一種抗弓形蟲(chóng)單克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種抗弓形蟲(chóng)單克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用，屬于生物制品領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)人胚肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)弓形蟲(chóng)，對(duì)收獲的弓形蟲(chóng)純化后反復(fù)凍融，免疫小鼠，取脾與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，篩選得到一株穩(wěn)定分泌弓形蟲(chóng)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其保藏編號(hào)為CGMCC No.9559，其分泌的單克隆抗體效價(jià)高，特異性好，可用于弓形蟲(chóng)的檢測(cè)，也可用于制備檢測(cè)弓形蟲(chóng)的試劑盒或診斷試劑，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確率高，在弓形蟲(chóng)診斷領(lǐng)域具有較好應(yīng)用前景。CGMCC No955920140812
【專利說(shuō)明】一種抗弓形蟲(chóng)單克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物制品領(lǐng)域與疫苗學(xué)領(lǐng)域，具體地，涉及一種抗抗弓形蟲(chóng)的單克隆 抗體及產(chǎn)生該抗體的雜交瘤細(xì)胞株和應(yīng)用，以及制備該單克隆抗體的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 弓形蟲(chóng)又名剛地弓形蟲(chóng)，呈全球分布，在人和多種動(dòng)物中都能造成廣泛的流行，給 人畜均造成嚴(yán)重的危害。弓形蟲(chóng)人群的感染率各地不同，許多國(guó)家和地區(qū)感染率為25%? 50%，高者達(dá)80%以上，推算全球平均感染率在25%左右，占世界人口的四分之一。我國(guó)人 群弓形蟲(chóng)感染率為4%?9%，被列為"TORCH綜合征"的首要病原體，可經(jīng)胎盤(pán)垂直傳播造 成流產(chǎn)，胎兒畸形，死胎等嚴(yán)重后果。
[0003]目前弓形蟲(chóng)的診斷檢測(cè)方法很多，病原學(xué)方法是最準(zhǔn)確的確診手段，但是此方法 靈敏度較低，易漏檢。分子生物學(xué)診斷方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件和操作人員技術(shù)要求較高，不適于 廣泛應(yīng)用。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)具有簡(jiǎn)單、快速、結(jié)果明確、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，已成為臨 床及檢疫診斷領(lǐng)域發(fā)展的一個(gè)方向。因此，為了提高檢測(cè)弓形蟲(chóng)的敏感性和特異性，建立一 種快速、簡(jiǎn)易和特異性好的診斷方法是十分必要的，而制備出高親和力的單克隆抗體是其 前提。
[0004] 在已報(bào)道的弓形蟲(chóng)單克隆抗體制備方法中，根據(jù)免疫小鼠的抗原和抗原的來(lái)源不 同，有3種方法。一是通過(guò)表達(dá)弓形蟲(chóng)的某一個(gè)蛋白（?30、5461、5八62、6狀3等）用做免疫 小鼠的抗原來(lái)制備單抗，該方法制備的單抗抗體效價(jià)要低于用弓形蟲(chóng)做抗原制備的單抗。 二是從淋巴細(xì)胞分離液中分離純化弓形蟲(chóng)，破碎弓形蟲(chóng)用于免疫小鼠制備單克隆抗體。三 是將弓形蟲(chóng)注射到小鼠腹腔，從抽取的腹水中分離純化速殖子，破碎速殖子用于免疫小鼠 制備單克隆抗體。第二種方法不適于弓形蟲(chóng)的大批量擴(kuò)繁。第三種方法在弓形蟲(chóng)大批量制 備過(guò)程中存在成本高，耗時(shí)長(zhǎng)，得到的弓形蟲(chóng)數(shù)量不足等缺點(diǎn)。因此，第二種方法和第三種 方法不易獲取大量的速殖子用于制備弓形蟲(chóng)的單克隆抗體。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種抗弓形蟲(chóng)單克隆抗體的制備方法。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供利用上述方法獲得的能夠穩(wěn)定分泌高效抗弓形蟲(chóng)單 克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
[0007] 本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供一種生物活性高、特異性高的抗弓形蟲(chóng)單克隆抗 體，用于檢測(cè)弓形蟲(chóng)。
[0008] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明首先提供一種制備抗弓形蟲(chóng)單克隆抗體的方法，是采 用人胚肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)弓形蟲(chóng)，收獲的弓形蟲(chóng)純化后再免疫小鼠，取脾與骨髓瘤細(xì)胞 SP2/0融合，篩選雜交瘤細(xì)胞株制備腹水，得到抗弓形蟲(chóng)單克隆抗體。
[0009] 本發(fā)明方法中，使用的人胚肺成纖維細(xì)胞是已經(jīng)商品化應(yīng)用的保藏編號(hào)為 CGMCC. 4875的人胚肺成纖維細(xì)胞。
[0010] 具體地，本發(fā)明方法用含8%?10%新生牛血清的MEM培養(yǎng)人胚肺成纖維細(xì)胞， 待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后棄掉原培養(yǎng)基，換成含1 %?3 %新生牛血清MEM，然后接種弓形蟲(chóng)，接種 M0I為0. 1?0. 5,5?9天后，待細(xì)胞CPE達(dá)到80%以上時(shí)收獲弓形蟲(chóng)。優(yōu)選7天后收獲 弓形蟲(chóng)。
[0011] 在本發(fā)明的制備抗弓形蟲(chóng)單克隆抗體的方法中，收獲的弓形蟲(chóng)在純化前還需滅 活。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中了，滅活方法是經(jīng)56°C水浴滅活30min。
[0012] 對(duì)收獲并滅活后的弓形蟲(chóng)通過(guò)蔗糖梯度離心進(jìn)行純化。
[0013] 具體的純化方法為：將收獲的弓形蟲(chóng)滅活后靜置，去除細(xì)胞及細(xì)胞團(tuán)；蔗糖密度 梯度離心：先添加待離心的弓形蟲(chóng)樣品，再加入低糖，再加入高糖，低糖和高糖按體積比 1:1添加，其中低糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%?20%，高糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%?55%，10000g? 20000g離心 30min?60min。
[0014] 純化后的弓形蟲(chóng)蟲(chóng)體反復(fù)凍融5-10次后，與弗氏完全佐劑等體積混合乳化，免疫 注射小鼠。
[0015] 優(yōu)選地，反復(fù)凍融7次。
[0016] 本發(fā)明方法中，純化后的弓形蟲(chóng)共免疫小鼠4次。免疫后檢測(cè)抗體效價(jià)，若抗體效 價(jià)不低于1 :1〇〇〇〇,采用純化后的弓形蟲(chóng)腹腔沖擊小鼠，采用小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0與小鼠 脾細(xì)胞融合技術(shù)篩選分泌抗弓形蟲(chóng)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
[0017] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，免疫小鼠的方法是將凍融后的蛋白用〇.〇lmol/L的 PBS稀釋至終濃度為500yg/mL，使其與弗氏完全佐劑各取lmL混合乳化；乳化后于BALB/c 小鼠的背部皮下4點(diǎn)免疫注射，0. 2mL/只；首次免疫后的第14天、28天用500yg/mL的弓形 蟲(chóng)和弗氏不完全佐劑各取lmL混合乳化，于BALB/c小鼠的背部皮下4點(diǎn)免注射，0. 2mL/只； 首次免疫后35天眼框采血，分離血清，ELISA檢測(cè)血清中的抗體效價(jià)，如果抗體效價(jià)不低于 1 :10000,則進(jìn)行腹腔沖擊，將500iig/mL的弓形蟲(chóng)注射到BALB/c小鼠腹腔，0.lmL/只。
[0018] 本發(fā)明通過(guò)上述方法與采用小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0與小鼠脾細(xì)胞融合技術(shù)篩選 得到分泌抗弓形蟲(chóng)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，于2014年8月12日在中國(guó)微生物菌種保 藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏（地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院 微生物研究所，簡(jiǎn)稱CGMCC，郵編100101)，分類命名為弓形蟲(chóng)單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，其 保藏編號(hào)為CGMCCNo. 9559。
[0019] 本發(fā)明提供了保藏編號(hào)為CGMCCNo. 9559的雜交瘤細(xì)胞株在制備預(yù)防或治療弓形 蟲(chóng)藥物中的應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明還提供了由上述雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn)生的單克隆抗體。
[0021] 本發(fā)明提供了保藏編號(hào)為CGMCCNo. 9559的雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體在制 備檢測(cè)弓形蟲(chóng)試劑盒中的應(yīng)用。
[0022] 本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)弓形蟲(chóng)的試劑盒，含有本發(fā)明的單克隆抗體。
[0023] 含有本發(fā)明單克隆抗體的用于檢測(cè)弓形蟲(chóng)抗體的試劑盒或檢測(cè)試劑也屬于本發(fā) 明的保護(hù)范圍。
[0024] 本發(fā)明還提供了一種非疾病診斷目的的檢測(cè)弓形蟲(chóng)的方法，是采用保藏編號(hào)為 CGMCCNo. 9559的雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)的。
[0025] 本發(fā)明提供的一種制備弓形蟲(chóng)單克隆抗體的方法，通過(guò)人胚肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)弓 形蟲(chóng)，對(duì)收獲的弓形蟲(chóng)通過(guò)蔗糖梯度離心進(jìn)行純化，純化后的弓形蟲(chóng)經(jīng)反復(fù)凍融后，按弓形 蟲(chóng)蛋白50yg/只免疫小鼠3次，50yg/只加強(qiáng)免疫一次，取脾與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，篩 選合適的雜交瘤細(xì)胞株，用篩選的雜交瘤細(xì)胞制備腹水，獲得弓形蟲(chóng)的單克隆抗體。該方法 同已有的弓形蟲(chóng)單克隆抗體制備方法相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)：一是通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)解決了弓形 蟲(chóng)大量培養(yǎng)的問(wèn)題；二是通過(guò)蔗糖梯度離心獲得純度在90%以上的弓形蟲(chóng)；三是人胚肺成 纖維細(xì)胞培養(yǎng)的弓形蟲(chóng)免疫原性要高于表達(dá)的弓形蟲(chóng)的某一個(gè)蛋白，容易篩選到合適的雜 交瘤細(xì)胞株。本發(fā)明方法篩選得到一株穩(wěn)定分泌弓形蟲(chóng)單克隆合適的雜交瘤細(xì)胞株，其保 藏編號(hào)為CGMCCNo. 9559,其分泌的單克隆抗體效價(jià)高，特異性好，可用于弓形蟲(chóng)的檢測(cè)，也 可用于制備檢測(cè)弓形蟲(chóng)的試劑盒或診斷試劑，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確率高，在弓形蟲(chóng)診斷領(lǐng)域具有 較好應(yīng)用前景

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1為接種弓形蟲(chóng)120h的人胚肺成纖維細(xì)胞（100X)
[0027] 圖2為SDS-PAGE鑒定實(shí)施例5的已純化的單抗。

【具體實(shí)施方式】
[0028] 以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離 本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明 的范圍。
[0029] 本發(fā)明實(shí)施例中使用的人胚肺成纖維細(xì)胞保藏編號(hào)為CGMCCNo. 4875。BALB/c小 鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為 本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段；實(shí)施例中所用的試劑為市售商品。
[0030] 實(shí)施例1免疫原制備與動(dòng)物免疫（1)
[0031] 1、用人胚肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)弓形蟲(chóng)（見(jiàn)圖1)，并對(duì)收獲的弓形蟲(chóng)進(jìn)行濃縮純化。
[0032] 弓形蟲(chóng)培養(yǎng)：用含8%新生牛血清的MEM培養(yǎng)人胚肺成纖維細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層 后，棄掉原培養(yǎng)基，加入含1%新生牛血清MEM，接種弓形蟲(chóng)，接種M0I為0. 1，7天后收獲弓 形蟲(chóng)。收獲的弓形蟲(chóng)經(jīng)56°C水浴滅活30min。
[0033] 弓形蟲(chóng)純化：靜置45min，自然沉降去除細(xì)胞及細(xì)胞團(tuán)；蔗糖密度梯度離心法去除 細(xì)胞碎片：蔗糖密度梯度離心：先添加700ml弓形蟲(chóng)樣品，再加入低糖溶液500ml，再加入高 糖溶液500ml，其中低糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，高糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55%，20000g離心30min取 樣鏡檢純化結(jié)果。在顯微鏡下觀察（200X)到大量的弓形蟲(chóng)，沒(méi)有雜質(zhì)，純度達(dá)到90%以 上。
[0034] 2、純化好的弓形蟲(chóng)蟲(chóng)體反復(fù)凍融7次后，將凍融后蛋白為500iig/mL的弓形蟲(chóng)與 弗氏完全佐劑各取lmL混合乳化；乳化后于BALB/c小鼠的背部皮下4點(diǎn)免疫注射，0. 2mL/ 只。
[0035] 加強(qiáng)免疫；首次免疫后的第14天、28天用500yg/mL的弓形蟲(chóng)和弗氏不完全佐劑 各取lmL混合乳化，于BALB/c小鼠的背部皮下4點(diǎn)免注射，0. 2mL/只。首次免疫后35天睛 框采血，分離血清，ELISA檢測(cè)血清中的抗體效價(jià)。抗體效價(jià)為1 :32768,不低于1 :10000。
[0036] 實(shí)施例2免疫原制備與動(dòng)物免疫（2)
[0037] 1、用人胚肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)弓形蟲(chóng)，并對(duì)收獲的弓形蟲(chóng)進(jìn)行濃縮純化。
[0038] 弓形蟲(chóng)培養(yǎng)：用含9%新生牛血清的MEM培養(yǎng)人胚肺成纖維細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層 后棄掉原培養(yǎng)基，加入含2%新生牛血清MEM，接種弓形蟲(chóng)，接種M0I為0. 5, 5天后收獲弓形 蟲(chóng)。收獲的弓形蟲(chóng)經(jīng)56°C水浴滅活30min。
[0039] 弓形蟲(chóng)純化：靜置30min，自然沉降去除細(xì)胞及細(xì)胞團(tuán)；蔗糖密度梯度離心法去除 細(xì)胞碎片：蔗糖密度梯度離心：先添加700ml弓形蟲(chóng)樣品，再加入低糖溶液500ml，再加入高 糖溶液500ml，其中低糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%，高糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%，10000g離心60min取 樣鏡檢純化結(jié)果。在顯微鏡下觀察（200X)到大量的弓形蟲(chóng)，沒(méi)有雜質(zhì)，純度達(dá)到90%以 上。
[0040] 2、純化好的弓形蟲(chóng)蟲(chóng)體反復(fù)凍融10次后，將凍融后蛋白為500i!g/mL的弓形蟲(chóng)與 弗氏完全佐劑各取lmL混合乳化；乳化后于BALB/c小鼠的背部皮下4點(diǎn)免疫注射，0. 2mL/ 只。
[0041] 加強(qiáng)免疫；首次免疫后的第14天、28天用500yg/mL的弓形蟲(chóng)和弗氏不完全佐劑 各取lmL混合乳化，于BALB/c小鼠的背部皮下4點(diǎn)免注射，0. 2mL/只。首次免疫后35天睛 框采血，分離血清，ELISA檢測(cè)血清中的抗體效價(jià)?？贵w效價(jià)為1:16384,不低于1 :10000。
[0042] 實(shí)施例3免疫原制備與動(dòng)物免疫（3)
[0043] 1、用人胚肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)弓形蟲(chóng)，并對(duì)收獲的弓形蟲(chóng)進(jìn)行濃縮純化。
[0044] 弓形蟲(chóng)培養(yǎng)：用含10%新生牛血清的培養(yǎng)人胚肺成纖維細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)成單 層后棄掉原培養(yǎng)基，加入含2 %新生牛血清MEM，接種弓形蟲(chóng)，接種M0I為0. 1，6天后收獲弓 形蟲(chóng)。收獲的弓形蟲(chóng)經(jīng)56°C水浴滅活30min。
[0045] 弓形蟲(chóng)純化：靜置60min，自然沉降去除細(xì)胞及細(xì)胞團(tuán)；蔗糖密度梯度離心法去除 細(xì)胞碎片：蔗糖密度梯度離心：先添加700ml弓形蟲(chóng)樣品，再加入低糖溶液500ml，再加入高 糖溶液500ml，其中低糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%，高糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為53%，15000g離心45min取 樣鏡檢純化結(jié)果。在顯微鏡下觀察（200X)到大量的弓形蟲(chóng)，沒(méi)有雜質(zhì)，純度達(dá)到90%以 上。
[0046] 2、純化好的弓形蟲(chóng)蟲(chóng)體反復(fù)凍融5次后，將凍融后蛋白為500iig/mL的弓形蟲(chóng)與 弗氏完全佐劑各取lmL混合乳化；乳化后于BALB/c小鼠的背部皮下4點(diǎn)免疫注射，0. 2mL/ 只。
[0047] 加強(qiáng)免疫；首次免疫后的第14天、28天用500yg/mL的弓形蟲(chóng)和弗氏不完全佐劑 各取lmL混合乳化，于BALB/c小鼠的背部皮下4點(diǎn)免注射，0. 2mL/只。首次免疫后35天睛 框采血，分離血清，ELISA檢測(cè)血清中的抗體效價(jià)?？贵w效價(jià)為1:16384,不低于1 :10000。
[0048] 實(shí)施例4細(xì)胞融合與建株
[0049] 實(shí)施例1-3方法得到的免疫原的抗體效價(jià)均符合制備腹水的要求。本實(shí)施例采用 實(shí)施例1方法制得的弓形蟲(chóng)對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔沖擊，500yg/mL的弓形蟲(chóng)注射到BALB/c小鼠 腹腔，0.lmL/只。
[0050] (1)骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備：細(xì)胞融合前兩周復(fù)蘇培養(yǎng)SP2/0細(xì)胞株，融合前3天擴(kuò)大 培養(yǎng)，融合前1天將細(xì)胞培養(yǎng)液去除，重新添加培養(yǎng)液。
[0051] (2)脾細(xì)胞制備：處死進(jìn)行動(dòng)物免疫的小鼠，按照常規(guī)方法制備小鼠脾細(xì)胞懸液。
[0052] (3)根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0分別加入適量無(wú)血清1640培養(yǎng) 液，SP2/0細(xì)胞晃動(dòng)混勻，脾細(xì)胞吹打均勻。
[0053] (4)將脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞按2:1?5:1(本實(shí)施例為2:1)的比例混合于一支 50ml離心管中，混勻。
[0054] (5)加無(wú)血清1640培養(yǎng)液至50ml，1500rpm離心5min，將上清盡量倒凈，可用移液 器將管口液體吸凈。
[0055] (6)輕擊融合管底，使沉淀細(xì)胞松散均勻，離心管置于37°C水浴，準(zhǔn)備融合。
[0056] (7)將37°C保溫的lmlPEG1500,用滴管緩慢滴入離心管，邊滴邊轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，使 細(xì)胞保存在混勻狀態(tài)。
[0057] (8)靜置90s，立即在2?4min(本實(shí)施例為3min)內(nèi)緩慢加入15ml無(wú)血清的1640 培養(yǎng)基（37°C)，盡可能不攪動(dòng)細(xì)胞。
[0058] (9) 1500rpm離心 5min，棄去上清。
[0059] (10)加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液，輕輕混勻，將混懸液分別加至96孔細(xì) 胞培養(yǎng)板中，每孔1〇〇U1。
[0060](11)將培養(yǎng)板放到37°C，5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
[0061] (12)融合第2天，添加HAT培養(yǎng)液，每孔100y1。
[0062] (13)每2?3天換一次HAT培養(yǎng)液，連續(xù)兩周觀察雜交瘤是否出現(xiàn)，兩周后換用 HT培養(yǎng)基，觀察融合細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。
[0063] (14)雜交瘤細(xì)胞的篩選：細(xì)胞融合后第七天開(kāi)始觀察雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待細(xì) 胞覆蓋孔底面積1/10以上時(shí)吸出上清進(jìn)行抗體ELISA檢測(cè)。陽(yáng)性孔細(xì)胞轉(zhuǎn)入24孔板擴(kuò)大 培養(yǎng)，及時(shí)做亞克隆。
[0064] (15)經(jīng)3次亞克隆得到穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞系，命名為T(mén)ox-Gl。將雜交瘤細(xì)胞 株進(jìn)行保藏，保藏號(hào)CGMCCN0. 9559,分類命名為：弓形蟲(chóng)單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株；保藏 時(shí)間：2014年8月12日；保藏單位：中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（ChinaGeneral MicrobiologicalCultureCollectionCenter，CGMCC)，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路 1 號(hào) 院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。
[0065]實(shí)施例5單抗細(xì)胞株腹水制備與抗體效價(jià)檢測(cè)及單抗的純化 [0066] 按常規(guī)方法將凍存的實(shí)施例4獲得的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，培養(yǎng)到細(xì)胞覆蓋瓶底 的80 %左右時(shí)搖下細(xì)胞，計(jì)數(shù)5X106個(gè)/mL，腹腔免疫BALB/c小鼠，0. 5mL/只，制備腹水。 [0067] 弓形蟲(chóng)單抗腹水鑒定：采用間接ELISA法檢測(cè)抗體的效價(jià)。弓形蟲(chóng)5iig/ml包被 過(guò)夜后檢測(cè)腹水的抗體效價(jià)，抗體效價(jià)為1〇6。具體結(jié)果見(jiàn)表1。
[0068] 表1腹水中抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果
[0069]

【權(quán)利要求】
1. 一種制備抗弓形蟲(chóng)單克隆抗體的方法，其特征在于，采用人胚肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)弓 形蟲(chóng)，收獲的弓形蟲(chóng)純化后免疫小鼠。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，人胚肺成纖維細(xì)胞長(zhǎng)成單層后棄掉原培養(yǎng) 基，換用含1 %?3 %新生牛血清MEM培養(yǎng)基，接種弓形蟲(chóng)，接種MOI為0. 1?0. 5,培養(yǎng)弓形 蟲(chóng)5?9天后，待細(xì)胞CPE達(dá)到80%以上時(shí)，收獲弓形蟲(chóng)。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，對(duì)收獲的弓形蟲(chóng)通過(guò)蔗糖梯度離心進(jìn)行 純化：對(duì)收獲的弓形蟲(chóng)滅活后靜置，去除細(xì)胞及細(xì)胞團(tuán)；加入低糖，再加入高糖，低糖和高 糖的體積比為1:1，其中低糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%?20%，高糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%?55%， 10000g ?20000g 離心 30min ?60min。
4. 一種抗弓形蟲(chóng)單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，其保藏編號(hào)為CGMCC No. 9559。
5. 權(quán)利要求4所述雜交瘤細(xì)胞株在制備檢測(cè)弓形蟲(chóng)試劑盒中的應(yīng)用。
6. 由權(quán)利要求4所述雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆抗體。
7. -種用于檢測(cè)弓形蟲(chóng)或其抗體的試劑盒，其特征在于，含有權(quán)利要求6所述的單克 隆抗體。
8. 含有權(quán)利要求6所述單克隆抗體的檢測(cè)試劑。
9. 權(quán)利要求4所述的雜交瘤細(xì)胞株或權(quán)利要求6所述的單克隆抗體在制備預(yù)防或治療 弓形蟲(chóng)藥物中的應(yīng)用。
10. -種非疾病診斷目的的檢測(cè)弓形蟲(chóng)的方法，其特征在于，采用保藏編號(hào)為CGMCC No. 9559的雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)。
【文檔編號(hào)】C12N5/20GK104387470SQ201410613919
【公開(kāi)日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年11月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月4日
【發(fā)明者】童欽, 張星星, 姚志東, 劉可心, 高強(qiáng), 尹衛(wèi)東 申請(qǐng)人:北京科興生物制品有限公司