專利名稱：一種棉花促絲裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK6及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種棉花促絲裂原活化蛋白激酶基因GhMAPKe的克隆、重組及在提高轉(zhuǎn)基因煙草產(chǎn)量方面的應(yīng)用，屬于分子生物學和生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著世界人口的不斷激增，人們對糧食的需求也在急劇增加。同時人類對資源環(huán)境的肆意開發(fā)，生態(tài)平衡逐漸遭到破壞，糧食生產(chǎn)也受到很大影響。在我國，經(jīng)濟水平的不斷提高及城市化、工業(yè)化進程的不斷加快，農(nóng)業(yè)人口及可用耕地面積所占比例正逐年下降， 因此，如何提高糧食產(chǎn)量來滿足人們?nèi)找嬖鲩L的基本生活物質(zhì)需求是人們當前亟待解決的問題。傳統(tǒng)的提高糧食產(chǎn)量的方法有擴大種植面積、改善栽培管理技術(shù)、田間套種、選育優(yōu)良品種等。由于人們對土地資源的不斷開發(fā)，可耕地面積逐年下降，通過擴大種植面積提高作物產(chǎn)量已不再是行之有效的方法。而通過改善栽培管理技術(shù)提高作物產(chǎn)量往往收效甚微。目前提高作物產(chǎn)量的方法主要是選育優(yōu)良品種，結(jié)合先進的栽培管理技術(shù)。傳統(tǒng)的選育方法主要是將雜交選育與形態(tài)改良相結(jié)合，利用雜交優(yōu)勢來選育新品種。如三系雜交水稻的選育。然而由于種間不親和性的限制，許多種間高產(chǎn)性狀無法通過雜交選育的方式得以充分利用。另外，傳統(tǒng)的選育方法具有育種周期長，工作量大，成本高等缺點。因此，應(yīng)用傳統(tǒng)育種方法來提高作物產(chǎn)量在一定程度上受到限制。隨著近代分子生物學與基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)與傳統(tǒng)選育方法相結(jié)合來選育新品種已經(jīng)成為一種行之有效的方法。轉(zhuǎn)基因技術(shù)具有快速、高效等優(yōu)點，一方面可以大大縮短選育新品種的周期，另一方面能克服種間的生殖隔離障礙，實現(xiàn)種間遺傳物質(zhì)交換，將種間優(yōu)良基因充分挖掘和利用。此外，利用轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)可針對性的改良作物性狀，以達到提高作物產(chǎn)量的目的。在我國，棉花是除糧食以外最為重要的經(jīng)濟作物。早在1995年，我國就通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)成功培育出Bt抗蟲棉，其推廣應(yīng)用使得棉花產(chǎn)量大幅度提高，極大的推進了棉花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。但近年來，我國棉花的消費需求正呈持續(xù)快速增長趨勢。相關(guān)資料表明，我國國內(nèi)棉花資源已不能滿足棉紡織業(yè)的需求，只能通過進口來達到供求平衡。因此加速提高棉花產(chǎn)量是十分必要的。通過基因工程技術(shù)的手段研究棉花中影響產(chǎn)量的基因的功能，對于棉花產(chǎn)量性狀的遺傳改良具有非常重要的現(xiàn)實意義。然而，目前關(guān)于棉花產(chǎn)量性狀的研究多集中于產(chǎn)量相關(guān)性狀的QTL定位及聚類分析方面，對于棉花產(chǎn)量相關(guān)基因的研究應(yīng)用很少。MAPK級聯(lián)途徑是真核生物中進化極為保守的細胞信號轉(zhuǎn)導途徑。研究表明，植物中MAH(參與細胞分裂、生長發(fā)育、脅迫反應(yīng)等過程，如Ma等Q009)通過對煙草BY-2細胞的研究發(fā)現(xiàn)，MAPK主要在細胞分裂中期，通過激活大量與細胞周期進程相關(guān)的底物來調(diào)節(jié)成膜體中細胞板的形成以影響細胞周期進程。而Jens等人O010)通過對模式植物擬南芥的研究進一步證實，MAI3K在細胞分裂過程中所具有的重要作用，并指出MAPK6在擬南芥早期根的生長發(fā)育階段通過影響細胞分裂來影響根的發(fā)育。另外有研究表明，植物中一些MAPK能夠參與生長素信號途徑，從而調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育過程。然而，目前關(guān)于棉花MAHi與產(chǎn)量關(guān)系方面的研究很少，國內(nèi)外尚沒有關(guān)于利用棉花MAPK提高作物產(chǎn)量的報道。本發(fā)明中，我們用常規(guī)方法在棉花(Gossypium hirsutum L.)(魯棉22)中克隆得到一個MAPK基因，構(gòu)建真核表達載體后轉(zhuǎn)入本生煙(Nicotiana benthamiana)，使之高效表達。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因煙草植株產(chǎn)量較非轉(zhuǎn)基因煙草植株顯著提高，表現(xiàn)為葉片面積增大、分蘗數(shù)增多、果莢數(shù)增加、結(jié)實率提高。因此，利用該基因在增加產(chǎn)量方面的特性，通過基因工程手段改善作物產(chǎn)量性狀，提高作物產(chǎn)量具有重要的現(xiàn)實意義。這一策略的應(yīng)用不僅能為植物產(chǎn)量性狀的改良提供新的基因源，而且對于培育其它可提高產(chǎn)量的種質(zhì)材料提供了理論基礎(chǔ)。經(jīng)檢索，國內(nèi)外文獻和專利中尚沒有關(guān)于該棉花產(chǎn)量相關(guān)基因GhMAPK6的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在提供一種可提高棉花產(chǎn)量的相關(guān)基因GhMAPK6，同時提供一種該基因在提高轉(zhuǎn)基因煙草產(chǎn)量方面的應(yīng)用，并應(yīng)用于生產(chǎn)其它可提高產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明中提供的核苷酸序列來自棉花。本發(fā)明利用同源克隆和RACE技術(shù)獲得了棉花產(chǎn)量相關(guān)基因GhMAPK6，其基因序列如SEQ. ID. NO. 1所示，蛋白質(zhì)氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。具體方法如下本發(fā)明從棉花幼葉中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。根據(jù)國際基因庫(GenBank) 中已發(fā)布的其它植物中促絲裂原活化蛋白激酶基因的保守氨基酸序列，設(shè)計一對簡并性引物BPlchtaygghatbgtytgytgtgcBP2 gcaaccaacwgaccadatrtc進行常規(guī)聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)。將PCR產(chǎn)物與克隆載體(pMDIS-T)連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，然后篩選重組子，進行序列分析。根據(jù)獲得的序列設(shè)計特異性引物3‘ outside :ctcgctcgtgtcacctctg3‘ inside :cgtccacctgaactgttgc5‘ outside :gatccatgtgacgaagcag5' inside :agagttctcttcgcatcaatc通過3'和 5'末端快速擴增(Rapid-amplification of cDNA ends，RACE)技術(shù)分別獲得和端序列，并拼接成完整的cDNA序列。根據(jù)cDNA的和端序列設(shè)計一對特異性引物WLP1 gtaagaatggaaggcggagWLP2 :tagaatggctattggaattgagatat以棉花幼葉的cDNA為模板進行PCR擴增，得到cDNA全長序列，將該cDNA命名為 GhMAPK6。該基因的cDNA全長為1564bp，其中開放閱讀框部分為1197bp。由此推得，該基因可編碼399個氨基酸。將其氨基酸序列在GenBank中檢索，發(fā)現(xiàn)與已發(fā)表的AtMAPK6 (擬南芥，NM_129941)、GmMAPK2 (大豆，AAQ14867)、LeMAPK2 (番茄，AAP20420)、NtNTF4 (煙草，Q40532)、0sMAPK6(水稻，ACD76439)、ZmMAPK6 (玉米，ACG37232)相比，氨基酸同源性分別為 87. 47%,90. 23%,89. 97%,89. 97%,81. 95%,82. 75%。由此表明，經(jīng)過上述同源克隆步驟得到了編碼棉花促絲裂原活化蛋白激酶的基因GhMAPK6。該基因序列如下序列表(l)SEQ. ID. NO. 1 的信息(a)序列特征長度1564bp類型核酸鏈型雙鏈拓撲結(jié)構(gòu)線性(b)分析類型cDNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源棉花(f)序列描述:SEQ. ID. NO. 1cacagatcta ttaaccaata aaatcctacg catccttcca gtacacccac tcaccctaat 60ttctttttagattcttttttccaggaattaaggtaaga jat g[' gaaggcgga ggaccaccac120
aggcggcggacaccgagatggcagaagcagcccagcaacagccacaacaccaccagcaac180
gtccgcctcaggtggccgctggcctggaaaatattccggccactctaagccacggcggta240
ggtttattcagtataacatctttggtaacattttcgaggtcactgctaaatataaaccac300
ctattatgcctatcggtaaaggcgcttacggcatcgtttgttccgcattgaattccgaga360
caaatgaacacgttgcgttaaagaagatagcgaacgcatttgataacaagattgatgcga420
agagaactcttcgtgagatcaagctgcttcgtcacatggatcatgaaaacgttgttgcaa480
tcagggatataattccaccacctcaaagggaatgctttaatgatgtttatattgcgtacg540
agctgatggacactgacctgcatcagataatccgttctaatcaagctttatctgaagagc600
attgtcagtatttcccctatcagatcttacgtgggctgaagtatatacactctgcaaatg660
ttctacacagggacttgaaacctagcaaccttctcctgaatgctaattgtgacttgaaaa720
tatgtgattttggactcgctcgtgtcacctctgaaagtgattttatgactgaatatgttg780
ttacaagatggtaccgtccacctgaactgttgctaaactcttcagactatactgcagcca840
ttgatgtatggtcagtgggttgcatttttatggaattgatggatcgaaagccattatttc900
ctggaagagatcatgtgcatcagcttcgattacttatggaactgattggcaccccatcag960
aggctgagttggagtttttaaatgagaatgctaagagatatattcgacaacttcctcttt1020
atcgtcgacaatctttcactgaaaagtttccaaatgtcccccctttagctattgatcttg1080
ttgaaaagatgttaacatttgatcccagacaaaggattactgtcgaggacgcacttgctc1140
atccctatctaacgtcactgcatgacataagtgatgaacctgtatgcatgacccccttta1200
gcttcgacttcgagcagcatgcattaaccgaggagcagatgaaggagctgatatatcggg1260
aggcacttgcattcaaccca gaatatctgc agcagjtgajtcagtccatatg ccattgattt1320
attgatgagcttttgtcagtgttggtgatcgttttcttca tgtatatata catacatatg1380
tatgtatgta tgtatgtatt tatgtatgtatgtatgtacg tatgtatgttccaatcccag1440
gatagaatgg ctattggaat tgagatatttaattatgggc aaaatgcagg aaactaaaac1500
agctgtattg gtgtttttat gtacggctgtcttgatttct ttctttcaaa-&￡l￡l￡l￡l￡l￡l￡l￡l￡l1560
SlSlSlSl1564
其中透明方框內(nèi)為起始密碼子，灰色方框內(nèi)為終止密碼子。
(3) SEQ. ID. NO. 2 的信息
(a)序列特征
長度399個氨基·
類型氨基酸
鏈型單鏈
拓撲結(jié)構(gòu)線性
(b)分析類型:蛋白質(zhì)
(C)序列描述:SEQ.ID.NO. 2
MetGluGlyGlyGlyProProGlnAlaAlaAspThrGluMetAlaGlu
151015
AlaAlaGlnGlnGlnProGlnHisHisGlnGlnArgProProGlnVal
202530
AlaAlaGlyLeuGluAsnlieProAlaThrLeuSerHisGlyGlyArg
354045
PheIleGlnTyrAsnliePheGlyAsnliePheGluValThrAlaLys
505560
TyrLysProProlieMetProlieGlyLysGlyAlaTyrGlylieVal
65707580
CysSerAlaLeuAsnSerGluThrAsnGluHisValAlaLeuLysLys
859095
IleAlaAsnAlaPheAspAsnLyslieAspAlaLysArgThrLeuArg
100105110
GluIleLysLeuLeuArgHisMetAspHisGluAsnValValAlalie
115120125
ArgAsplielieProProProGlnArgGluCysPheAsnAspValTyr
130135140
IleAlaTyrGluLeuMetAspThrAspLeuHisGlnlielieArgSer
145150155160
AsnGlnAlaLeuSerGluGluHisCysGlnTyrPheProTyrGlnlie
165170175
LeuArgGlyLeuLysTyrlieHisSerAlaAsnValLeuHisArgAsp
180185190
LeuLysProSerAsnLeuLeuLeuAsnAlaAsnCysAspLeuLyslie
1952002050099]CysAspPheGlyLeuAlaArgValThrSerGluSerAspPheMetThr0100]2102152200101]GluTyrValValThrArgTrpTyrArgProProGluLeuLeuLeuAsn0102]2252302352400103]SerSerAspTyrThrAlaAlalieAspValTrpSerValGlyCyslie0104]2452502550105]PheMetGluLeuMetAspArgLysProLeuPheProGlyArgAspHis0106]2602652700107]ValHisGlnLeuArgLeuLeuMetGluLeulieGlyThrProSerGlu0108]2752802850109]AlaGluLeuGluPheLeuAsnGluAsnAlaLysArgTyrlieArgGln0110]2902953000111]LeuProLeuTyrArgArgGlnSerPheThrGluLysPheProAsnVal0112]3053103153200113]ProProLeuAlalieAspLeuValGluLysMetLeuThrPheAspPro0114]3253303350115]ArgGlnArglieThrValGluAspAlaLeuAlaHisProTyrLeuThr0116]3403453500117]SerLeuHisAsplieSerAspGluProValCysMetThrProPheSer0118]3553603650119]PheAspPheGluGlnHisAlaLeuThrGluGluGlnMetLysGluLeu0120]3703753800121]IleTyrArgGluAlaLeuAlaPheAsnProGluTyrLeuGlnGln0122]3853903950123]本發(fā)明還提供了編碼促絲裂原活化蛋白;敫酶基因GhMAPK6在其它農(nóng)作物
的方法，可提高轉(zhuǎn)基因作物的產(chǎn)量。步驟為(a)利用棉花促絲裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK6，將cDNA序列置于CaMV 35S啟動子之下，構(gòu)建植物表達載體。(b)采用本領(lǐng)域熟知的方法，如農(nóng)桿菌介導的方法將構(gòu)建的表達載體導入植物細胞，得到轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明從棉花中分離出一種編碼促絲裂原活化蛋白激酶基因(GhMAPK6)，將該 cDNA序列構(gòu)建在由組成型CaMV 35S強啟動子控制的真核表達載體pBI121上，構(gòu)建了 GhMAPK6的正義表達載體，采用農(nóng)桿菌介導的方法轉(zhuǎn)化本生煙。對獲得的轉(zhuǎn)基因煙草進行功能分析表明，轉(zhuǎn)基因煙草中GhMAPK6的過量表達能提高其產(chǎn)量。相比于非轉(zhuǎn)基因煙草，轉(zhuǎn)基因煙草葉片面積增加約1. 7倍，果莢數(shù)增加約2. 4倍，種子數(shù)量增加約1. 5倍。該基因可轉(zhuǎn)化棉花、玉米、小麥等農(nóng)作物，能提高其產(chǎn)量，具有重大的經(jīng)濟價值和社會價值。本發(fā)明涉及一種植物表達載體，包含有如SEQ. ID. NO. 1所示的核苷酸序列，用于提高植物產(chǎn)量。本發(fā)明涉及將上述植物表達載體導入植物細胞中，獲得可提高產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物。導入方法都是本領(lǐng)域人員熟知的，這些方法包括但不僅限于農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化法、基因槍法、電擊法、顯微注射法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、PEG介導的轉(zhuǎn)化法、花粉管導入法等。本發(fā)明所用選擇標記基因為新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，可進一步包括其它選擇標記基因和報告基因。在本發(fā)明中GhMAPK6基因及含有該基因的植物表達載體也可以用于生產(chǎn)其它轉(zhuǎn)基因植物，包括轉(zhuǎn)基因植物的器官、組織、細胞及其種子和后代。


圖1.棉花中GhMAPK6氨基酸序列與幾種其它植物的MAPK氨基酸序列的比較結(jié)果。其中相同的氨基酸殘基用黑底表示。它們在GenBank中的物種來源及其注冊號分別為AtMAPK6 (擬南芥，NM_129941)、GmMAPK2 (大豆，AAQ14867)、LeMAPK2 (番茄，AAP20420)、 NtNTF4 (煙草，Q40532)、0sMAPK6 (水稻，ACD76439)、ZmMAPK6 (玉米，ACG37232)。圖2. GhMAPK6正義表達載體的構(gòu)建程序。圖3.部分轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定結(jié)果。1-9 轉(zhuǎn)基因煙草植株；CK+ :pBI121質(zhì)粒作為陽性對照；CK-非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?；M :marker DL2000。圖4.過量表達GhMAPK6的轉(zhuǎn)基因煙草與非轉(zhuǎn)基因煙草在苗期的生長狀況比較。A 非轉(zhuǎn)基因煙草；B 轉(zhuǎn)基因煙草。圖5.過量表達GhMAPK6的轉(zhuǎn)基因煙草與非轉(zhuǎn)基因煙草在產(chǎn)量方面的狀況比較。A 非轉(zhuǎn)基因煙草；B 轉(zhuǎn)基因煙草。
具體實施例方式基于本生煙生長速度快、生活周期短、離體培養(yǎng)再生能力強、遺傳轉(zhuǎn)化效率高等優(yōu)點，在下述實施例中以本生煙為例對本發(fā)明進行了詳細的說明。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。實施方式(一)一種棉花促絲裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK6的克隆方法1. RNA的提取利用TRIZOL試劑盒提取棉花總RNA2. cDNA第一鏈的合成(采用Transgen公司cDNA第一鏈合成試劑盒法)在0. 25ml離心管中加入下列試劑mRNA5μ 1Oligod(T)1 μ 12 X Buffer10 μ 1EasyScript Reverse Transcriptase 1 μ 1RNAase free water3 μ 1吸打混勻后42°C水浴30min，85°C水浴5min，冰上冷卻5min，輕離心后，保存?zhèn)溆谩?. cDNA的5'加尾反應(yīng)(a)反應(yīng)體系cDNA20 μ 15 X TdT Buffer10 μ 10.1% BSA5μ 1
IOOmMdCTP1 μ 1TdT1 μ 1ddH20Upto50 μ 1(b)37°C保溫 3Omin。(c)加 100 μ 1 無水乙醇，_20°C沉淀 30min。(d)12，000rpm，室溫離心5min。棄上清，干燥后加適量ddH20回溶。4. cDNA全長序列的獲得4. 1用簡并引物進行PCR反應(yīng)獲得GhMAPK6中間片段引物序列如下BPlchtaygghatbgtytgytgtgcBP2 gcaaccaacwgaccadatrtc
0163]體系如下
0164]IOXEasyTaq buffer 2. 5 μ 1
0165]dNTP mixture (IOmM) 1 μ 1
0166]BPl (10 μ Μ)1 μ 1
0167]ΒΡ2(10μΜ)1 μ 1
0168]cDNA1 μ 1
0169]TaqE0. 25 μ 1
0170]ddH20 Up to25 μ 1
0171]反應(yīng)程序為
0172]94°C 5min
0173]
權(quán)利要求
1.一種棉花促絲裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK6，其特征在于其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示；該核苷酸序列編碼的氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種棉花促絲裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK6的應(yīng)用，其特征在于該基因在本生煙草中過量表達，能提高轉(zhuǎn)基因煙草產(chǎn)量。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種棉花促絲裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK6及其應(yīng)用，屬于分子生物學和生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明采用同源克隆和RACE技術(shù)獲得一種棉花促絲裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK6，將該基因的cDNA序列置于CaMV 35S啟動子之下，構(gòu)建植物表達載體，轉(zhuǎn)化本生煙，使該基因在煙草中過量表達。實驗證實，轉(zhuǎn)基因煙草植株產(chǎn)量較非轉(zhuǎn)基因煙草植株顯著提高，表現(xiàn)為葉片面積增大、分蘗數(shù)增多、果莢數(shù)增加、結(jié)實率提高。因此，利用該基因在增加產(chǎn)量方面的特性，通過基因工程手段改善作物產(chǎn)量性狀，提高作物產(chǎn)量具有重要的現(xiàn)實意義。
文檔編號C12N15/54GK102154337SQ20101059083
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月7日
發(fā)明者吳長艾, 張偉, 張良, 李玉真, 郭興啟 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學