專利名稱：一種副豬嗜血桿菌5型高密度發(fā)酵培養(yǎng)基及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種副豬嗜血桿菌5型高密度發(fā)酵培
養(yǎng)基及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis, HPs)是常規(guī)飼養(yǎng)豬群上呼吸道的一種常在菌，但在特定條件下可以侵入機(jī)體并引起嚴(yán)重的全身性疾病，以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、 關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為特征，該病又稱為革拉瑟氏病(Oliverira et al.，2004)。早期采用抗生素進(jìn)行治療，但是該菌耐藥現(xiàn)象越來(lái)越常見(jiàn)，常用藥物對(duì)該病已無(wú)明顯的療效，而且，隨著人們對(duì)無(wú)藥物殘留、綠色食品需求的期望越來(lái)越高，目前許多國(guó)家對(duì)抗生素在動(dòng)物飼料中應(yīng)用的限制也越來(lái)越嚴(yán)格，抗生素在本病預(yù)防和控制等方面的應(yīng)用必將受到嚴(yán)格限制和逐步禁止，因此，疫苗接種己成為預(yù)防和控制該病的主要措施。TSB培養(yǎng)基作為HPs傳統(tǒng)的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的基本成分為葡萄糖2. 5g/L，干酪素17g/L，磷酸二氫鉀2. 5g/L，胰液大豆蛋白胨3g/L。該培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)在于配制容易，且是復(fù)合的培養(yǎng)基。但是TSB培養(yǎng)基成本較高，最后所得的活菌數(shù)較少，一般活菌數(shù)在15 20 億，且生產(chǎn)周期長(zhǎng)。另外，TSB培養(yǎng)基中氮源物質(zhì)的種類和含量均很少，不利于菌體大量增長(zhǎng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，針對(duì)副豬嗜血桿菌5型高密度發(fā)酵培養(yǎng)的需要而篩選的一種高性能的發(fā)酵培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基既能保證副豬嗜血桿菌生長(zhǎng)旺盛，進(jìn)行正常代謝，又能提高生長(zhǎng)速度，縮短生產(chǎn)時(shí)間，并且該培養(yǎng)基完全能適應(yīng)于副豬嗜血桿菌疫苗生產(chǎn)。本發(fā)明制備的培養(yǎng)基是一種生產(chǎn)成本低廉，活菌數(shù)較高，一般活菌數(shù)為45 50 億，且生產(chǎn)周期短的高密度發(fā)酵培養(yǎng)基。本發(fā)明通過(guò)下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)—種副豬嗜血桿菌5型高密度發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的組分及配比為，按重量/體積計(jì)谷氨酸鈉1 10g/L，酵母粉5 50g/L，氯化鈉1 10g/L，無(wú)水磷酸二氫鉀0. 063 2. 502g/L,三水磷酸氫二鉀0. 351 14. 044g/L ；按體積比計(jì)牛血清5 40%，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD) 1 10%。，余量是水，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至7. 2 8. 0。作為優(yōu)選方案，本發(fā)明的培養(yǎng)基的組分及配比為按照重量/體積計(jì)，谷氨酸鈉 2 8g/L，酵母粉6 40g/L，氯化鈉2 8g/L，無(wú)水磷酸二氫鉀0. 126 1. 89g/L，三水磷酸氫二鉀0. 702 10. 53g/L ；按體積比計(jì)牛血清6 35 %，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD) 2 8%。，余量是水，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至7. 3 7. 8。作為優(yōu)選方案，本發(fā)明的培養(yǎng)基的組分及配比為按重量/體積計(jì)，谷氨酸鈉 2. 5g/L，酵母粉30g/L，氯化鈉5. Og/L,無(wú)水磷酸二氫鉀0. 195g/L，三水磷酸氫二鉀1. 155g/L ；按體積比計(jì)牛血清10%，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD) 2%。，余量是水，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至7. 4。本發(fā)明提供的培養(yǎng)基通過(guò)下列方法制備A、取谷氨酸鈉1 10g/L，酵母粉5 50g/L，氯化鈉1 10g/L，用蒸餾水溶解后定容至1000ml，調(diào)培養(yǎng)基的pH至7. 2 8. 0，在115 121 °C的高壓蒸汽下滅菌20 30min ；B、稱取27. 2g的無(wú)水磷酸二氫鉀，加蒸餾水定容至1000ml，配制成磷酸二氫鉀溶液；稱取45. 6g三水磷酸氫二鉀加蒸餾水定容至1000ml，配制成磷酸氫二鉀溶液；取23ml 磷酸二氫鉀溶液和77ml磷酸氫二鉀溶液，將二者混合，配制成磷酸鹽緩沖溶液，在121°C的高壓蒸汽下滅菌20 30min ；C、按體積比計(jì)，取步驟B的的磷酸鹽緩沖溶液1 40%，過(guò)濾除菌的牛血清5 40%，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸1 10%。，加入滅過(guò)菌的步驟A的培養(yǎng)基，得到副豬嗜血桿菌 5型高密度發(fā)酵培養(yǎng)基。本發(fā)明的特點(diǎn)是本發(fā)明的培養(yǎng)基以谷氨酸鈉即味精作為副豬嗜血桿菌5型的主要碳源，既降低了生產(chǎn)成本，并且谷氨酸鈉作為小分子碳源物質(zhì)，更利于被副豬嗜血桿菌5 型吸收和利用。本發(fā)明以酵母粉作為主要氮源，酵母粉作為一種復(fù)合氮源不僅可以為菌體提供氮源，還可以為菌體提供必須的各種微量元素。磷酸鹽緩沖液一方面能夠有效地中和副豬嗜血桿菌5型生長(zhǎng)過(guò)程中所產(chǎn)生的酸性物質(zhì)，從而促進(jìn)菌體增殖。另一方面磷酸鹽是細(xì)菌合成ATP等代謝產(chǎn)物的必須物質(zhì)。因此該培養(yǎng)基比商業(yè)培養(yǎng)基TSB更經(jīng)濟(jì)且更利于菌的生長(zhǎng)。


圖1 是副豬嗜血桿菌5型在商業(yè)培養(yǎng)基TSB中的生長(zhǎng)曲線(對(duì)照)。圖2 是副豬嗜血桿菌5型在本發(fā)明的最佳實(shí)施例制備的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:培養(yǎng)基的制備(1)將谷氨酸鈉lg，酵母粉5g，氯化鈉lg，用蒸餾水溶解后定容至1L，調(diào)培養(yǎng)基的 pH至7. 2，在115°C高壓蒸汽下滅菌30min。(2)稱取27. 2g無(wú)水磷酸二氫鉀加蒸餾水定容至1L，配置成磷酸二氫鉀溶液，備用；稱取45. 6g三水磷酸氫二鉀加蒸餾水定容至1L，配置成磷酸氫二鉀溶液，備用；取23ml 磷酸二氫鉀溶液和77ml磷酸氫二鉀溶液，將二者混合，配成磷酸鹽緩沖溶液，于115°C高壓蒸汽下滅菌30min。(3)待步驟(1)培養(yǎng)基冷卻到35°C時(shí)，向滅過(guò)菌的培養(yǎng)基中加入所述的磷酸鹽緩沖液(ν/ν) 1%，再加入過(guò)濾除菌的牛血清5% (ν/ν)和NAD 1%0 (ν/ν)，得到副豬嗜血桿菌 5型高密度發(fā)酵培養(yǎng)基。實(shí)施例2 優(yōu)化培養(yǎng)基的制備(1)將谷氨酸鈉5g，酵母粉20g，氯化鈉4g，用蒸餾水溶解后定容至1L，調(diào)培養(yǎng)基的 pH至7. 5，在117°C高壓蒸汽滅菌25min。
(2)稱取27. 2g無(wú)水磷酸二氫鉀加蒸餾水定容至1L，配置成磷酸二氫鉀溶液，備用；稱取45. 6g三水磷酸氫二鉀加蒸餾水定容至1L，配置成磷酸氫二鉀溶液，備用。取23ml 磷酸二氫鉀溶液和77ml磷酸氫二鉀溶液，二者混合，配成磷酸鹽緩沖溶液，于117°C高壓蒸汽滅菌25min。(3)待步驟(1)培養(yǎng)基冷卻到37°C時(shí)，向滅過(guò)菌的培養(yǎng)基中加入所述的磷酸鹽緩沖液(ν/ν) 20%。再加入過(guò)濾除菌的牛血清20% (ν/ν)和NAD3%。(ν/ν)，得到副豬嗜血桿菌5型高密度發(fā)酵培養(yǎng)基。實(shí)施例3 優(yōu)化培養(yǎng)基的制備(1)將谷氨酸鈉10g，酵母粉50g，氯化鈉10g，用蒸餾水溶解后定容至1L，調(diào)培養(yǎng)基的pH至7. 6，在121 °C高壓蒸汽滅菌20min。(2)稱取27. 2g無(wú)水磷酸二氫鉀加蒸餾水定容至1L，配置成磷酸二氫鉀溶液，備用；稱取45. 6g三水磷酸氫二鉀加蒸餾水定容至1L，配置成磷酸氫二鉀溶液，備用。取23ml 磷酸二氫鉀溶液和77ml磷酸氫二鉀溶液，二者混合，配成磷酸鹽緩沖溶液，于121°C高壓蒸汽滅菌20min。(3)待步驟(1)培養(yǎng)基冷卻到40°C時(shí)，向滅過(guò)菌的培養(yǎng)基中加入所述的磷酸鹽緩沖液(ν/ν)40%。再加入過(guò)濾除菌的牛血清40% (ν/ν)和NAD10%。(ν/ν)，得到副豬嗜血桿菌5型高密度發(fā)酵培養(yǎng)基。實(shí)施例4 優(yōu)化培養(yǎng)基的制備(1)將谷氨酸鈉2g，酵母粉6g，氯化鈉2g，用蒸餾水溶解后定容至1L，調(diào)培養(yǎng)基的 pH至7. 3，在116°C高壓蒸汽滅菌^min。(2)稱取27. 2g無(wú)水磷酸二氫鉀加蒸餾水定容至1L，配置成磷酸二氫鉀溶液；稱取 45. 6g三水磷酸氫二鉀加蒸餾水定容至1L，配置成磷酸氫二鉀溶液。取23ml磷酸二氫鉀溶液和77ml磷酸氫二鉀溶液，二者混合，配成磷酸鹽緩沖溶液，于116°C高壓蒸汽滅菌^min。(3)待步驟(1)培養(yǎng)基冷卻到36°C時(shí)，向滅過(guò)菌的培養(yǎng)基中加入所述的磷酸鹽緩沖液(v/v)2%。再加入過(guò)濾除菌的牛血清6% (ν/ν)和NAD2%。(ν/ν)，得到副豬嗜血桿菌 5型高密度發(fā)酵培養(yǎng)基。實(shí)施例5 優(yōu)化培養(yǎng)基的制備(1)將谷氨酸鈉8g，酵母粉40g，氯化鈉8g，用蒸餾水溶解后定容至1L，調(diào)培養(yǎng)基的 pH至7. 8，在118°C高壓蒸汽滅菌2%iin。(2)稱取27. 2g無(wú)水磷酸二氫鉀加蒸餾水定容至1L，配置成磷酸二氫鉀溶液；稱取 45. 6g三水磷酸氫二鉀加蒸餾水定容至1L，配置成磷酸氫二鉀溶液。取23ml磷酸二氫鉀溶液和77ml磷酸氫二鉀溶液，二者混合，配成磷酸鹽緩沖溶液，于118°C高壓蒸汽滅菌2%iin。(3)待步驟(1)培養(yǎng)基冷卻到38°C時(shí)，向滅過(guò)菌的培養(yǎng)基中加入所述的磷酸鹽緩沖液(V/V)30%。再加入過(guò)濾除菌的牛血清35% (ν/ν)和NAD8%。(ν/ν)，得到副豬嗜血桿菌5型高密度發(fā)酵培養(yǎng)基。實(shí)施例6 優(yōu)化培養(yǎng)基的制備(1)將谷氨酸鈉2. 5g，酵母粉30g，氯化鈉5g，用蒸餾水溶解后定容至1L，調(diào)培養(yǎng)基的pH至7. 4，在121 °C高壓蒸汽滅菌20min。(2)稱取27. 2g無(wú)水磷酸二氫鉀加蒸餾水定容至1L，配置成磷酸二氫鉀溶液；稱取45. 6g三水磷酸氫二鉀加蒸餾水定容至1L，配置成磷酸氫二鉀溶液。取23ml磷酸二氫鉀溶液和77ml磷酸氫二鉀溶液，二者混合，配成磷酸鹽緩沖溶液，于121°C高壓蒸汽滅菌20min。(3)待步驟(1)培養(yǎng)基冷卻到39°C時(shí)，向滅過(guò)菌的培養(yǎng)基中加入所述的磷酸鹽緩沖液(V/V)5%。再加入過(guò)濾除菌的牛血清10% (ν/ν)和NAD2%。(ν/ν)，得到副豬嗜血桿菌 5型高密度發(fā)酵培養(yǎng)基。實(shí)施例7 優(yōu)化培養(yǎng)基的制備(1)將谷氨酸鈉5g，酵母粉25g，氯化鈉2. 5g，用蒸餾水溶解后定容至1L，調(diào)培養(yǎng)基的pH至7. 4，在121 °C高壓蒸汽滅菌20min。(2)稱取27. 2g無(wú)水磷酸二氫鉀加蒸餾水定容至1L，配置成磷酸二氫鉀溶液；稱取 45. 6g三水磷酸氫二鉀加蒸餾水定容至1L，配置成磷酸氫二鉀溶液。取23ml磷酸二氫鉀溶液和77ml磷酸氫二鉀溶液，二者混合，配成磷酸鹽緩沖溶液，于121°C高壓蒸汽滅菌20min。(3)待步驟(1)培養(yǎng)基冷卻到34°C時(shí)，向滅過(guò)菌的培養(yǎng)基中加入所述的磷酸鹽緩沖液(ν/ν) 20%。再加入過(guò)濾除菌的牛血清15% (ν/ν)和NAD5%。(ν/ν)，得到副豬嗜血桿菌5型高密度發(fā)酵培養(yǎng)基。表1 副豬嗜血桿菌5型3L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)
權(quán)利要求
1.一種適用于副豬嗜血桿菌5型的高密度發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于培養(yǎng)基組分及配比為，按重量/體積計(jì)谷氨酸鈉1 10g/L，酵母粉5 50g/L，氯化鈉1 10g/L，無(wú)水磷酸二氫鉀0. 063 2. 502g/L，三水磷酸氫二鉀0. 351 14. 044g/L ；按體積比計(jì)牛血清5 40%，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸1 10%。，余量是水，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至7. 2 8. 0。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述的培養(yǎng)基的組分及配比為按重量/ 體積計(jì)谷氨酸鈉2 8g/L，酵母粉6 40g/L，氯化鈉2 8g/L，無(wú)水磷酸二氫鉀0. 126 1. 89g/L，三水磷酸氫二鉀0. 702 10. 53g/L ；按體積比計(jì)牛血清6 35%，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸2 8%。，余量是水，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至7. 2 8. 0。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述的培養(yǎng)基的組分及配比為按重量/體積計(jì)谷氨酸鈉2. 5g/L，酵母粉30g/L，氯化鈉5. Og/L,無(wú)水磷酸二氫鉀0. 195g/L， 三水磷酸氫二鉀1. 155g/L ；按體積比計(jì)牛血清10%，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸2%。，余量是水，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至7. 2 8. 0。
4.權(quán)利要求1所述培養(yǎng)基的制備方法，其特征包括下列步驟A、取谷氨酸鈉1 10g/L，酵母粉5 50g/L，氯化鈉1 10g/L，用蒸餾水溶解后定容至1000ml，調(diào)培養(yǎng)基的pH至7. 2 8. 0，在115 121 °C的高壓蒸汽下滅菌20 30min ；B、稱取27.2g的無(wú)水磷酸二氫鉀，加蒸餾水定容至1000ml，配制成磷酸二氫鉀溶液；稱取45. 6g三水磷酸氫二鉀加蒸餾水定容至1000ml，配制成磷酸氫二鉀溶液；取23ml磷酸二氫鉀溶液和77ml磷酸氫二鉀溶液，將二者混合，配制成磷酸鹽緩沖溶液，在121°C的高壓蒸汽下滅菌20 30min ；C、按體積比計(jì)，取步驟B的的磷酸鹽緩沖溶液1 40%，過(guò)濾除菌的牛血清5 40%， 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸1 10%。，加入滅過(guò)菌的步驟A的培養(yǎng)基，得到副豬嗜血桿菌5型高密度發(fā)酵培養(yǎng)基。
5.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基在副豬嗜血桿菌5型的高密度發(fā)酵中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種適用于副豬嗜血桿菌5型的高密度發(fā)酵培養(yǎng)基，其包括下列組分按照重量/體積計(jì)，谷氨酸鈉1～10g/L，酵母粉5～50g/L，氯化鈉1～10g/L，無(wú)水磷酸二氫鉀0.063～2.502g/L，三水磷酸氫二鉀0.351～14.044g/L；按體積比計(jì)牛血清5～40％，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)1～10‰，余量是水。本發(fā)明有利于副豬嗜血桿菌5型的高密度發(fā)酵，菌體生長(zhǎng)速度快，能獲得較高菌量，培養(yǎng)后的副豬嗜血桿菌5型活菌數(shù)可達(dá)到50億。本發(fā)明的培養(yǎng)基材料來(lái)源廣泛，成本低廉，可有效擴(kuò)增副豬嗜血桿菌5型，能滿足大規(guī)模疫苗生產(chǎn)的需要。
文檔編號(hào)C12R1/21GK102559531SQ201010596059
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2010年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月15日
發(fā)明者何偉, 冀志霞, 周銳, 尹爭(zhēng)艷, 徐高原, 方玉林, 曹毅, 蔡旭旺, 金梅林, 陳關(guān)平, 陳守文, 陳煥春, 韓進(jìn), 顧偉 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司