專利名稱：一種抗β-葡萄糖醛酸苷酶的兔單克隆抗體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗葡萄糖醛酸苷酶抗體，尤其涉及一種抗葡萄糖醛酸苷酶兔 單克隆抗體的制備方法。
背景技術(shù)：
^AS基因是從細(xì)菌中獲得的一類報告基因，能編碼葡萄糖醛酸苷酶，該酶在組織化 學(xué)染色中水解底物5-溴-4氯-3吲哚-葡萄糖醛酸苷，其水解產(chǎn)物呈藍(lán)色。植株組織中不 存在內(nèi)源gus活性，用gus組織化學(xué)檢測法檢測轉(zhuǎn)化愈傷組織或者再生植物切片，若呈現(xiàn) 藍(lán)色，就可以初步判斷gM基因已轉(zhuǎn)入到植株細(xì)胞并表達(dá)葡萄糖醛酸苷酶。gM基因就是
葡萄糖醛酸苷酶基因，即3-guSo通過組織染色法只能初步判斷gM基因是否已經(jīng)轉(zhuǎn) 入到植株組織中基因中，因此這種方法對gM基因的判斷會存在很大的誤差，且其他干擾 性較大?；蚩贵w與抗原之間特異性結(jié)合的免疫技術(shù)具有極高的靈敏度，當(dāng)組織所表達(dá)出 的葡萄糖醛酸苷酶極其微量時也能對其進(jìn)行檢測，且其他因素干擾性較小。因此開發(fā) 能夠與葡萄糖醛酸苷酶特異性結(jié)合的單克隆抗體具有極大的意義。兔單克隆抗體較常規(guī)的鼠單克隆抗體具有更多優(yōu)點(diǎn)。首先，兔比鼠能識別更多免 疫抗原的表位抗原決定簇。其次，由于兔脾臟較大，可以進(jìn)行更多的細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)，使得高 通量篩選陽性融合細(xì)胞成為可能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種抗葡萄糖醛酸苷酶的兔單克 隆抗體的制備方法?？笰 -葡萄糖醛酸苷酶的兔單克隆抗體的制備方法，的步驟如下
1)兔子免疫
將40(Γ600μβ的免疫抗原β -葡萄糖醛酸苷酶與等量弗氏不完全佐劑混合，完全乳化 后，采用背部皮下3飛點(diǎn)注射2 3只新西蘭大白兔，在開始免疫后的第三、五、七、九周，分別 用15(T250mg的免疫抗原蛋白與弗氏不完全佐劑混合后以同樣的方法進(jìn)行免疫；
2)細(xì)胞融合
選擇第五次免疫之后血清效價高的兔子先進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，8 10天后取無菌 脾臟，制備單細(xì)胞懸浮液，融合當(dāng)天選擇生長旺盛、處于對數(shù)生長期的脾細(xì)胞與處于對 數(shù)生長期的骨髓瘤細(xì)胞相融合，質(zhì)量百分比為48% 52%的聚乙二醇為融合劑，體積 百分比為189Γ22%的HAT作為選擇性培養(yǎng)基，鋪于40塊96孔板中，其中H是濃度為 0. 8 X 10_6 1. 2Χ lO—mol/L的次黃嘌呤，A是濃度為3. 5X10^4. 5X 10_9mol/L的氨基蝶呤， T是濃度為1. 4X 10，1. 8X 10_7mol/L的胸腺嘧啶核苷；
3)雜交瘤細(xì)胞的篩選
細(xì)胞融合后第壙12天隨機(jī)選擇40板中的2塊板對克隆子通過間接酶聯(lián)免疫吸附進(jìn) 行預(yù)篩，確定是否需要更換細(xì)胞培養(yǎng)液；第15 19天通過間接酶聯(lián)免疫吸附進(jìn)行初篩，初步確定是陽性的克隆子，并將對應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞轉(zhuǎn)移到M孔培養(yǎng)板中傳代培養(yǎng)一周； 第2216天通過間接酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行復(fù)篩，篩選出陽性克隆，并確定3飛株生長狀態(tài) 最好且表達(dá)特異性抗體能力最強(qiáng)的細(xì)胞株進(jìn)入重組載體的構(gòu)建，其他克隆子_20°C凍存， 經(jīng)重組獲得的細(xì)胞株選擇一株親和力和分泌抗體能力強(qiáng)，特異性高的克隆子經(jīng)體外培養(yǎng)， Sepharose CL-4B Protein A柱分離純化并得到目標(biāo)單克隆抗體。本發(fā)明制備的抗葡萄糖醛酸苷酶兔單克隆抗體可用于ELISA、Western Blotting等免疫學(xué)手段對β -葡萄糖醛酸苷酶的定性或定量研究。具體的實(shí)施方式 實(shí)施例1
1)兔子免疫
將400μβ的免疫抗原葡萄糖醛酸苷酶與等量弗氏不完全佐劑混合，完全乳化 后，采用背部皮下3點(diǎn)注射2只新西蘭大白兔，在開始免疫后的第三、五、七、九周，分別用 15(T250mg的免疫抗原蛋白與弗氏不完全佐劑混合后以同樣的方法進(jìn)行免疫；
2)細(xì)胞融合
選擇第五次免疫之后血清效價高的兔子先進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，8天后取無菌脾臟，制備 單細(xì)胞懸浮液，融合當(dāng)天選擇生長旺盛、處于對數(shù)生長期的脾細(xì)胞與處于對數(shù)生長期的骨 髓瘤細(xì)胞相融合，質(zhì)量百分比為48%的聚乙二醇為融合劑，體積百分比為18%的HAT作為選 擇性培養(yǎng)基，鋪于40塊96孔板中，其中H是濃度為0. 8X 10_6mOl/L的次黃嘌呤，A是濃度 為3. 5X 10_9mol/L的氨基蝶呤，T是濃度為1. 4X 10_7mol/L的胸腺嘧啶核苷；
3)雜交瘤細(xì)胞的篩選
細(xì)胞融合后第8天隨機(jī)選擇40板中的2塊板對克隆子通過間接酶聯(lián)免疫吸附進(jìn)行預(yù) 篩，確定是否需要更換細(xì)胞培養(yǎng)液；第15天通過間接酶聯(lián)免疫吸附進(jìn)行初篩，初步確定是 陽性的克隆子，并將對應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞轉(zhuǎn)移到M孔培養(yǎng)板中傳代培養(yǎng)一周；第22天 通過間接酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行復(fù)篩，篩選出陽性克隆，并確定3株生長狀態(tài)最好且表達(dá)特 異性抗體能力最強(qiáng)的細(xì)胞株進(jìn)入重組載體的構(gòu)建，其他克隆子_20°C凍存，經(jīng)重組獲得的細(xì) 胞株選擇一株親和力和分泌抗體能力強(qiáng)，特異性高的克隆子經(jīng)體外培養(yǎng)，Sepharose CL-4B Protein A柱分離純化并得到目標(biāo)單克隆抗體。經(jīng)分析測定，該方法制備的單克隆抗體的免疫學(xué)類型為IgG，該方法制備的單克隆 抗體對葡萄糖醛酸苷酶的親和常數(shù)為2. 07 X IO9M-1,其分子量為150KDa。實(shí)施例2
1)兔子免疫
將600μβ的免疫抗原β -葡萄糖醛酸苷酶與等量弗氏不完全佐劑混合，完全乳化后，采 用背部皮下6點(diǎn)注射3只新西蘭大白兔，在開始免疫后的第三、五、七、九周，分別用250mg 的免疫抗原蛋白與弗氏不完全佐劑混合后以同樣的方法進(jìn)行免疫；
2)細(xì)胞融合
選擇第五次免疫之后血清效價高的兔子先進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，10天后取無菌脾臟，制 備單細(xì)胞懸浮液，融合當(dāng)天選擇生長旺盛、處于對數(shù)生長期的脾細(xì)胞與處于對數(shù)生長期的 骨髓瘤細(xì)胞相融合，質(zhì)量百分比為52%的聚乙二醇為融合劑，體積百分比為2 的HAT作為 選擇性培養(yǎng)基，鋪于40塊96孔板中，其中H是濃度為1. 2 X 10_6mOl/L的次黃嘌呤，A是濃度為4. 5X 10_9mol/L的氨基蝶呤，T是濃度為1. 8X 10_7mol/L的胸腺嘧啶核苷； 3)雜交瘤細(xì)胞的篩選
細(xì)胞融合后第12天隨機(jī)選擇40板中的2塊板對克隆子通過間接酶聯(lián)免疫吸附進(jìn)行預(yù) 篩，確定是否需要更換細(xì)胞培養(yǎng)液；第19天通過間接酶聯(lián)免疫吸附進(jìn)行初篩，初步確定是 陽性的克隆子，并將對應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞轉(zhuǎn)移到M孔培養(yǎng)板中傳代培養(yǎng)一周；第26天 通過間接酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行復(fù)篩，篩選出陽性克隆，并確定5株生長狀態(tài)最好且表達(dá)特 異性抗體能力最強(qiáng)的細(xì)胞株進(jìn)入重組載體的構(gòu)建，其他克隆子_20°C凍存，經(jīng)重組獲得的細(xì) 胞株選擇一株親和力和分泌抗體能力強(qiáng)，特異性高的克隆子經(jīng)體外培養(yǎng)，Sepharose CL-4B Protein A柱分離純化并得到目標(biāo)單克隆抗體。經(jīng)分析測定，該方法制備的單克隆抗體的免疫學(xué)類型為IgG，該方法制備的單克隆 抗體對葡萄糖醛酸苷酶的親和常數(shù)為2. 25 X IO9M-1,其分子量為150KDa。實(shí)施例3
1)兔子免疫
將500μβ的免疫抗原β -葡萄糖醛酸苷酶與等量弗氏不完全佐劑混合，完全乳化后，采 用背部皮下5點(diǎn)注射3只新西蘭大白兔，在開始免疫后的第三、五、七、九周，分別用200mg 的免疫抗原蛋白與弗氏不完全佐劑混合后以同樣的方法進(jìn)行免疫；
2)細(xì)胞融合
選擇第五次免疫之后血清效價高的兔子先進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，10天后取無菌脾臟，制 備單細(xì)胞懸浮液，融合當(dāng)天選擇生長旺盛、處于對數(shù)生長期的脾細(xì)胞與處于對數(shù)生長期的 骨髓瘤細(xì)胞相融合，質(zhì)量百分比為50%的聚乙二醇為融合劑，體積百分比為20%的HAT作為 選擇性培養(yǎng)基，鋪于40塊96孔板中，其中H是濃度為1. OX 10_6mOl/L的次黃嘌呤，A是濃 度為4. OX 10_9mol/L的氨基蝶呤，T是濃度為1. 6X 10_7mol/L的胸腺嘧啶核苷；
3)雜交瘤細(xì)胞的篩選
細(xì)胞融合后第10天隨機(jī)選擇40板中的2塊板對克隆子通過間接酶聯(lián)免疫吸附進(jìn)行預(yù) 篩，確定是否需要更換細(xì)胞培養(yǎng)液；第17天通過間接酶聯(lián)免疫吸附進(jìn)行初篩，初步確定是 陽性的克隆子，并將對應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞轉(zhuǎn)移到M孔培養(yǎng)板中傳代培養(yǎng)一周；第M天 通過間接酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行復(fù)篩，篩選出陽性克隆，并確定3株生長狀態(tài)最好且表達(dá)特 異性抗體能力最強(qiáng)的細(xì)胞株進(jìn)入重組載體的構(gòu)建，其他克隆子_20°C凍存，經(jīng)重組獲得的細(xì) 胞株選擇一株親和力和分泌抗體能力強(qiáng)，特異性高的克隆子經(jīng)體外培養(yǎng)，Sepharose CL-4B Protein A柱分離純化并得到目標(biāo)單克隆抗體。經(jīng)分析測定，該方法制備的單克隆抗體的免疫學(xué)類型為IgG，該方法制備的單克隆 抗體對葡萄糖醛酸苷酶的親和常數(shù)為2. 13 X IO9Mi其分子量為150KDa。
權(quán)利要求
1. 一種抗葡萄糖醛酸苷酶的兔單克隆抗體的制備方法，其特征在于它的步驟如下1)兔子免疫將45(Γ600μβ的免疫抗原β -葡萄糖醛酸苷酶蛋白與等量弗氏不完全佐劑混合，完全 乳化后，采用背部皮下3飛點(diǎn)注射2 3只新西蘭大白兔，在開始免疫后的第三、五、七、九周， 分別用15(T250mg的免疫抗原蛋白與弗氏不完全佐劑混合后以同樣的方法進(jìn)行免疫；2)細(xì)胞融合選擇第五次免疫之后血清效價高的兔子先進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，8 10天后取無菌 脾臟，制備單細(xì)胞懸浮液，融合當(dāng)天選擇生長旺盛、處于對數(shù)生長期的脾細(xì)胞與處于對 數(shù)生長期的骨髓瘤細(xì)胞相融合，質(zhì)量百分比為48% 52%的聚乙二醇為融合劑，體積 百分比為189Γ22%的HAT作為選擇性培養(yǎng)基，鋪于40塊96孔板中，其中H是濃度為 0. 8 X 10_6 1. 2Χ lO—mol/L的次黃嘌呤，A是濃度為3. 5X10^4. 5X 10_9mol/L的氨基蝶呤， T是濃度為1. 4X 10，1. 8X 10_7mol/L的胸腺嘧啶核苷；3)雜交瘤細(xì)胞的篩選細(xì)胞融合后第壙12天隨機(jī)選擇40板中的2塊板對克隆子通過間接酶聯(lián)免疫吸附進(jìn) 行預(yù)篩，確定是否需要更換細(xì)胞培養(yǎng)液；第15 19天通過間接酶聯(lián)免疫吸附進(jìn)行初篩，初 步確定是陽性的克隆子，并將對應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞轉(zhuǎn)移到M孔培養(yǎng)板中傳代培養(yǎng)一周； 第2216天通過間接酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行復(fù)篩，篩選出陽性克隆，并確定3飛株生長狀態(tài) 最好且表達(dá)特異性抗體能力最強(qiáng)的細(xì)胞株進(jìn)入重組載體的構(gòu)建，其他克隆子_20°C凍存， 經(jīng)重組獲得的細(xì)胞株選擇一株親和力和分泌抗體能力強(qiáng)，特異性高的克隆子經(jīng)體外培養(yǎng)， Sepharose CL-4B Protein A柱分離純化并得到目標(biāo)單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗β-葡萄糖醛酸苷酶的兔單克隆抗體的制備方法。它包括高純度β-葡萄糖醛酸苷酶蛋白作為免疫抗原免疫兔子、多抗血清效價的測定、兔子B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合、以選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，經(jīng)預(yù)篩、初篩、復(fù)篩過程選擇陽性克隆子并大量擴(kuò)增，構(gòu)建重組載體并體外培養(yǎng)，分離并純化獲得單克隆抗體，本發(fā)明可用于ELISA，WesternBlotting等免疫學(xué)手段對β-葡萄糖醛酸苷酶的定性或定量檢測。
文檔編號C12N5/16GK102120769SQ20101060112
公開日2011年7月13日 申請日期2010年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月23日
發(fā)明者倪庚, 馮勁松, 劉娜, 沈金兒, 鄭曉冬, 陸蕾 申請人:浙江大學(xué)