專利名稱：一種快速測(cè)定梨果實(shí)細(xì)胞大小和形態(tài)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速測(cè)定梨果實(shí)細(xì)胞大小和形態(tài)的方法，是利用植物組織化學(xué)處 理技術(shù)從梨果實(shí)中快速分離測(cè)定細(xì)胞大小和形態(tài)的方法，屬于植物生理及生物化學(xué)領(lǐng)域。背景技術(shù)：
果實(shí)是果樹生產(chǎn)收獲器官，果實(shí)的大小與產(chǎn)量、品質(zhì)和生產(chǎn)效益密切相關(guān)。果實(shí)的大小 主要取決于細(xì)胞的數(shù)量、大小、形狀和細(xì)胞間隙等；通常一個(gè)梨果由2500萬 4000萬個(gè)細(xì) 胞組成，果實(shí)增大主要是通過果肉組織內(nèi)細(xì)胞的分裂和體積增大來實(shí)現(xiàn)的。果實(shí)細(xì)胞在大小和形態(tài)方面的規(guī)律性差異，一方面受遺傳因素決定，另一方面也 與外界因子直接相關(guān)，這些差異與果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律相聯(lián)系。梨樹種類和品種繁多，且栽 培范圍廣泛，研究梨屬植物種間或種內(nèi)不同品種間果實(shí)細(xì)胞的大小和形態(tài)規(guī)律性差異，以 及這種差異與果實(shí)大小發(fā)育及質(zhì)地的關(guān)系等一系列問題，對(duì)梨的遺傳育種、品種鑒別、品質(zhì) 分析等方面具有重要的參考價(jià)值，是解析果實(shí)發(fā)育方面細(xì)胞形態(tài)學(xué)內(nèi)容的共性關(guān)鍵技術(shù)之
ο根據(jù)報(bào)道，目前在番茄(2002)、蘋果(2005)、櫻桃(2007)、柿子(2008)、桃(2008)、 香蕉(2001)等肉質(zhì)果實(shí)上用于細(xì)胞大小和形態(tài)研究的方法多采用酶解分離法和組織切片 法?？墒沁@些技術(shù)最大的缺陷是耗時(shí)、費(fèi)力，不利于實(shí)際工作中分析處理大量的樣品。酶解 法盡管不受器官組織限制，獲得的細(xì)胞完整性好、回收率高，但所需酶的成本高，且酶解過 程往往會(huì)隨著長(zhǎng)時(shí)間的孵育(12 48h)而引起細(xì)胞膨脹，增加細(xì)胞變形的可能性，最終影 響測(cè)定結(jié)果。組織切片法雖然可以將組織制成玻片進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞的觀測(cè)，但過程繁瑣，技術(shù) 要求高，制片的各個(gè)步驟都是相互關(guān)聯(lián)，必須對(duì)任何一個(gè)步驟都要細(xì)致、嚴(yán)格操作，往往要 連續(xù)幾天才能完成，而且由于切片后細(xì)胞為非球形，細(xì)胞大小必然受到切片平面的影響，觀 測(cè)誤差大。因此，建立一種比目前已有方法更為快捷、準(zhǔn)確的梨果實(shí)細(xì)胞大小和形態(tài)測(cè)定方 法具有重要的實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值。三
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題
本發(fā)明提供了一種新的快速測(cè)定梨果實(shí)細(xì)胞大小和形態(tài)的方法，應(yīng)用該方法可快速觀 測(cè)果實(shí)細(xì)胞大小和形態(tài)的目的，且具有準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便及實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。技術(shù)方案
以山梨醇(Sorbit)作為平衡細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的介質(zhì)，通過逐漸加熱、攪拌，使胞間層的 果膠質(zhì)在強(qiáng)堿弱酸鹽碳酸鈉(Na2CO3)的作用下快速地溶解，實(shí)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞的分離釋放，用于 細(xì)胞大小和形態(tài)的測(cè)定。該技術(shù)方案主要包括細(xì)胞分離液的配制，果實(shí)組織塊的切割，細(xì) 胞的分離純化，細(xì)胞的收集和測(cè)定(圖1) 1)細(xì)胞分離液的配制
根據(jù)所配溶液終體積X和終濃度為0. 3M山梨醇和0. 05M碳酸鈉，分別稱取相應(yīng)質(zhì)量的 山梨醇和碳酸鈉，用燒杯加2/3 X體積的蒸餾水溶解山梨醇，待山梨醇溶解完全后加入稱取 的碳酸鈉充分溶解，最后用蒸餾水定容到X體積待用；2)果實(shí)組織塊的切分 切取果實(shí)組織的部位，并切塊。3)細(xì)胞分離
將果實(shí)組織切塊放入1倍體積的細(xì)胞分離液中，用保鮮膜封口，以防水分過多蒸發(fā)，煮 沸后加熱并攪拌保持3-5分鐘，再減緩加熱并繼續(xù)攪拌，直到可觀察到燒杯內(nèi)出現(xiàn)云霧狀 即停止加熱和攪拌，獲得含有分離細(xì)胞的細(xì)胞分離液；
4)細(xì)胞純化
待冷卻后，將含有分離細(xì)胞的細(xì)胞分離液用紗布過濾，去除未分離的細(xì)胞團(tuán)和殘留的 維管束細(xì)胞及碎片；
5)細(xì)胞收集
將過濾好的細(xì)胞分離液轉(zhuǎn)入到離心管中，靜置Ih使分離的細(xì)胞沉于管底，傾去上清 液，獲得分離細(xì)胞，或立即使用，或置4 °C下儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?br> 6)細(xì)胞大小和形態(tài)的測(cè)定
用微量移液器吸取20 30 μ 1懸浮液滴到載玻片上，在顯微鏡(X 10)下觀察拍照形 態(tài)，測(cè)定細(xì)胞大小。細(xì)胞分離過程為將切好的2 mm3的小方塊果實(shí)組織倒入50 ml的玻璃燒杯中，然 后加入40 ml含0.05 M碳酸鈉和0.3 M山梨醇的細(xì)胞分離液，將燒杯置于恒溫磁力攪拌器 (加熱功能為0 350瓦)上，用2cm的磁力攪拌子一邊攪拌，轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)，一邊緩慢加熱 使反應(yīng)充分，煮沸3-5 min，然后逐步停止加熱以免細(xì)胞破碎，繼續(xù)攪拌，直到可觀察到分離 液中出現(xiàn)云霧狀為止。有益效果
果實(shí)細(xì)胞初生壁和胞間層中含有豐富的果膠質(zhì)(Pectin)，是相鄰細(xì)胞彼此粘連的重要 成分，通常結(jié)構(gòu)是由D-半乳糖醛酸以α _1，4糖苷鍵連接的多聚半乳糖醛酸。果膠質(zhì)可被 酸、堿、果膠酶等溶解，從而導(dǎo)致細(xì)胞的相互分離。因此，本發(fā)明在保持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡 的情況下，快速地促使細(xì)胞間的果膠質(zhì)溶解，可使細(xì)胞處于游離狀態(tài)，以達(dá)到快速測(cè)定細(xì)胞 大小和形態(tài)的目的。1)這一方法不涉及酶解和組織制片過程，具有傳統(tǒng)方法所不具有的優(yōu)點(diǎn)，如操作 簡(jiǎn)單、成本低廉、時(shí)間短，不需樣品的特殊處理等，應(yīng)用十分廣泛。2)這一方法的優(yōu)勢(shì)是將化學(xué)處理和加熱煮沸相結(jié)合，快速殺死細(xì)胞，在很大程度 上減少了細(xì)胞在分離過程中出現(xiàn)變化，利于細(xì)胞大小和形態(tài)的測(cè)定。3)可以梨屬植物種間或種內(nèi)不同品種間的果實(shí)為材料，利用本方法和普通光學(xué)顯 微鏡快速測(cè)定果實(shí)細(xì)胞的大小和形態(tài)，研究細(xì)胞大小、形態(tài)特征與果實(shí)大小發(fā)育及質(zhì)地的 關(guān)系，為梨果實(shí)的品質(zhì)分析和發(fā)育建模提供了依據(jù)。四

圖1梨果實(shí)細(xì)胞快速分離測(cè)定技術(shù)方案簡(jiǎn)圖。圖2梨果實(shí)組織取樣與切分示意圖。矩形框表示果實(shí)赤道面，方形框?yàn)槿硬课?。圖3梨果實(shí)細(xì)胞的顯微觀察圖(X 10)。左圖為‘翠冠’梨品種，右圖為‘黃冠’梨 品種。圖4梨果實(shí)細(xì)胞大小測(cè)定結(jié)果。為Image-Pro Plus軟件測(cè)定的‘黃冠’和‘翠冠’梨果實(shí)細(xì)胞的長(zhǎng)度差異Gd < 0. 05)。五具體實(shí)施例方式
1選果與取樣。選擇能代表本品種果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育特性的梨果實(shí)，清洗果實(shí)，如圖 2用削皮刀沿果實(shí)赤道面，切取一塊楔形果肉組織，然后用鋒利的解剖刀片從中央切取 IcmXlcmXlcm的立方體(Icm3)組織塊。2切分。將上述組織塊置載玻片或玻璃板上，如圖2，進(jìn)一步使用鋒利的解剖刀 片進(jìn)一步將其分割成約2 mm3的小方塊(ImmX ImmX 2mm)。3分離細(xì)胞。將上述切好的2mm3的小方塊組織(約500塊)倒入50 ml的玻璃 燒杯中，然后加入40 ml含0.05 M碳酸鈉和0.3 M山梨醇的細(xì)胞分離液。將燒杯置于恒溫 磁力攪拌器(加熱功能為0 350瓦)上，用2cm的磁力攪拌子一邊攪拌，轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)(180 rpm)，一邊緩慢加熱煮沸3-5 min。然后逐步停止加熱，繼續(xù)攪拌(約20 min)，直到可觀察 到分離液中出現(xiàn)云霧狀的游離細(xì)胞為止。4去雜純化。將分離好的細(xì)胞連同分離液一起，用紗布過濾至培養(yǎng)皿中，去除未 分離的細(xì)胞團(tuán)和殘留的維管束細(xì)胞及碎片。然后，將培養(yǎng)皿中的過濾液轉(zhuǎn)入50 ml離心管 中，靜置lh，傾去多余的上清液，只保留與細(xì)胞等體積的溶液，獲得分離細(xì)胞?；蛄⒓词褂茫?或置4 °C下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?b>5觀測(cè)。用時(shí)輕微振蕩管壁，使上述獲得的分離細(xì)胞重新懸浮。然后用微量移液 器吸取20 30 μ 1懸浮液，滴到載玻片上在顯微鏡下(XlO)觀察拍照，用于細(xì)胞大小和形 態(tài)的測(cè)定。為更清楚地觀察，觀測(cè)時(shí)可用細(xì)胞染色劑染色后觀察，圖3中的細(xì)胞是用伊文斯 藍(lán)染色后的觀察結(jié)果。圖4為所選兩個(gè)梨品種果實(shí)細(xì)胞的測(cè)定結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種快速測(cè)定梨果實(shí)細(xì)胞大小和形態(tài)的方法，具體操作步驟如下1)細(xì)胞分離液的配制根據(jù)所配溶液終體積X和終濃度為0. 3M山梨醇和0. 05M碳酸鈉，分別稱取相應(yīng)質(zhì)量的 山梨醇和碳酸鈉，用燒杯加2/3 X體積的蒸餾水溶解山梨醇，待山梨醇溶解完全后加入稱取 的碳酸鈉充分溶解，最后用蒸餾水定容到X體積待用；2)果實(shí)組織塊的切分切取果實(shí)組織的部位，并切塊；3)細(xì)胞分離將果實(shí)組織切塊放入1倍體積的細(xì)胞分離液中，用保鮮膜封口，以防水分過多蒸發(fā)，加 熱并攪拌煮沸后保持3-5分鐘，再減緩加熱并繼續(xù)攪拌，直到可觀察到燒杯內(nèi)出現(xiàn)云霧狀 即停止加熱和攪拌，獲得含有分離細(xì)胞的細(xì)胞分離液；4)細(xì)胞純化待冷卻后，將含有分離細(xì)胞的細(xì)胞分離液用紗布過濾，去除未分離的細(xì)胞團(tuán)和殘留的 維管束細(xì)胞及碎片；5)細(xì)胞收集將過濾好的細(xì)胞分離液轉(zhuǎn)入到離心管中，靜置Ih使分離的細(xì)胞沉于管底，傾去上清 液，獲得分離細(xì)胞，或立即使用，或置4 °C下儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?)細(xì)胞大小和形態(tài)的測(cè)定用微量移液器吸取20 30 μ 1懸浮液滴到載玻片上，在顯微鏡下觀察拍照形態(tài)，測(cè)定 細(xì)胞大小。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種快速測(cè)定梨果實(shí)細(xì)胞大小和形態(tài)的方法，其特征在于所述步驟3)細(xì)胞分離為，將切好的2 mm3的小方塊果實(shí)組織倒入50 ml的玻璃燒杯 中，然后加入40 ml含0.05 M碳酸鈉和0.3 M山梨醇的細(xì)胞分離液，將燒杯置于加熱功能 為0 350瓦的恒溫磁力攪拌器上，用2cm的磁力攪拌子一邊攪拌，轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)，一邊緩 慢加熱，煮沸3-5 min，然后逐步停止加熱，繼續(xù)攪拌，直到可觀察到分離液中出現(xiàn)云霧狀為
全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速測(cè)定梨果實(shí)細(xì)胞大小和形態(tài)的方法，屬于植物生理及生物化學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明以山梨醇溶液作為平衡細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的介質(zhì)，通過加熱、攪拌，促使碳酸鈉快速地溶解梨果實(shí)細(xì)胞壁及胞間層的果膠質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞游離釋放，達(dá)到快速測(cè)定果實(shí)細(xì)胞大小和形態(tài)的目的。這一方法的優(yōu)勢(shì)是將化學(xué)處理和加熱煮沸相結(jié)合，快速殺死細(xì)胞，阻止細(xì)胞在分離過程中出現(xiàn)變化，利于細(xì)胞大小和形態(tài)的測(cè)定。步驟包括細(xì)胞分離液的配制，果實(shí)組織塊的切分，細(xì)胞的分離純化和收集測(cè)定等過程。本方法不涉及酶解和組織制片過程，具有快速準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單、成本低廉、無污染，不需樣品的特殊處理等優(yōu)點(diǎn)，在效率上遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于目前的方法，應(yīng)用十分廣泛。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK102102120SQ20101059605
公開日2011年6月22日 申請(qǐng)日期2010年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月20日
發(fā)明者吳俊 , 吳華清, 張紹鈴, 張虎平, 王鑫, 秦改花, 陶書田, 齊開杰 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)