專利名稱：一種啟動子BgIosP565、制備方法及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程技術領域，特別是涉及一種啟動子BgIosP565，含有該啟動子 的核酸構建體、載體、重組細胞、植物愈傷組織，該啟動子的制備方法以及利用該啟動子來 調(diào)控植物中基因表達的方法。
背景技術：
啟動子是基因的一個組成部分，通常位于結構基因5’端上游，是RNA聚合酶識別、 結合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。啟動子能夠指導全酶(holoenzyme)同模板正確結合，活 化RNA聚合酶，啟動基因轉(zhuǎn)錄，從而控制基因表達(轉(zhuǎn)錄)的起始時間和表達的程度。在轉(zhuǎn) 基因植物中，啟動子是影響轉(zhuǎn)基因表達效率的重要因素之一，選擇高效率的啟動子是高效 率表達外源基因的關鍵。根據(jù)啟動子的轉(zhuǎn)錄模式可將其分為3類組成型啟動子、組織或器官特異性啟動 子和誘導型啟動子。所謂組成型啟動子是指在組成型啟動子調(diào)控下，不同組織器官和發(fā)育 階段的基因表達沒有明顯差異，因而稱之組成型啟動子。雙子葉植物中最常使用的組成型 啟動子是花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動子。另一種高效的組成型啟動子CsVMV是從木薯 葉脈花葉病毒(cassava vein mosaic virus)中分離的。人們高度重視從植物本身克隆組成型啟動子。例如肌動蛋白(actin)和泛素 (ubiquitin)等基因的啟動子已被克隆。用這些啟動子代替CaMV 35S啟動子，可以更有效 地在單子葉植物中驅(qū)動外源基因的轉(zhuǎn)錄。Naomi等分別從擬南芥的色氨酸合酶β亞基基因 和植物光敏色素基因中克隆了相應啟動子，用其代替CaMV 35S啟動子，在轉(zhuǎn)基因煙草中也 取得了很好的表達效果(Plant biotechnology, 2002,19(1) :19-26)。單子葉植物基因中常見的啟動子有山bi啟動子(Plant ubiquitin promoter)、 Actin 啟動子(Plant Actin promoter)禾口 Adh-1 啟動子(Maize alcohol dehydrogenase 1 promoter)。Ubi啟動子以其啟動效率高、甲基化程度低、遺傳性狀穩(wěn)定等因素而倍受青睞。目 前，已經(jīng)從很多泛素基因中分離得到啟動子序列，包括玉米基因組中的WDi-I啟動子、水稻 泛素RUBQ2啟動子、擬南芥泛素啟動子、向日葵泛素WdBI啟動子、煙草泛素Ubi. U4啟動子、 馬鈴薯泛素證丨7啟動子、番茄泛素W^il-I啟動子，大麥泛素Mubl啟動子。玉米泛素W^i-I 啟動子已經(jīng)廣泛地應用于玉米、小麥、水稻等單子葉植物中，水稻泛素RUBQ2啟動子在水稻 和甘蔗中也有較多的應用。Actin啟動子1990年由康奈爾大學的McElroy等首次在水稻中發(fā)現(xiàn)，屬于強組成 型啟動子。Actin啟動子在單子葉禾本科中作用顯著，但是鄰近科屬的植物中的基因調(diào)控功 能卻十分不理想。因此，許多相關研究通過其他單子葉植物尋找Actin啟動子，并成功在香 蕉、甜瓜、玉米和擬南芥中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。Actin啟動子由于對基因表達的強調(diào)控作用，在單子葉 植物優(yōu)良性狀的轉(zhuǎn)基因中已經(jīng)得到越來越廣泛的應用。Adh-I啟動子調(diào)控乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase)基因，對植物在缺氧環(huán)境下乙醇脫氫酶的表達至關重要。Adh-I啟動子對單子葉植物特別是谷類植物如水稻、燕麥 和大麥，和少部分雙子葉植物如煙草，基因的調(diào)控功能比花椰菜花葉病毒CaMV 35S啟動子 提高10-50倍。Adh-I啟動子主要應用于單子葉植物，對絕大部分雙子葉植物基因表達的調(diào) 控效果都很有限。單子葉植物是被子植物的主要類群，單子葉植物中的禾本科、百合科、棕櫚科和天 南星等，是非常重要的農(nóng)業(yè)作物。單子葉植物基因的強效啟動子，能夠調(diào)控植物高效率表達 具有特殊性狀的外源基因，對優(yōu)良作物的分子育種研究意義重大。在強效啟動子相關研究領域，發(fā)現(xiàn)并驗證了許多單子葉植物的啟動子。此外，雙子 葉植物中的一些強效啟動子如CsVMV啟動子、番茄E8啟動子、白藜蘆醇合酶基因Vstl啟動 子等高效啟動子，在單子葉植物中也有很強的基因調(diào)控作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的啟動子，能夠在植物中調(diào)控基因的表達。本發(fā)明的另一目的在于提供含有上述啟動子的核酸構建體、載體、重組細胞、植物 愈傷組織、植物外植體及植物。本發(fā)明的再一目的在于提供一種制備上述啟動子的引物、方法，以及一種利用該 啟動子來調(diào)控植物中基因表達的方法。本發(fā)明的再一目的在于提供一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，以及上述啟動子在調(diào)控 植物中目的基因表達或植物育種中的用途。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術方案本發(fā)明公開了一種啟動子，所述啟動子含有選自以下任意一組并具有啟動子功能 的核苷酸序列a、Seq ID No. 1所示的核苷酸序列；以與kq ID No. 1互補的核苷酸序列；C、在高等嚴緊條件下能夠與上述a或b的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；d、對上述a或b所示核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾的核 苷酸序列；e、與上述a或b所示核苷酸序列具有至少90%同一性的核苷酸序列。本發(fā)明還公開了一種核酸構建體，包含上述啟動子，以及與啟動子可操作連接的 基因序列，其中所述啟動子與所述基因序列來源相同或者不同。本發(fā)明還公開了一種載體，所述載體含有上述啟動子或上述核酸構建體，優(yōu)選的， 所述載體為上述啟動子與PMD18-T或p8質(zhì)粒經(jīng)重組得到的重組載體。本發(fā)明進一步公開了一種重組細胞，所述細胞含有上述啟動子、上述核酸構建體 或上述載體，優(yōu)選的，所述重組細胞為重組大腸桿菌細胞或重組農(nóng)桿菌細胞。本發(fā)明進一步公開了含有上述啟動子、核酸構建體、載體或重組細胞的植物愈傷 組織、植物外植體或植物，優(yōu)選的，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，再優(yōu)選的，所述植 物為稻屬或煙草屬，更優(yōu)選的，所述植物為水稻或煙草，進一步優(yōu)選的，所述植物為水稻日 本晴或煙草NC89。本發(fā)明進一步公開了一組引物對，用于擴增得到上述啟動子，所述引物對的兩條引物分別含有IDNo :3所示的序列，優(yōu)選的，所述引物對的兩條引物在
5’端還分別連接有限制性酶切位點和/或保護堿基，更優(yōu)選的，所述引物對的兩條引物分 別具有ID No 4和kq ID No 5所示的序列。本發(fā)明還公開了制備SEQ ID No 1所示啟動子的方法，包括以水稻日本晴基因 組DNA為模板，使用一對擴增引物進行擴增，所述擴增引物根據(jù)SEQ ID NO :1在水稻日本晴 gDNA中的序列分別針對首尾進行設計，優(yōu)選是上述的引物對。本發(fā)明進一步公開了一種調(diào)控植物中基因表達的方法，所述方法包括，將上述啟 動子、核酸構建體、載體或重組細胞導入植物細胞。優(yōu)選導入植物愈傷組織。進一步優(yōu)選的， 啟動子或核酸構建體導入植物細胞是利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物愈傷組織，所述植物優(yōu)選為單子 葉植物或雙子葉植物，所述植物再優(yōu)選為稻屬或煙草屬，所述植物更優(yōu)選為水稻或煙草，所 述植物進一步優(yōu)選為水稻日本晴或煙草NC89。本發(fā)明還公開了一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方 法，包括在有效產(chǎn)生植物的條件下培養(yǎng)上述的重組細胞或植物愈傷組織或植物外植體或植 物。本發(fā)明還公開了上述啟動子、核酸構建體、載體、重組細胞或植物愈傷組織或植物 外植體或植物在調(diào)控植物中目的基因表達或植物育種中的用途，優(yōu)選植物是單子葉植物或 雙子葉植物，再優(yōu)選的植物為稻屬或煙草屬，更優(yōu)選植物為水稻或煙草，進一步優(yōu)選植物為 水稻日本晴或煙草NC89。由于采用了以上技術方案，使本發(fā)明具備的有益效果在于本發(fā)明提供的新的啟動子能夠在植物中調(diào)控基因表達，并且，在單子葉植物如水 稻和雙子葉植物如模式植物-煙草的根和葉中均具有啟動子功能，能夠調(diào)控外源基因的表 達，從而為研究植物(包括單子葉植物和雙子葉植物)中目的基因的表達提供了一種新的 工具和選擇。保藏信息培養(yǎng)物名稱煙草NC89種子保藏日期2010年11月12日保藏單位湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學保藏中心，即中國典型培養(yǎng)物保藏 中心(CCTCC)保藏編號CCTCCNo :P201017


圖1為用于構建p8質(zhì)粒的pCAMBIA-1301質(zhì)粒示意圖。圖2為p8質(zhì)粒示意圖。圖3為經(jīng)轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織的GUS染色結果。其中，由帶有本發(fā)明所述啟動子 P565序列的重組根癌農(nóng)桿菌P8+P565轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織(右)經(jīng)⑶S染色后呈現(xiàn)藍色； 不帶有本發(fā)明啟動子序列的重組根癌農(nóng)桿菌p8質(zhì)粒的水稻愈傷組織(對照，左)經(jīng)⑶S染 色后顏色未發(fā)生變化。圖4A、4B和圖5分別為經(jīng)轉(zhuǎn)化的煙草苗根和葉的GUS染色結果，在光學顯微鏡放 大3倍下拍攝。經(jīng)經(jīng)含有啟動子的P8+P565重組載體的重組根癌農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化的煙草苗 的根(圖5右)和葉(圖4B)經(jīng)染色后呈現(xiàn)藍色，經(jīng)不含有啟動子的p8質(zhì)粒重組根癌農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化的煙草苗的根(作為對照，圖5左)和葉(圖4A)經(jīng)GUS染色后顏色未發(fā)生變 化。
具體實施例方式本發(fā)明涉及一種能夠在植物中調(diào)控基因表達的啟動子序列，本發(fā)明的啟動子含有 選自以下任意一組并具有啟動子功能的核苷酸序列a、序列表中kq ID No. 1所示的核苷酸序列；以與kq ID No. 1互補的核苷酸序列；C、在高等嚴緊條件下能夠與上述a或b的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；d、對上述a或b所示核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾的核 苷酸序列；e、與上述a或b所示核苷酸序列具有至少90%同一性的核苷酸序列。在本發(fā)明一個具體的實施方式中，本發(fā)明的啟動子優(yōu)選具有kq ID No. 1所示的 核苷酸序列，并在本發(fā)明中被稱為啟動子BgIosP565，或者簡稱為P565啟動子。在本發(fā)明中，典型地，“雜交條件”根據(jù)測量雜交時所用條件的“嚴緊性”程度來分 類。嚴緊性程度可以以例如核酸結合復合物或探針的解鏈溫度(Tm)為依據(jù)。例如，“最大嚴 緊性”典型地發(fā)生在約Tm-5°C (低于探針Tm 5°C )；“高等嚴緊性”發(fā)生在Tm以下約5_10°C ； “中等嚴緊性”發(fā)生在探針Tm以下約10-20°C ；“低嚴緊性”發(fā)生在Tm以下約20_25°C。作 為替代，或者進一步地，雜交條件可以以雜交的鹽或離子強度條件和/或一或多次的嚴緊 性洗滌為依據(jù)。例如，6XSSC =極低嚴緊性；3XSSC =低至中等嚴緊性；IXSSC =中等嚴 緊性；0. 5XSSC =高等嚴緊性。從功能上說，可以采用最大嚴緊性條件確定與雜交探針嚴 緊同一或近嚴緊同一的核酸序列；或采用高等嚴緊性條件確定與該探針有約80%或更多 序列同一性的核酸序列。對于要求高選擇性的應用，典型地期望采用相對嚴緊的條件來形成雜交體，例如 選擇相對低的鹽和/或高溫條件。Sambrook等(Sambr00k，J.等(1989)分子克隆，實驗室 手冊，Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y.)提供了包括中等嚴緊性和高等嚴緊性 在內(nèi)的雜交條件。為了便于說明，用于檢測本發(fā)明的雜交的合適的中等嚴緊條件包括用5XSSC、 0.5% SDS、1. OmM EDTA(pH8. 0)溶液預洗；在50-65°C下在5XSSC中雜交過夜；隨后用含 0. SDS的2X、0. 5X和0.2XSSC在65°C下各洗滌兩次20分鐘。本領域技術人員應當 理解，能容易地操作雜交嚴緊性，如改變雜交溶液的含鹽量和/或雜交溫度。例如，合適的 高等嚴緊雜交條件包括上述條件，不同之處在于雜交溫度升高到例如60-65°C或65-70°C。在本發(fā)明中，所述在高等嚴緊條件下與SeqID No. 1所示或與其互補的核苷酸序 列雜交的核苷酸序列，其具有與kq ID No. 1所示核苷酸序列相同或相似的啟動子活性。在本發(fā)明中，所述對kq ID No. 1或與其互補的核苷酸序列進行一個或多個堿基 的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列，是指分別或同時在所述核苷酸序列的5’端和/或3’ 端，和/或序列內(nèi)部進行例如不超過2-45個，或者不超過3-20個，或者不超過3-20個，或 者不超過4-15個，或者不超過5-10個，或者不超過6-8個的分別用逐個連續(xù)整數(shù)表示的堿 基的取代、缺失、添加修飾。
在本發(fā)明中，所述對kq ID No. 1或與其互補的核苷酸序列進行如上述一個或多 個堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列，具有與kq ID No. 1所示的核苷酸序列相同 或相似的啟動子活性。通過一種多核苷酸進行說明，其所具有的核苷酸序列例如與kq ID No. 1的參考 核苷酸序列至少90% “同一性”是指在^^ ID No. 1的參考核苷酸序列之每100個核苷 酸中，該多核苷酸的核苷酸序列除了含有多達10個核苷酸的不同外，該多核苷酸之核苷酸 序列與參考序列相同。換句話說，為了獲得核苷酸序列與參考核苷酸序列至少90%相同的 多核苷酸，參考序列中多達10%的核苷酸可以被刪除或被另一核苷酸替代；或可將一些核 苷酸插入?yún)⒖夹蛄兄?，其中插入的核苷酸可多達參考序列之總核苷酸的10% ；或在一些核 苷酸中，存在刪除、插入和替換的組合，其中所述核苷酸多達參考序列之總核苷酸的10%。 參考序列的這些突變可發(fā)生在參考核苷酸序列的5’或3’末端位置，或在這些末端位置之 間的任意地方，它們或單獨散在于參考序列的核苷酸中，或以一個或多個相鄰的組存在于 參考序列中。在本發(fā)明中，用于確定序列同一性和序列相似性百分數(shù)的算法是例如BLAST和 BLAST2. 0 算法，它們分別描述在 Altschul 等(1977) Nucl. Acid. Res. 25 :3389-3402 和 Altschul等(1990)J.Mol.Bio. 215 :403-410。采用例如文獻中所述或默認參數(shù)，BlAST和 BLAST 2.0可以用于確定本發(fā)明的核苷酸序列同一性百分數(shù)。執(zhí)行BLAST分析的軟件可以 通過國立生物技術信息中心為公眾所獲得。在本發(fā)明中，所述與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一 性的核苷酸序列包括與SEQ ID NO :1所公開序列基本同一的多核苷酸序列，例如當采用本 文所述方法(例如采用標準參數(shù)的BLAST分析)時，與本發(fā)明多核苷酸序列相比含有至少 90%序列同一性、優(yōu)選至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的 序列同一性的那些序列。在本發(fā)明中，所述與SEQ ID No. 1或其互補的核苷酸序列具有至 少90%的序列同一性的核苷酸序列具有與kq ID No. 1所示的核苷酸序列相同或相似的啟 動子活性。本發(fā)明還涉及一種核酸構建體，包括基因以及與該基因可操作地連接的上述啟動 子。在本發(fā)明中，“可操作地連接”是指兩個或多個核苷酸區(qū)域或核酸序列的功能性的空間 排列。在本發(fā)明的核酸構建體中，例如，啟動子被置于所述基因的核酸序列的特定位置，例 如啟動子位于所述基因核酸序列的上游位置，使得核酸序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動子區(qū)域的引 導，從而，啟動子區(qū)域被“可操作地連接”到該基因的核酸序列上。所述基因一般是需要提高 轉(zhuǎn)錄水平的任何核酸序列，或者，可設計本發(fā)明所述啟動子和基因以便下調(diào)特定核酸序列。 也就是通過將啟動子與反義方向的基因相連來實現(xiàn)。在本發(fā)明一個具體的實施方式中，所 述基因優(yōu)選為GUS基因。本發(fā)明還涉及一種含有上述啟動子或上述核酸構建體的載體。本發(fā)明的載體可 以是通過將上述啟動子或上述核酸構建體插入到克隆載體或表達載體而得到的重組載 體。適于構建本發(fā)明所述重組載體的克隆載體包括但不限于，例如pUC18、pUC19、pUC118、 pUC119、pMD19-T、pMD20-T、pMD18-T Simple Vecter、pMD19_T Simple Vecter 等。適于構 建本發(fā)明所述重組載體的表達載體包括但不限于，例如pMI121、pl3W4、pGEM等。在本發(fā)明 具體的實施方式中，本發(fā)明含有所述啟動子的載體為上述啟動子與PMD18-T或p8質(zhì)粒經(jīng)重組得到的重組載體，優(yōu)選的，本發(fā)明的重組載體為PMD18-T+P565重組載體或者p8+P565重 組載體。本發(fā)明的又一方面，還涉及含有本發(fā)明所述啟動子的重組細胞。本發(fā)明的重組 細胞可以通過將上述含有本發(fā)明啟動子的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞而得到。適于構建本發(fā) 明所述重組細胞的宿主細胞包括但不限于，例如大腸桿菌細胞DH5ci，根癌農(nóng)桿菌細胞 LBA4404、EHA105、GV3101等。在本發(fā)明一個具體的實施方式中，所述重組細胞為重組根癌 農(nóng)桿菌 EHA105-P565。本發(fā)明的再一方面，還涉及一種植物愈傷組織或植物外植體或植物，所述愈傷組 織、植物外植體或植物含有有本發(fā)明的上述啟動子。本發(fā)明的植物愈傷組織可以是單子葉 植物愈傷組織例如水稻愈傷組織，或者雙子葉植物愈傷組織例如煙草愈傷組織。本發(fā)明的再一方面，還涉及用于PCR擴增得到本發(fā)明所述啟動子的一組引物對， 該組引物對含有序列表中kq ID似.2及％(1 No. 3所示的序列。為了便于操作，通常優(yōu)選 在引物的5’端含設計連接有限制性酶切位點和/或保護堿基，在本發(fā)明具體的實施方式 中，所述引物對的兩條引物分別具有^^ IDID No :5所示的序列。采用上述引物，以水稻日本晴基因組DNA為模板進行PCR擴增，能夠制備得到本發(fā) 明的啟動子。本發(fā)明進一步公開了一種調(diào)控植物中基因表達的方法，所述方法包括，將上述啟 動子導入植物細胞。優(yōu)選的是通過將同時含有外源基因以及本發(fā)明啟動子的核酸構建體導 入植物細胞來達到調(diào)控基因表達的目的。所述核酸構建體中，外源基因與本發(fā)明的啟動子 可操作地連接。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，可以利用含有目的外源基因與本發(fā)明啟動子 的重組載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，再將得到的重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物愈傷組織，從而實現(xiàn)將所述外源 基因與本發(fā)明啟動子一起導入植物細胞的目的。在本發(fā)明一個具體的實施方式中，外源基 因優(yōu)選為GUS基因。本發(fā)明的植物可以是單子葉植物，例如水稻、小麥、玉米、小米、甘蔗、高 粱、大麥等，也可以是雙子葉植物，例如煙草，大豆，馬鈴薯、蠶豆、蘿卜、花生等。煙草是典型的基因工程模式植物。故本發(fā)明選擇煙草進行轉(zhuǎn)基因研究，以研究本 發(fā)明的啟動子在雙子葉植物中的效果。實驗結果表明，該啟動子能在轉(zhuǎn)基因煙草中起作用。在本發(fā)明中，可采用植物基因轉(zhuǎn)化技術將目的基因及所述啟動子插入到植物基因 組中，包括農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化、病毒介導轉(zhuǎn)化、顯微注射、粒子轟擊、基因槍轉(zhuǎn)化和電穿孔等。 本領域周知，農(nóng)桿菌介導的基因轉(zhuǎn)化常被用于單子葉植物和雙子葉植物的基因轉(zhuǎn)化，但其 它轉(zhuǎn)化技術也可用于本發(fā)明啟動子及外源基因的導入。當然，適于本發(fā)明的啟動子及外源 基因?qū)氲牧硪环N方法是粒子轟擊(顯微金或鎢粒子包覆轉(zhuǎn)化的DNA)胚性愈傷組織或胚 胎開發(fā)。另外，還可以采用的轉(zhuǎn)化植物細胞的方法是原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。基因轉(zhuǎn)化后，采用通用 的方法來篩選和再生整合有表達單元的植株。為實現(xiàn)上述調(diào)控基因表達的目的，本發(fā)明所述啟動子可以以單拷貝和/或多拷貝 的形式應用，可以與現(xiàn)有技術中已知的啟動子聯(lián)用。本發(fā)明的啟動子以及調(diào)控植物中基因表達的方法，可以應用于植物品種的選育。 比如，可以用于水稻或煙草的育種。所述水稻可以為日本晴、中花9、中花10、中花11、臺北 309、丹江8號、云稻2號、汕優(yōu)63、汕優(yōu)608、豐優(yōu)22、黔優(yōu)88、II優(yōu)416、II優(yōu)107、II優(yōu) 128,11優(yōu)718、準兩優(yōu)527、川農(nóng)1號、雜0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、 皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101等。在本發(fā)明一個具體的實施方式中，所述水 稻為日本晴。所述的煙草可以為K326、K346、K394、NC82、NC89、G140、G28、G80、中煙90、 Cokerl76,以及CV87等。在本發(fā)明另一個具體的實施方式中，所述煙草為煙草NC89。本發(fā)明的啟動子可成為一種新的啟動子，作為植物(包括單子葉植物和雙子葉植 物，尤其是水稻和煙草)轉(zhuǎn)基因的工具啟動子，為開展低表達基因轉(zhuǎn)化苗篩選、植物花器官 敗育等分子育種研究提供便利，從而極大地縮短優(yōu)良品種的選育時間。本發(fā)明的啟動子可 廣泛用于培育水稻、煙草、小麥、玉米、小米、甘蔗、高粱、大麥、大豆，馬鈴薯、蠶豆、蘿卜、花 生等。在本發(fā)明中，術語“單子葉植物”，具體地，可以為禾本科植物，更具體地，可以為稻 屬植物例如水稻，包括但不限于日本晴、中花9、中花10、中花11、臺北309、丹江8號、云稻2 號、汕優(yōu)63、汕優(yōu)608、豐優(yōu)22、黔優(yōu)88、II優(yōu)416、II優(yōu)107、II優(yōu)128、II優(yōu)718、準兩優(yōu) 527、川農(nóng)1號、雜0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖 稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻 207，以及津原101等。在本發(fā)明中，術語“雙子葉植物”，具體地，可以為茄科植物，更具體地，可以為煙草 屬植物(煙草)，包括但不限于煙草K326、K;346、K394、NC82、NC89、G140、G28、G80、中煙90、 Cokerl76,以及 CV87 等。下面通過具體實施方式
結合附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。但本領域技術人員 將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明 具體技術或條件者，按照本領域內(nèi)的文獻所描述的技術或條件(例如參考J.薩姆布魯克等 著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進行。 所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實施例1 :P565啟動子片段的PCR擴增和pMD18_T+P565重組載體的構建PCR 擴增使用植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN新型植物基因組DNA提取試劑盒，目錄 號DP320-(^)提取水稻日本晴(已在申請?zhí)枮?00910238992.0、發(fā)明名稱為“一種啟動子 BgIosP587、其制備方法及用途”的發(fā)明申請中保藏，并于2010年9月22日公開，保藏編號 為CCTCC NO :P200910)的基因組DNA，根據(jù)該啟動子在水稻日本晴gDNA中的序列，分別在 首尾設計一對PCR特異性擴增引物(上游引物F1，加限制性酶切位點EcoR I和保護堿基， 下游引物R1，加限制性酶切位點SbfI和保護堿基)。以上述提取的水稻日本晴的gDNA為 模板，使用高保真Ex Taq (TaKaRa, DRR100B)聚合酶進行PCR擴增。如表1所示。表1基因啟動子擴增的PCR體系
權利要求
1.一種啟動子，所述啟動子含有選自以下任意一組并具有啟動子功能的核苷酸序列a>Seq ID No. 1所示的核苷酸序列；以與kq ID No. 1互補的核苷酸序列；C、在高等嚴緊條件下能夠與上述a或b的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；d、對上述a或b所示核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸 序列；e、與上述a或b所示核苷酸序列具有至少90%同一性的核苷酸序列。
2.—種核酸構建體，包含權利要求1所述的啟動子，與啟動子可操作連接的基因序列， 其中所述啟動子與所述基因序列來源相同或者不同。
3.一種載體，其特征在于所述載體含有權利要求1所述的啟動子或權利要求2所述 的核酸構建體，優(yōu)選的，所述載體為權利要求1所述的啟動子或權利要求2所述的核酸構建 體與pMD18-T或p8質(zhì)粒經(jīng)重組得到的重組載體。
4.一種重組細胞，其特征在于所述細胞含有權利要求1所述的啟動子或權利要求2 所述的核酸構建體或權利要求3所述的載體，優(yōu)選的，所述重組細胞為重組大腸桿菌細胞 或重組農(nóng)桿菌細胞。
5.一種含有權利要求1的啟動子或權利要求2的核酸構建體或權利要求3的載體或權 利要求4的重組細胞的植物愈傷組織或植物外植體或植物，優(yōu)選的，所述植物為單子葉植 物或雙子葉植物，再優(yōu)選的，所述植物為稻屬或煙草屬，更優(yōu)選的，所述植物為水稻或煙草， 進一步優(yōu)選的，所述植物為水稻日本晴或煙草NC89。
6.一組引物對，所述引物對用于擴增得到權利要求1所述的啟動子，其特征在于所述 引物對的兩條引物分別含有kq IDID No :3所示的序列，優(yōu)選的，所述引物對 的兩條引物在5’端還分別連接有限制性酶切位點和/或保護堿基，更優(yōu)選的，所述引物對 的兩條引物分別具有kq ID No ID No :5所示的序列。
7.制備SEQID NO :1所示的啟動子的方法，包括以水稻日本晴基因組DNA為模板，使用一對擴增引物進行擴增，所述擴增引物根據(jù)SEQ ID NO :1在水稻日本晴gDNA中的序列分別針對首尾進行設計，優(yōu)選是權利要求6所述的引 物對。
8.—種調(diào)控植物中基因表達的方法，所述方法包括，將權利要求1所述的啟動子或權 利要求2的核酸構建體或權利要求3的載體或權利要求4的重組細胞導入植物，優(yōu)選導入 植物愈傷組織，優(yōu)選的，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，再優(yōu)選的，所述植物為稻屬或煙草屬，更優(yōu)選的，所述植物為水稻或煙草，進一步優(yōu)選的，所述植物為水稻日本晴或煙草NC89。
9.一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括在有效產(chǎn)生植物的條件下培養(yǎng)權利要求4的重組 細胞或權利要求5的植物愈傷組織或植物外植體或植物。
10.權利要求1所述的啟動子或權利要求2的核酸構建體或者權利要求3的載體或權 利要求4的重組細胞或權利要求5的植物愈傷組織或植物外植體或植物在調(diào)控植物中目的 基因表達或植物育種中的用途，植物優(yōu)選是單子葉植物或雙子葉植物，再優(yōu)選為稻屬或煙草屬，更優(yōu)選為水稻或煙草，更進一步優(yōu)選為水稻日本晴或煙草NC89。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種啟動子BgIosP565、制備方法及應用。所述啟動子含有選自以下任意一組并具有啟動子功能的核苷酸序列a、Seq ID No.1所示的核苷酸序列；b、與Seq ID No.1互補的核苷酸序列；c、在高等嚴緊條件下能夠與上述a或b的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；d、對上述a或b所示核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列；e、與上述a或b所示核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。本發(fā)明啟動子能夠在單子葉和雙子葉植物中調(diào)控基因表達，從而為研究植物中目的基因的表達提供了一種新的工具和選擇。
文檔編號C12R1/19GK102146387SQ201010614860
公開日2011年8月10日 申請日期2010年12月30日 優(yōu)先權日2010年12月30日
發(fā)明者張豐豐, 束禮平, 楊爽, 蔡雪梅 申請人:深圳華大基因科技有限公司