用于促進(jìn)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖分化的多種生長(zhǎng)因子復(fù)合物纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)【技術(shù)領(lǐng)域】，提供一種用于促進(jìn)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖分化的多種生長(zhǎng)因子復(fù)合物纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)，包括纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)及以之為載體加入其中的四種生長(zhǎng)因子，所述四種生長(zhǎng)因子為血小板源性生長(zhǎng)因子-AB、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1及表皮生長(zhǎng)因子。
【專利說(shuō)明】用于促進(jìn)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖分化的多種生長(zhǎng)因子復(fù)合物纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種用于促進(jìn)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖分化的多種生長(zhǎng)因子復(fù)合物纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)。
【背景技術(shù)】
[0002]難治性氣胸(refractory pneumothorax)又稱自發(fā)性氣胸持續(xù)漏氣(persistentair leak),是經(jīng)肋間引流5~7d后仍持續(xù)漏氣的自發(fā)性氣胸,主要表現(xiàn)為患者經(jīng)胸腔穿刺抽氣、閉式引流治療后胸膜破裂處仍難以閉合，組織損傷難以修復(fù)，這些患者常需采用胸腔鏡或開胸手術(shù)治療，但常因存在各種嚴(yán)重基礎(chǔ)性疾病或主觀上不愿接受手術(shù)而無(wú)法進(jìn)行外科治療，給臨床治療帶來(lái)一定的困難。難治性氣胸其主要原因?yàn)槌掷m(xù)性支氣管胸膜瘺，故促進(jìn)肺組織損傷的修復(fù)、胸膜破裂口的閉合，對(duì)于難治性氣胸的治療具有關(guān)鍵性作用。
[0003]肺組織損傷修復(fù)過(guò)程包括炎癥反應(yīng)期、肉芽組織形成期以及瘢痕形成期三個(gè)階段，整個(gè)過(guò)程不僅涉及細(xì)胞再生，還受細(xì)胞外微環(huán)境和各種化學(xué)因子的調(diào)節(jié)，主要包括細(xì)胞外基質(zhì)以及多種生長(zhǎng)因子之間的相互作用。肺組織損傷修復(fù)早期主要表現(xiàn)為傷口收縮、肉芽組織形成、成纖維細(xì)胞大量增生、膠原蛋白分泌及細(xì)胞外基質(zhì)沉積等，后期則表現(xiàn)為瘢痕形成及其異常增生。人肺成纖維細(xì)胞在組織修復(fù)整個(gè)過(guò)程中起到極為重要的作用，主要由靜止?fàn)顟B(tài)的纖維細(xì)胞 轉(zhuǎn)變而來(lái)，或未分化間葉細(xì)胞分化而來(lái)，幼稚成纖維細(xì)胞體積大，有星芒狀突起，逐漸成熟并合成分泌前膠原蛋白，在損傷部位細(xì)胞周圍形成膠原纖維，并分泌生長(zhǎng)因子，最終分化成纖維細(xì)胞，促進(jìn)傷口愈合。同時(shí)，與組織修復(fù)關(guān)系密切的還有多種生長(zhǎng)因子，如血小板源性生長(zhǎng)因子-AB (platelet derived growth factor-AB, PDGF-AB)>血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β I(transforming growth factor, TGF-β I)和表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)等。細(xì)胞外基質(zhì)將增生的成纖維細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞連接在一起，與多種生長(zhǎng)因子形成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，在時(shí)間和空間上相互作用，調(diào)節(jié)并促進(jìn)成纖維細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞的增殖、分化和遷移以及血管的生成、組織連接等過(guò)程，從而促進(jìn)組織損傷的修復(fù)和傷口的愈合。
[0004]近年來(lái)大量動(dòng)物和臨床試驗(yàn)研究顯示,纖維蛋白凝膠作為生長(zhǎng)因子(如NGF、bFGF、VEGF等)的載體，可穩(wěn)定生長(zhǎng)因子在組織中的生物學(xué)活性，保證其緩慢均勻地釋放，起到局部刺激細(xì)胞增生和組織修復(fù)的作用。國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，在體外可控條件下，對(duì)生長(zhǎng)因子纖維蛋白凝膠和成纖維細(xì)胞及組織修復(fù)進(jìn)行了一系列的研究，研究結(jié)果表明生長(zhǎng)因子凝膠對(duì)促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、遷移具有促進(jìn)作用。
[0005]根據(jù)上述已有的研究基礎(chǔ)，我們提出假設(shè):將組織修復(fù)過(guò)程中關(guān)鍵的多種生長(zhǎng)因子與纖維蛋白凝膠結(jié)合，建立“多種生長(zhǎng)因子復(fù)合物纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)”，形成多種生長(zhǎng)因子的緩釋系統(tǒng)，在一定的時(shí)間內(nèi)持續(xù)促進(jìn)人肺成纖維細(xì)胞的增殖、分化、遷移，從而促進(jìn)肺組織的損傷修復(fù)，對(duì)難治性氣胸的臨床治療具有重要的意義。[0006]以上提及的大多數(shù)研究建立的多為單種生長(zhǎng)因子凝膠釋放系統(tǒng)，僅有少數(shù)研究建立了兩種生長(zhǎng)因子聯(lián)合凝膠釋放系統(tǒng)，且相關(guān)資料顯示，現(xiàn)有研究多集中在皮膚、軟組織、骨骼肌腱、神經(jīng)組織等領(lǐng)域，尚缺乏對(duì)肺實(shí)質(zhì)、間質(zhì)細(xì)胞的增生及肺組織修復(fù)作用的研究。故與以往的研究不同，本實(shí)驗(yàn)采用纖維蛋白凝膠作為多種生長(zhǎng)因子復(fù)合物的載體，建立“多種生長(zhǎng)因子復(fù)合物纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)”，同時(shí)利用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，擬對(duì)生長(zhǎng)因子纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、分化的影響進(jìn)行研究和探討。
[0007]難治性氣胸的治療是臨床上的一個(gè)難題。2003年BTS發(fā)布的《自發(fā)性氣胸處理指南》將自發(fā)性氣胸引流5~7d后仍持續(xù)漏氣作為外科干預(yù)治療的時(shí)間點(diǎn)，認(rèn)為延長(zhǎng)引流時(shí)間對(duì)患者無(wú)益。外科 手術(shù)治療不但創(chuàng)傷大，費(fèi)用高，且有肺部基礎(chǔ)疾病患者常不能耐受，給社會(huì)和家庭帶來(lái)很大的負(fù)擔(dān)。2003年我們首先在國(guó)內(nèi)報(bào)道了采用自體血+凝血酶的方法對(duì)目標(biāo)支氣管及所屬肺葉肺段進(jìn)行灌注封堵的成功經(jīng)驗(yàn)，并于2010年發(fā)表相關(guān)報(bào)道顯示難治性氣胸封堵成功率達(dá)82%，并初步觀察到有降低其復(fù)發(fā)率的趨勢(shì)。促進(jìn)肺組織損傷的修復(fù)，胸膜破裂口的閉合，是治療難治性氣胸的關(guān)鍵突破口。
[0008]近十年來(lái)，為尋找使生長(zhǎng)因子持續(xù)、發(fā)揮生物學(xué)作用的途徑，國(guó)內(nèi)外學(xué)者模擬PRP的構(gòu)成進(jìn)行了大量的細(xì)胞和臨床實(shí)驗(yàn)研究，將生長(zhǎng)因子(如VEGF、TGF、EGF、PDGF等)與纖維蛋白凝膠結(jié)合，建立生長(zhǎng)因子凝膠釋放系統(tǒng)，緩慢、均勻釋放生長(zhǎng)因子，起到持續(xù)刺激組織真皮成纖維細(xì)胞、韌帶成纖維細(xì)胞、成肌纖維細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞等增生，從而促進(jìn)皮膚、骨骼、神經(jīng)、血管組織的修復(fù)的作用。但目前仍缺乏對(duì)肺實(shí)質(zhì)、間質(zhì)細(xì)胞的增生及肺組織修復(fù)作用的研究。另外已有研究所建立的上述生長(zhǎng)因子凝膠釋放系統(tǒng)模型多為單種生長(zhǎng)因子凝膠釋放系統(tǒng)的研究，少數(shù)研究建立了兩種生長(zhǎng)因子釋放系統(tǒng)，尚無(wú)有關(guān)多種生長(zhǎng)因子凝膠釋放系統(tǒng)模型的研究報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]因此，針對(duì)以上內(nèi)容，本發(fā)明提供一種用于促進(jìn)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖分化的多種生長(zhǎng)因子復(fù)合物纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)。
[0010]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:用于促進(jìn)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖分化的多種生長(zhǎng)因子復(fù)合物纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)，包括纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)及以之為載體加入其中的四種生長(zhǎng)因子，所述四種生長(zhǎng)因子為血小板源性生長(zhǎng)因子-AB、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β I及表皮生長(zhǎng)因子。
[0011]進(jìn)一步的改進(jìn)是:所述多種生長(zhǎng)因子復(fù)合物纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)的構(gòu)建方法為:先建立纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)，接著再加入四種生長(zhǎng)因子復(fù)合物。
[0012]進(jìn)一步的改進(jìn)是:所述纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)為碎片狀纖維蛋白二維凝膠模型。
[0013]進(jìn)一步的改進(jìn)是:所述纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)為島狀纖維蛋白二維凝膠模型。
[0014]進(jìn)一步的改進(jìn)是:所述碎片狀纖維蛋白二維凝膠模型的建立方法為:取纖維蛋白原溶液與凝血酶混合于無(wú)菌培養(yǎng)皿正中央，形成直徑為8~IOmm的半球形液滴，于37°C孵育30分鐘，形成吸納為蛋白凝膠后，用無(wú)菌手術(shù)刀將其平均分成6小塊后置于培養(yǎng)皿中，SP得到碎片狀纖維蛋白二維凝膠模型。
[0015]進(jìn)一步的改進(jìn)是:所述島狀纖維蛋白二維凝膠模型的構(gòu)建方法為，取纖維蛋白原溶液與凝血酶混合與無(wú)菌培養(yǎng)皿正中央，形成直徑為8~IOmm的半球形液滴，于37°C孵育30分鐘，即得到島狀纖維蛋白二維凝膠模型。
[0016]用于促進(jìn)人胚肺成纖維線報(bào)增殖分化的多種生長(zhǎng)因子復(fù)合物纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)應(yīng)用于促進(jìn)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖分化的方法:首先對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，其培養(yǎng)方法為:將購(gòu)買的原代人胚肺成纖維細(xì)胞接種于直徑IOcm的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，使用含體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37°C 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖至接近匯合狀態(tài)時(shí)，常規(guī)使用0.05%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，實(shí)驗(yàn)選用3-6代成纖維細(xì)胞；接著將人胚肺成纖維細(xì)胞接種于權(quán)利要求1所述的多種生長(zhǎng)因子復(fù)合物纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)中，進(jìn)行培養(yǎng)。
[0017]通過(guò)采用前述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明的纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)中含有四種生長(zhǎng)因子，即血小板源性生長(zhǎng)因子-AB、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β I及表皮生長(zhǎng)因子，本發(fā)明以纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)作為四種生長(zhǎng)因子復(fù)合物的載體，在該多種生長(zhǎng)因子復(fù)合物纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)中接種人胚肺成纖維細(xì)胞，能夠有效促進(jìn)人胚肺成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化，人胚肺成纖維細(xì)胞的增殖分化可促進(jìn)肺組織損傷的修復(fù)、胸膜破裂口的閉合，對(duì)治療難治性氣胸具有重大作用。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1為本發(fā)明實(shí)施例中纖維蛋白凝膠全覆蓋組的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖2為本發(fā)明實(shí)施例中纖維原全覆蓋組的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖3為本發(fā)明實(shí)施例中島狀凝膠組的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖4為本發(fā)明實(shí)施例中碎片狀凝膠組的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖5為本發(fā)明實(shí)施例中不同纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)累計(jì)釋放曲線圖；
圖6為本發(fā)明實(shí)施例中分組結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019]以下將結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，借此對(duì)本發(fā)明如何應(yīng)用技術(shù)手段來(lái)解決技術(shù)問(wèn)題，并達(dá)成技術(shù)效果的實(shí)現(xiàn)過(guò)程能充分理解并據(jù)以實(shí)施。
[0020]若未特別指明，實(shí)施例中所采用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所采用的試劑和產(chǎn)品也均為可商業(yè)獲得的。所用試劑的來(lái)源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明。
[0021]本發(fā)明的實(shí)施例為:
參考圖1至圖5，用于促進(jìn)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖分化的多種生長(zhǎng)因子復(fù)合物纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)，包括纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)及以之為載體加入其中的四種生長(zhǎng)因子，所述四種生長(zhǎng)因子為血小板源性生長(zhǎng)因子-ΑΒ、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β I及表皮生長(zhǎng)因子。
[0022]所述多種生長(zhǎng)因子復(fù)合物纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)的構(gòu)建方法為:先建立纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)，接著再加入四種生長(zhǎng)因子復(fù)合物。
[0023]參考圖1至圖4，所述纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)有四組，其具體構(gòu)建方法如下:①取2ml纖維蛋白原溶液于培養(yǎng)皿中平鋪，加入凝血酶0.2ml混合均勻，于37°C孵育30分鐘，形成纖維蛋白凝膠全覆蓋組，之后使用促貼壁劑多聚賴氨酸溶液(0.lmg/ml)鋪被覆蓋于凝膠表面lh，起到促進(jìn)細(xì)胞貼壁作用，Ih后用PBS適當(dāng)潤(rùn)洗后可進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；②取2ml纖維蛋白原于培養(yǎng)皿平鋪均勻后，不加入凝血酶，于37°C孵育30分鐘，形成纖維原全覆蓋組；③取2ml纖維蛋白原與凝血酶0.2ml混合于無(wú)菌培養(yǎng)皿正中央,形成直徑約8mm的半球形液滴，于37°C孵育30分鐘，為島狀凝膠組；④同③制作方法制作半球形液滴，孵育形成纖維蛋白凝膠后，用無(wú)菌手術(shù)刀將其平均分成6小塊后置于培養(yǎng)皿中，為碎片狀凝膠組。
[0024]參考圖5，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:培養(yǎng)基條件下不同凝膠釋放系統(tǒng)釋放曲線存在差異:島狀凝膠組與碎片狀凝膠組釋放曲線無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，纖維蛋白凝膠全覆蓋與島狀、碎片組有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P〈0.001)，全覆蓋組釋放高峰落后于島狀組和碎片狀組。
[0025]人胚肺成纖維細(xì)胞應(yīng)用于多種生長(zhǎng)因子復(fù)合物纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)的方法為:首先對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，其培養(yǎng)方法為:將購(gòu)買的原代人胚肺成纖維細(xì)胞接種于直徑IOcm的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，使用含體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置于370C 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖至接近匯合狀態(tài)時(shí)，常規(guī)使用0.05%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，實(shí)驗(yàn)選用3-6代成纖維細(xì)胞；接著將人胚肺成纖維細(xì)胞接種于上述四組多種生長(zhǎng)因子復(fù)合物纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)中，進(jìn)行培養(yǎng)。
[0026]其分組如圖6所示。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
(I)顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)觀察:接種時(shí)人胚肺成纖維細(xì)胞表現(xiàn)為圓形形態(tài)，懸浮于培養(yǎng)基中，呈不同層次分布。在不同纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)的影響下，細(xì)胞伸展貼壁時(shí)間及增殖速度存在一定的差別:纖維蛋白凝膠全覆蓋組、纖維蛋白原全覆蓋組細(xì)胞均無(wú)貼壁生長(zhǎng)，而島狀組、碎片組細(xì)胞均貼壁生長(zhǎng) ，形態(tài)良好，伸展呈梭形或紡錘狀，增殖活躍。(2)細(xì)胞分布情況:將培養(yǎng)皿中心點(diǎn)至直徑3cm區(qū)域定義為凝膠內(nèi)帶，將直徑3-6cm區(qū)域定義為凝膠中帶，直徑>6cm區(qū)域定義為凝膠外帶。凝膠內(nèi)帶細(xì)胞生長(zhǎng)速度最慢，凝膠外帶增殖速度最快，凝膠中帶細(xì)胞生長(zhǎng)情況介于兩者之間。隨著凝膠的溶解，細(xì)胞逐漸向凝膠內(nèi)帶遷移生長(zhǎng)，增殖速度逐漸增快。(3)生長(zhǎng)因子促進(jìn)人胚肺成細(xì)胞增殖:將生長(zhǎng)因子組(A組)和無(wú)生長(zhǎng)因子組(B組)的島狀凝膠組、碎片狀凝膠組及無(wú)凝膠對(duì)照組(C組)細(xì)胞增殖情況進(jìn)行比較:A組細(xì)胞增殖速度明顯快于B組，兩組細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P〈0.001)。無(wú)凝膠對(duì)照組生長(zhǎng)因子組(Cl組)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖情況顯著優(yōu)于無(wú)生長(zhǎng)因子組(C2組)(P〈0.001)。(4)不同凝膠釋放系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞影響和促進(jìn)作用各不相同:不論是生長(zhǎng)因子組或無(wú)生長(zhǎng)因子組，Al、A2、B1、B2組細(xì)胞均無(wú)貼壁和增殖生長(zhǎng)；取3、6、9、12d的細(xì)胞計(jì)數(shù)值及調(diào)零后OD值進(jìn)行對(duì)t匕，生長(zhǎng)因子組(A組)中各組細(xì)胞生長(zhǎng)增殖情況比較結(jié)果為碎片組明顯優(yōu)于島狀組及無(wú)凝膠對(duì)照組，島狀組優(yōu)于正常細(xì)胞對(duì)照組(P〈0.001);無(wú)生長(zhǎng)因子組(B組)中，細(xì)胞生長(zhǎng)增殖情況比較結(jié)果為碎片組明顯優(yōu)于島狀組及無(wú)凝膠對(duì)照組，但無(wú)凝膠對(duì)照細(xì)胞組生長(zhǎng)增殖情況優(yōu)于島狀組(P〈0.001)。(5)細(xì)胞增殖情況評(píng)估細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法和MTT法測(cè)得OD值存在一定線性關(guān)系，并呈正相關(guān)關(guān)系(生長(zhǎng)因子組:島狀組r=0.929，P〈0.001 ;碎片組r=0.863，P〈0.001 ;無(wú)凝膠對(duì)照組r=0.716，P〈0.005。無(wú)生長(zhǎng)因子組:島狀組r=0.706，P〈0.005 ;碎片組 r=0.423，Ρ〈0.05 ;無(wú)凝膠對(duì)照組 r=0.512，Ρ〈0.05)。
[0027]本發(fā)明多種生長(zhǎng)因子復(fù)合物(PDGF、TGF、VEGF、EGF)纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)具有促進(jìn)人胚肺成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化的作用。島狀和碎片狀纖維蛋白二維凝膠模型均可作為生長(zhǎng)因子的載體，并穩(wěn)定其生物學(xué)活性，保證緩慢、有效地釋放，持續(xù)促進(jìn)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖。碎片纖維蛋白凝膠二維模型對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖促進(jìn)作用明顯優(yōu)于島狀纖維蛋白凝膠二維模型，更有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化。
[0028]本發(fā)明的纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)中含有四種生長(zhǎng)因子，即血小板源性生長(zhǎng)因子-AB、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β I及表皮生長(zhǎng)因子，本發(fā)明以纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)作為四種生長(zhǎng)因子復(fù)合物的載體，在該多種生長(zhǎng)因子復(fù)合物纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)中接種人胚肺成纖維細(xì)胞，能夠有效促進(jìn)人胚肺成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化，人胚肺成纖維細(xì)胞的增殖分化可促進(jìn)肺組織損傷的修復(fù)、胸膜破裂口的閉合，對(duì)治療難治性氣胸具有重大作用。
[0029]本發(fā)明中，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞:人胚肺成纖維細(xì)胞(human embryonic lung fibroblast,HELF) 2株，由上海復(fù)祥科技有限公司提供的美國(guó)菌種保藏中心(American Type CultureCollection，ATCC)細(xì)胞株。人重組生長(zhǎng)因子PDGF-AB、TGF-β 1、VEGF165、EGF購(gòu)買于美國(guó)R&D Systems公司，人纖維蛋白原(純度>90%)購(gòu)買于上海萊士有限公司，人凝血酶購(gòu)買于美國(guó)Sigma公司，L-多聚賴氨酸購(gòu)買于美國(guó)Sigma公司，RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)買于美國(guó)Hyclone公司，胎牛血清購(gòu)買于美國(guó)Hyclone公司，磷酸緩沖溶液購(gòu)買于美國(guó)Hyclone公司。
[0030]以上所記載，僅為利用本創(chuàng)作技術(shù)內(nèi)容的實(shí)施例，任何熟悉本項(xiàng)技藝者運(yùn)用本創(chuàng)作所做的修飾、變化 ，皆屬本創(chuàng)作主張的專利范圍，而不限于實(shí)施例所揭示者。
【權(quán)利要求】
1.一種用于促進(jìn)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖分化的多種生長(zhǎng)因子復(fù)合物纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)，其特征在于:包括纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)及以之為載體加入其中的四種生長(zhǎng)因子，所述四種生長(zhǎng)因子為血小板源性生長(zhǎng)因子-AB、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β I及表皮生長(zhǎng)因子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于促進(jìn)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖分化的多種生長(zhǎng)因子復(fù)合物纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)，其特征在于:所述多種生長(zhǎng)因子復(fù)合物纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)的構(gòu)建方法為:先建立纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)，接著再加入四種生長(zhǎng)因子復(fù)合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于促進(jìn)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖分化的多種生長(zhǎng)因子復(fù)合物纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)，其特征在于:所述纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)為碎片狀纖維蛋白二維凝膠模型。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于促進(jìn)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖分化的多種生長(zhǎng)因子復(fù)合物纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)，其特征在于:所述纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)為島狀纖維蛋白二維凝膠模型。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于促進(jìn)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖分化的多種生長(zhǎng)因子復(fù)合物纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)，其特征在于:所述碎片狀纖維蛋白二維凝膠模型的建立方法為:取纖維蛋白原溶液與凝血酶混合于無(wú)菌培養(yǎng)皿正中央，形成直徑為8~IOmm的半球形液滴，于37°C孵育30分鐘，形成吸納為蛋白凝膠后，用無(wú)菌手術(shù)刀將其平均分成6小塊后置于培養(yǎng)皿中，即得到碎片狀纖維蛋白二維凝膠模型。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于促進(jìn)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖分化的多種生長(zhǎng)因子復(fù)合物纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)，其特征在于:所述島狀纖維蛋白二維凝膠模型的構(gòu)建方法為，取纖維蛋白原溶液與凝血酶混合與無(wú)菌培養(yǎng)皿正中央，形成直徑為8~IOmm的半球形液滴，于37°C孵育30分鐘，即得到島狀纖維蛋白二維凝膠模型。
7.用于促進(jìn)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖分化的多種生長(zhǎng)因子復(fù)合物纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)應(yīng)用于促進(jìn)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖分化的方法，其特征在于:首先對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，其培養(yǎng)方法為:將購(gòu)買的原代人胚肺成纖維細(xì)胞接種于直徑IOcm的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，使用含體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37°C 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖至占培養(yǎng)皿面積80~90%時(shí)，常規(guī)使用0.05%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，實(shí)驗(yàn)選用3-6代成纖維細(xì)胞；接著將人胚肺成纖維細(xì)胞接種于權(quán)利要求1所述的多種生長(zhǎng)因子復(fù)合物纖維蛋白凝膠釋放系統(tǒng)中，進(jìn)行培養(yǎng)。
【文檔編號(hào)】C12N5/073GK104004709SQ201410185814
【公開日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年5月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月5日
【發(fā)明者】曾奕明, 施麗泳, 黃琳琳 申請(qǐng)人:曾奕明