 0. 15 μ g 抗人 IL-6 中和抗體(NAB) (R&D Systems, Minneapolis, MN)或 15ng 外源性人IL-6(R&D Systems,Minneapolis,MN)以10 μ 1的體積注射入脫離的視網(wǎng)膜下間隙。 劑量基于制造商在體外活性試驗(yàn)基礎(chǔ)上的推薦。蛋白質(zhì)印跡分析在視網(wǎng)膜脫離后3天，將來自帶有脫離的實(shí)驗(yàn)眼和沒有脫離的對(duì)照眼的視網(wǎng)膜與 RPE-脈絡(luò)膜切開、勻漿并在緩沖液中裂解，所述緩沖液每IOmL含有IOmM HEPES (ρΗ7. 6)、 0. 5% IgEPal,42mM KC1、ImM 苯甲基磺酰氟(PMSF)、lmM EDTAUmM EGTA、ImM 二硫蘇糖醇 (DTT)和 5mM MgCl2 以及 1 片蛋白酶抑制劑(Complete Mini ；Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)。該勻漿在冰上溫育并在4°C下以22，000g離心60分鐘。然后確定上清液中的蛋白質(zhì)濃度(DC蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒；Bio-Rad Laboratories,Hercules CA)。將蛋白質(zhì)樣品上樣在SDSPage聚丙烯酰胺凝膠(Tris-HCl Ready Gels ；Bio-Rad Laboratories) 上并運(yùn)行。電泳分離后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(ImmobiIon-P ;AmerSham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)上。用麗春紅S染色使蛋白質(zhì)條帶可見，并通過對(duì)存在于所有泳道的非特異性條帶進(jìn)行密度測(cè)定來評(píng)估等量上樣的泳道。然后根據(jù)制造商的說明書，利用1 1000稀釋的初級(jí)抗體，用免疫印跡試劑盒(分別為WiosphoPlus Statl (Tyr701)抗體試劑盒 #9170 或 PhosphoPlus Mat3 (Tyr705)抗體試劑盒 #9130, Cell Signaling Technology, Danvers, MA)針對(duì)磷酸化 STATl (phospho-STATl) (Tyr701) 或磷酸化STAT3 (ph0Sph0-STAT3) (Tyr705)對(duì)膜進(jìn)行免疫印跡分析。TUNEL染色和組織學(xué)在脫離產(chǎn)生后的不同間隔，動(dòng)物被施行安樂死并將眼睛摘除。對(duì)于TUNEL染色，將整個(gè)眼睛在4°C下在含4%多聚甲醛的磷酸緩沖鹽水(pH7.4)中固定過夜。將樣本包埋于石蠟中并切成5-6 μ m厚。根據(jù)制造商的說明書(Millipore,Billerica,MA)用ApopTag熒光素原位凋亡檢測(cè)試劑盒(ApopTag Fluorescein In Situ Apoptosis Detection Kit)對(duì)切片進(jìn)行TUNEL染色。對(duì)于光顯微鏡分析，用含0.5%甲苯胺藍(lán)的0. 硼酸鹽緩沖液對(duì)石蠟切片染色。
數(shù)據(jù)分析將感光細(xì)胞凋亡定量為外核層(ONL)中TUNEL陽(yáng)性的總細(xì)胞的百分比。每個(gè)切片選擇在RD最高處的三個(gè)非重疊高倍視野(40X)并取均值，除非存在少于三個(gè)非重疊高倍視野，這種情況下使用較少視野。每個(gè)眼使用一個(gè)代表性的切割。以類似的方式測(cè)定ONL 中的總細(xì)胞數(shù)目。在每個(gè)切片的三個(gè)RD最高處非重疊高倍視野(40X)的每個(gè)視野的三個(gè)地方測(cè)定視網(wǎng)膜的總厚度(從ONL的外緣測(cè)定至內(nèi)界膜)并對(duì)每只眼取均值。假定這些元件在感覺神經(jīng)視網(wǎng)膜脫離后可變退縮，則光感受器內(nèi)區(qū)段和外區(qū)段不包括在總視網(wǎng)膜厚度測(cè)定內(nèi)，該可變退縮無需與光感受器重附著后的生存能力相關(guān)(Guerin等人，hvest Ophthalmol Vis Sci，1993 年第；34卷第 1 期第 175-183 頁(yè)；Lewis 等人，Invest Ophthalmol Vis ki，1995年第36卷第12期第M04-2416頁(yè)；通過引用以其整體結(jié)合到本文中)。對(duì)于甲苯胺藍(lán)染色的樣本，將每個(gè)切片的ONL細(xì)胞計(jì)數(shù)對(duì)總視網(wǎng)膜厚度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(S卩，ONL 細(xì)胞計(jì)數(shù)除以總視網(wǎng)膜厚度)，以說明切片角度可能的差異并允許樣品間比較。將大鼠實(shí)驗(yàn)每組中的ONL細(xì)胞計(jì)數(shù)和總視網(wǎng)膜厚度也標(biāo)準(zhǔn)化至該組附著視網(wǎng)膜的相應(yīng)值以允許樣品間比較。對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)組，對(duì)來自4-11只眼睛的3個(gè)切片進(jìn)行測(cè)量，每只眼睛來自單獨(dú)的動(dòng)物。用2尾斯氏t檢驗(yàn)(不假設(shè)相等的方差)進(jìn)行比較組間ONL中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的百分比和比較組間ONL細(xì)胞計(jì)數(shù)/總視網(wǎng)膜厚度比率的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)施例2視網(wǎng)膜脫離實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭邪准?xì)胞介素-6作為光感受器神經(jīng)保護(hù)劑IL-6受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的立即下游轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(STAT) (Heinrich 等人，Biochem J，2003 年第 374 卷(Pt 1)第 1-20 頁(yè)；Samardzija 等人，F(xiàn)ASEB J，2006年第20卷第13期第M11-2413頁(yè)；通過引用以其整體結(jié)合到本文中)。在視網(wǎng)膜-RPE分離的情況下，STATl和STAT3轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)水平都增加了(Zacks等人，Invest Ophthalmol Vis Sci，2006年第47卷第4期第1691-1695頁(yè)，通過引用以其整體結(jié)合到本文中)。與附著的視網(wǎng)膜相比，脫離的視網(wǎng)膜中STATl和STAT3磷酸化(S卩，活化)增加。 在脫離時(shí)將IL-6中和抗體注射入視網(wǎng)膜下間隙導(dǎo)致磷酸化STAT3的水平大約降低50%。 磷酸化STATl的水平?jīng)]有任何降低。這些數(shù)據(jù)提示，視網(wǎng)膜-RPE分離后，IL-6的作用主要通過STAT3而非STATl介導(dǎo)。在開發(fā)本發(fā)明實(shí)施方案期間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其中視網(wǎng)膜-RPE分離在野生型C57BL和 IL-6-/-小鼠中產(chǎn)生。脫離后三天，收集眼并用TUNEL染色評(píng)估視網(wǎng)膜內(nèi)的凋亡。TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞限于光感受器的0NL，符合前面實(shí)驗(yàn)性RD. 3的研究。與野生型小鼠相比，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞在脫離視網(wǎng)膜的ONL中的百分比在IL-6-/-小鼠中明顯較大(見圖2)。在野生型和IL-6-/-小鼠中產(chǎn)生脫離并維持1和2個(gè)月。然后收獲眼用于甲苯胺藍(lán)染色。野生型小鼠附著視網(wǎng)膜和IL-6-/-小鼠附著視網(wǎng)膜之間的ONL細(xì)胞計(jì)數(shù)/總視網(wǎng)膜厚度比率非常類似(見圖3)。與零時(shí)間時(shí)附著的視網(wǎng)膜相比，野生型和IL-6-/-小鼠兩者在1個(gè)月時(shí)間點(diǎn)時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)化ONL細(xì)胞計(jì)數(shù)下降，但是IL-6-/-小鼠中的感光細(xì)胞死亡率顯著較高(見圖幻。脫離后兩個(gè)月，ONL細(xì)胞計(jì)數(shù)/總視網(wǎng)膜厚度的比率進(jìn)一步下降。 IL-6-/"組的最終ONL細(xì)胞計(jì)數(shù)比野生型動(dòng)物低(見圖幻。在Brown Norway大鼠中產(chǎn)生視網(wǎng)膜-RPE分離并且將僅溶媒或溶媒加0. 15 μ g抗人IL-6NAB在脫離時(shí)視網(wǎng)膜下注射入。脫離后3天大鼠眼睛的TUNEL染色顯示，與僅用溶媒處理的那些相比，用抗IL-6NAB處理的視網(wǎng)膜ONL中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的百分比顯著較高(見圖4A-D、G)。在脫離產(chǎn)生時(shí)將15ng 重組IL-6視網(wǎng)膜下注射入。用視網(wǎng)膜下外源性IL-6處理的大鼠組的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞百分比與僅用溶媒處理的大鼠沒有不同，但是仍然顯著低于用視網(wǎng)膜下抗IL-6NAB處理的大鼠 (見圖4)。當(dāng)視網(wǎng)膜-RPE分離的時(shí)期延長(zhǎng)至4周和8周，與視網(wǎng)膜下僅注射溶媒相比，在脫離時(shí)于視網(wǎng)膜下注射抗IL-6NAB導(dǎo)致脫離后4周標(biāo)準(zhǔn)化ONL細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著較低(見圖5B、 D、H)。相反，與僅用溶媒注射的對(duì)照相比，在脫離時(shí)于視網(wǎng)膜下給予外源性IL-6導(dǎo)致在脫離后4周顯著較高的ONL細(xì)胞計(jì)數(shù)/總視網(wǎng)膜厚度比率(見圖5B、F、H)。視網(wǎng)膜下給予外源性IL-6似乎減緩了脫離后第一個(gè)月期間感光細(xì)胞的損失率，但該速率在脫離后第二個(gè)月期間加速，使得外源性IL-6的保護(hù)的益處喪失，并且脫離后8周的ONL細(xì)胞計(jì)數(shù)/總視網(wǎng)膜厚度比率在僅用溶媒處理的組、用抗IL-6NAB處理的組和用外源性IL-6處理的組之間類似(見圖5C、E、G、H)。在脫離產(chǎn)生時(shí)用外源性IL-6注射大鼠，然后在脫離后4周用相同劑量的外源性 IL-6第二次注射。在產(chǎn)生RD后8周，在4周時(shí)重復(fù)注射IL-6的動(dòng)物的ONL細(xì)胞計(jì)數(shù)/總視網(wǎng)膜厚度仍然顯著高于對(duì)照動(dòng)物(見圖5H)。按照上述方案產(chǎn)生視網(wǎng)膜-RPE分離，然后在RD產(chǎn)生后兩周注射外源性IL-6。在脫離后4、6和8周(S卩，分別為視網(wǎng)膜下IL-6注射后2、4和6周)采集眼睛并用甲苯胺藍(lán)染色。延遲2周注射IL-6的組的ONL細(xì)胞計(jì)數(shù)/總視網(wǎng)膜厚度，與在脫離產(chǎn)生時(shí)給予IL-6 注射的組相比最低限度地降低，并且顯著高于對(duì)照動(dòng)物(見圖5H)。如與在視網(wǎng)膜-RPE分離時(shí)用IL-6處理的動(dòng)物一樣，延遲IL-6注射的作用似乎在脫離時(shí)間點(diǎn)后4周后減少，其中到脫離后8周，ONL細(xì)胞的數(shù)目達(dá)到對(duì)照值。實(shí)施例3與X連鎖凋亡抑制劑相關(guān)的組合物和方法動(dòng)物從 Harlan(Indianapolis,IN)禾口 Charles River Laboratories(Wilmington,MA) 購(gòu)買至少6周齡的成年雄性Brown Norway大鼠。動(dòng)物在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下維持并且所有程序都符合關(guān)于動(dòng)物在眼科和視覺研究中的使用的ARVO聲明和渥太華大學(xué)動(dòng)物護(hù)理和獸醫(yī)月艮務(wù)(the University of Ottawa Animal Care and Veterinary Service)的才旨南。將大鼠分成兩組，一組接受XIAP基因治療而另一組接受綠色熒光蛋白(GFP)對(duì)照。重組腺伴隨病毒(rAAV)載體的構(gòu)建將編碼帶有N末端血凝素(HA)標(biāo)記的人XIAP全長(zhǎng)開放閱讀框的cDNA構(gòu)建體插入處于雞肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的控制下的pTR載體中。類似地產(chǎn)生GFP構(gòu)建體用作手術(shù)和病毒對(duì)照。通過在構(gòu)建體的3’非翻譯區(qū)插入土拔鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件(WPRE)， 提高X連鎖凋亡抑制劑(XIAP)病毒轉(zhuǎn)基因表達(dá)。將血清型5rAAV產(chǎn)生(Hauswirth等人， Methods Enzymol，2000 年第 316 卷第 743-761 頁(yè) Jolotukhin 等人，Methods，2002 年第 28 卷第158-167頁(yè)，通過引用以其整體結(jié)合到本文中)并純化(Leonard等人，PLoS ONE, 2007 年第2卷e314頁(yè)，通過引用以其整體結(jié)合到本文中)。rAAV-GFP的病毒滴度為2. 33 X 1012 物理顆粒/ml，rAAVXIAP的病毒滴度為1. 87X1013物理顆粒/ml。物理顆粒與感染顆粒的比率小于100。視網(wǎng)膜下注射將攜帶XIAP或GFP的rAAV注射劑遞送至每只大鼠左眼的視網(wǎng)膜下間隙。右眼用作未經(jīng)處理的對(duì)照。動(dòng)物通過吸入2%異氟烷氣體麻醉。將眼睛用托吡卡胺(Mydriacyl ；Alcon Canada, Mississauga, ON, Canada)和 2. 5 % 鹽酸去氧腎上腺素 (Mydfrin ；Alcon)擴(kuò)大。將鹽酸丙美卡因滴劑(0.5%，Alcaine, Alcon)作為局部麻醉藥給予。通過注射丁丙諾啡(0.(Mmg/kg)實(shí)現(xiàn)疼痛管理。為在整個(gè)程序過程中維持潤(rùn)滑，將 0.3%輕丙甲纖維素(Genteal gel ；Novartis Pharmaceutical Inc. , Mississauga, ON, Canada)施用至眼。通過用20規(guī)V型柳葉刀(V-lance knife) (Alcon)在緣后2mm產(chǎn)生鞏膜切開術(shù)，進(jìn)行視網(wǎng)膜下注射。小心避免接觸晶狀體，因?yàn)檫@會(huì)引起白內(nèi)障形成。將涂覆有Genteal的蓋玻片放在眼睛上面以提供眼睛背面的放大和可視化。與IOml注射器 (Hamilton Company, Reno, NV)連接的33規(guī)鈍針通過鞏膜穿刺插入，引至晶狀體側(cè)面并插入穿過視網(wǎng)膜。將2yL體積的與熒光素示蹤劑組合的rAAV-XIAP或rAAV-GFP(50 1 ν/ ν)遞送至眼睛視網(wǎng)膜下間隙。熒光素允許即時(shí)可視化和評(píng)價(jià)注射位置，這允許確定成功的視網(wǎng)膜下遞送。以一致的方式在12:00和2:00位置間遞送注射劑。術(shù)后護(hù)理包括在注射后給予抗生素0.3%鹽酸環(huán)丙沙星(Ciloxan ；Alcon)和非留體抗炎藥0. 03%氟比洛芬鈉 (Ocufen ；Allergan, Irvine, CA) 5 天。視網(wǎng)膜脫離注射病毒后大約2周，在每只大鼠左眼進(jìn)行視網(wǎng)膜脫離。通過在病毒注射位點(diǎn)附近將lOmg/mL透明質(zhì)酸鈉(Healon ；ΑΜ0, Santa Ana, CA)注射入視網(wǎng)膜下間隙產(chǎn)生脫離。大約三分之一到二分之一的視網(wǎng)膜脫離，留下余下附著的部分用作內(nèi)部對(duì)照。在脫離后M小時(shí)、3天和2個(gè)月采樣動(dòng)物。胱天蛋白酶試驗(yàn)-脫離后M小時(shí)脫離產(chǎn)生后M小時(shí)，從XIAP (N = 15)和GFP (N = 15)動(dòng)物中采集完好的右視網(wǎng)膜 (內(nèi)部對(duì)照)和左視網(wǎng)膜的脫離部分，并提取rotein (Zacks等人，InvestOphthalmol Vis Sci, 2004年第45卷第4563-4569頁(yè)，通過引用以其整體結(jié)合到本文中)。按照制造商的說明書，用胱天蛋白酶9比色測(cè)定試劑盒(Caspase 9 Colorimetric Assay Kit) (BioVision Research Products,Mountain View,CA)測(cè)定胱天蛋白酶9的活性。該測(cè)定基于標(biāo)記底物 LEHD-pNA裂解后的生色團(tuán)對(duì)硝基苯胺(pNA)的檢測(cè)。按照制造商的說明，用胱天蛋白酶3 比色測(cè)定試劑盒(Chemicon InternationalBillerica, MA)測(cè)定胱天蛋白酶3的活性。該測(cè)定基于活化的胱天蛋白酶3對(duì)pNADEVD底物的裂解。組織固定和加工對(duì)大鼠給予致死性的Euthansol注射，并隨后用4%多聚甲醛(PFA)灌注，以保存組織結(jié)構(gòu)。左眼用白熱針劃痕以在成核和包埋過程中能夠定位。用針穿刺眼睛以使固色劑滲透并置于4% PFA中過夜。然后將樣品經(jīng)過一系列脫水步驟，最后包埋于石蠟中。將眼睛以IOmm切片用于組織學(xué)分析。組織學(xué)分析在IOmm切片上進(jìn)行蘇木素和伊紅(H&E)染色以定位視網(wǎng)膜脫離的位置。一旦鑒定脫離，對(duì)后續(xù)的載玻片進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析以證實(shí)XIAP或GFP的存在。用抗HA小鼠IgG初級(jí)抗體(Roche Applied Science, Laval, QC)然后用山羊抗小鼠IgG 二級(jí)抗體 (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc. ,West Grove, PA)檢測(cè) XIAP0 用抗 GFP 兔 IgG (Invitrogen, Eugene, OR)然后用山羊抗兔 IgG (Invitrogen，Eugene，OR)檢測(cè) GFP。用 B630單克隆抗體檢測(cè)視紫紅質(zhì)。用核染色劑二鹽酸4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)對(duì) 27片載玻片進(jìn)行復(fù)染。用帶有kiss AxioCam HRc攝像頭的kiss Axioskop光顯微鏡獲取圖像。末端尿苷脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)染色脫離后3天用TUNEL來比較經(jīng)XIAP處理和經(jīng)GFP處理的樣品脫離區(qū)域中的凋亡水平。用Apoptag過氧化物酶原位凋亡檢測(cè)試劑盒(Chemicon，Temecula, CA)檢測(cè)TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞。為消除觀察者偏倚，用數(shù)學(xué)軟件MATLAB (R2007a版本，The Mathworks Inc.)開發(fā)的程序檢測(cè)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞。該程序分析脫離視網(wǎng)膜外核層(ONL)的Wiotoshop圖像 (Adobe System Inc.)。鑒定TUNEL陽(yáng)性核，并記錄其RGB值。該軟件在逐個(gè)像素基礎(chǔ)上掃描圖像以確定落入陽(yáng)性核RGB值的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差內(nèi)的像素?cái)?shù)目。然后將“TUNEL陽(yáng)性”像素的數(shù)目除以總組織像素，得到該切片的“TUNEL陽(yáng)性”像素比。視網(wǎng)膜厚度比較加工脫離后2個(gè)月取樣的眼睛用于組織學(xué)分析。采集用H&E染色的10 μ m切片的圖像。將ONL的厚度測(cè)定為跨越脫離視網(wǎng)膜ONL的核層數(shù)目除以跨越相同視網(wǎng)膜附著部分 ONL的核層數(shù)目的比率。視網(wǎng)膜厚度隨著離視神經(jīng)的距離而變化，用內(nèi)核層(INL)的厚度作為對(duì)照以確保ONL測(cè)量在離視神經(jīng)頭相同距離處進(jìn)行。對(duì)于附著和脫離區(qū)域兩者，從每只動(dòng)物中獲得至少4次計(jì)數(shù)，然后取均值。實(shí)施例4X連鎖凋亡抑制劑胱天蛋白酶活性測(cè)定將rAAV-GFP用作載體和手術(shù)對(duì)照，顯示光感受器變性速率。沒有證據(jù)表明， rAAV-GFP具有神經(jīng)保護(hù)作用或加速了光感受器的變性。與完好的未脫離視網(wǎng)膜相比， rAAV-GFP轉(zhuǎn)染眼(GFP0Q的視網(wǎng)膜脫離顯示胱天蛋白酶3和9活性的預(yù)期升高(見圖6)。 經(jīng)XIAP處理的視網(wǎng)膜(XIAP-0Q的胱天蛋白酶活性水平未顯示脫離引起的增加，并與其對(duì)側(cè)附著的對(duì)照相當(dāng)。所有胱天蛋白酶活性均在脫離后M小時(shí)測(cè)定，該時(shí)間先前顯示為峰值胱天蛋白酶活性的時(shí)間。TUNEL 分析在視網(wǎng)膜脫離產(chǎn)生后3天對(duì)眼睛取樣，并將其包埋、切片和加工，用于免疫組織化學(xué)和TUNEL分析。選擇3天的時(shí)間點(diǎn)是因?yàn)閯?dòng)物模型中的先前實(shí)驗(yàn)研究表明視網(wǎng)膜脫離后 3天的峰值TUNEL陽(yáng)性染色(Zacks等人，Invest Ophthalmol Vis Sci,2003年第44卷第 1262-1267 頁(yè)，Lewis GP, Charteris 等人，Invest Ophthalmol Vis Sci，2002 年第 43 卷第M12-2420頁(yè)，通過引用以其整體結(jié)合到本文中)。免疫組織化學(xué)證實(shí)來自rAAV-GFP和 rAAV-XIAP病毒注射兩者的強(qiáng)烈表達(dá)(見圖7A、B)。在視網(wǎng)膜脫離區(qū)域的細(xì)胞體和光感受器內(nèi)外區(qū)段中鑒定GFP或XIAP抗體的強(qiáng)烈染色。該信號(hào)并非總是覆蓋全部的脫離，并且有時(shí)在視網(wǎng)膜附著部分發(fā)現(xiàn)，表明病毒轉(zhuǎn)染和脫離并不總是完全重疊。TUNEL染色的自動(dòng)化的基于計(jì)算機(jī)的定量顯示，rAAV-XIAP眼睛中的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比rAAV-GFP眼睛中的少(見圖7C-E)。盡管與經(jīng)GFP處理的眼睛相比，XIAP相關(guān)的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目下降并沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性，但是結(jié)果確實(shí)與XIAP相關(guān)的胱天蛋白酶下降良好關(guān)聯(lián)(見圖6)。慢性脫離中的光感受器存活率為評(píng)價(jià)光感受器的長(zhǎng)期結(jié)構(gòu)保護(hù)，對(duì)視網(wǎng)膜脫離后2個(gè)月時(shí)取樣的眼睛進(jìn)行組織學(xué)。用針對(duì)GFP (見圖8A、B)或XIAP (見圖8D、E)的免疫組織化學(xué)顯現(xiàn)rAAV病毒注射位點(diǎn)并將其與組織學(xué)研究關(guān)聯(lián)。觀察經(jīng)XIAP處理和經(jīng)GFP處理的視網(wǎng)膜之間的形態(tài)學(xué)差異。 經(jīng)XIAP處理樣品的內(nèi)外區(qū)段通常比經(jīng)GFP處理的視網(wǎng)膜更有條理，但沒有相同眼的附著區(qū)域那么有條理。視紫紅質(zhì)染色證實(shí)，保留下來的光感受器可存活并產(chǎn)生功能蛋白質(zhì)(見圖 8C、F)。將ONL中的光感受器核層進(jìn)行計(jì)數(shù)并在rAAV-XIAP或rAAV_GFP處理的脫離視網(wǎng)膜與其正常的附著對(duì)應(yīng)物之間進(jìn)行比較?？偸窃谘刂怪弊游缇€在離視神經(jīng)距離相同處進(jìn)行計(jì)數(shù)以說明視網(wǎng)膜變薄，因?yàn)楫?dāng)朝眼睛周圍移動(dòng)時(shí)，視網(wǎng)膜變薄會(huì)自然發(fā)生?？傊?，在經(jīng) XIAP處理的脫離視網(wǎng)膜中ONL得到顯著保存(見圖8和9)。這些視網(wǎng)膜具有4_8個(gè)核層 (相比于相同眼睛附著區(qū)域中的6-11個(gè)核層)。經(jīng)GFP處理的脫離視網(wǎng)膜具有0-7個(gè)核層 (而相同眼睛附著部分中具有6-14個(gè)核層)。對(duì)每只動(dòng)物，計(jì)算相對(duì)于附著區(qū)域的脫離區(qū)域中的ONL核比例(見圖9E)。實(shí)施例5MET對(duì)視網(wǎng)膜凋亡的作用在開發(fā)本發(fā)明實(shí)施方案期間進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，用標(biāo)準(zhǔn)化動(dòng)物模型(大鼠)產(chǎn)生視網(wǎng)膜脫離。在視網(wǎng)膜脫離時(shí)，注射三種化合物之一(mMET、MET、DMS0)。在脫離后72小時(shí)時(shí)， 采集并加工眼睛用于TUNEL染色。MET顯著減少陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目(見圖10)(即減少凋亡細(xì)胞的數(shù)目)。在開發(fā)本發(fā)明實(shí)施方案期間進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，用標(biāo)準(zhǔn)化動(dòng)物模型(大鼠)產(chǎn)生視網(wǎng)膜脫離。在脫離后M小時(shí)，采集并加工眼睛用于胱天蛋白酶8活性測(cè)定。胱天蛋白酶8 是FAS受體活化的第一個(gè)下游靶標(biāo)。胱天蛋白酶8活性增加意味著更多的FAS受體活化。 α-Met (實(shí)驗(yàn)性化合物)防止由視網(wǎng)膜脫離引起的胱天蛋白酶8活性的增加(見圖11)。類似的結(jié)果在該途徑中的甚至更遠(yuǎn)下游的另兩種胱天蛋白酶(胱天蛋白酶3和9)中觀察到。實(shí)施例6組合物及方法通過視網(wǎng)膜下注射透明質(zhì)酸在Brown Norway大鼠中產(chǎn)生視網(wǎng)膜-RPE分離。在分離時(shí)將從癌蛋白Met的Fas結(jié)合細(xì)胞外域獲得的Metl2注射入視網(wǎng)膜下間隙。以類似方式給予的突變體肽或溶媒充當(dāng)無活性對(duì)照。用Fas活化抗體在Metl2存在或不存下在661W 細(xì)胞中誘導(dǎo)外源性凋亡途徑。用量熱測(cè)定和發(fā)光測(cè)定在視網(wǎng)膜提取物和細(xì)胞裂解物中測(cè)定胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8和胱天蛋白酶9的活性。分離后3天在視網(wǎng)膜切片中進(jìn)行末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移膜dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)。在視網(wǎng)膜脫離后2個(gè)月對(duì)視網(wǎng)膜切片進(jìn)行組織學(xué)。視網(wǎng)膜脫離實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Ｓ?0 50混合的氯胺酮(lOOmg/mL)和賽拉嗪QOmg/mL) 麻醉嚙齒動(dòng)物，用局部去氧腎上腺素(2. 5% )和托吡卡胺(1% )擴(kuò)瞳。用20規(guī)微玻璃體視網(wǎng)膜刀(Walcott Scientific, Marmora, NJ)緣前2mm產(chǎn)生鞏膜切開術(shù)，小心避免晶狀體損壞。在通過手術(shù)顯微鏡的直接顯現(xiàn)下，將Glaser視網(wǎng)膜下注射器(32規(guī)尖；BD OphthalmicSystem, Sarasota, FL)通過鞏膜切開術(shù)引入玻璃體腔，然后通過周邊視網(wǎng)膜切開術(shù)引入視網(wǎng)膜下間隙。緩慢注射透明質(zhì)酸鈉(10mg/mL) (Pharmacia and Upjohn Co.，Kalamazoo, MI)以從底下的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中分離感覺神經(jīng)視網(wǎng)膜。在所有實(shí)驗(yàn)中，大約三分之一到二分之一的鼻上的感覺神經(jīng)視網(wǎng)膜被脫離。脫離在所有測(cè)試動(dòng)物的相同位置產(chǎn)生以允許直接比較視網(wǎng)膜細(xì)胞計(jì)數(shù)。脫離在左眼產(chǎn)生，留下右眼作為對(duì)照。在一些眼中，在脫離產(chǎn)生后立即將野生型 Met YLGA 12-聚體(HHIYLGAVNYIY (SEQ ID NO :1)，Metl2，50 μ g)、突變體 Metl2-聚體(HHGSDHERNYIY (SEQ ID NO :2)，mMet,50y g)或溶媒(DMSO)以 10 μ 1 體積用 Hamilton注射器(Hamilton Company, Reno, NV)注射入脫離區(qū)域視網(wǎng)膜下間隙。細(xì)胞培養(yǎng)。將661W細(xì)胞系維持在Dulbecco氏改良的fegle氏培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含有10%胎牛血清、300mg/L谷氨酰胺、3ang/L腐胺、40μ L/Ιβ -巰基乙醇和40 μ g/L的氫化可的松21-半琥酯和孕酮。該培養(yǎng)基還含有青霉素(90單位/ml)和鏈霉素(0.09mg/ ml)。將細(xì)胞在37°C下在5% CO2和95%空氣的增濕氣氛中生長(zhǎng)。胱天蛋白酶活性測(cè)定。按照制造商的說明書(Bio-Vision，Mountain View, CA)， 用比色法四肽裂解測(cè)定試劑盒測(cè)定胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8和胱天蛋白酶9的活性。 按照先前公布的方案提取總視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)(Zacks等人，I0VS，2003年第44卷第3期第 1262-1267頁(yè)，通過引用以其整體結(jié)合到本文中)。將來自附著或脫離視網(wǎng)膜的100微克總視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)與胱天蛋白酶3 (DEVD-pNA)、胱天蛋白酶8 (IETD-pNA)或胱天蛋白酶9底物(LEHD-pNA)以200 μ M終濃度溫育60分鐘。用微量培養(yǎng)板讀數(shù)器(Spectra-MAX 190， Molecular Devices, Sunnyvale, CA)在405nm處測(cè)定吸光度。作為陰性對(duì)照，將視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)與沒有四肽的測(cè)定緩沖液共同溫育。使用第二陰性對(duì)照，其中測(cè)定緩沖液?jiǎn)为?dú)與四肽溫育。作為陽(yáng)性對(duì)照，將純化的胱天蛋白酶3、胱天蛋白8或胱天蛋白酶9單獨(dú)與四肽溫育。 將脫離視網(wǎng)膜中的胱天蛋白酶活性針對(duì)在相同時(shí)間點(diǎn)的附著視網(wǎng)膜中的胱天蛋白酶活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。對(duì)于每一組，數(shù)據(jù)代表數(shù)個(gè)(例如5個(gè))獨(dú)立樣品的平均胱天蛋白酶活性水平，每個(gè)樣品由來自5只眼的蛋白質(zhì)構(gòu)成。在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，用市售發(fā)光四肽(LETD)裂解測(cè)定試劑盒(ftOmega，Madison， WI)測(cè)定胱天蛋白酶8的活性。在處理前將661W細(xì)胞以1500個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板 (Nunc, Rochester, NY)達(dá)M小時(shí)。用不同濃度的Metl2、mMet或溶媒預(yù)處理細(xì)胞1小時(shí)， 然后用500ng/mFas拮抗性Jo2單克隆抗體(BD Biosciences, San Jose, CA)處理。按照制造商的說明書，通過將細(xì)胞與高亮度冷光(pro-luminescent)底物在96孔板中溫育，在不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定胱天蛋白酶8的活性。對(duì)照包括未經(jīng)處理的細(xì)胞和沒有細(xì)胞的孔。用平板讀數(shù)器發(fā)光計(jì)(Turner Bio System, Sunnyvale, CA)測(cè)定發(fā)光。蛋白質(zhì)印跡分析。將帶有脫離的實(shí)驗(yàn)眼睛和沒有脫離的對(duì)照眼睛的視網(wǎng)膜從 RPE脈絡(luò)膜切開、勻漿并在緩沖液中裂解，每IOmL緩沖液含有IOmM HEPES(pH7. 6) ,0.5% IgEPal、42mM KClUmM苯甲基磺酰氟(PMSF)、lmM EDTAUmM EGTA、ImM二硫蘇糖醇(DTT)和 5mM MgCl2 以及 1 片蛋白酶抑制劑(Complete Mini ；Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)。將勻漿在冰上溫育并在4°C下于22，OOOg離心60分鐘。然后確定上清液的蛋白質(zhì)濃度(DC蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒；Bio-Rad Laboratories, Hercules CA)。將蛋白質(zhì)樣品上樣在 SDS 聚丙烯酰胺凝膠(Tris-HCl Ready Gels ；Bio-Rad Laboratories)上并運(yùn)行。在電泳分離后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Immobilon-P ；Amersham PharmaciaBiotech, Piscataway, NJ)上。將蛋白質(zhì)條帶用麗春紅S染色顯現(xiàn)，并通過對(duì)存在于所有泳道上的非特異性條帶進(jìn)行密度測(cè)定來評(píng)估等量上樣的泳道。然后根據(jù)制造商的說明書， 針對(duì)裂解的胱天蛋白酶3、裂解的胱天蛋白酶8和裂解的胱天蛋白酶9 (Ce 11 Signal ing Technology, Danvers, ΜΑ)進(jìn)行免疫印跡。TUNEL染色和組織學(xué)。在脫離產(chǎn)生后的不同間隔，將動(dòng)物施行安樂死并摘下眼睛。對(duì)于TUNEL染色，將全眼在4°C下于具有4%多聚甲醛的磷酸緩沖鹽水(pH7.4) 中固定過夜。將樣品包埋于石蠟中并以5-6μπι的厚度切片。根據(jù)制造商的說明書 (MilliporeBillerica, MA)，用ApopTag熒光素原位凋亡檢測(cè)試劑盒對(duì)切片進(jìn)行TUNEL染色。對(duì)于光顯微鏡分析，用含0.5%甲苯胺藍(lán)的0. 硼酸鹽緩沖液對(duì)石蠟切片進(jìn)行染色。細(xì)胞計(jì)數(shù)和視網(wǎng)膜厚度測(cè)定。將感光細(xì)胞凋亡定量為外核層(ONL)中TUNEL陽(yáng)性的總細(xì)胞的百分比。每個(gè)切片選擇視網(wǎng)膜脫離最大高度處的三個(gè)非重疊高倍視野(40Χ) 并取平均值，除非存在少于三個(gè)非重疊高倍視野，在這種情況下使用較少視野。每只眼睛使用一個(gè)代表性的切片。以類似的方式測(cè)定ONL中的細(xì)胞總數(shù)目。在每個(gè)切片視網(wǎng)膜脫離最大高度處的三個(gè)非重疊高倍視野(40Χ)中每個(gè)視野的三個(gè)地方測(cè)定視網(wǎng)膜的總厚度(從 ONL外緣測(cè)定至內(nèi)界膜)并對(duì)每個(gè)眼取均值。假定感覺神經(jīng)視網(wǎng)膜脫離后這些元件可變退縮，則光感受器內(nèi)區(qū)段和外區(qū)段不包括在總視網(wǎng)膜厚度測(cè)量中，該可變退縮無需與光感受器的重附著后的生存能力相關(guān)(Zou等人，Nat Med, 2007年9月第13卷第9期第1078-85. 頁(yè)；Guerin 等人，Invest Ophthalmol Vis Sci, 1993 年第 34 卷第 1 期第 175-183 頁(yè)，通過引用以其整體結(jié)合到本文中)。對(duì)于甲苯胺藍(lán)染色的樣本，將每個(gè)切片的ONL細(xì)胞計(jì)數(shù)對(duì)總視網(wǎng)膜厚度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(即，ONL細(xì)胞計(jì)數(shù)除以總視網(wǎng)膜厚度)，以說明切片角度的可能差異并允許進(jìn)行樣品間比較。每個(gè)大鼠實(shí)驗(yàn)組的ONL細(xì)胞計(jì)數(shù)和總視網(wǎng)膜厚度也針對(duì)該組的附著視網(wǎng)膜的相應(yīng)值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化以允許進(jìn)行樣品間比較。對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)組，對(duì)來自多只眼睛(例如，10只)的多個(gè)切片(例如，3個(gè))進(jìn)行測(cè)量，每只眼睛來自單獨(dú)的動(dòng)物。實(shí)施例7Metl2的體外分析661W細(xì)胞系為感光細(xì)胞系，其通過在人光感受器間視黃醇結(jié)合蛋白(IRBP)啟動(dòng)子的控制下表達(dá)SV40-T抗原而永生化(Al-Ubaidi等人，J Cell Biol, 1992年第119卷第6期第1681-1687頁(yè)，通過引用以其整體結(jié)合到本文中)。661W細(xì)胞表達(dá)視錐光感受器標(biāo)記，包括藍(lán)色和綠色視錐色素、轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和視錐抑制蛋白(Tan等人，Invest Ophthalmol Vis Sci, 2004年第3期第764-768頁(yè)，通過引用以其整體結(jié)合到本文中)，并可經(jīng)受胱天蛋白酶介導(dǎo)的細(xì)胞死亡(Kanan等人，Invest Ophthalmol Vis Sci，2007年第48卷第1期第40-51頁(yè)，通過引用以其整體結(jié)合到本文中)。在開發(fā)本發(fā)明期間進(jìn)行的在先實(shí)驗(yàn)表明， Fas信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在體內(nèi)胱天蛋白酶8活化和光感受器凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。用Fas活化抗體(Fas-Ab)處理661W細(xì)胞。Fas-Ab的添加導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在661W細(xì)胞裂解物中測(cè)定的胱天蛋白酶8活性隨!^is-Ab濃度的增加而增加，峰值在500ng/ml劑量處(見圖12A)。用 500ng/ml Fas-Ab處理661W細(xì)胞并在不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定活性水平。在暴露于!^as-Ab的661W 細(xì)胞中，胱天蛋白酶8的活性在48小時(shí)處顯著增加(見圖12B)。Met抑制Fas途徑。小的12-聚體肽Metl2包含Met的Fas結(jié)合YLGA模體周圍的氨基酸，其保護(hù)Jurkat細(xì)胞免受！^認(rèn)誘導(dǎo)的凋亡(Zou等人，Nat Med，2007年9月，第13卷第9期第1078-85.頁(yè)，通過引用以其整體結(jié)合到本文中)。在Met2或無活性突變體肽 mMet的存在下用Fas-Ab處理66IW細(xì)胞，mMet中隨機(jī)改變包含YLGA模體的中央6個(gè)氨基酸。在處理后48小時(shí)確定胱天蛋白酶8的活性，作為!^s-受體途徑活化的衡量。Fas-Ab誘導(dǎo)的胱天蛋白酶8的活化被Metl2處理以劑量依賴方式抑制(見圖12C)。相反，僅用mMet 肽或溶媒對(duì)細(xì)胞的處理對(duì)Fas介導(dǎo)的胱天蛋白酶8活化無影響。661W細(xì)胞具有完好的Fas 死亡受體途徑。Metl2肽可在體外光感受器模型中抑制Fas信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。實(shí)施例8Metl2的體內(nèi)作用在開發(fā)本發(fā)明期間進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明，視網(wǎng)膜脫離導(dǎo)致hs/i^sL途徑活化和胱天蛋白酶8裂解(Zacks等人，I0VS，2003年第44卷第3期第1262-1267 M ；Zacks等人，Arch Ophthalmol, 2007 年第 125 卷第 1389-1395 頁(yè)；Zacks 等人，10VS, 2004 年第 45 卷第 12 期第4563-4569. 8頁(yè)，通過引用以其整體結(jié)合到本文中)。在視網(wǎng)膜脫離后M小時(shí)研究Metl2 對(duì)光感受器胱天蛋白酶8活化的影響。大鼠視網(wǎng)膜在Metl2 (50 μ g)、mMet (50 μ g)或溶媒的存在下被脫離。與附著的視網(wǎng)膜相比，胱天蛋白酶8的活性在用溶媒或mMet注射的脫離的視網(wǎng)膜中顯著增加(見圖13)。在視網(wǎng)膜脫離時(shí)于視網(wǎng)膜下注射Metl2肽使胱天蛋白酶 8的活性減少大約50%。這些結(jié)果表明，與661W細(xì)胞類似，用Metl2處理脫離的視網(wǎng)膜抑制光感受器中Fas介導(dǎo)的胱天蛋白酶8的活化。在嚙齒動(dòng)物光感受器凋亡期間，F(xiàn)as/FasL信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作為內(nèi)源性死亡途徑的上游調(diào)節(jié)物。這通過將抗Fas或!^asL的中和抗體注射入脫離視網(wǎng)膜的視網(wǎng)膜下間隙后胱天蛋白酶9活性減少而表明(Zacks等人，10VS, 2004年第45卷第12期第4563-4569. 8頁(yè)，通過引用以其整體結(jié)合到本文中)。在徹{12(5(^0、!111討(5(^0或溶媒的存在下的視網(wǎng)膜脫離后M小時(shí)測(cè)定胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9的活性水平。M小時(shí)后視網(wǎng)膜下Metl2注射使胱天蛋白酶3的活性減少了大約50% (見圖13)。類似地，用Metl2注射的脫離視網(wǎng)膜中，胱天蛋白酶9的活性也減少了約50% (見圖13)。相反，視網(wǎng)膜下注射mMet并不影響任一種這些胱天蛋白酶的活性水平。蛋白質(zhì)印跡確證了胱天蛋白酶8酶原轉(zhuǎn)化為裂解胱天蛋白酶8(見圖13)，如胱天蛋白酶3和9的裂解一樣。這些結(jié)果表明，Metl2介導(dǎo)的!^s 受體抑制導(dǎo)致脫離的光感受器中內(nèi)源性細(xì)胞死亡途徑活化減少。在嚙齒動(dòng)物的眼睛中，TUNEL染色峰值出現(xiàn)在視網(wǎng)膜/RPE分離后3天，到第7天， TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞快速下降至接近分離前的水平(Zacks等人，I0VS, 2003年第44卷第3期第 1262-1267 頁(yè)；Zacks 等人，Arch Ophthalmol，2007 年第 125 卷第 1389-1395 頁(yè)，通過引用以其整體結(jié)合到本文中)。在Metl2、mMet或溶媒的存在下使大鼠視網(wǎng)膜脫離。在視網(wǎng)膜脫離后3天，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞局限于光感受器的ONL(見圖14A)。約5%的ONL細(xì)胞在分離后3天表現(xiàn)出TUNEL陽(yáng)性染色(見圖14B)。與用mMet注射的獨(dú)立視網(wǎng)膜相比，將Metl2注射入視網(wǎng)膜下間隙導(dǎo)致TUNEL陽(yáng)性光感受器減少約77% (見圖14B)。由于單獨(dú)注射溶媒， 總組織學(xué)改變不可檢測(cè)。如上所述脫離大鼠視網(wǎng)膜并在脫離時(shí)將Metl2、mMet或溶媒注射入視網(wǎng)膜下間隙。2個(gè)月后，與附著的視網(wǎng)膜相比，脫離的視網(wǎng)膜的ONL厚度顯示出顯著的減少(見圖 15A)。視網(wǎng)膜脫離后2個(gè)月，與用mMet注射的視網(wǎng)膜相比，用Metl2注射的大鼠視網(wǎng)膜顯示出ONL細(xì)胞計(jì)數(shù)增加37% (見圖15B)以及ONL厚度測(cè)量增加27% (見圖15C)。這些結(jié)果表明，通過Metl2抑制Fas信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和胱天蛋白酶活化在延長(zhǎng)的視網(wǎng)膜/RPE分離后增加光感受器的存活率。
權(quán)利要求
1.一種增加光感受器存活率的方法，包括給予光感受器保護(hù)組合物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述增加光感受器存活率包括抑制光感受器凋亡。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述光感受器保護(hù)組合物包含光感受器保護(hù)多肽或編碼光感受器保護(hù)多肽的核酸。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述光感受器保護(hù)多肽包括IL-6或其片段。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述光感受器保護(hù)多肽包括XIAP或其片段。
6.權(quán)利要求3的方法，其中所述光感受器保護(hù)多肽包括MET或其片段。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述MET片段包括MET12。
8.權(quán)利要求6的方法，其中所述MET片段包含與MET12至少70%的序列相似性。
9.權(quán)利要求2的方法，其中所述光感受器凋亡包括FAS介導(dǎo)的光感受器凋亡。
10.權(quán)利要求1的方法，其中將所述光感受器保護(hù)組合物給予細(xì)胞群。
11.權(quán)利要求10的方法，其中將所述光感受器保護(hù)組合物以足以增加所述細(xì)胞群內(nèi)的光感受器存活率的量給予。
12.權(quán)利要求1的方法，其中將所述光感受器保護(hù)組合物給予受試者。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述受試者處于眼部病況、疾病或者影響眼部健康的病況或疾病的風(fēng)險(xiǎn)中。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述受試者患有眼部病況、疾病或者影響眼部健康的病況或疾病。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述眼部病況、疾病或者影響眼部健康的病況或疾病包括視網(wǎng)膜脫離、黃斑變性、視網(wǎng)膜色素變性、眼部炎癥、自身免疫性視網(wǎng)膜病變、創(chuàng)傷、癌癥、 腫瘤、葡萄膜炎、遺傳性視網(wǎng)膜變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變、脈絡(luò)膜新血管形成、視網(wǎng)膜缺血、 病理性近視、血管樣條紋癥、黃斑水腫或中心性漿液性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述眼部病況、疾病或者影響眼部健康的病況或疾病包括視網(wǎng)膜脫離。
17.權(quán)利要求15方法，其中所述眼部病況、疾病或者影響眼部健康的病況或疾病包括黃斑變性。
18.權(quán)利要求12方法，其中將所述光感受器保護(hù)組合物以足以提高所述受試者內(nèi)的光感受器存活率的量給予。
19.一種組合物，其包含光感受器保護(hù)組合物和配置用于眼部遞送的藥用載體。
20.權(quán)利要求19的組合物，其中所述光感受器保護(hù)組合物包含光感受器保護(hù)多肽或編碼光感受器保護(hù)多肽的核酸。
全文摘要
本發(fā)明提供防止光感受器死亡的方法。具體而言，本發(fā)明提供防止FAS介導(dǎo)的光感受器凋亡的肽。
文檔編號(hào)C12N5/02GK102449140SQ201080020137
公開日2012年5月9日 申請(qǐng)日期2010年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月3日
發(fā)明者D·N·扎克斯 申請(qǐng)人:密執(zhí)安大學(xué)評(píng)議會(huì)