專利名稱：擴增常見致病型軍團菌gyrB基因特異區(qū)引物及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及對米克戴德軍團菌(Legionella micdadei)；博茲曼軍團菌 (Legionellabozemanii) ； 長灘軍團菌 (Legionella longbeachae)中 gyrB 基因(DNA gyrase B subimitgene，以下簡稱gyrB)的特異的核苷酸，特別是涉及對米克戴德軍團菌、 博茲曼軍團菌、長灘軍團菌中的gyrB特異的寡核苷酸及其應用。
背景技術：
軍團菌屬于革蘭陰性桿菌，是廣泛存在于自然界的土壤和水環(huán)境中的一種條件致病菌。軍團菌可以引發(fā)軍團菌病，它是一種以呼吸道感染癥狀為主，伴全身中毒癥狀的細菌感染性疾病。自1976年首次在美國發(fā)現(xiàn)軍團病以來，該病已呈現(xiàn)出世界性分布及病死率高的兩大特點。軍團菌有42個種，64個血清型，其中至少有22個種與人類疾病有關，與人類關系最密切的是嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)。在軍團菌病例中，由嗜肺軍團菌引發(fā)的病例占致病性軍團菌引發(fā)病例的95%以上，其次為米克戴德軍團菌、博茲曼軍團菌、 長灘軍團菌。軍團菌的生長與繁殖與環(huán)境因素密切相關，集中空調的冷卻塔冷卻水、冷凝水以及溫泉水是軍團菌在外界適宜的生存環(huán)境。當環(huán)境水中的軍團菌繁殖到一定濃度，則會形成氣溶膠進而感染人。宿主感染主要受其易感性和細菌毒力的影響，任何年齡均可發(fā)生， 但中老年、基礎免疫較差者、長途旅行者、吸煙者為高危人群，并以醫(yī)院、賓館、大型建筑工地等公共場所好發(fā)。目前，細菌學培養(yǎng)法對疾病的診斷具有良好的敏感性和特異性，可以作為臨床確診和鑒定的標準。但是由于軍團菌不易分離培養(yǎng)，而且種類又繁多。利用細菌學培養(yǎng)法對其進行鑒定需要價格昂貴的特殊培養(yǎng)基，而且細菌生長比較緩慢，要3 7d以上才能出結果，不利于臨床的快速診斷，同時要求實驗人員要有比較高的技術，費時費力。近年來，越來越多的分子技術用于病原菌的鑒定、檢測及病害診斷中，近年來，越來越多的分子技術用于病原菌的鑒定、檢測及病害診斷中，包括特定基因序列分析、隨機擴增長度多態(tài)性(RAPD)分析、核糖體DNA限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析等。和傳統(tǒng)檢測技術相比，這些基于多聚酶鏈式反應(PCR)的分子檢測技術，不需要經過病原菌的分離、 純培養(yǎng)等過程，而且具有快速、靈敏、特異性強等優(yōu)點。DNA鏈或染色體高級結構的變化是需要拓撲異構酶(Topoisomerase)參與的，包括I型和II型。DNA解螺旋酶gyrase是一種II型拓撲異構酶，最早是在E. coli中發(fā)現(xiàn)的，它由A、B兩個亞基形式組成，gyrB就是編碼B亞基的基因。和16S rRNA 一樣，gyrB和 ISR均廣泛存在于各種細菌細胞中，是細胞生命過程所必須的基因，但gyrB的進化速率卻是16S rRNA的3 6倍，ISR的進化速率也比16S rRNA更快，可以作為細菌分子進化和系統(tǒng)分析的模式分子，近年來，人們已經開始使用它來區(qū)分、鑒定和檢測許多用16S rRNA無能為力區(qū)分的細菌，相關報道及文獻也越來越多。聚合酶鏈式反應技術(Polymerase chain reaction，簡稱PCR技術)作為微生物檢測的技術目前正在得到認同和推廣，該技術相對于傳統(tǒng)的方法有高通量、檢測速度快、特異性強、靈敏度高等優(yōu)點，只需對樣品進行簡單的預增菌或增菌過程，再通過離心及裂解制備細菌DNA模板，就可以在高特異性引物介導下的PCR過程中擴增目標序列，達到檢測樣品中是否含有待測的致病性微生物的目的。PCR的擴增過程僅需2個小時。這對檢驗檢疫部門和臨床檢驗無疑極大提高了工作速度和降低了工作成本。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供擴增米克戴德軍團菌、博茲曼軍團菌、長灘軍團菌中 gyrB基因特異區(qū)的引物；本發(fā)明的另一個目的是提供一種包括擴增米克戴德軍團菌、博茲曼軍團菌、長灘軍團菌gyrB基因特異區(qū)的引物的PCR試劑盒，并利用該PCR試劑盒檢測米克戴德軍團菌、 博茲曼軍團菌、長灘軍團菌的存在。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過以下技術方案予以實現(xiàn)擴增常見致病型軍團菌gyrB基因特異區(qū)引物包括米克戴德軍團菌、博茲曼軍團菌、長灘軍團菌其中(1)對米克戴德軍團菌的gyrB的特異核苷酸，所述核苷酸包含a) SEQ ID NO=I所示的核苷酸序列或者其互補DNA序列；b)上述a)中缺失、替換或插入一個或多個堿基、仍具有所述核苷酸功能的核苷酸序列。所述的SEQ ID NO 1所示的分離的核苷酸，全長為625個堿基；其中SEQ ID NO
1(5 ’ -GGGCGTGGAATACCTGTAGACATTCATAAAGAAGAAGGCCGATCTGCTGCAGAAGTCATCATGACCATTTTG CACGCAGGAGGAAAATTTGATGATAACTCCTACAAAGTATCAGGTGGTTTGCACGGTGTGGGTGTATCTGTTGTTAA TGCGCTTTCTGAAGAGTTGCATTTAACCATTCGTCGTAACGGAAAAGTACACGAACAACACTATCGCAACGGTGTTC CAGATGCACCATTGGCGATGACAGGTGAGGCAAATACGACTGGAACTCAAGTTTGGTTTAAACCCAGCGCAAATACC TTTAGCAACATTGAGTTTCATTATGACATCCTTGCTAAACGCCTACGTGAACTTTCATTCCTGAATTCAGGCGTTCG CATCCATTTATATGATGAGCGTACCCAGAAGCAAGACACATTTTGCTACGAAGGCGGCATTAAAGCGTTTGTGGAAC ATTTAAACCGCAATAAAACGCCCATTATGCCCGTTGTTTTTTCGCTTAGCGGCGAAAGAGACAATATCAGTGTGGAA TTATCCATGCAATGGAATGATTCATTTCAAGAAACCATATTTTGTTTCACGAATAACATTCCCCAACGCGATGGAGG AACCCATTTAGCTG-3，)(2)對博茲曼軍團菌的gyrB的特異核苷酸，所述核苷酸包含a) SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列或者其互補DNA序列；b)上述a)中缺失、替換或插入一個或多個堿基、仍具有所述核苷酸功能的核苷酸序列。所述的SEQ ID NO 2所示的分離的核苷酸，全長為625個堿基；其中SEQ ID NO
2(5 ’ -GGACGAGGGATACCCGTCGATATTCATAAAGAAGAAGGACGATCCGCTGCTGAAGTGATTATGACAGTGCTT CACGCCGGTGGTAAATTTGATGATAATTCTTATAAAGTATCGGGTGGTTTGCATGGAGTGGGTGTTTCTGTAGTTAA TGCCTTATCCGAGGAATTACATTTAACCGTACGTCGTCATGGTAAAATCCATGAGCAACATTACCGTAATGGAGTTC CAGATGCGCCAATGGCAGAAACAGGAGATGCATCGACAACCGGAACTCAAATTTGGTTTAAACCAAGTGCCGAAACG TTTTCTAATATTGAGTTTCACTATGATATTTTAGCAAAACGGCTAAGAGAATTATCTTATTTAAATTCAGGTGTTTG CATCCATTTATTCGATGAGCGATCCCAAAGGCAAGACACTTTTCATTATGAAGGTGGAATCACGGCATTTGTGGAGCATCTCAATAAAAATAAAAATACTATTATGCCCACTGTTTTTTCTATGACCGCTGAAAAAGATAACATTGTTGTTGAA CTGTCTATGCAGTGGAATGATTCTTATCAAGAAACACTTTATTGCTTTACAAATAATATCCCTCAGCGTGACGGTGG AACACATATGGCTG-3，)
序列。
(3)對長灘軍團菌的gyrB的特異核苷酸，所述核苷酸包含
a)SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列或者其互補DNA序列；
b)上述a)中缺失、替換或插入一個或多個堿基、仍具有所述核苷酸功能的核苷酸
所述的SEQ ID NO 3所示的分離的核苷酸，全長為625個堿基；其中SEQ ID NO 3 (5 ’ -GGACGTGGCATACCCGTTGATATTCATAAGGAACAAGGACGTTCTGCTGCTGAAGTGATTATGACAGTCTTG CATGCAGGAGGTAAGTTTGATGATAATTCCTATAAAGTATCTGGTGGACTACATGGCGTCGGTGTGTCAGTAGTTAA TGCTTTATCCGAAGAGTTGCATTTGACTGTGCGGCGTCATGGTAAAATCCATGAGCAACGTTATAGAAATGGAGTTC CCGATGCGCCAATGGCTGAAACGGGAGATGCAACAACAACAGGAACACAAATATGGTTTAAGCCAAGCGCTGATACC TTTTCAAATATAGAGTTCCACTATGATATTCTCGCGAAACGCCTTAGGGAACTGTCTTATCTAAATTCGGGTGTTTG TATCCATTTATTTGATGAGCGCTCGCAAAGGCAGGATACTTTTCACTATGAAGGTGGTATAAAAGCTTTTGTTGAGC ATCTCAATAAGAATAAAAATGTGATTATGCCCATCGTATTCTCCATGACAGCTGAAAAAGAGAATATTGTTGTTGAG CTTTCAATGCAGTGGAATGATTCATATCAAGAAACGCTCTATTGTTTTACTAACAATATACCTCAGCGTGATGGCGG AACGCATATGGCAG-3，)上述的分別擴增米克戴德軍團菌、博茲曼軍團菌、長灘軍團菌的gyrB基因特異區(qū)的引物的制備方法包括下述步驟1)基因組的提??；2)通過PCR擴增這三種軍團菌中的 gyrB基因；!3)gyrB基因的測序；4)核苷酸序列的拼接及分析力)特異引物的篩選。上述的核苷酸的應用，可用所述核苷酸設計引物用于PCR試劑盒、設計探針用于雜交反應與熒光檢測，或者用于制造基因芯片或微陣列以檢測細菌。上述的PCR試劑盒，包括PCR引物、dNTP、緩沖液和DNA聚合酶，其中PCR引物包括SEQIDNO4(5，-ATTTAACCATTCGTCGTAAC-3’ )米克戴德軍團菌上游引物
SEQIDNO5(5，-TTGGGGAATGTTATTCGTG-3，)米克戴德軍團菌下游引物
SEQIDNO6(5，-TGGTAAAATCCATGAGCA-3’ )博茲曼軍團菌上游引物
SEQIDNO7(5，-AACAGTGGGCATAATAGTA-3’ )博茲曼軍團菌下游引物
SEQIDNO8(5，-TGGTGGACTACATGGCGTC-3，)長灘軍團菌上游引物
SEQIDNO9(5，-ATACGATGGGCATAATCACAT-3’ )長灘軍團菌下游引物上述上游引物SEQ ID NO 4是根據(jù)米克戴德軍團菌gyrB基因種內保守但種間特異的區(qū)段設計合成的，下游引物SEQ ID NO :5亦是根據(jù)米克戴德軍團菌gyrB基因種內保守但種間特異的區(qū)段設計合成的寡核苷酸，位于gyrB序列上的581-600堿基位置。該引物可在PCR管中由DNA聚合酶選擇性的復制合成介于兩引物之間的DNA區(qū)段(針對米克戴德軍團菌為431bp靶DNA片段)，因而可以將極其微量的(lng DNA)目的基因在較短的時間內 (2小時)擴增到電泳檢測顯而易見的水平。上述上游引物SEQ ID NO 6是根據(jù)博茲曼軍團菌gyrB基因種內保守但種間特異的區(qū)段設計合成的，下游引物SEQ ID NO :7亦是根據(jù)博茲曼軍團菌gyrB基因種內保守但種間特異的區(qū)段設計合成的寡核苷酸，位于gyrB序列上的478-495堿基位置。該引物可在PCR管中由DNA聚合酶選擇性的復制合成介于兩引物之間的DNA區(qū)段(針對博茲曼軍團菌為307bp靶DNA片段)，因而可以將極其微量的(lng DNA)目的基因在較短的時間內0小時)擴增到電泳檢測顯而易見的水平。上述上游引物SEQ ID NO 8是根據(jù)長灘軍團菌gyrB基因種內保守但種間特異的區(qū)段設計合成的，下游引物SEQ ID NO :9亦是根據(jù)長灘軍團菌gyrB基因種內保守但種間特異的區(qū)段設計合成的寡核苷酸，位于gyrB序列上的476-496堿基位置。該引物可在PCR管中由DNA聚合酶選擇性的復制合成介于兩引物之間的DNA區(qū)段(針對長灘軍團菌為38;3bp 靶DNA片段)，因而可以將極其微量的(lng DNA)目的基因在較短的時間內O小時)擴增到電泳檢測顯而易見的水平。上述PCR檢測試劑盒包括如下試劑IOmM dNTP 5μ 1 ；IOX酶特異性反應緩沖液 30 μ 1 ；5U/ μ 1耐熱DNA聚合酶5 μ 1 ；上下游引物各20 μ 1 ；陽性對照品各15 μ 1，陰性對照品 15 μ 1 ； ddH20 3ml。本發(fā)明還涉及上述的PCR試劑盒在檢測米克戴德軍團菌、博茲曼軍團菌、長灘軍團菌中的應用。上述針對米克戴德軍團菌、博茲曼軍團菌、長灘軍團菌的PCR檢測試劑盒，整個檢測步驟包括樣品預處理-擴增-電泳檢測結果。引物和PCR反應體系所需要的試劑已預先加入擴增管中，使用者只需將預處理后的樣本加入擴增管啟動擴增反應即可，簡單快速的完成檢測工作。使用上述的PCR試劑盒檢測米克戴德軍團菌、博茲曼軍團菌、長灘軍團菌的PCR檢測方法包括以下步驟1)提取待測臨床樣品的DNA模板；2)在PCR管中加入dNTP、10 X酶特異性反應緩沖液、Taq聚合酶、引物、待測樣品 DNA模板和ddH20，混勻；3)將步驟2)中混勻的PCR管在PCR儀上擴增；4)在電泳設備中電泳擴增產物，記錄結果；5)分析并進行結果判斷。上述步驟1)中的臨床樣品模板為臨床樣品中的自來水取樣、礦泉水取樣、空調冷卻水取樣等的培養(yǎng)物的粗提液，或是米克戴德軍團菌、博茲曼軍團菌、長灘軍團菌的純培養(yǎng)物的粗體液，或是純DNA，或者是陽性對照品和陰性對照品。上述步驟1)中的臨床樣品DNA模板的提取方法為(1) 1. 5ml 50mM Tris-HCl (ρΗ8· 0)刮取培養(yǎng)物，在 8000rpm 條件下離心 5 分鐘，去
掉上清液；(2)取500 μ 1的ddH20重懸沉淀，在8000rpm條件下離心5分鐘，去掉上清液，控干；(3)取100 μ 1 ddH20重懸沉淀，在100°C沸水中水浴10分鐘；(4)再置于冰上10分鐘后，在12000rpm條件下離心2分鐘；(5)取3μ 1中層上清作為PCR反應的模板。上述步驟3)中的PCR儀上的反應循環(huán)參數(shù)包括DNA的變性、復性、延伸的溫度和時間、循環(huán)次數(shù)，具體為
80°C，10 分鐘94°C，5 分鐘
權利要求
1.擴增常見致病型軍團菌gyrB基因特異區(qū)引物包括米克戴德軍團菌、博茲曼軍團菌、長灘軍團菌其中(1)米克戴德軍團菌的gyrB的特異核苷酸，所述核苷酸包含a)SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列或者其互補DNA序列；b)上述a)中缺失、替換或插入一個或多個堿基、仍具有所述核苷酸功能的核苷酸序列；所述的SEQ ID NO 1所示的分離的核苷酸，全長為625個堿基。(2)博茲曼軍團菌的gyrB特異核苷酸，所述核苷酸包含a)SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列或者其互補DNA序列；b)上述a)中缺失、替換或插入一個或多個堿基、仍具有所述核苷酸功能的核苷酸序列；所述的SEQ ID NO 2所示的分離的核苷酸，全長為625個堿基。(3)長灘軍團菌的gyrB的特異核苷酸，所述核苷酸包含a)SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列或者其互補DNA序列；b)上述a)中缺失、替換或插入一個或多個堿基、仍具有所述核苷酸功能的核苷酸序列；所述的SEQ ID NO 3所示的分離的核苷酸，全長為625個堿基。
2.一種含有權利要求1所述特異區(qū)引物的PCR試劑盒，其特征在于，該試劑盒由PCR引物、dNTP、緩沖液和DNA聚合酶組成，其中PCR引物包括=SEQ ID NO :4_9 ；其他試劑10mM dNTP 5μ 1 ；IOX酶特異性反應緩沖液30 μ 1 ； 5U/μ 1耐熱DNA聚合酶 5 μ 1 ；上下游引物各20 μ 1 ；陽性對照品各15 μ 1，陰性對照品15 μ 1 ；ddH20 3ml ；DNA聚合酶為Taq聚合酶。
3.權利要求2所述PCR試劑盒在檢測米克戴德軍團菌、博茲曼軍團菌、長灘軍團菌中的應用。
4.權利要求2所述PCR試劑盒的使用方法，其特征在于檢測米克戴德軍團菌、博茲曼軍團菌、長灘軍團菌，包括以下步驟1)提取待測臨床樣品的DNA模板；2)在PCR管中加入dNTP、10X酶特異性反應緩沖液、Taq聚合酶、引物、待測樣品DNA 模板和ddH20，混勻；其中上下游引物各1. 5 μ L，IOmM dNTP 0. 3 μ L，IOX酶特異性反應緩沖液2. 5μ L，5U/y L耐熱DNA聚合酶0. 4μ L，余下的體積在除去;3uL待測樣品的量后用(MH2O 補足至25 μ L03)將步驟2)中混勻的PCR管在PCR儀上擴增；4)在電泳設備中電泳擴增產物，記錄結果；5)分析并進行結果判斷。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分別擴增米克戴德軍團菌(Legionella micdadei)；博茲曼軍團菌(Legionella bozemanii)；長灘軍團菌(Legionella longbeachae)中gyrB基因(DNAgyrase B subunit gene，以下簡稱gyrB)特異區(qū)的引物，還提供了一種包括擴增米克戴德軍團菌、博茲曼軍團菌、長灘軍團菌gyrB基因特異區(qū)的引物的PCR試劑盒，利用該PCR試劑盒對米克戴德軍團菌、博茲曼軍團菌、長灘軍團菌進行檢測，簡便快速、特異性好、靈敏度高，可用于水體和臨床樣品的監(jiān)督和檢測、飲用水中病原菌檢測、細菌學分類及流行病學調查等領域，具有深遠的社會效益和較大的經濟效益。
文檔編號C12Q1/68GK102168131SQ201010597299
公開日2011年8月31日 申請日期2010年12月20日 優(yōu)先權日2010年12月20日
發(fā)明者劉衍偉, 周光朋, 曹勃陽, 王磊, 竇巖 申請人:南開大學