專利名稱：用哺乳動物細胞系生產(chǎn)禽呼腸孤病毒與疫苗的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用哺乳動物細胞系生產(chǎn)的禽呼腸孤病毒與疫苗的方法及產(chǎn)品，屬于獸用疫苗領域。
背景技術：
禽呼腸孤病毒(Avian Reovirus，簡稱ARV)在世界范圍內(nèi)廣泛存在，廣泛流行于雞、火雞中，它引起的關節(jié)炎、腱鞘炎及免疫抑制等給養(yǎng)雞業(yè)帶來重大經(jīng)濟損失。目前，我國控制禽呼腸孤病毒的主要手段是使用減毒活疫苗或全病毒滅活苗通過免疫接種來控制雞呼腸孤病毒感染，而我國目前所用的禽呼腸孤病毒疫苗均為國外進口疫苗，使用雞胚或雞胚成纖維細胞培養(yǎng)生產(chǎn)病毒，使得制備的疫苗價格很高，且工藝復雜，造成養(yǎng)殖戶防治ARV的成本升高。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的主要目的在于提供一種用哺乳動物細胞系生產(chǎn)的禽呼腸孤病毒及禽呼腸孤病毒滅活疫苗及其方法，以提供一種雞胚源的滅活疫苗批間差異更小，免疫效力更佳的禽呼腸孤病毒滅活疫苗，從而實現(xiàn)更安全、更有效地生產(chǎn)禽呼腸孤病毒及疫苗的目的。技術方案用哺乳動物細胞系生產(chǎn)禽呼腸孤病毒的方法，包括以下步驟:I)將收獲的禽呼腸孤病毒，接種至長滿單層的哺乳動物細胞系，使用細胞維持液
培養(yǎng)；2)接種培養(yǎng)后，收獲禽呼腸孤病毒優(yōu)選地，用哺乳動物細胞系生產(chǎn)禽呼腸孤病毒的方法，上述步驟I)具體地包括:a)細胞毒種的繁殖，即:使用禽腎細胞對禽呼腸孤病毒繼代；b)禽呼腸孤病毒適應哺乳動物細胞的步驟，即:將經(jīng)過繼代處理的禽呼腸孤病毒，接種于長滿單層的哺乳動物細胞系，使用細胞維持液培養(yǎng)，至出現(xiàn)CPE大于75%時，收獲禽呼腸孤病毒，作為制苗用毒種；c)制苗毒液的繁殖，即:將收獲的禽呼腸孤病毒，接種至長滿單層的哺乳動物細胞系，使用細胞維持液培養(yǎng)；優(yōu)選地，上述步驟2)為制苗毒液的收獲，即:接種培養(yǎng)6 7天后，收獲禽呼腸孤病毒。
本發(fā)明對所用的哺乳動物細胞系沒有特別的限制，即本發(fā)明可以使用任意的哺乳動物細胞系；優(yōu)選地，可以使用VeiO細胞系(非洲綠猴腎細胞系)、MDCK細胞系(馬-達二氏犬腎細胞系)、ΡΚ_15細胞系(豬腎細胞系)、Marcl45細胞(上皮樣細胞系，來源于猴腎細胞)、ST細胞(豬睪丸細胞系)、IBRS-2細胞(豬腎細胞系)任意一種或幾種細胞系；更優(yōu)選地，使用VeiO細胞系或MDCK細胞系；最優(yōu)選地，使用Vero細胞系生產(chǎn)禽呼腸孤病毒與疫苗。優(yōu)選地，本發(fā)明的禽呼腸孤病毒在接種至哺乳動物細胞系生產(chǎn)前，要使用禽類腎細胞繼代(在本發(fā)明中也可以稱為傳代)14代 18代；更優(yōu)選地，使用SPF雞胚腎細胞(CK細胞)進行繼代(或傳代)；最優(yōu)選地，在繼代處理后還包括在使用前在禽腎細胞繼代(或傳代)一次。優(yōu)選地，本發(fā)明步驟2)收獲的禽呼腸孤病毒的效價為大于4X 107TCID5Q/ml。本發(fā)明對禽呼腸孤病毒沒有特別的限制，即本發(fā)明的方法可以使用哺乳動物細胞系生產(chǎn)任意類型的禽呼腸孤病毒；優(yōu)選地，本發(fā)明所述的禽呼腸孤病毒是禽呼腸孤病毒AV2311 株。本發(fā)明的另一目的在于提供一種用哺乳動物細胞系生產(chǎn)禽呼腸孤病毒滅活疫苗的方法，即使用上述方法獲得的禽呼腸孤病毒，加入滅活劑，滅活后加入獸藥學上可接受的疫苗佐劑，乳化后獲得禽呼腸孤病毒滅活疫苗。由上可知，本發(fā)明可以使用哺乳動物細胞系生產(chǎn)禽呼腸孤病毒及禽呼腸孤病毒滅活疫苗。即，發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)在禽呼腸孤病毒在禽類腎細胞繼代處理后，可以幫助禽呼腸孤病毒更適應在哺乳動物細胞 上的生長與繁殖，從而獲得一種高滴度、質(zhì)量批次穩(wěn)定的禽呼腸孤病毒；另外，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)在利用哺乳動物細胞培養(yǎng)禽呼腸孤病毒前，使用至少一次的禽源細胞預培養(yǎng)或適應，可以使得禽呼腸孤病毒在哺乳動物細胞的生產(chǎn)更有利。因此，本發(fā)明可以利用哺乳動物細胞來生產(chǎn)禽呼腸孤病毒，而利用本發(fā)明的禽呼腸孤病毒在哺乳動物細胞系獲得的禽呼腸孤病毒滅活疫苗比雞胚源的滅活疫苗批間差異更小，免疫效力更佳。
具體實施例方式本發(fā)明實施例中使用了常見的商業(yè)化的容易培養(yǎng)的細胞系如Vero細胞(非洲綠猴腎細胞)、BHK-21細胞(幼倉鼠腎傳代細胞)、PK-15細胞(豬腎細胞)、Marcl45細胞(上皮樣細胞，來源于猴腎細胞)、ST細胞(豬睪丸細胞)、IBRS-2細胞(豬腎細胞)等細胞或細胞系生產(chǎn)禽呼腸孤病毒及疫苗。本發(fā)明對禽呼腸孤病毒沒有特別的限制，即本發(fā)明的方法可以使用哺乳動物細胞系生產(chǎn)任意類型的禽呼腸孤病毒；本發(fā)明實施例中所用的禽呼腸孤病毒是禽呼腸孤病毒AV2311株(購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保藏號為CVCC AV2311，于1979年11月30號保藏與國家獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心)。為使本發(fā)明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，下列實施例中未提及的具體實驗方法，通常按照常規(guī)實驗方法進行。實施例1:使用Vero細胞制備禽呼腸孤病毒及禽呼腸孤病毒滅活疫苗(I)制苗用細胞的選擇:選用非洲綠猴腎(Vero)細胞,購自上海生化所。(2)制苗用細胞的傳代與培養(yǎng)=Vero細胞經(jīng)EDTA-胰酶細胞分散液消化傳代，以細胞生長液于37°C繼續(xù)培養(yǎng)，形成良好單層時，用于繼續(xù)傳代或接種病毒。(3)細胞毒種繁殖:雞胚腎細胞(CK細胞)的制備:取17-20日齡SPF雞胚10只，剪開腹腔，移出內(nèi)臟，用鑷子仔細分離腎臟的包膜，然后取出腎臟，以Hank’s液洗3次，再將其剪成Imm3的方塊，加入適量0.25%胰酶，以37°C水浴消化15min。倒出胰酶，再以Hank’ s液洗3次，經(jīng)大口吸管吹打分散，以水解乳蛋白培養(yǎng)液懸浮細胞，上層液經(jīng)8層紗布過濾，收集的細胞液定量至細胞數(shù)約為100萬/ml。加入10%小牛血清，分裝后于37°C培養(yǎng)48h即可長成單層。禽呼腸孤病毒在CK細胞上傳代(即繼代)14代。先將AV2311株病毒液在禽腎細胞上傳代(即繼代)一次，將有細胞病變(CPE)的培養(yǎng)物接種于長滿單層的Vero細胞，加入細胞維持液，置37°C繼續(xù)培養(yǎng)，待出現(xiàn)75% CPE時，棄去維持液，加入2ml滅菌純水，_70°C反復凍融3次后收獲,作為生產(chǎn)用細胞毒種。(4)制苗毒液的繁殖:取已形成單層的Veix)細胞培養(yǎng)瓶，棄去細胞生長液，接種含3% v/v生產(chǎn)用細胞毒種的維持液，置37°C繼續(xù)培養(yǎng)，接毒后6日收獲病毒液，_15°C以下保存，使病毒效價檢測達到4X107TCID50/ml。病毒效價的測定方法如下:a.取一瓶細胞，消化，吹勻后，加于96孔板中，置于5%的C02培養(yǎng)箱37°C中培養(yǎng)，96孔板中細胞長至細胞方瓶底面面積的60%-70%時，一般是24h之內(nèi)；b.用無血清的DMEM培養(yǎng)液對病毒進行10倍體積連續(xù)倍比稀釋(即10-10-10-10)。c.從C02培養(yǎng)箱中取出96孔細胞板，用無血清的DMEM培養(yǎng)液洗滌一次，以除去血清，避免血清對病毒吸附的干擾。d.將稀釋后的病毒液加到96孔細胞板中，每個稀釋度至少接種4孔，每孔IOOul。并設正常細胞對照。e.37°C,5%的C02培養(yǎng)箱孵育Ih后，換成含1.5% v/v胎牛血清的維持液，繼續(xù)培養(yǎng)72h，觀察CPE，按Reed-Muench 法計算 TCID50。(5)疫苗滅活:將收獲的病毒液，使用甲醛滅活16h，所述甲醛溶液濃度為34%，力口入量為滅活溶液體積的2%0，37°C滅活16h，每2h搖動一次。(6)乳化:加入乳化劑吐溫-80，吐溫-80占水相體積的I %，水相與油相比例為3: 5，其中水相即是滅活的病毒液，油相為乳化時用的白油，用乳化機以12，000轉/分乳化lOmin，制成禽呼腸孤病毒滅活疫苗，每0.2ml含病毒含量103 5TCID50。該疫苗經(jīng)性 狀測定為油包水類型，穩(wěn)定性良好，粘度適中。疫苗在20°C放置4個月，4°C放置59個月，未出現(xiàn)分層。安檢:取使用劑量的10倍量即104 5TCID5Q/0.2ml足墊免疫I日齡SPF雞，觀察2周，足墊接種部位無炎癥反應等情況出現(xiàn)。效檢:用使用劑量即103_5TCID5tlA).2ml頸背部皮下免疫I日齡雞，2周后，用強毒攻擊，保護率達到100%。免疫雞只I周內(nèi)產(chǎn)生免疫應答，2周內(nèi)，即可產(chǎn)生足夠的免疫力，免疫期為2個月，免疫期間攻毒保護率為96.2% -98.9%。上述方法中所用細胞生長液的配方是:95%體積DMEM液、5%體積胎牛血清、加適量抗菌素，PH值調(diào)整為7.2。上述所用細胞維持液的配方是:98.5%體積DMEM液、1.5%體積胎牛血清、加適量抗菌素，PH值調(diào)整為7.4。實施例2:細胞源ARV滅活疫苗與雞胚源ARV雞胚源滅活疫苗的檢驗結果比較I 材料1.1疫苗按照實施例1制備ARV滅活疫苗(細胞系源)3批，批號:試Vero2011030U 試 Vero20110302、Vero20110303。雞胚源 3 批，批號:201101、201102、201103，制備方法見本實施例2.1。
1.2SPF蛋和SPF雞購自北京梅里亞維通生物技術有限公司。2ARV雞胚源滅活疫苗制備方法與結果
2.1制備雞胚源ARV滅活疫苗:a.病毒繁殖:將AV2311株毒種在雞胚上繁殖傳代，使病毒效價檢測達到IO1tl 5EID5ciA).2ml ；b.疫苗滅活:甲醛滅活16h，所述甲醛溶液濃度為34%，加入量為滅活溶液體積的2%。；c.油相制備:在白油中按2%。加入硬脂酸鋁，按5%。加入司本-80熬制而成；d.乳化:加入乳化劑吐溫-80，吐溫-80占水相體積的1%，水相與油相體積比為3: 5，其中水相即是滅活的病毒液體，油相為乳化時用的白油。用乳化機以12000轉/分乳化10分鐘，制成ARV雞胚源滅活疫苗。2.2物理性狀檢驗:肉眼觀察疫苗外觀，6批疫苗均為乳白色均勻乳劑；劑型均為油包水(W/0)型；取6批苗各I管(15ml)在37°C放置21日，均無破乳；用Iml吸管(下口內(nèi)徑為1.2mm，上口內(nèi)徑為2.7mm)吸取25°C左右的疫苗1.0ml，令其垂直自然流出，記錄流出0.4ml所需的時間，結果6批疫苗流出時間分別為3.5秒、3.5秒、3.6秒、3.5秒、3.7秒、
3.5秒，均在8秒以內(nèi)。2.3無菌檢驗按現(xiàn)行《中國獸藥典》對6批ARV疫苗進行檢驗，均無細菌生長。2.4安全檢驗用3周齡SPF雞120只，分為6組，每組20只，每批苗分別肌肉注射疫苗2羽份(1ml)，觀察21天，結果見表I。表I安全檢驗結果比較
權利要求
1.一種用細胞系生產(chǎn)禽呼腸孤病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)將收獲的禽呼腸孤病毒，接種至長滿單層的哺乳動物細胞系，使用細胞維持液培養(yǎng); 2)接種培養(yǎng)后，收獲禽呼腸孤病毒。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟I)進一步為以下步驟:a)使用禽腎細胞對禽呼腸孤病毒繼代山)將經(jīng)過繼代處理的禽呼腸孤病毒，接種于長滿單層的哺乳動物細胞系，使用細胞維持液培養(yǎng)，至出現(xiàn)CPE大于75%時，收獲禽呼腸孤病毒，作為制苗用毒種；c)將收獲的禽呼腸孤病毒，接種至長滿單層的哺乳動物細胞系，使用細胞維持液培養(yǎng)； 所述步驟2)中接種培養(yǎng)的時間為6天后，收獲禽呼腸孤病毒。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述哺乳細胞系為Vero細胞系、MDCK細胞系、PK-15細胞系、Marcl45細胞系、ST細胞系、IBRS-2細胞系任意一種或幾種細胞系。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物細胞系為Vero細胞系或MDCK細胞系。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I)中還包括在接種前使用禽腎細胞繼代處理的禽呼腸孤病毒。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于，所述繼代處理的次數(shù)為14代 18代。
7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)的收獲禽呼腸孤病毒的效價為大于 4X107TCID5(l/ml。
8.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的禽呼腸孤病毒是禽呼腸孤病毒AV2311 株。
9.一種根據(jù)權利要求1 8任意一項所述的方法制備的禽呼腸孤病毒，其特征在于，使用哺乳動物細胞系生產(chǎn)禽呼腸孤病毒。
10.一種用哺乳動物細胞系生產(chǎn)禽呼腸孤病毒滅活疫苗的方法，其特征在于，使用權利要求9所述的禽呼腸孤病毒，加入滅活劑，滅活后加入獸藥學上可接受的疫苗佐劑，乳化后獲得禽呼腸孤病毒滅活疫苗。
11.一種根據(jù)權利要求10所述的方法制備的禽呼腸孤病毒滅活疫苗，其特征在于，使用哺乳動物細胞系生產(chǎn)禽呼腸孤病毒滅活疫苗。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用哺乳動物細胞系生產(chǎn)禽呼腸孤病毒的方法，包括使用如Vero細胞系或MDCK細胞系等哺乳動物細胞系，在上述細胞系形成生長良好的細胞單層后，接種使用禽腎細胞繼代的禽呼腸孤病毒，并使之吸附于上述細胞系；換用細胞維持液培養(yǎng)，以進行禽呼腸孤病毒的增殖，并收獲禽呼腸孤病毒。使用上述方法獲得的禽呼腸孤病毒，加入滅活劑，滅活后加入獸藥學上可接受的疫苗佐劑，乳化后獲得禽呼腸孤病毒滅活疫苗。
文檔編號C12N7/00GK103184194SQ20111044819
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月29日 優(yōu)先權日2011年12月29日
發(fā)明者張許科, 孫進忠, 白朝勇 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司