專利名稱：一種人肺細胞beas-2b/cyp2a13及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人重組基因肺上皮細胞，特別涉及一種人肺細胞BEAS-2B/CYP2A13及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
選擇一個理想的模型是做好科研工作的必備條件，細胞無疑是科研中比較理想、 也很常用的研究模型。一方面單一的細胞可減少實驗間的誤差，保證研究結(jié)果的可控性和可重復(fù)性；另一方面細胞試驗周期短、成本低、實驗條件要求不高。因此備受廣大科研工作者的青睞。隨著研究的不斷深入，人類已進入后基因組研究時代，其核心內(nèi)容就是研究基因的功能。由于大部分細胞系中特定蛋白低表達或不表達，因此亟需構(gòu)建高表達目的蛋白的細胞模型。目前一般采用腺病毒的方法構(gòu)建瞬時表達目的蛋白的細胞，但往往效果不盡人意。主要是由于瞬時表達的細胞，目的蛋白的表達不穩(wěn)定，且不同實驗間的差異有時非常大。此外，用腺病毒構(gòu)建穩(wěn)定表達細胞的效率低、成果率小，往往費時費力。因此，亟需使用穩(wěn)定可靠的載體系統(tǒng)通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和單克隆篩選，以獲得穩(wěn)定高表達目的蛋白的特定細胞。鑒于上述因素，本發(fā)明利用新型慢病毒系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定表達人細胞色素P450 2A13 (CYP2A13)的肺支氣管上皮細胞(BEAS-2B)，簡稱為BEAS-2B/CYP2A13細胞，以期為研究藥物代謝活化作用以及呼吸系統(tǒng)腫瘤及分子機制提供理想的細胞模型。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的
本發(fā)明采用新型慢病毒系統(tǒng)來構(gòu)建細胞模型，具體來說提供一種人肺細胞BEAS-2B/ CYP2A13及其應(yīng)用。一種人肺細胞BEAS-2B/CYP2A13，其特征在于，該細胞株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO C2010127 ；保藏時間為2010年12月7日。保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)。一種人肺細胞BEAS-2B/CYP2A13的制備方法，其特征在于具體制備步驟如下
A. pLJMl-GFP-CYP2A13質(zhì)粒構(gòu)建及驗證
通過內(nèi)切酶雙酶切以及酶連的方法構(gòu)建含有目的CYP基因的慢病毒質(zhì)粒 pLJMl-GFP-CYPs,即對本實驗室現(xiàn)有的pFastBac 1-CYP2A13質(zhì)粒與慢病毒專用空載質(zhì)粒 pLJMl-GFP同時進行酶切，回收酶切產(chǎn)物后分別進行酶連，然后轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細胞，通過氨芐青霉素篩選，挑取陽性克隆提取重組質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒使用各基因特異引物進行PCR 驗證；B.慢病毒載體包裝以及感染BEAS-2B細胞
傳細胞至60mm培養(yǎng)皿中，細胞密度達到80-90%融合度時進行轉(zhuǎn)染；制備脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染復(fù)合物=DMEM無血清，無雙抗，轉(zhuǎn)染每皿的復(fù)合物含6ug pLJMl-GFP-CYPs質(zhì)粒、3ug pVSVG、4. 5ug delta 8. 91以及15ul Sofast轉(zhuǎn)染試劑，將復(fù)合物加至培養(yǎng)皿中的DMEM液面下，吹打3-4次混勻，將此細胞放至37°C CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，6- 后更換新鮮完全培養(yǎng)基； 轉(zhuǎn)染24h后，通過觀察細胞綠色熒光蛋白表達情況確定轉(zhuǎn)染效率；收集病毒上清，此即為含有CYP2A13基因的完整慢病毒上清；使用該完整慢病毒上清過濾后感染BEAS-2B細胞，同時加入10ug/mL的polybrene和HEPES ；感染24h后重復(fù)感染一次。構(gòu)建穩(wěn)定表達 CYP2A13 的 BEAS-2B 細胞 BEAS-2B/CYP2A13 ；
C.BEAS-2B/CYP2A13 細胞的驗證
分別收取慢病毒感染成功后一周和兩周的各BEAS-2B/CYP2A13細胞總蛋白，使用 CYP2A13的特異性抗體，采用免疫印跡方法驗證BEAS-2B/CYP2A13細胞中的蛋白表達；
D.流式細胞儀分選BEAS-2B/CYP2A13細胞株
為保證轉(zhuǎn)染細胞的純度，使用流式細胞儀對BEAS-2B/CYP2A13細胞株進行了 GFP陽性細胞分選；未轉(zhuǎn)染的正常細胞無熒光，轉(zhuǎn)染細胞的熒光強度明顯增強，通過分選，將熒光強度較強的細胞分選出來，以保證細胞為100%轉(zhuǎn)染細胞；
E.BEAS-2B/CYP2A13單克隆細胞的挑選及驗證
將GFP陽性的BEAS-2B/CYP2A13細胞，以每孔1個細胞的濃度接種到96孔細胞培養(yǎng)板， 結(jié)果7-10天后，對形成單克隆的細胞進行放大培養(yǎng)，直到細胞滿足實驗和保存要求為止； 對篩選出的單克隆細胞進行驗證，選取CYP2A13蛋白表達高且穩(wěn)定的細胞作為后續(xù)實驗和保存之用。一種人肺細胞BEAS-2B/CYP2A13的應(yīng)用，其特征在于該細胞對于CYP2A13的特征性底物AFBl反應(yīng)的高效敏感性，可運用于任何研究CYP2A13的功能及其在環(huán)境化學(xué)物致呼吸系統(tǒng)腫瘤的效應(yīng)及機制上，也可用于相關(guān)藥物的活性篩選及研發(fā)。
有益效果
1.本發(fā)明采用新型慢病毒系統(tǒng)來構(gòu)建細胞模型。該體系具有如下優(yōu)勢高效轉(zhuǎn)染，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率可以達到95%以上，且片段不已丟失；包裝的病毒系統(tǒng)可侵染多種細胞類型，包括非分化細胞和難以轉(zhuǎn)染的細胞(如原代細胞、血細胞、干細胞等)；包裝基因整合到基因組 DNA上，表達水平高，變異率低，不干擾細胞的正常功能；表達穩(wěn)定、可遺傳。2、本發(fā)明以細胞色素P450 2A13 (CYP2A13)為目的基因，以永生化的人正常肺細胞(BEAS-2B)作為載體細胞，利用慢病毒系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定表達CYP2A13的BEAS-2B細胞 (BEAS-2B/CYP2A13)并獲得成功。通過基因、蛋白及功能研究，結(jié)果顯示該細胞具有表達穩(wěn)定、反應(yīng)靈敏等特點，是研究藥物代謝活化作用以及呼吸系統(tǒng)腫瘤及分子機制的理想模型， 值得推廣應(yīng)用。3、在國內(nèi)外率先利用慢病毒系統(tǒng)構(gòu)建了穩(wěn)定表達CYP2A13的BEAS-2B細胞，這是本發(fā)明最重要的關(guān)鍵技術(shù)。該技術(shù)相比其它病毒載體系統(tǒng)而言，具有轉(zhuǎn)染效率高、表達穩(wěn)定、易于篩選等優(yōu)點，對于轉(zhuǎn)染永生化的原代細胞具有獨特的優(yōu)勢。4、利用該技術(shù)，可以構(gòu)建任何穩(wěn)定表達目的基因的原代細胞或細胞株，為基因的功能研究及
疾病的機制研究提供了重要的載體，一旦推廣，必將產(chǎn)生顯著的社會效益和可觀的經(jīng)濟效益。


圖1 PLJM1-GFP-CYP2A13重組質(zhì)粒PCR驗證。隨機選擇3個克隆載體，利用CYP2A13 引物進行PCR驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3個質(zhì)粒都在預(yù)期大小(1500bp)的位置出現(xiàn)了明亮的條帶， 提示質(zhì)粒構(gòu)建成功。圖中M為DNA Maker。圖2感染后不同時間細胞中GFP蛋白的表達情況。分別在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前、轉(zhuǎn)染后4 天和1周，運用熒光顯微鏡通過觀察熒光蛋白GFP的強度評價細胞的轉(zhuǎn)染效率。圖中所示， 不管是BEAS-2B/CYP2A13細胞還是空載細胞(BEAS-2B/VeCtor)，轉(zhuǎn)染后1周明顯強于轉(zhuǎn)然后4天，而未轉(zhuǎn)染細胞則無熒光。圖3 BEAS-2B/CYP2A13細胞的蛋白表達驗證。采用免疫印跡法檢測細胞中 CYP2A13的表達情況，并以Tubulin作為內(nèi)參，其中1和2分別為轉(zhuǎn)染后1周和2周的細胞； P為陽性對照，是體外表達的CYP2A13微粒體蛋白；V為空載細胞BEAS-2B/VeCtor ；N為未轉(zhuǎn)染的BEAS-2B細胞。圖4各轉(zhuǎn)染細胞的流式細胞儀檢測結(jié)果。其中左圖為未轉(zhuǎn)染的BEAS-2B細胞，其熒光強度很弱，右圖為BEAS-2B/CYP2A13細胞明顯右移。以BEAS-2B細胞的熒光強度為分界線，將分界線右側(cè)的細胞分選出來，已獲得100%轉(zhuǎn)染效率的目的細胞。圖5 BEAS-2B/CYP2A13單克隆細胞的基因和蛋白表達驗證。其中圖A為CYP2A13 的蛋白表達驗證，1-7分別為各細胞株挑選的單隆隆細胞蛋白；圖B為6號和7號單克隆細胞的基因表達驗證；圖C為6號和7號單克隆細胞的蛋白驗證。GADPH為內(nèi)參，V為空載細胞，N為未轉(zhuǎn)染細胞；P為陽性對照，M為DNA Marker。圖6 AFBl對BEAS-2B/CYP2A13細胞的毒性效應(yīng)。其中圖A為不同濃度AFBl處理M小時后細胞的活性變化，圖B為利用IOOnM的AFBl處理不同時間后細胞的活性變化， Vector表示空載細胞，是BEAS-2B/CYP2A13細胞的對照細胞。
具體實施方式

實施例1
1. PLJM1-GFP-CYP2A13質(zhì)粒構(gòu)建及驗證
通過內(nèi)切酶雙酶切以及酶連的方法構(gòu)建含有目的CYP基因的慢病毒質(zhì)粒 pLJMl-GFP-CYPs,即對本實驗室現(xiàn)有的pFastBac 1-CYP2A13質(zhì)粒與慢病毒專用空載質(zhì)粒 pLJMl-GFP同時進行酶切，回收酶切產(chǎn)物后分別進行酶連，然后轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細胞，通過氨芐青霉素篩選，挑取陽性克隆提取重組質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒使用各基因特異引物進行PCR 驗證。 2.慢病毒載體包裝以及感染BEAS-2B細胞傳細胞至60mm培養(yǎng)皿中，細胞密度達到80-90 %融合度時進行轉(zhuǎn)染。制備脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染復(fù)合物=DMEM (無血清，無雙抗)，轉(zhuǎn)染每皿的復(fù)合物含6ug pLJMl-GFP-CYPs質(zhì)粒、 3ug pVSVG、4. 5ug delta 8. 91以及15ul Sofast轉(zhuǎn)染試劑，將復(fù)合物加至培養(yǎng)皿中的DMEM 液面下，吹打3-4次混勻，將此細胞放至37°C CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，6- 后更換新鮮完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染24h后，通過觀察細胞綠色熒光蛋白(GFP)表達情況確定轉(zhuǎn)染效率。收集病毒上清，此即為含有^ ^基因的完整慢病毒上清。使用該完整慢病毒上清過濾后感染BEAS-2B細胞，同時加入10ug/mL的polybrene和HEPES。感染24h后重復(fù)感染一次。構(gòu)建穩(wěn)定表達 CYP2A13 的 BEAS-2B 細胞(BEAS-2B/CYP2A13)。3. BEAS-2B/CYP2A13 細胞的驗證
分別收取慢病毒感染成功后一周和兩周的各BEAS-2B/CYP2A13細胞總蛋白，使用 CYP2A13的特異性抗體，采用免疫印跡方法驗證BEAS-2B/CYP2A13細胞中的蛋白表達。4.流式細胞儀分選BEAS-2B/CYP2A13細胞株
為保證轉(zhuǎn)染細胞的純度，使用流式細胞儀對BEAS-2B/CYP2A13細胞株進行了 GFP陽性細胞分選。未轉(zhuǎn)染的正常細胞無熒光，轉(zhuǎn)染細胞的熒光強度明顯增強，通過分選，將熒光強度較強的細胞分選出來，以保證細胞為100%轉(zhuǎn)染細胞。5. BEAS-2B/CYP2A13單克隆細胞的挑選及驗證
將GFP陽性的BEAS-2B/CYP2A13細胞，以每孔1個細胞的濃度接種到96孔細胞培養(yǎng)板， 結(jié)果7-10天后，對形成單克隆的細胞進行放大培養(yǎng)，直到細胞滿足實驗和保存要求為止。 對篩選出的單克隆細胞進行驗證，選取CYP2A13蛋白表達高且穩(wěn)定的細胞作為后續(xù)實驗和保存之用。該細胞株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO C2010127。 保藏時間為2010年12月7日。保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)。結(jié)果人肺細胞BEAS-2B/CYP2A13的構(gòu)建
通過對重組質(zhì)粒使用CYP2A13的特異引物進行PCR驗證，可見各PCR產(chǎn)物片段與基因長短一致，證實pLJMl-GFP-CYPs各質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖1)；利用該質(zhì)粒感染細胞4天和1 周，通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞的綠色熒光強度逐漸增強，而未轉(zhuǎn)染細胞則無熒光，提示細胞轉(zhuǎn)染成功并具有較高的感染效率(圖2)；采用CYP2A13的特異性抗體對轉(zhuǎn)染細胞的CYP2A13蛋白進行免疫印跡法驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所挑選的細胞都高表達CYP2A13細胞，而空載細胞核未轉(zhuǎn)染細胞則不表達CYP2A13，結(jié)果提示細胞的穩(wěn)定表達成功(圖3)；為了獲得單克隆的BEAS-2B/CYP2A13細胞，通過流式細胞儀對細胞進行分選，以未轉(zhuǎn)染細胞為對照，將熒光強度陽性的細胞分選出來(圖4);隨后對上述細胞進行單克隆篩選，并分別運用免疫印跡法和RT-PCR法對單克隆細胞的CYP2A13蛋白和mRNA進行驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有細胞都較好地表達了 CYP2A13蛋白(圖5A)，所挑選的單克隆細胞都穩(wěn)定高表達 CYP2A13 mRNA (圖5B)和CYP2A13蛋白(圖5C)，結(jié)果提示單克隆的BEAS-2B/CYP2A13構(gòu)建成功。實施例2
1.細胞對AFBl作用的劑量依賴性運用研究
利用實施例1獲得的BEAS-2B/CYP2A13細胞，以空載細胞BEAS_2B/Vector為對照，分別給予細胞0、10、100、1000和10,000 nM的AFBl，處理24小時，然后采用MTT法檢測各劑量處理下的細胞活性，評價細胞不同劑量AFBl處理下的毒性效應(yīng)，構(gòu)建劑量-效應(yīng)關(guān)系。
2.細胞對AFBl作用的時間依賴性運用研究
利用實施例1獲得的BEAS-2B/CYP2A13細胞，以空載細胞BEAS_2B/Vector為對照，運用100 nM AFBl分別處理細胞M、48和72小時，然后采用MTT法檢測各時間點處理下的細胞活性，評價細胞在AFBl處理不同時間下的毒性效應(yīng)，構(gòu)建時間-效應(yīng)關(guān)系。結(jié)果人肺細胞BEAS-2B/CYP2A13的運用研究
由圖6A可見，相對于空載細胞BEAS-2B/Vector而言，BEAS-2B/CYP2A13細胞對AFBl 十分敏感，從最低濃度起，其細胞活性均顯著低于BEAS-2B/VeCtor細胞(P<0.01)，半數(shù)抑制濃度(IC5tl)為350nM，而BEAS_2B/Vector細胞在IOOOOnM的AFBl時仍然保持95%以上的細胞活性。如圖5B所示，隨著時間的延長，BEAS-2B/CYP2A13細胞的活性逐漸下降，而 BEAS-2B/VeCtor細胞則無明顯改變；在各個時間點，BEAS-2B/CYP2A13的細胞活性均顯著低于BEAS-2B/Vector細胞(P<0. 01)。結(jié)果證明，該BEAS-2B/CYP2A13細胞對AFBl的反應(yīng)是靈敏的，是理想的細胞模型，可適用于CYP2A13的功能研究以及藥物篩選和活性研究。
權(quán)利要求
1.一種人肺細胞BEAS-2B/CYP2A13，其特征在于，該細胞株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO: C2010127。
2.一種人肺細胞BEAS-2B/CYP2A13的制備方法，其特征在于具體制備步驟如下A.pLJMl-GFP-CYP2A13質(zhì)粒構(gòu)建及驗證通過內(nèi)切酶雙酶切以及酶連的方法構(gòu)建含有目的CYP基因的慢病毒質(zhì)粒 pLJMl-GFP-CYPs,即對本實驗室現(xiàn)有的pFastBac 1-CYP2A13質(zhì)粒與慢病毒專用空載質(zhì)粒 pLJMl-GFP同時進行酶切，回收酶切產(chǎn)物后分別進行酶連，然后轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細胞，通過氨芐青霉素篩選，挑取陽性克隆提取重組質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒使用各基因特異引物進行PCR 驗證；B.慢病毒載體包裝以及感染BEAS-2B細胞傳細胞至60mm培養(yǎng)皿中，細胞密度達到80-90 %融合度時進行轉(zhuǎn)染；制備脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染復(fù)合物=DMEM無血清，無雙抗，轉(zhuǎn)染每皿的復(fù)合物含6ug pLJMl-GFP-CYPs質(zhì)粒、3ug pVSVG、4. 5ug delta 8. 91以及15ul Sofast轉(zhuǎn)染試劑，將復(fù)合物加至培養(yǎng)皿中的DMEM液面下，吹打3-4次混勻，將此細胞放至37°C CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，6- 后更換新鮮完全培養(yǎng)基； 轉(zhuǎn)染24h后，通過觀察細胞綠色熒光蛋白表達情況確定轉(zhuǎn)染效率；收集病毒上清，此即為含有CYP2A13基因的完整慢病毒上清；使用該完整慢病毒上清過濾后感染BEAS-2B細胞，同時加入10ug/mL的polybrene和HEPES ；感染24h后重復(fù)感染一次；構(gòu)建穩(wěn)定表達 CYP2A13 的 BEAS-2B 細胞 BEAS-2B/CYP2A13 ；C.BEAS-2B/CYP2A13 細胞的驗證分別收取慢病毒感染成功后一周和兩周的各BEAS-2B/CYP2A13細胞總蛋白，使用 CYP2A13的特異性抗體，采用免疫印跡方法驗證BEAS-2B/CYP2A13細胞中的蛋白表達；D.流式細胞儀分選BEAS-2B/CYP2A13細胞株為保證轉(zhuǎn)染細胞的純度，使用流式細胞儀對BEAS-2B/CYP2A13細胞株進行了 GFP陽性細胞分選；未轉(zhuǎn)染的正常細胞無熒光，轉(zhuǎn)染細胞的熒光強度明顯增強，通過分選，將熒光強度較強的細胞分選出來，以保證細胞為100%轉(zhuǎn)染細胞；E.BEAS-2B/CYP2A13單克隆細胞的挑選及驗證將GFP陽性的BEAS-2B/CYP2A13細胞，以每孔1個細胞的濃度接種到96孔細胞培養(yǎng)板， 結(jié)果7-10天后，對形成單克隆的細胞進行放大培養(yǎng)，直到細胞滿足實驗和保存要求為止； 對篩選出的單克隆細胞進行驗證，選取CYP2A13蛋白表達高且穩(wěn)定的細胞作為后續(xù)實驗和保存之用。
3.一種人肺細胞BEAS-2B/CYP2A13的應(yīng)用，其特征在于利用CYP2A13的特征性底物黃曲霉毒素Bl對細胞進行測試；使用0-10,000 nM的AFB1，處理細胞對h，采用MTT法評價劑量-效應(yīng)關(guān)系；使用100 nM處理細胞M-72小時，采用MTT法評價時間-效應(yīng)關(guān)系；通過與空載細胞BEAS-2B/Vector進行比較，評價BEAS-2B/CYP2A13細胞對AFBl的敏感性。
全文摘要
本發(fā)明涉及人重組基因肺上皮細胞，特別涉及一種人肺細胞BEAS-2B/CYP2A13及其應(yīng)用。一種人肺細胞BEAS-2B/CYP2A13，其特征在于，該細胞株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NOC2010127。在國內(nèi)外率先利用慢病毒系統(tǒng)構(gòu)建了穩(wěn)定表達CYP2A13的BEAS-2B細胞，這是本發(fā)明最重要的關(guān)鍵技術(shù)。該技術(shù)相比其它病毒載體系統(tǒng)而言，具有轉(zhuǎn)染效率高、表達穩(wěn)定、易于篩選等優(yōu)點，對于轉(zhuǎn)染永生化的原代細胞具有獨特的優(yōu)勢。
文檔編號C12Q1/02GK102168061SQ201010596659
公開日2011年8月31日 申請日期2010年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月21日
發(fā)明者李孜音, 李建民, 楊雪嬌, 王守林, 陸慧媛 申請人:南京醫(yī)科大學(xué)