專利名稱：一種天藍(lán)色鏈霉菌海藻糖合成酶基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程和現(xiàn)代酶工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種天藍(lán)色鏈霉菌海藻糖合成酶基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
海藻糖(Trehalose)是由兩分子葡萄糖以α，α-1，1_糖苷鍵相連而成的非還原性二糖，1832年由Wiggers首次將其從黑麥的麥角菌中首次提取出來，隨后的研究發(fā)現(xiàn)海藻糖廣泛地存在于微生物、蝦類、釀酒酵母、蘑菇及各種真菌、昆蟲、植物等。外源性的海藻糖同樣對(duì)生物體及生物大分子、生物膜具有良好的非特異性保護(hù)作用，它可以保護(hù)細(xì)胞免受由于環(huán)境變化，如脫水、高滲變化后造成的損害，具體表現(xiàn)為對(duì)生物膜、蛋白質(zhì)和DNA等的有效保護(hù)，因此被譽(yù)為“生命之糖”。天然中海藻糖的含量很低，過去主要是從干酵母中提取，由于含量低，提取過程較復(fù)雜，成本極高。如此昂貴的海藻糖只能局限于某些特殊領(lǐng)域如醫(yī)學(xué)生物制品的活性保持的應(yīng)用，隨著人類社會(huì)的發(fā)展和進(jìn)步，希望能將海藻糖應(yīng)用于各類食品的鮮味保持與質(zhì)地改善，更好提高人們的生活和健康水平，因此有必要盡快地找到廉價(jià)而高效的海藻糖制造方法。目前已經(jīng)在多種微生物中分離到多種不同類型的海藻糖合成酶及其相關(guān)的基因，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的海藻糖合成相關(guān)酶和基因表明，微生物中合成海藻糖可以分為三種途徑，第一種途徑是海藻糖磷酸化酶合成途徑，主要由徑6-磷酸海藻糖合成酶 (Trehalose-6-phosphate synthase)禾口 6_ 粦酸海藻糖酉旨 (Trehalose-6-phosphate phosphatase)組成，首先由6磷酸海藻糖合成酶催化UDP-葡萄糖和6_磷酸葡萄糖合成 6_磷酸海藻糖，然后再由6磷酸海藻糖酯酶脫磷酸后得到海藻糖；第二種途徑是麥芽寡糖基海藻糖合成酶合成途徑，主要是由麥芽寡糖基海藻糖合成酶(Maltooligosyltrehlosen， MTSase)和麥芽寡糖基海藻糖水解酶(Maltooligosyltrehalose trehalohydrolase, MTHase)組成，先由麥芽寡糖基海藻糖合成酶以麥芽糊精(Maltodextrin)為底物，通過分子內(nèi)轉(zhuǎn)糖基作用把麥芽糊精末端的兩個(gè)葡萄糖分子間的α，α_1，4糖苷鍵轉(zhuǎn)變成α， α-1，1糖苷鍵，形成麥芽寡糖基海藻糖(Maltooligosyltrehalose)。然后麥芽寡糖基海藻糖在麥芽寡糖基海藻糖水解酶的催化下從麥芽寡糖基海藻糖分子上水解下一個(gè)海藻糖分子，而原來的麥芽糊精則轉(zhuǎn)變?yōu)闇p少了兩個(gè)葡萄糖基的新寡糖，并可作為新的底物進(jìn)行下一輪反應(yīng)，如此反復(fù)就可以將麥芽糊精轉(zhuǎn)化成海藻糖，經(jīng)過兩個(gè)反應(yīng)步驟海藻糖的得率在 60-70%左右；第三種途徑是海藻糖合成酶途徑，與其它海藻糖合成途徑不同是這種海藻糖合成途徑只需要一種酶即海藻糖合成酶(Trehalose synthase, Tre S)，它作用的底物是麥芽糖(Maltose)，通過催化麥芽糖分子內(nèi)轉(zhuǎn)糖基，將α，α _1，4糖苷鍵連接的麥芽糖轉(zhuǎn)化為 α, α-1，1糖苷鍵，麥芽糖轉(zhuǎn)變成海藻糖同時(shí)會(huì)有副產(chǎn)物葡萄糖生成。海藻糖合成酶是一種可逆酶也可以將海藻糖轉(zhuǎn)變成麥芽糖，同時(shí)產(chǎn)生副產(chǎn)物葡萄糖，不同的海藻糖合成酶特性差異很大，對(duì)麥芽糖的轉(zhuǎn)化率差異也很大，40-80 %之間。三種海藻糖合成途徑相比，第一種途徑需要用到價(jià)格昂貴的高能磷酸化合物UDP-葡萄糖和6-磷酸葡萄糖為底物來生產(chǎn)海藻糖，在生產(chǎn)成本很難產(chǎn)生競爭優(yōu)勢，也未見相關(guān)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的報(bào)道；第二種和第三種途徑都是可以以淀粉的水解產(chǎn)物麥芽糊精或者麥芽糖為底物生產(chǎn)海藻糖，在生產(chǎn)成本上具有很強(qiáng)的競爭優(yōu)勢，第三種途徑和第二種途徑相比，第三種途徑只需要一種酶，因此在利用基因工程菌生產(chǎn)酶，不需構(gòu)建兩種工程菌，由于不用生產(chǎn)兩種酶，在生產(chǎn)過程設(shè)備的占用率會(huì)更低，不需要考慮兩種的反應(yīng)條件是否一致，生產(chǎn)工藝上會(huì)更簡單，因而具有更強(qiáng)的競爭優(yōu)勢。用于工業(yè)化生產(chǎn)海藻糖的最理想海藻糖合成酶是具有適合的反應(yīng)溫度，麥芽糖的轉(zhuǎn)化率高，副產(chǎn)物葡萄糖少等特點(diǎn)。目前已有不少文獻(xiàn)和專利報(bào)道了海藻糖合成相關(guān)基因的克隆和分離，以及這些海藻糖合成酶基因的相關(guān)酶用于制備海藻糖，但這些海藻糖合成相關(guān)酶的合成途徑不同，或者菌種來源不同，導(dǎo)致 了 DNA序列和氨基酸序列相差甚遠(yuǎn)，酶學(xué)特性與酶活力不同，而且目前大部分還沒有得到工業(yè)規(guī)?；膽?yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種天藍(lán)色鏈霉菌海藻糖合成酶基因及其應(yīng)用。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明人利用生物信息手段對(duì)GenBank中龐大的DNA序列和氨基酸序列資源進(jìn)行同源性檢索分析，對(duì)已經(jīng)完成序列分析的上千種微生物的DNA序列進(jìn)行大量核酸序列進(jìn)行分析和對(duì)比，發(fā)現(xiàn)了在蛋白質(zhì)的序列數(shù)據(jù)庫Genbank中注釋為“未知蛋白”或“推測是某功能蛋白質(zhì)”的極為有用基因，推測該序列的功能，找到候選基因序列，然后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的功能鑒定，最終確定基因的功能和性質(zhì)，其中包括至今為止人們并未發(fā)現(xiàn)的海藻糖合成酶基因 (treS)，并用這種合成酶基因經(jīng)過克隆和進(jìn)行重組表達(dá)，再利用重組表達(dá)的海藻糖合成酶用于轉(zhuǎn)化麥芽糖生產(chǎn)海藻糖。本發(fā)明人在研究海藻糖合成酶的過程中，對(duì)天藍(lán)色鏈霉菌(Str印tomyces coelicolor)基因組序列進(jìn)行同源檢索分析，發(fā)現(xiàn)這一段尚未有文獻(xiàn)報(bào)道其功能的DNA序列，這段DNA序列在Genbank中被注釋為“假定的海藻糖合成酶基因”(putative trehalose synthase)。經(jīng)過分析這段DNA與已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道的海藻糖合成酶、糖苷酶、淀粉酶家族蛋白的基因都有較高的同源性，同源性達(dá)到75%以上，而其編碼的假定的蛋白質(zhì)的氨基酸序列與已發(fā)表的海藻糖合成酶、糖苷酶、淀粉酶家族蛋白的氨基酸序列也有較高同源性，氨基酸序列同源性達(dá)到80%以上，因此很難通過氨基酸序列的分析來確定其為何種酶，必須要經(jīng)過具體實(shí)驗(yàn)來鑒定這段基因的真正功能，確定其是那一種酶，目前也還沒有該基因功能的實(shí)驗(yàn)鑒定相關(guān)報(bào)道。本發(fā)明所述的海藻糖合成酶基因克隆自天藍(lán)色鏈霉菌(Sti^ptomyces coelicolor，菌株編號(hào)為AS 4. 1061)。該菌種可以從中國微生物保藏中心購買，也可以通過野外采集、分離純化和其他途徑獲得。天藍(lán)色鏈霉菌(Str印tomyces coelicolor)克隆得到的海藻糖合成酶具有以下特征1、分子量約為65· 37kD2、等電點(diǎn)約為PI = 4. 73、酶的最適反應(yīng)溫度為25 30°C
4、酶的反應(yīng)的pH在6. 5 7. 5，優(yōu)選pH為7. 0 7. 5 5、當(dāng) Ni2+，F(xiàn)e3+，F(xiàn)e2+，Zn2+，Mn2+，Mg2+，Ca2+ 等二價(jià)金屬離子的濃度在 5m mol/L 時(shí)， 該酶的活力不受影響，但Cu2+在5m mol/L的濃度時(shí)幾乎完全抑制該酶的活力。6、酶對(duì)底物的轉(zhuǎn)化率會(huì)隨著反應(yīng)溫度的提高而逐漸降低，在35°C以下的反應(yīng)溫度底物麥芽糖的轉(zhuǎn)化率在70%以上，但在35°C以上的反應(yīng)溫度轉(zhuǎn)化率急劇下降，反應(yīng)溫度 40°C時(shí)麥芽糖的轉(zhuǎn)化率低于25%。7、酶轉(zhuǎn)化麥芽糖生成海藻糖時(shí)，在30°C以下的反應(yīng)溫度，生成的葡萄糖含量較少， 低于10%，在20°C的反應(yīng)溫度時(shí)，葡萄含量低于5%本發(fā)明人所采用的實(shí)驗(yàn)方法，包括眾所周知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)；DNA的提取、酶切、連接等DNA分子操作技術(shù)，把這一段標(biāo)記為假定的海藻糖合成酶基因的DNA序列連接到表達(dá)載體上，如PSE380等表達(dá)質(zhì)粒上，然后導(dǎo)入大腸桿菌進(jìn)行高效表達(dá)，經(jīng)過細(xì)胞破碎，例如利用溶菌酶、超聲波或機(jī)械碾磨法等破碎細(xì)胞后，獲得該基因表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行研究，確定其功能和酶學(xué)特性，證實(shí)了這一段DNA序列編碼的是一種特性特征與前人發(fā)現(xiàn)的完全不同的海藻糖合成酶。這些不同的特性特征包括了氨基酸序列和DNA序列的不同，酶的分子大小不同，酶的最適反應(yīng)溫度最適PH不同，反應(yīng)條件的不同以及酶對(duì)底物麥芽糖轉(zhuǎn)化為海藻糖比例的差異等特性，因此判定是一種新的發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明所述的海藻糖合成酶的基因是克隆自天藍(lán)色鏈霉菌(Str印tomyces coelicolor)，該酶在天然的天藍(lán)色鏈霉菌中是一種胞內(nèi)酶，需要用細(xì)胞破碎的方法才能檢查到，而且在天然菌中該酶的含量也非常低，需要將培養(yǎng)液濃縮1000倍濃縮以上才能檢驗(yàn)到海藻糖合成酶的活力，很難真正用于工業(yè)化生產(chǎn)海藻糖。應(yīng)用基因工程菌來表達(dá)本發(fā)明所述的海藻糖合成酶基因，可以使酶的活力比天然菌株高數(shù)千倍，可以用于海藻糖的生產(chǎn)。編碼本發(fā)明所述的海藻糖合成酶的基因是一段未確定功能的DNA片段，長度為 1698個(gè)堿基對(duì)，編碼566個(gè)氨基酸，GC含量為66. 7%。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的優(yōu)勢1、同樣具有轉(zhuǎn)化麥芽糖生成海藻糖的功能，但具有較小的分子量，與日本林原研究所專利報(bào)道的來自Pimerlobacter sp. R48的海藻糖合成酶相比，本發(fā)明的海藻糖合成酶的氨基酸個(gè)數(shù)少了 32個(gè)，比同樣是林原研究所報(bào)道的來自水棲嗜熱菌Thermus aquaticus 的海藻糖合酶少398個(gè)氨基酸，與中國專利專利號(hào)為ZL200410013007. 3的報(bào)道的 Thermobifida fusca海藻糖合成酶相比少了 44個(gè)氨基酸，比專利號(hào)為ZL200410073883. 5 報(bào)道的騰沖嗜熱厭氧菌的海藻糖合成酶少了 214個(gè)氨基酸。小分子量基因重組和表達(dá)上較大分子量的蛋白質(zhì)容易，小分子量的蛋白質(zhì)酶更加容易地通過基因重組與表達(dá)技術(shù)來進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)重組酶，因而更有市場競爭力。2、海藻糖合成酶轉(zhuǎn)化麥芽糖生成海藻糖的同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生一定的葡萄糖副產(chǎn)物， 目前報(bào)道的海藻合成酶基因在轉(zhuǎn)化麥芽糖，隨著反應(yīng)溫度的提高，葡萄糖副產(chǎn)物會(huì)隨著溫度升高而增加，大多會(huì)產(chǎn)生10-30%的葡萄糖，因此反應(yīng)產(chǎn)物中海藻糖的含量一般在65% 左右，本發(fā)明的海藻糖合成酶與已經(jīng)報(bào)道的海藻糖合成酶相比具有較低葡萄糖副產(chǎn)物，在 25-30°C的反應(yīng)溫度時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物中海藻糖的含量可以達(dá)到75%以上，而葡萄糖含量低于 10 %，在20°C的反應(yīng)溫度時(shí)，葡萄含量低于5 %，這一特點(diǎn)就有利于提高底物的轉(zhuǎn)化效率， 降低生產(chǎn)成本，從而更具有市場競爭力。


圖1為海藻糖合成酶最適反應(yīng)pH值的分析。圖2為海藻糖合成酶最適反應(yīng)溫度值的測定。圖3為金屬離子對(duì)海藻糖合成酶酶活影響的測定。圖4為海藻糖合成酶轉(zhuǎn)化麥芽糖不同反應(yīng)時(shí)間后反應(yīng)產(chǎn)物中各種糖含量變化分析。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步說明。1、天藍(lán)色鏈霉菌的培養(yǎng)天藍(lán)色鏈霉菌(Sti^ptomyces coelicolor，菌株編號(hào)為AS 4. 1061)從中國微生物保藏中心購買，接種于以下培養(yǎng)基(克/升)葡萄糖4. 0克，酵母提取物10克，麥芽提取物10克L，用KOH調(diào)pH至7. 2，然后在25 30°C恒溫?fù)u床上振蕩48小時(shí)，用于總DNA的提取。2、天藍(lán)色鏈霉菌海藻糖合成酶基因的克隆、表達(dá)及粗酶的制備根據(jù)Genbank中公布的Sti^ptomyces coelicolor基因序列中注釋為可能為海藻糖合成酶基因的序列，命名為Set，設(shè)計(jì)相應(yīng)引物擴(kuò)增該基因并連接到表達(dá)載體上然后導(dǎo)入大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)，設(shè)計(jì)引物如下上游引物(Senseprimer) 5' -CTGAATTC ATGATCGTCAACGAGCCC-3‘下游引物(AntisensePrimer) 5' -TCAAGCTT TCAGGCGGCGTCCTTGCG-3‘上下游引物的5'端分別設(shè)計(jì)了的EcoR 1和Hind III酶切位點(diǎn)用于連接到表達(dá)載體PSE380上，用設(shè)計(jì)好的引物擴(kuò)增可能為海藻糖合成酶基因的序列的DNA序列Set，擴(kuò)增產(chǎn)物用試劑盒純化回收目的擴(kuò)增片段，然后利用EcoR 1和Hind III進(jìn)行雙酶切，與同樣利用EcoR 1和Hind III進(jìn)行雙酶切的表達(dá)載體pSE380進(jìn)行連接，然后經(jīng)過篩選驗(yàn)證得到 Sct基因的表達(dá)重組質(zhì)粒pSE380-Sct用于表達(dá)制備海藻糖合成酶。把重組的表達(dá)質(zhì)粒pSE380_Sct轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21菌株的感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落轉(zhuǎn)化子于LB液體培養(yǎng)基中，在37°C搖床中培養(yǎng)，當(dāng)0D600達(dá)到0. 8左右時(shí)，加入IPTG 使其終濃度達(dá)到lmmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)20h進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)好的發(fā)酵液離心收集菌體，利用破胞緩沖液洗滌菌體一次，再利用破胞緩沖液重懸菌體后在冰浴條件下利用超聲波進(jìn)行破胞，破胞至菌液澄清，12000rpm/min離心15分鐘離心收集上清，所收集的上清液即為粗酶液，可用于轉(zhuǎn)化麥芽糖的試驗(yàn)。3、天藍(lán)色鏈霉菌海藻糖合成酶轉(zhuǎn)化麥芽糖產(chǎn)物的分析利用高效液相色譜儀(HPLC)來進(jìn)行海藻糖合成酶轉(zhuǎn)化麥芽糖后的產(chǎn)物分析，分析條件，色譜柱Alltima Amino IOOA 5u 柱(4. 6mmX250mm)；檢測器Alltech 2000ES 型蒸發(fā)光散射檢測器；流動(dòng)相70%乙腈/30% H2O ；流速lmL/min，柱溫35°C。(1)最適反應(yīng)pH值的分析分別取96 μ L用不同pH的磷酸鹽緩沖液配制10%的麥芽糖底物+4 μ L的酶液， 在37°C反應(yīng)lh，然后用HPLC分析反應(yīng)的產(chǎn)物組分，以反應(yīng)產(chǎn)物中的海藻糖含量來代表酶 活力。不同pH對(duì)酶活力的影響結(jié)果如圖1所示，表明酶最適的反應(yīng)pH為6. 5 7. 5。(2)最適反應(yīng)溫度測定 取pH7. 5的10%麥芽糖底物96 μ L+4 μ L酶液(蛋白含量達(dá)32 μ g)，在不同的反應(yīng)溫下保溫反應(yīng)lh，然后用HPLC分析反應(yīng)的產(chǎn)物組分，以反應(yīng)產(chǎn)物中的海藻糖含量來代表酶活力。不同溫度對(duì)酶活力的影響結(jié)果如圖2所示，表明酶的最適反應(yīng)溫度為25 30°C。(3)金屬離子對(duì)酶活的影響取pH7. 0的10 %麥芽糖底物96 μ L+4 μ L酶液(蛋白含量達(dá)32 μ g) +10 μ L金屬離子(使金屬離子終濃度為5mmol/L)，在25°C下反應(yīng)lh，按底物的消耗量來反映酶活的變化， 以加磷酸鹽緩沖液的酶活力為100%，不同金屬離子對(duì)酶活力的影響結(jié)果如圖3所示，表明在5mmol/L的濃度的條件下，Ni2+, Fe3+，F(xiàn)e2+，Zn2+，Mn2+，Mg2+，Ca2+等二價(jià)金屬離子對(duì)該酶的活力沒有抑制作用，但Cu2+在5m mol/L的濃度時(shí)該酶活力幾乎完全被抑制該酶。(4)不同反應(yīng)時(shí)間，產(chǎn)物中各種糖含量變化取96yL的10%麥芽糖底物(pH7. 0)+4 μ L酶液(蛋白含量達(dá)32 μ g)，在20°C下反應(yīng)不同的時(shí)間，然后分析反應(yīng)產(chǎn)物中各種糖的含量，以反應(yīng)產(chǎn)物中的海藻糖含量高低來表示酶的最適合反應(yīng)時(shí)間。不同時(shí)間對(duì)產(chǎn)物中各種糖含量的影響結(jié)果如圖4所示，表明以 10%麥芽糖為底物反應(yīng)40分鐘左右海藻糖含量就可以達(dá)到最高。4、從麥芽糖漿制備海藻糖取市售的以淀粉制備麥芽糖含量約為70 %的麥芽糖漿，用5mM，pH為7. 0磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉配成的緩沖液配制成含30%麥芽糖的反應(yīng)底物，pH為7.0，取100升配制好的反應(yīng)底物放置于不銹鋼反應(yīng)罐中，取上述第2步方法制得的海藻糖合成酶粗酶液10升， 加入到100升含30%麥芽糖的反應(yīng)底物中，然后在25°C條件下反應(yīng)24小時(shí)，然后用HPLC 對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行各種糖含量的分析，結(jié)果如表1 表1 反應(yīng)24小時(shí)后反應(yīng)液中各組分含量(％ )
權(quán)利要求
1.一種天藍(lán)色鏈霉菌海藻糖合成酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所7J\ ο
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述天藍(lán)色鏈霉菌海藻糖合成酶基因，其特征在于，其編碼的蛋白質(zhì)具有序列表中SEQ ID NO. 2所述的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述天藍(lán)色鏈霉菌海藻糖合成酶基因，其特征在于，其分子量約為 65. 37kD，等電點(diǎn)為PI = 4. 7，酶的適合反應(yīng)溫度為25 30°C，酶的適合反應(yīng)pH在6. 5 7. 5，在反應(yīng)溫度為25°C時(shí)，麥芽糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)到75%。
4.權(quán)利要求1所述天藍(lán)色鏈霉菌海藻糖合成酶基因在轉(zhuǎn)化麥芽糖生產(chǎn)海藻糖中的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟1)將海藻糖合成酶基因構(gòu)建基因工程菌進(jìn)行海藻糖合成酶的高效表達(dá)；幻收集制備重組的海藻糖合成酶；3)以麥芽糖或者淀粉制備的麥芽糖漿為原料用海藻糖合成酶制造海藻糖。
全文摘要
一種天藍(lán)色鏈霉菌海藻糖合成酶基因，該基因克隆自天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor，AS 4.1061)，該基因表達(dá)的海藻糖合成酶能夠在正常的生化反應(yīng)條件下將麥芽糖轉(zhuǎn)化為海藻糖，它具有反應(yīng)速度快、底物轉(zhuǎn)化率高和副產(chǎn)物少的特點(diǎn)，在25℃時(shí)轉(zhuǎn)化麥芽糖的產(chǎn)物中海藻糖含量可達(dá)75％以上，只產(chǎn)生很少的葡萄糖，有利于提高底物的轉(zhuǎn)化率，降低生產(chǎn)成本。該基因能夠應(yīng)用于生產(chǎn)海藻糖，這種海藻糖可應(yīng)用于食品工業(yè)、美容化妝品、醫(yī)藥生物制品等領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12N15/52GK102154326SQ20101061481
公開日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者杜麗琴, 梁甲元, 韋宇拓, 黃日波 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)