專利名稱：一種重組tat-xiap融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域與優(yōu)化的X-連鎖 凋亡抑制蛋白融合形成的融合蛋白。
背景技術(shù)：
基因治療(gene therapy)是二十世紀(jì)八十年代以來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)，它主 要是向靶細(xì)胞或組織中引入外源基因DNA或RNA片段，以糾正或補(bǔ)償基因的缺陷，關(guān)閉或抑 制異常表達(dá)的基因，從而達(dá)到治療的目的。傳統(tǒng)的基因治療是將目的基因?qū)氲郊?xì)胞當(dāng)中，并使其表達(dá)，但是這一技術(shù)存在 著以下一些不足首先是常規(guī)轉(zhuǎn)基因方法操作繁瑣，轉(zhuǎn)染效率較低，轉(zhuǎn)染后目的基因表達(dá)水 平不足，基因表達(dá)調(diào)控較困難，其次是常用的病毒載體存在著安全性的問(wèn)題。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)是近年發(fā)展起來(lái)的一種將外源蛋白導(dǎo)入細(xì)胞的方法。將某些特殊的 多肽與靶物質(zhì)共價(jià)相連后，這些多肽會(huì)連同靶物質(zhì)一起，進(jìn)入臨近細(xì)胞。這種由多肽攜帶 靶物質(zhì)跨過(guò)細(xì)胞膜的阻擋，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的過(guò)程稱為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)(protein transduction)。這 些能攜帶外源物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的多肽成稱蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(proteintransduction domain, PTD)。人類I型免疫缺陷病毒(HIV-I)的轉(zhuǎn)錄反式激活因子(trans-activator of transcription, TAT)的47 57位氨基酸(YGRKKRRQRRR)是轉(zhuǎn)導(dǎo)功能較強(qiáng)而確切的一種 蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。研究表明，TAT-PTD能夠?qū)⑴c之共價(jià)連接的生物大分子(如核酸、多肽、 蛋白質(zhì)等)轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)部，這種過(guò)程不依賴于受體和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能在無(wú)脂質(zhì)體、磷酸鈣、 電轉(zhuǎn)化、病毒載體等條件下直直接透過(guò)細(xì)胞膜甚至血腦屏障，并可在周圍細(xì)胞間傳遞，被轉(zhuǎn) 導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的外源蛋白保留其原有的生物學(xué)活性與功能，與溫度和能量無(wú)關(guān)，對(duì)宿主細(xì)胞 幾乎沒(méi)有毒性。在正常情況下，蛋白質(zhì)由于分子量較大，是不能透過(guò)細(xì)胞膜阻擋，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)甚至 細(xì)胞核中的，但是將富含賴氨酸、精氨酸的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域多膚與共價(jià)的所需要的目的基 因產(chǎn)物相連后，這些目的基因產(chǎn)物就會(huì)被帶到細(xì)胞中，發(fā)揮應(yīng)有的生物學(xué)功能。目前利用該 方法已經(jīng)高效地將EGFP、β-半乳糖苷酶、caspase-3, insulin等等多種蛋白質(zhì)帶到細(xì)胞 中。目前最常用的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域共價(jià)偶連方法是將目的基因與蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域基因相融 合，最后產(chǎn)生賦予了新的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的目的蛋白。蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)高效、快速，并且不受目的基因產(chǎn)物大小限制，因而有望成為一種新 的基因治療手段，目前正成為研究熱點(diǎn)。凋亡抑制蛋白(inhibitorof apoptosis protein, IAP)是一類在結(jié)構(gòu)上具 有同源性的內(nèi)源性凋亡抑制蛋白家族，對(duì)半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase, caspase)誘發(fā)的細(xì)胞凋亡過(guò)程有明顯的抑制效應(yīng)。X_連 鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibotor ofapoptosis protein,XIAP)是 IAP家族中最有效 力的caspase抑制物，通過(guò)結(jié)合與抑制caspase-3、caspase-7、caspase-9的活性及減少細(xì) 胞色素C從線粒體釋放入胞漿而阻止細(xì)胞凋亡。
研究顯示神經(jīng)細(xì)胞凋亡是老年癡呆和帕金森病等神經(jīng)退行性疾病的共同特征和 結(jié)局。然而，XIAP是分子量57kDa的大分子物質(zhì)，由于不易通過(guò)血腦屏障，使進(jìn)一步研究和 臨床應(yīng)用受到極大的限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種重組TAT-XIAP融合蛋白及其制備方法。所 述的融合蛋白能夠進(jìn)入腦細(xì)胞中，產(chǎn)生抵抗細(xì)胞凋亡的作用。本發(fā)明所述的重組TAT-XIAP融合蛋白，是人免疫缺陷病毒HIV的TAT基因編碼的 蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域與優(yōu)化的χ-連鎖凋亡抑制蛋白核苷酸序列融合形成的融合蛋白，該融合 蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。上述重組TAT-XIAP融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。所述優(yōu)化的X-連鎖凋亡抑制蛋白是利用大腸桿菌偏愛(ài)密碼子對(duì)核苷酸序列如 SEQ ID NO :3所示的X-連鎖凋亡抑制蛋白核苷酸序列進(jìn)行優(yōu)化，該X-連鎖凋亡抑制蛋 白核苷酸序列從美國(guó)國(guó)立生物信息中心(NCBI基因庫(kù))獲得，生物體為褐家鼠(Rattus norvegicus)，最早由日本的Saito，N獲得。優(yōu)化的X-連鎖凋亡抑制蛋白核苷酸序列如SEQ ID NO 4 所示。所述人免疫缺陷病毒HIV的TAT基因編碼的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列如SEQ ID NO 5所示，從人類I型免疫缺陷病毒(HIV-I)獲得，該人類I型免疫缺陷病毒(HIV-I) 的TAT基因編碼的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域由美國(guó)NicholeLake贈(zèng)送給申請(qǐng)人，所述人類I型免疫 缺陷病毒(HIV-I)最早由法國(guó)巴斯德研究所的蒙塔尼教授獲得。本發(fā)明所述的融合蛋白含有6His標(biāo)簽蛋白、腸激酶酶切位點(diǎn)、TAT-PTD蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo) 結(jié)構(gòu)域、X-連鎖凋亡抑制蛋白及其它連接序列。OTis標(biāo)簽蛋白用于融合蛋白的純化，腸激 酶酶切位點(diǎn)(5個(gè)氨基酸DDDDK)通過(guò)腸激酶切除6His標(biāo)簽蛋白而釋放TAT-XIAP融合蛋白。上述重組TAT-XIAP融合蛋白的制備方法為1、構(gòu)建TAT-XIAP融合蛋白原核表達(dá)載體根據(jù)NCBI基因庫(kù)提供的大鼠XIAP的DNA序列，按照大腸桿菌的偏愛(ài)密碼子進(jìn)行 優(yōu)化，由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成基因序列，兩端分別帶有NcoI和XhoI酶切位 點(diǎn)。用NcoI和XhoI酶對(duì)pTAT-HA質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，將XIAP基因插入NcoI和XhoI酶切位 點(diǎn)之間，構(gòu)建TAT-XIAP融合蛋白原核表達(dá)載體，上述載體經(jīng)酶切及測(cè)序檢測(cè)，序列正確。2、轉(zhuǎn)化大腸桿菌取100 μ 1感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)菌株BL21(DE3)pLysS于冰水浴，向感受態(tài)細(xì)胞中加入 10 μ 1 pTAT-XIAP質(zhì)粒DNA，冰浴靜置30min，將離心管置于42°C水浴90s，冰浴冷卻2 3min,向離心管中加入900 μ 1 LB液體培養(yǎng)基(不含抗生素)，37°C搖床震蕩培養(yǎng)45min。取 100 μ 1轉(zhuǎn)化菌液加到LB固體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素)，37°C培養(yǎng)12 16h。3、IPTG誘導(dǎo)融合蛋白基因表達(dá)挑取單個(gè)轉(zhuǎn)化的陽(yáng)性菌落于3ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C搖床培養(yǎng)過(guò) 夜，取活化菌液10%接種于IOml LB(Amp 100mg/L)培養(yǎng)液中，當(dāng)OD6tltl達(dá)0. 6-0. 8時(shí)，加 IPTG至終濃度lmmlol/L，30°C誘導(dǎo)表達(dá)4小時(shí)。SDS-PAGE電泳及Western blot證實(shí)，TAT-XIAP融合蛋白在BL21 (DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞中獲得高效表達(dá)。4、融合蛋白純化上述誘導(dǎo)表達(dá)的菌液經(jīng)過(guò)超聲破碎后，4°C IOOOOrpm離心30min，表達(dá)產(chǎn)物存在于 沉淀中，沉淀經(jīng)2M、4M尿素洗滌后，加8M尿素溶解，取上清經(jīng)鎳柱親和層析純化，獲得純化 后的融合蛋白，其純度大于90 %。5、融合蛋白復(fù)性純化后的樣品加入10%甘油，依次用5M、4M、2M、1M的尿素緩沖液透析，再用PBS、 去離子水透析后，凍干，蛋白定量分析試劑盒測(cè)定重組蛋白濃度，0. 22 μ m濾膜過(guò)濾除菌，小 量分裝后-80°C保存。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明將人免疫缺陷病毒TAT基因47 57位氨基酸 (YGRKKRRQRRR)編碼序列與優(yōu)化后的X-連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)基因融合，利用人免疫缺 陷病毒HIV的TAT基因編碼的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力來(lái)彌補(bǔ)X-連鎖凋亡抑制蛋白不 能跨過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦內(nèi)發(fā)揮抗凋亡作用的不足，使得該基因的最終表達(dá)產(chǎn)物能夠進(jìn)入腦 組織細(xì)胞中，產(chǎn)生抵抗細(xì)胞凋亡作用。


圖1為構(gòu)建的pTAT-XIAP質(zhì)粒載體示意圖；圖2為pTAT-XIAP重組質(zhì)粒載體的酶切鑒定圖，其中1、DNA Marker,2、pTAT-XIAP重組質(zhì)粒，3、雙酶切產(chǎn)物；圖3為pTAT-XIAP重組質(zhì)粒在BL21 (DE3)pLysS中表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析圖， 其中1、pTAT-HA轉(zhuǎn)化菌經(jīng)lmmol/L IPTG誘導(dǎo)，2、重組菌經(jīng)lmmol/LIPTG誘導(dǎo)，3、重組菌未 加IPTG誘導(dǎo)的對(duì)照，4、蛋白Marker ；圖4為pTAT-XIAP重組質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物的Western blot分析圖；圖5為TAT-XIAP融合蛋白純化結(jié)果圖，其中1、蛋白Marker，2 5、TAT-XIAP融
合蛋白ο圖6為不同濃度的TAT-XIAP融合蛋白抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用的曲線圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例1TAT-XIAP融合蛋白的制備UpTAT-XIAP融合蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)NCBI基因庫(kù)提供的大鼠XIAP的DNA序列，按照大腸桿菌的偏愛(ài)密碼子進(jìn)行 優(yōu)化，由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成基因序列，兩端分別帶有NcoI和XhoI酶切位 點(diǎn)。用NcoI和XhoI酶對(duì)pTAT-HA質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，將XIAP基因插入NcoI和XhoI酶切位 點(diǎn)之間，構(gòu)建pTAT-XIAP融合蛋白原核表達(dá)載體，其質(zhì)粒載體示意圖如圖1所示，另外構(gòu)建 pET-32a-XIAP表達(dá)載體，產(chǎn)生XIAP作為對(duì)照。2、pTAT-XIAP重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化取100 μ 1 DH5 α感受態(tài)細(xì)胞于冰水浴，向感受態(tài)細(xì)胞中加入10 μ ΙρΤΑΤ-ΧΙΑΡ質(zhì) 粒DNA，冰浴靜置30min，將離心管置于42°C水浴90s，冰浴冷卻2 3min，向離心管中加入900 μ 1 LB液體培養(yǎng)基(不含抗生素)(配方胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，加 蒸餾水至1升)，37°C搖床震蕩培養(yǎng)45min。取100 μ 1轉(zhuǎn)化菌液加到LB固體培養(yǎng)基(含氨 芐青霉素)(配方胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，加蒸餾水至1升，臨用前加氨 芐青霉素至終濃度為100mg/L)，37°C培養(yǎng)12 16h。以未轉(zhuǎn)化菌和轉(zhuǎn)化pTAT_HA空載體的 菌珠作為對(duì)照。3、pTAT-XIAP重組質(zhì)粒擴(kuò)增及鑒定取pTAT-XIAP質(zhì)粒的單個(gè)轉(zhuǎn)化菌落接種至LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，將1 1. 5ml 菌液加入 1. 5ml 無(wú)菌 EP 管中，IOOOOrpm 離心 30s，棄上清，加 250 μ IResuspension Buffer 重懸菌體，力口 250 μ 1 Lysis Buffer,輕柔顛倒 4 6 次，力口 350 μ 1 Neutralization Buffer，立即輕柔顛倒4 6次，12000rpm離心15min。將上清液轉(zhuǎn)移到Spin column內(nèi)， 6000rpm 離心 lmin,棄接液管液體，加 650 μ 1 Wash Buffer, 12000rpm 離心 30 60s,棄接 液管液體，再次于12000rpm離心lmin，將Spin column轉(zhuǎn)移至1. 5ml無(wú)菌EP管中。向Spin column內(nèi)加TE溶液50 μ 1，靜置lmin，于12000rpm離心lmin。提取的pTAT-XIAP質(zhì)粒經(jīng) NcoI和XhoI雙酶切，于150V電壓瓊脂糖凝膠上電泳，紫外透射儀觀察，凝膠成像系統(tǒng) 照相。質(zhì)粒于_80°C保存?zhèn)溆?。pTAT-XIAP質(zhì)粒經(jīng)NcoI和XhoI雙酶切后，電泳結(jié)果顯示重 組pTAT-XIAP質(zhì)粒約4500bp，酶切后可觀察到pTAT_HA質(zhì)粒約3000bp，XIAP目的基因條帶 1491bp (不含酶切位點(diǎn))，大小與質(zhì)粒圖譜一致，如圖2所示。提取的重組pTAT-XIAP質(zhì)粒 經(jīng)上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序顯示序列正確。4、pTAT-XIAP重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21 (DE3)pLysS中的表達(dá)及鑒定將pTAT-XIAP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)pLysS，涂布于 含100mg/L氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基中，37°C過(guò)夜培養(yǎng)，挑取轉(zhuǎn)化的陽(yáng)性菌落于3ml 含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C搖床培養(yǎng)過(guò)夜，取活化菌液10%接種于10ml LB (Amp 100mg/L)培養(yǎng)液中，當(dāng)OD600達(dá)0. 6-0. 8時(shí)，加IPTG至終濃度lmmlol/L，30°C誘導(dǎo)表達(dá)4小 時(shí)。5000rpm，4°C離心15min，棄上清收集菌體。PBS洗滌菌體，在細(xì)菌裂解液中超聲破菌， SDS-PAGE分析，考馬斯亮藍(lán)R-250染色。以未加IPTG的菌株和pTAT_HA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21 (DE3) PLysS感受態(tài)細(xì)胞作對(duì)照。結(jié)果顯示以lmmlol/L IPTG誘導(dǎo)的重組菌在63kD位置有明顯條 帶，與理論值相符，對(duì)照菌均無(wú)明顯條帶，如圖3所示。5、pTAT-XIAP重組質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物的Western blot分析將SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)束后的蛋白樣品電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上進(jìn)行western blot分析，以小鼠抗6XHis單克隆抗體作為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體作為二 抗，ECL發(fā)光試劑顯色，X線曝光顯影。結(jié)果顯示以lmmlol/L IPTG誘導(dǎo)的重組菌在63kD處 有明顯條帶，如圖4所示。6、TAT-XIAP融合蛋白的純化、復(fù)性將誘導(dǎo)表達(dá)后收集的菌體按5g/mL(M V)裂解于washing buffer中。冰浴超 聲破菌，4°C IOOOOrpm離心30min，取沉淀。沉淀經(jīng)2M、4M尿素洗滌后，加8M尿素冰浴溶 解lh，4°C 12000rpm離心20min取上清上柱，依次以2OmM和50mM咪唑溶液各15mL[含 50Mm NaH2PO4, 300Mm NaCl，8M尿素，pH8. 0]進(jìn)行洗脫，用IOOmM咪唑溶液收集純化的蛋白， SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖5所示。純化后的樣品加入10%甘油，依次用5M、4M、2M、IM的尿 素緩沖液透析，再用PBS、去離子水透析后，凍干，蛋白定量分析試劑盒測(cè)定重組蛋白濃度，0. 22 μ m濾膜過(guò)濾除菌，小量分裝后-80°c保存。實(shí)施例2TAT-XIAP融合蛋白穿神經(jīng)細(xì)胞膜能力檢測(cè)取新生SD大鼠，在無(wú)菌條件下取腦，0. 125%胰蛋白酶消化(37°C、30min)分散后， 以DMEM培養(yǎng)基稀釋成5 X IO5個(gè)細(xì)胞/ml密度的細(xì)胞液，接種于涂有多聚賴氨酸培養(yǎng)皿中， 在培養(yǎng)液中加入1 2 μ 1實(shí)施例1純化后的TAT-XIAP融合蛋白(試驗(yàn)組)，輕柔混勻，培 養(yǎng)6 12h后，制作細(xì)胞爬片，免疫細(xì)胞化學(xué)(SP法)檢測(cè)XIAP，觀察融合蛋白穿過(guò)細(xì)胞膜 的能力。結(jié)果顯示，隨著融合蛋白濃度增加，陽(yáng)性染色隨之增加，而用XIAP或PBS處理過(guò)的 對(duì)照組未見(jiàn)明顯陽(yáng)性染色，說(shuō)明含有TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的融合蛋白進(jìn)入了腦細(xì)胞中。實(shí)施例3TAT-XIAP融合蛋白穿血腦屏障能力檢測(cè)SD大鼠尾靜脈分別注射10 20 μ 1實(shí)施例1純化后的TAT-XIAP融合蛋白(試驗(yàn) 組)、ΧΙΑΡ(陰性對(duì)照組)、PBS(空白對(duì)照組)6 12h后，免疫組織化學(xué)(SP法)檢測(cè)腦組 織切片XIAP，觀察融合蛋白通過(guò)血腦屏障的能力。結(jié)果表明，試驗(yàn)組的陽(yáng)性染色隨TAT-XIAP融合蛋白濃度增加而增加，而對(duì)照組未 見(jiàn)明顯陽(yáng)性染色。說(shuō)明含有TAT結(jié)構(gòu)域的融合蛋白透過(guò)血腦屏障進(jìn)入了腦細(xì)胞中。實(shí)施例4TAT-XIAP融合蛋白抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡能力檢測(cè)原代培養(yǎng)6周齡胎鼠海馬神經(jīng)元，接種于涂有多聚賴氨酸的96孔培養(yǎng)板，加入不 同濃度的實(shí)施例1制得的TAT-XIAP融合蛋白作用48h后，MTT法檢測(cè)神經(jīng)元存活率，結(jié)果 顯示神經(jīng)元存活率隨融合蛋白濃度的增加而增加，說(shuō)明TAT-XIAP融合蛋白發(fā)揮了抵抗神 經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用，不同濃度的TAT-XIAP融合蛋白抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用的曲線圖如圖6所
7J\ ο
權(quán)利要求
一種重組TAT XIAP融合蛋白，其特征在于它是人免疫缺陷病毒HIV的TAT基因編碼的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域與優(yōu)化的X 連鎖凋亡抑制蛋白核苷酸序列融合形成的融合蛋白，該融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組TAT-XIAP融合蛋白，其特征在于所述重組TAT-XIAP融 合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組TAT-XIAP融合蛋白，其特征在于所述優(yōu)化的X-連 鎖凋亡抑制蛋白核苷酸序列是利用大腸桿菌偏愛(ài)密碼子對(duì)核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示 的χ-連鎖凋亡抑制蛋白核苷酸序列進(jìn)行優(yōu)化得到。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組TAT-XIAP融合蛋白，其特征在于優(yōu)化的X-連鎖凋亡 抑制蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組TAT-XIAP融合蛋白，其特征在于所述人免疫缺陷 病毒HIV的TAT基因編碼的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列如SEQ ID N0:5所示。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體是人免疫缺陷病毒HIV的TAT基因編碼的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域與X-連鎖凋亡抑制蛋白核苷酸序列融合形成的融合蛋白，該融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO1所示。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明先利用大腸桿菌偏愛(ài)密碼子對(duì)核苷酸序列如SEQ ID NO3所示的原XIAP基因進(jìn)行優(yōu)化，使其在大腸桿菌高效表達(dá)，用人免疫缺陷病毒HIV的TAT基因編碼的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力來(lái)彌補(bǔ)X-連鎖凋亡抑制蛋白不能跨過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦內(nèi)發(fā)揮抗凋亡作用的不足，使得該基因的最終表達(dá)產(chǎn)物能夠進(jìn)入腦組織細(xì)胞中，產(chǎn)生抵抗細(xì)胞凋亡作用，用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療與研究。
文檔編號(hào)C07K19/00GK101962412SQ20101011529
公開日2011年2月2日 申請(qǐng)日期2010年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月26日
發(fā)明者劉源劼, 劉漫君, 劉靜, 周思, 夏春波, 張曉紅, 林靜, 秦小云, 范才文, 蔣常文 申請(qǐng)人:桂林醫(yī)學(xué)院