專利名稱：一種控制植物體內(nèi)ala合成、促進(jìn)生長(zhǎng)并提高抗逆性的轉(zhuǎn)基因方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種控制植物體內(nèi)ALA合成、促進(jìn)生長(zhǎng)并提高抗逆性的轉(zhuǎn)基因方法， 屬于基因工程領(lǐng)域。是一種微生物基因在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用，是一種運(yùn)用生物基因工程技術(shù)培育高產(chǎn)、多抗植物新種質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
5-氨基乙酰丙酸(5-Aminolevunilic acid, ALA)是所有生物體內(nèi)普遍存在的一種類似于氨基酸的5碳化合物，是所有卟啉化合物(如葉綠素、亞鐵血紅素、維生素B12等) 生物合成的關(guān)鍵前體。在植物體內(nèi)，它由谷氨酸通過(guò)三步酶催反應(yīng)轉(zhuǎn)化而成；在動(dòng)物及酵母體內(nèi)，它由琥珀酰CoA和甘氨酸通過(guò)ALA合酶催化，一步反應(yīng)即可生成。我們以及其它研究小組通過(guò)大量的外源處理試驗(yàn)表明，ALA可以明顯提高甜瓜、西瓜、西葫蘆、番茄、蘿卜、黃瓜、菠菜、小白菜、生菜、油麥菜、草莓、水稻、小麥、棉花、煙草、棗、 梨、康乃馨、紅掌等多種草本和木本植物抵抗高溫、低溫、高光、弱光、鹽漬、干旱、貧瘠等環(huán)境脅迫能力，并顯著提高產(chǎn)量(汪良駒等，植物生理學(xué)通訊，2003，39 =185-192 ；Wanget al, Physiol Plant，2004，121 :258-264 ；汪良駒等，園藝學(xué)報(bào)，2004，31 =321-326 ；汪良駒等， 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，27 O) 34-38 ；Wang et al, J Intergrative Plant Biol, 2005, 47 :1084-1091 ；汪良駒等，西北植物學(xué)報(bào)，2005，25 :488-496 ；劉暉等，果樹學(xué)報(bào)，2006，23 854-859 ；常蘇紅等，自然災(zāi)害學(xué)報(bào)，2006，15 :312-317 ；尹璐璐等，西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007， 16(4) :166-169 ；周賀芳等，干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2007，25 ) :212-215 ；程菊娥等，湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007⑷58-60 ；孫永平等，西北植物學(xué)報(bào)，2008，28 =1384-1390 ；康瑯等，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，31(1) :31-36;王乃江等，西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2008， 36(9) :76-80;徐銘等，西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2008，36(9) =128-132 ； 劉芳等，中國(guó)水稻科學(xué)，2008，22 =411-415 ；徐曉潔等，干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2008，沈 131-135 ；祁向玲等，西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，17 =202-206 ；趙曉進(jìn)等，西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，17 303-308 ；孫永平等，園藝學(xué)報(bào)，2009，36 :671-678 ；馮志威等，山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37 (5) 42-43;康博文等，西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2009，37 (4) :97-102;童金株等，干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2009，27 ) =116-120 ；姚素梅等，植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)，2010，16 242-246 ；郭珍等，西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2010,25(3) :93-96 ；劉玉梅等，園藝學(xué)報(bào)，2010，37 65-71 ；李文華等，西北林學(xué)院學(xué)報(bào)2010，25(1) :90-94)。然而，國(guó)際上迄今仍然沒有通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)來(lái)提高植物內(nèi)源ALA含量以至于提高作物抗逆性并提高產(chǎn)量的成功報(bào)道。德國(guó)學(xué)者(Hiifgenet al, PNAS, 1994,91 :1726-1730 ；Kumar et al, Plant Physiol, 2000,122 :49-56)曾經(jīng)將植物體內(nèi)的ALA合成酶基因(包括tRNAGlu還原酶基因 HemA和谷氨酸-1，2-半醛氨基轉(zhuǎn)移酶基因(isa)轉(zhuǎn)入煙草和擬南芥體內(nèi)，但是，沒有獲得 ALA過(guò)量合成型轉(zhuǎn)基因植物。這可能與植物ALA合成需要多個(gè)酶催化，從而導(dǎo)致的轉(zhuǎn)化難度增大有關(guān)。Zavgorodnyaya等(Plant J，1997，12 :169-178)最早選擇酵母菌ALA合酶基因(Hem)為目的基因，然后把它與CaMV35S啟動(dòng)子重組在一起，轉(zhuǎn)入煙草后，獲得了 ALA過(guò)量合成的轉(zhuǎn)基因植物。韓國(guó)學(xué)者 Jung 等(Plant Sci, 2004,167 :789-795 ；Photosynthetica 2008,46 3-9)則把大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)的Hem基因與玉米泛素啟動(dòng)子重組起來(lái)，轉(zhuǎn)入水稻后，也獲得了 ALA過(guò)量合成型轉(zhuǎn)基因植株。然而，無(wú)論是煙草還是水稻，所有的轉(zhuǎn)基因植株都只能生長(zhǎng)在弱光條件下。一旦轉(zhuǎn)入到強(qiáng)光(1/6的自然光強(qiáng))下，轉(zhuǎn)基因植株就會(huì)出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象，因而，這樣的轉(zhuǎn)基因植物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上沒有實(shí)用價(jià)值。我們也從釀酒酵母菌中克隆出ALA合酶基因(Wfem)，并把它與擬南芥中一種光敏型啟動(dòng)子(擬南芥HemAl基因啟動(dòng)子)重組起來(lái)，轉(zhuǎn)入到煙草、擬南芥、番茄、西瓜、油菜、水稻、草莓、梨等植物體內(nèi)后，發(fā)現(xiàn)它不僅可以誘導(dǎo)植物體內(nèi)源ALA過(guò)量合成，而且即使生長(zhǎng)在自然光照條件下(約ΖΟΟΟμπιοΙ·!^2·^)也不會(huì)出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象。因而，轉(zhuǎn)基因植物不僅抗逆性明顯增強(qiáng)，而且產(chǎn)量明顯提高。這種轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的是提供一種促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高植物抗逆性的轉(zhuǎn)基因方法。技術(shù)方案本發(fā)明所提供的促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高植物抗逆性的轉(zhuǎn)基因方法，是將擬南芥HemAl 基因光敏型啟動(dòng)子(AtHemAlP)和釀酒酵母ALA合酶基因(YHeml)重組，通過(guò)植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入植物中，篩選得到光合能力明顯提高，生長(zhǎng)發(fā)育受到促進(jìn)，并且延緩衰老，單株產(chǎn)量也比野生型植株明顯提高，同時(shí)抗逆性也得到提高的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明所述方法中，AtHemAlP核苷酸序列是Genebank中ΑΜ95364的全長(zhǎng)序列； YHeml基因的編碼序列是Genebank中YSCHEM1AA全長(zhǎng)序列。AtHemAlP和YHeml基因可以通過(guò)植物表達(dá)載體YF8631或13840導(dǎo)入植物中的。其中釀酒酵母Heml基因的植物雙元載體pYF8631構(gòu)建為將測(cè)序正確的pMD18-T載體上的Heml基因經(jīng)BamHI和^icI雙酶切后，插入植物雙元載體pYPXVhb，替換原先載體上的Vhb基因，構(gòu)成載體pYF8630，隨后再將經(jīng)HindIII和 BamHI雙酶切的擬南芥HemAl基因啟動(dòng)子AtHemAlP插入pYF8630載體的相應(yīng)酶切點(diǎn)間，經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序后得到正確的雙元載體PYF8631 ；釀酒酵母Heml基因的植物雙元載體pI3840構(gòu)建為將測(cè)序正確的Heml基因經(jīng)BamHI和^icI雙酶切后，回收1647bp的DNA片段，與相應(yīng)酶切的PYF7716載體相連，隨后再將經(jīng)HindIII和BamHI雙酶切的擬南芥HemAl基因啟動(dòng)子AtHemAlP插入上述載體的相應(yīng)酶切點(diǎn)間，經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序后得到正確的雙元載體PYK3840。本發(fā)明所述的促進(jìn)植物生長(zhǎng)包括煙草、擬南芥、番茄、油菜、水稻、西瓜、草莓、蘋果、梨等。本發(fā)明所述的提高抗逆性包括耐鹽性，抗寒性，耐高溫性、耐弱光性，耐強(qiáng)光性。有益效果本發(fā)明的方法既可以促進(jìn)單子葉植物，也可以提高雙子葉植物的植株生長(zhǎng)及并且提高植株的抗逆性。如水稻、煙草、番茄、擬南芥、油菜、西瓜、草莓、梨等。攜帶有光敏型啟動(dòng)子AtHemAlP和^feml的編碼基因的表達(dá)載體，可以通過(guò)熱激法或電擊法導(dǎo)入農(nóng)桿菌EH105， LBA4404，GV3101等感受態(tài)細(xì)胞中。通過(guò)Ti質(zhì)粒和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法、愈傷組織法、 蘸花法，基因槍法等常規(guī)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物經(jīng)組織培養(yǎng)的方法，獲得植物生長(zhǎng)得到促進(jìn)，抗逆性提高的轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明方法重組的擬南芥光敏型啟動(dòng)子AtHemAlP控制釀酒酵母Wfeml基因不需要設(shè)計(jì)葉綠體蛋白信號(hào)肽序列，因而，在轉(zhuǎn)基因植物中翻譯成的ALA合酶主要分布于植物線粒體中，而不是一般綠色植物的葉綠體中。本發(fā)明方法利用擬南芥光敏型啟動(dòng)子AtHemAlP控制釀酒酵母Wfeml基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)隨著光照條件的變化而變化。YHeml基因在光照條件下的表達(dá)量明顯高于黑暗下。因而，在光照下，Wfeml基因編碼的ALA合酶可以在植物線粒體中將琥珀酰CoA和甘氨酸縮合為ALA，提高植物體內(nèi)源ALA含量，從而促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，提高植物對(duì)低溫、鹽脅迫、弱光、強(qiáng)光的抗性，同時(shí)又避免了黑暗中YHeml基因的表達(dá)和ALA及其代謝中產(chǎn)物的積累，因而，轉(zhuǎn)基因植株不會(huì)表現(xiàn)出光漂白現(xiàn)象。不僅生長(zhǎng)發(fā)育正常，而且生物學(xué)產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)學(xué)產(chǎn)量均會(huì)明顯提高。 實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的方法獲得的含有光敏型啟動(dòng)子AtHemAlP和^feml基因的轉(zhuǎn)基因煙草、擬南芥、油菜、水稻、番茄、西瓜在正常條件下的生長(zhǎng)勢(shì)、單株產(chǎn)量均優(yōu)于野生型植株。在逆境條件下，轉(zhuǎn)基因植株比野生型具有較強(qiáng)的抗逆性，具體表現(xiàn)為耐鹽、抗寒、耐弱光和耐強(qiáng)光等。


圖1為YF8631植物表達(dá)載體構(gòu)建示意2為13840植物表達(dá)載體構(gòu)建示意3為轉(zhuǎn)光敏型啟動(dòng)子AtHemAlP和^feml基因T3代株系煙草Wfeml基因表達(dá)隨著光照時(shí)間的變化4為轉(zhuǎn)YF8631-YHeml煙草結(jié)果期延緩植株衰老情況圖5為轉(zhuǎn)YF3840-YHeml擬南芥鹽脅迫兩周的生長(zhǎng)情況和萌發(fā)率比較圖6為正常光照條件下轉(zhuǎn)YF3840-YHeml擬南芥生長(zhǎng)和結(jié)莢情況圖7為正常環(huán)境條件下盆栽轉(zhuǎn)YF8631-YHeml油菜越冬期抗凍性和返青期生長(zhǎng)情況圖8為轉(zhuǎn)YF8631-YHeml油菜耐鹽性研究圖9為轉(zhuǎn)YF8631-YHeml油菜與野生型油菜角果長(zhǎng)度和飽滿度的研究
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中的方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、轉(zhuǎn)光敏型啟動(dòng)子AtHemAlP和^feml植物的獲得一、轉(zhuǎn)基因所采用的重組表達(dá)載體的構(gòu)建1、擬南芥HemAl光敏型啟動(dòng)子(AtHemAlP)的獲得根據(jù)Genbank中登錄的擬南芥HemAl基因啟動(dòng)子的核苷酸序列(GenebankNo :AF295364)，以抽提的擬南芥的總DNA為模板，通過(guò)加入HindiII酶切位點(diǎn)的引物 (AtHemAlPZl :5，-CCCAAGCTTACCGAAATGTAGGAATCCCACTTC-3，和加入 BamHI 酶切位點(diǎn)的引物(AtHemAlPFl :5，-AGGATCCCAAAATCTCAATCTCCTCTCTGTC-3，)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為 50 μ 1，含 IOmmol/L Tri-HCl pH 8. 3,50mmol · L-1KCl，2m mol · L-1Mg2Cl^SOymol · L-1 的各種dNTP，每種引物25pmol，200-500ng的DNA，以及IU的Taq聚合酶，擴(kuò)增條件是 940C /IOmin預(yù)變性后，94°C /40s變性，72°C退火和延伸2min，共30個(gè)循環(huán)；72°C后延伸 IOmin0 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳，DNA回收試劑盒回收1800bp左右的DNA片段，PCR產(chǎn)物進(jìn)行日本TAKARA公司的pMDIS-T載體克隆，酶切鑒定后，對(duì)重組子中插入基因進(jìn)行核苷酸全序列測(cè)定。結(jié)果表明，該片段與Genebank號(hào)為AM95364的核苷酸序列相同，為擬南芥 HemAl基因啟動(dòng)子(AtHemAlP)的序列。2、釀酒酵母ALA合酶編碼基因(^feml)的獲得根據(jù)Genbank中登錄的釀酒酵母Heml基因的核苷酸序列(Genebank No AF295364, YSCHEM1AA)，鑒于Heml基因內(nèi)部沒有內(nèi)含子，以抽提的釀酒酵母的總DNA為模板，以引物(YHemlZl 5‘-AGGATCCATGCAACGCTCCATTTTTGCGAGGTTC-3‘)和(YHemlFl 5'-AAG AGCTCTTACTGCTTGATACCACTAGAAACCTC-3，)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。為了便于產(chǎn)物的克隆，分別在啟動(dòng)子的5 ’和3 ’端加了 BamHI和McI限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)。擴(kuò)增體系為50 μ 1，含10 X PCR buffer 5 μ L，10 X dNTP (2. 5mmol 'L^each) 5· O μ L，引物 YHemlZl 和 YHemlFl (IOOpmol .171) 各 0. 5 μ L，DNA 1 μ L，Taq 聚合酶(1U · μ Γ1) 2 μ L，DNA 模板 5 μ L，加雙蒸水至 50 μ L。擴(kuò)增條件是94°C /IOmin預(yù)變性后，94°C /40s變性，72°C退火和延伸2min，共30個(gè)循環(huán)；72°C 后延伸lOmin。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1. 0% Agrose電泳，DNA回收試劑盒回收1647bp左右的DNA 片段，PCR產(chǎn)物進(jìn)行日本TAKARA公司的pMD18_T載體克隆，酶切鑒定后，對(duì)重組子中的插入基因進(jìn)行核苷酸全序列測(cè)定。結(jié)果表明，該片段與Genebank中YSCHEM1AA的核苷酸序列相同，證明確為釀酒酵母Heml基因的全長(zhǎng)核苷酸序列。3、釀酒酵母Heml基因的植物雙元載體pYF8631構(gòu)建如圖1所示，將測(cè)序正確的pMD18-T載體上的Heml基因經(jīng)BamHI和&icl雙酶切后，插入植物雙元載體 pYPXVhb(Li 等，Plant Cell Reports, 2005, 23 :710-715)，替換原先載體上的Vtib基因，構(gòu)成載體pYF8630，隨后再將經(jīng)Hindi11和BamHI雙酶切的擬南芥HemAl 基因啟動(dòng)子AtHemAlP插入pYF8630載體的相應(yīng)酶切點(diǎn)間。經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序后得到正確的雙元載體PYF8631。4、釀酒酵母Heml基因的植物雙元載體pI3840構(gòu)建如圖1所示，將測(cè)序正確的Heml基因經(jīng)BamHI和&icl雙酶切后，回收1647bp 的DNA片段，與相應(yīng)酶切的pYF7716載體(郭兆奎等，西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)2008，36 58-64)相連，隨后再將經(jīng)HindIII和BamHI雙酶切的擬南芥HemAl基因啟動(dòng)子AtHemAlP插入上述載體的相應(yīng)酶切點(diǎn)間。經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序后得到正確的雙元載體 PYK3840。二、轉(zhuǎn)光敏型啟動(dòng)子AtHemAlP和^feml植物的獲得1、光敏型啟動(dòng)子AtHemAlP控制的過(guò)量合成YHeml煙草、番茄和油菜的獲得將 pYF8631 載體通過(guò)根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404 的介導(dǎo)轉(zhuǎn)入煙草、番茄和油菜中。具體方法如下所述
(1)煙草無(wú)菌苗的制備煙草品種‘K326，種子(美國(guó)Northup King Seed Company 生產(chǎn))用70%乙醇浸泡lmin，然后用5%的漂白粉(加兩滴Tween-20)消毒15分鐘，其間不斷搖動(dòng)，然后用無(wú)菌水洗3遍，接種在MS培養(yǎng)基上。置于培養(yǎng)室中發(fā)芽(溫度22士2°C， 光照強(qiáng)度為150μπιΟ1 !^ 8_1，光/暗周期16h/ !)。待種子發(fā)芽后，培養(yǎng)30天后，用于轉(zhuǎn)化。(2)番茄無(wú)菌苗的制備挑選飽滿的番茄品種‘合作903’種子(浙江勿忘農(nóng)集團(tuán)生產(chǎn))用流動(dòng)的自來(lái)水浸泡1 后，用70%乙醇浸泡Imin和20%次氯酸鈉(加兩滴 Tween-20)消毒20分鐘，無(wú)菌水沖洗3_5次，并用無(wú)菌吸水紙略微吸干后，按30粒/瓶播種于MS培養(yǎng)基上。常溫暗培養(yǎng)出芽后，在溫度(25士 1)°C，光照強(qiáng)度36μπι01 ·πΓ2 · s、光周期16h/ !條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)一周后，用于轉(zhuǎn)化。(3)油菜無(wú)菌苗的制備挑選飽滿的油菜品種‘滬油-15’種子(浙江勿忘農(nóng)集團(tuán)生產(chǎn))用70%乙醇浸泡Imin和25%次氯酸鈉(加兩滴Tween-20)消毒10分鐘，無(wú)菌水沖洗3-5次，并用無(wú)菌吸水紙略微吸干后，按30粒/皿播于MS培養(yǎng)基上。常溫暗培養(yǎng)出芽后， 在溫度(25 士 1)°C，光照強(qiáng)度βθμπιο ·!!!-2·^，光周期16h/ !條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)一周后，用于轉(zhuǎn)化。(4)農(nóng)桿菌菌株培養(yǎng)將PYF8631載體通過(guò)電擊方法導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌菌株 LBA4404(徐增富和李寶健，生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1996，23 =286-287)，構(gòu)成新的農(nóng)桿菌工程菌AG200。-70°C保存的菌種AG200在含利福平Rf 50mg/L+Cm 10mg/L的YEB固體培養(yǎng)基上劃線，于27°C下培養(yǎng)2 3d后，挑取直徑為Imm左右的1個(gè)單菌落接種于50ml 含利福平Rf 50mg/L+Cml0mg/L的YEB培養(yǎng)液中，27°C、200rpm下震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。在27°C、 5000rpm離心8min收集菌體，棄上清夜后用MS液體培養(yǎng)液洗滌菌體兩次，備用。(5)農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化分別取煙草無(wú)菌葉片、番茄和油菜無(wú)菌子葉作為轉(zhuǎn)化的外植體，置于上述農(nóng)桿菌工程菌AG200菌液中，侵染8-lOmin。取出外植體用無(wú)菌濾紙吸干，再轉(zhuǎn)入覆有一層無(wú)菌濾紙的共培養(yǎng)基(MS+0. Img L^NAA+lmg Ll-BA)上暗培養(yǎng)48h_72h，培養(yǎng)溫度為22-25°C。將外植體轉(zhuǎn)接到篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每20d更換新的培養(yǎng)基，直至經(jīng)第二次篩選培養(yǎng)后分化出抗性芽。形成的抗性芽經(jīng)過(guò)GUS染色檢測(cè)，將GUS陽(yáng)性芽切下，插入生根培養(yǎng)基中。生根完成后，置于自然光溫下練苗3-5d，再連同對(duì)照移栽到試驗(yàn)田中。共得到轉(zhuǎn)基因煙草36株Ttl代植株，轉(zhuǎn)基因番茄17株Ttl代植株，轉(zhuǎn)基因油菜13株Ttl代植株。 Ttl代植株自花授粉，單株拷種。將Ttl代種子經(jīng)過(guò)Km抗性篩選，抗性苗經(jīng)過(guò)GUS染色，PCR, Southern雜交，RT-PCT檢測(cè)，選出陽(yáng)性植株(T1)培養(yǎng)至開花結(jié)實(shí)，收集T1植株上所結(jié)種子， 依Ttl種子篩選方法繼續(xù)進(jìn)行T1代種子篩選、種植和獲得T2代種子，最終得到獨(dú)立的純合的轉(zhuǎn)基因煙草，番茄，油菜種子。煙草轉(zhuǎn)化與篩選培養(yǎng)基共培養(yǎng)基MS+!3mgLl-BA第一次選擇培養(yǎng)基:MS+3mgL_16-BA+50mg L^1Km+IOOmg L-1Cb第二次選擇培養(yǎng)基:MS+3mgL_16-BA+IOOmg L^1Km+IOOmg L-1Cb生根培養(yǎng)基l/2MS+0.5mg Γ1 NAA番茄轉(zhuǎn)化與篩選培養(yǎng)基共培養(yǎng)基MS+0.Img L-1 NAA+Img L_16-BA
第一次選擇培養(yǎng)基:MS+0.5mg L_1ZT+0. 5mg L_1IAA+200mg r1Km+400mg L-1Cb第二次選擇培養(yǎng)基:MS+0.5mg L_1ZT+0. 5mg L_1IAA+400mg r1Km+200mg L-1Cb生根培養(yǎng)基1/2MS+IAA0.Img Γ1油菜轉(zhuǎn)化與篩選培養(yǎng)基共培養(yǎng)基MS+0.Img L^1NAA+Img L_16-BA+5mg L-1AgNO3第一次選擇培養(yǎng)基:MS+0.Img L_1NAA+3mg L^e-BA+lOmg r1Km+400mg L-1Cb+5mg L-1AgNO3第二次選擇培養(yǎng)基:MS+0.Img L_1NAA+3mg L_16-BA+20mg r1Km+200mg L-1Cb+5mg L-1AgNO3生根培養(yǎng)基1/2MS+IAA0.Img Γ1以上MS培養(yǎng)基均加瓊脂6. 5g/L，蔗糖30g/L，并用IN NaOH調(diào)節(jié)pH至5. 8。2、光敏型啟動(dòng)子AtHemAlP控制的過(guò)量合成Wfeml擬南芥的獲得將pYK3840 載體通過(guò)根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens) GV3101 (馬立安和張忠明，長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版)農(nóng)學(xué)卷2007,4 ) :41-44)介導(dǎo)的蘸花法轉(zhuǎn)入擬南芥中。具體方法如下所述擬南芥的培養(yǎng)擬南芥‘Columbia’型種子(美國(guó)俄亥俄州立大學(xué)的生物資源中心 ABRC生產(chǎn))用70%乙醇浸泡lmin，然后用5%的漂白粉(加兩滴Tween-20)消毒20分鐘。 其間，不斷搖動(dòng)，然后用無(wú)菌水洗3編，接種在MS培養(yǎng)基上，置于4°C冰箱，進(jìn)行2-3天的春化處理，然后至于培養(yǎng)室中，培養(yǎng)兩周。將蛭石、黑土、珍珠巖按18 6 1的比例拌勻，裝于IOcm的塑料小盆，以營(yíng)養(yǎng)液PNS浸濕待用。用鑷子將擬南芥幼苗按4 X 3cm移栽于濕潤(rùn)的基質(zhì)上，保鮮膜封口，培養(yǎng)2-3天，揭去保鮮膜，繼續(xù)培養(yǎng)至抽薹開花，中途可視情況適當(dāng)澆PNS營(yíng)養(yǎng)液。首次抽苔后需剪去初生苔，利于次生苔的生長(zhǎng)，當(dāng)次生苔長(zhǎng)至2-lOcm(少數(shù)已經(jīng)開花)可用于遺傳轉(zhuǎn)化。培養(yǎng)條件為溫度22 士 2°C，光照強(qiáng)度為150μπιΟ1 ·πΓ2 · s"1, 光/暗周期16h/8h0農(nóng)桿菌的準(zhǔn)備-70°C保存的轉(zhuǎn)入pI3840載體菌種工程菌株GV3101在含利福平 Rf50mg/L+Km 50mg/L的YEB固體培養(yǎng)基上劃線，于27°C下培養(yǎng)2 3d后，挑取直徑為Imm 左右的1個(gè)單菌落接種于50ml含利福平Rf 50mg/L+Km 50mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，27 °C、 200rpm下震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。8000rpm，4°C，IOmin離心收集菌體，重懸于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化滲透液 (5%蔗糖，0. 05% Silwet L-77)，備用。擬南芥蘸花法轉(zhuǎn)化將擬南芥的花序浸入滲透液中，輕輕攪動(dòng)約3 5秒后取出，全部轉(zhuǎn)化完畢后，托盤中加入PNS營(yíng)養(yǎng)液，以黑色塑料袋套盆封口，保持濕潤(rùn)環(huán)境，置于 22°C培養(yǎng)室低光強(qiáng)度下生長(zhǎng)M小時(shí)，即可正常培養(yǎng)。初次轉(zhuǎn)化四天后，可再進(jìn)行一次轉(zhuǎn)化， 重復(fù)兩次。生長(zhǎng)約兩個(gè)月后，收集種子，4°C冰箱貯存待用。共得到轉(zhuǎn)基因擬南芥30株Ttl代植株，自花授粉得到Ttl代的種子。將Ttl代種子經(jīng)過(guò)潮霉素抗性篩選，將抗性植株移栽到盆中培養(yǎng)，苗稍大后，進(jìn)行GUS活性檢測(cè)，PCR，RT-PCR檢測(cè)，選出陽(yáng)性植株(Ttl)培養(yǎng)至開花結(jié)實(shí)，收集Ttl植株上所結(jié)T1種子，依Ttl種子篩選方法繼續(xù)進(jìn)行T1代種子篩選、種植和獲得T2 代種子。3、光敏型啟動(dòng)子AtHemAlP控制的過(guò)量合成Wfeml水稻的獲得將 pYK3840 載體通過(guò)根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens) EH105 (曹自力等，遺傳學(xué)報(bào)，2001J8 :352-358)的介導(dǎo)的愈傷組織法轉(zhuǎn)入水稻中。具體方法如下所述水稻愈傷組織的培養(yǎng)取水稻品種‘中花11’(上海市種子公司生產(chǎn))12-15天的未成熟種子，直接用75%的酒精浸泡Imin進(jìn)行表面消毒，然后用5% NaClO溶液(加1_3 滴Tween 20)浸泡60min以上(最長(zhǎng)可至2h)，并不時(shí)搖動(dòng)，然后用無(wú)菌水沖洗4_5次。在超靜工作臺(tái)上用解剖刀和鑷子從滅菌后的未成熟種子中挑出未成熟胚，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織。培養(yǎng)4-5天后，取培養(yǎng)4-5d的未成熟胚來(lái)源的初生愈傷組織立即浸入準(zhǔn)備好的農(nóng)桿菌懸浮液中，侵染30min后，然后將愈傷組織在無(wú)菌濾紙上吸除多余的菌液，直接轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基于23°C黑暗條件下培養(yǎng)3-4d。將共培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)出，無(wú)菌水漂洗 3-4次，然后用無(wú)菌濾紙吸干多余水分，將愈傷組織轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基上，28°C暗培養(yǎng)，兩周繼代一次。經(jīng)2-3代篩選后，選擇生長(zhǎng)旺盛的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到預(yù)分化培養(yǎng)基上進(jìn)行預(yù)分化處理；暗培養(yǎng)5-7天后再將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基每天1 光照、他黑暗、28°C 條件下進(jìn)行分化，再生的小苗剪去原有的根，在生根培養(yǎng)基(Rooting medium)上生根壯苗， 隨后移入人工氣候室盆栽，最初幾天保持濕度。轉(zhuǎn)基因水稻的栽培管理按照常規(guī)方法進(jìn)行。 共得到轉(zhuǎn)基因水稻7株Ttl代植株，自花授粉得到Ttl代的種子。將Ttl代種子經(jīng)過(guò)潮霉素抗性篩選，將抗性植株移栽到盆中培養(yǎng)，苗稍大后，進(jìn)行GUS活性檢測(cè)，PCR，RT-PCR檢測(cè)，選出陽(yáng)性植株(Ttl)培養(yǎng)至開花結(jié)實(shí)，收集Ttl植株上所結(jié)T1種子，依Ttl種子篩選方法繼續(xù)進(jìn)行T1 代種子篩選、種植和獲得T2代種子。三、轉(zhuǎn)光敏型啟動(dòng)子AtHemAlP和^feml植物的功能鑒定實(shí)例1、光敏型啟動(dòng)子AtHemAlP控制^feml基因煙草的功能鑒定1、轉(zhuǎn)基因煙草YHeml基因表達(dá)隨著光照時(shí)間的變化圖為了檢測(cè)光敏型啟動(dòng)子AtHemAlP控制^feml基因在光照下表達(dá)情況，對(duì)轉(zhuǎn)YF8631 的T3代煙草植株，隨著光照時(shí)間變化，YHeml基因表達(dá)情況進(jìn)行半定量和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)。結(jié)果如圖2所示，無(wú)論是用半定量PCR檢測(cè)還是實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，轉(zhuǎn)基因煙草有黑暗條件轉(zhuǎn)入光照條件下，YHeml基因的表達(dá)量迅速增加，光照證后達(dá)到最大值，隨后逐漸下降，當(dāng)轉(zhuǎn)基因煙草轉(zhuǎn)入黑暗下2. 5h，YHeml基因的的表現(xiàn)出很低的轉(zhuǎn)錄水平，表明 YHeml基因在煙草中的表達(dá)受到光敏型啟動(dòng)子AtHemAlP控制。2、轉(zhuǎn)基因煙草ALA合酶活性和ALA含量測(cè)定ALA 合酶活性和 ALA 含量測(cè)定用 Zavgorodnyaya 等(Plant J, 1997，12 :169-178) 方法，ALA合酶活性以每小時(shí)每毫克蛋白質(zhì)催化生成Inmol的ALA(nmol mg—1 -h"1)為單位。表1轉(zhuǎn)基因煙草ALA-S活性和ALA含量測(cè)定
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權(quán)利要求
1.一種控制植物體內(nèi)ALA合成，促進(jìn)生長(zhǎng)并提高抗逆性的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于，將擬南芥HemAl基因光敏型啟動(dòng)子AtHemAlP和釀酒酵母ALA合酶基因Wfeml重組，通過(guò)植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入植物中，獲得到光合能力明顯提高，生長(zhǎng)發(fā)育受到促進(jìn)，并且延緩衰老，單株產(chǎn)量也比野生型植株明顯提高，同時(shí)抗逆性也得到提高的轉(zhuǎn)基因植物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中AtHemAlP核苷酸序列是Genebank中AM95364的全長(zhǎng)序列；YHeml基因的編碼序列是Genebank中YSCHEM1AA全長(zhǎng)序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中AtHemAlP和YHeml基因是通過(guò)植物表達(dá)載體 PYF8631或ρ (3840導(dǎo)入植物中的，其中釀酒酵母Heml基因的植物雙元載體PYF8631構(gòu)建為將測(cè)序正確的PMD18-T載體上的Heml基因經(jīng)BamHI和McI雙酶切后，插入植物雙元載體pYPXVhb，替換原先載體上的Vhb基因，構(gòu)成載體pYF8630，隨后再將經(jīng)HindIII和BamHI 雙酶切的擬南芥HemAl基因啟動(dòng)子AtHemAlP插入pYF8630載體的相應(yīng)酶切點(diǎn)間，經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序后得到正確的雙元載體PYF8631 ；釀酒酵母Heml基因的植物雙元載體pI3840構(gòu)建為將測(cè)序正確的Heml基因經(jīng)BamHI和McI雙酶切后，回收1647bp的DNA片段，與相應(yīng)酶切的PYF7716載體相連，隨后再將經(jīng)HindIII和BamHI雙酶切的擬南芥HemAl基因啟動(dòng)子AtHemAlP插入上述載體的相應(yīng)酶切點(diǎn)間，經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序后得到正確的雙元載體 PYK3840。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，所述的促進(jìn)植物生長(zhǎng)包括煙草、擬南芥、番茄、油菜、水稻、西瓜、草莓、蘋果和梨。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法所述的提高抗逆性包括耐鹽性，抗寒性，耐高溫性， 耐弱光性和耐強(qiáng)光性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種控制植物體內(nèi)ALA生物合成、促進(jìn)生長(zhǎng)并提高植物抗逆性的轉(zhuǎn)基因方法，屬于基因工程領(lǐng)域。是將擬南芥HemA1基因光敏型啟動(dòng)子和釀酒酵母菌5-氨基乙酰丙酸(ALA)合酶基因(YHem1)通過(guò)植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入植物中。本發(fā)明通過(guò)提高光照下植物內(nèi)源ALA合成量，促進(jìn)葉綠素、亞鐵血紅素合成，避免黑暗中ALA以及其它卟啉中間物積累，從而避免植物光漂白現(xiàn)象，并且提高了植物對(duì)低溫、高溫、高光、弱光以及鹽脅迫耐受力。因而，不僅不影響轉(zhuǎn)基因植物的正常發(fā)育，而且提高了植物生物產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)學(xué)產(chǎn)量增加?？梢赃\(yùn)用于擬南芥、煙草、番茄、油菜、水稻、西瓜、草莓等草本植物，也可以運(yùn)用于蘋果、梨等木本植物。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102168106SQ201010596008
公開日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2010年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月20日
發(fā)明者姚泉洪, 張治平, 汪良駒 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)