結(jié)合淋巴細(xì)胞活化基因-3(lag-3)的抗體的優(yōu)化及該抗體的用途
【專利摘要】本發(fā)明提供分離的單克隆抗體，其特異性結(jié)合LAG-3且與先前描述的抗LAG-3抗體(例如抗體25F7(US 2011/0150892A1))相比具有優(yōu)化的功能特性。這些特性包括減少的去酰胺化位點(diǎn)，同時(shí)仍然保留對(duì)人LAG-3的高親和力結(jié)合，以及物理(即熱和化學(xué))穩(wěn)定性。亦提供編碼本發(fā)明的抗體的核酸分子、用于表達(dá)本發(fā)明抗體的表達(dá)載體、宿主細(xì)胞和方法，以及包含所述抗體的免疫綴合物、雙特異性分子及藥物組合物。本發(fā)明亦提供用于檢測(cè)LAG-3的方法以及使用本發(fā)明的抗LAG-3抗體刺激免疫反應(yīng)的治療方法。亦提供組合療法，其中將所述抗體與至少一種另外的免疫刺激性抗體共施用。
【專利說明】結(jié)合淋巴細(xì)胞活化基因-3 (LAG-3)的抗體的優(yōu)化及該抗體 的用途
[0001] 發(fā)明背景
[0002] 治療性抗體是醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中最快發(fā)展的部分之一。為維持效力（即活性）并使免疫 原性最小化，在制造及儲(chǔ)存期間必須防止抗體及其他蛋白質(zhì)藥物發(fā)生物理和化學(xué)降解。實(shí) 際上，在研發(fā)抗體治療物中的一個(gè)主要困難是在對(duì)受試者施用時(shí)的潛在免疫原性反應(yīng)，其 可導(dǎo)致快速清除或甚至誘導(dǎo)危及生命的副作用（包括過敏性休克）。許多因素影響抗體的 免疫原性，例如其生理化學(xué)特性（例如純度、穩(wěn)定性或溶解性）、臨床因素（例如劑量、施用 路徑、疾病異質(zhì)性或患者特征）、及其他藥劑的伴隨治療（Swann等人（2008)Curr Opinion Tmmuol 20:493-499) 〇
[0003] 抗體的免疫原性和/或抗體活性的損失通常是由去酰胺化所致。去酰胺化是自發(fā) 性發(fā)生于蛋白質(zhì)（例如抗體）中的化學(xué)降解過程。去酰胺化自氨基酸殘基（例如天冬酰胺 及谷氨酰胺）去除酰胺官能團(tuán)，由此破壞其含酰胺的側(cè)鏈。這繼而在整個(gè)蛋白質(zhì)中引起結(jié) 構(gòu)及生物學(xué)變化，由此創(chuàng)建出抗體的異質(zhì)性形式。去酰胺化是在重組產(chǎn)生的治療性抗體中 發(fā)生的最常見的翻譯后修飾之一。
[0004] 舉例而言，Tsai等人（Pharm Res 10(11) :1580(1993))報(bào)導(dǎo)了單克隆抗體 hlB4(人源化抗CD18抗體）的重鏈中因細(xì)胞培養(yǎng)期間的去酰胺化而產(chǎn)生異質(zhì)性。此外，由 去酰胺化所致的生物活性的減小/損失已成為公認(rèn)問題。例如，Kroon等人表征了治療性 抗體0KT3中的幾個(gè)去酰胺化位點(diǎn)，并報(bào)導(dǎo)0KT3生產(chǎn)批次的樣品（出廠14個(gè)月至3年） 已降至低于75%活性（Pharm Res 9 (11) :1386 (1992)，第1389頁，第二欄）。此外，在圖譜 中展示大量氧化肽的0KT3樣品在抗原結(jié)合效力測(cè)定中具有顯著降低的活性（第1390頁， 第一欄）。作者總結(jié)得出，在儲(chǔ)存0KT3時(shí)發(fā)生的化學(xué)修飾的特定位點(diǎn)可通過肽圖譜法進(jìn)行 鑒別且與抗體的化學(xué)分析及生物測(cè)定中所觀察到的變化相關(guān)（第1392頁，第一欄）。對(duì) 于多種其他去酰胺化的治療性蛋白亦已報(bào)導(dǎo)生物活性損失，包括重組人DNase(Cacia等人 (1993) J. Chromatogr. 634:229-239)和重組可溶性 CD4(Teshima等人（1991)Biochemistry 30:3916-3922)。
[0005] 總之，去酰胺化在醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中引起重要且不可預(yù)測(cè)的問題。具體地，與監(jiān)測(cè)由抗體 治療物內(nèi)的去酰胺化引起的變化性有關(guān)的工作以及與此變化性有關(guān)的FDA關(guān)注增加成本 且延遲臨床試驗(yàn)。另外，用于解決此問題的改良，包括改變與易受去酰胺化影響的氨基酸的 重組產(chǎn)生和/或改變（例如定點(diǎn)誘變）有關(guān)的條件（例如溫度、pH和細(xì)胞類型），可負(fù)面影 響穩(wěn)定性及活性，尤其當(dāng)在抗體的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)內(nèi)作出改變時(shí)。因此，需要治療性抗體 的更穩(wěn)定形式。
[0006] 發(fā)明概述
[0007] 本發(fā)明提供分離的單克隆抗體（例如人單克隆抗體），其結(jié)合LAG_3(例如人 LAG-3)且與先前所描述的抗LAG-3抗體相比具有優(yōu)化的物理穩(wěn)定性。具體地，本發(fā)明涉及 抗體25F7 (US 2011/0150892 Al)的經(jīng)修飾形式，其與未修飾抗體相比展現(xiàn)顯著改良的熱穩(wěn) 定性及化學(xué)穩(wěn)定性。特定地，通過改變抗體25F7的重鏈CDR2域的關(guān)鍵結(jié)合區(qū)，展示經(jīng)修飾 的抗體展現(xiàn)出顯著較高的物理和熱穩(wěn)定性、降低的去酰胺化、更高的熱可逆性和更低的聚 集。同時(shí)，出人意料地觀察到，經(jīng)修飾的抗體保留與未修飾抗體同樣高的對(duì)人LAG-3的結(jié)合 親和力和功能活性，包括抑制LAG-3對(duì)主要組織相容性（MHC) II類分子的結(jié)合并刺激抗原 特異性T細(xì)胞反應(yīng)的能力。經(jīng)修飾抗體在穩(wěn)定性和結(jié)合/生物活性保留上的組合的實(shí)質(zhì)性 提高是令人驚訝的，尤其是考慮到CDR區(qū)對(duì)于抗體功能的關(guān)鍵性。
[0008] 本發(fā)明的抗體可用于各種應(yīng)用，包括檢測(cè)LAG-3蛋白和刺激帶腫瘤或攜帶病毒的 受試者中的抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)。
[0009] 因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種分離的單克隆抗體（例如人抗體）或其抗原結(jié) 合部分，其具有包含SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述 抗體進(jìn)一步包含輕鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO: 14的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 抗體或其抗原結(jié)合部分包含含有SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)的⑶Rl、⑶R2 及⑶R3區(qū)（例如分別為SEQ ID NO: 15、16及17)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體進(jìn)一步 包含含有SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的CDRUCDR2及CDR3區(qū)（例如分別為 SEQ ID NO:18、19 及 20)。
[0010] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，與抗體25F7相比，所述抗體展現(xiàn)增加的物理特性（即 熱穩(wěn)定性及化學(xué)穩(wěn)定性），同時(shí)仍保留至少與25F7相同的對(duì)人LAG-3的結(jié)合親和力。舉例 而言，與抗體25F7相比，所述抗體在重鏈CDR2區(qū)中展現(xiàn)降低的由去酰胺化所致的序列可變 性，例如在4°C 12周后（即在如本文描述的"實(shí)時(shí)"穩(wěn)定性研究下）氨基酸序列中約2. 5% 或更少的修飾和/或在40°C 12周后（即在如本文描述的加速應(yīng)激條件下）氨基酸序列中 約12. 0%或更少的修飾，同時(shí)仍保留約至少IxKT7M或更小的Kd (更優(yōu)選地，IxKT8M或更小 的KD、5xl(T9M或更小的K d或IxKT9M或更小的Kd)的對(duì)人LAG-3的結(jié)合親和力。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，所述抗體在PH8. 0于PBS中展現(xiàn)至少約40 %的熱可逆性。
[0011] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，與未修飾抗體相比，所述抗體擁有較高熔解溫度（指示體 內(nèi)更高的總體穩(wěn)定性）（Krishnamurthy R 及 Manning MC(2002)Curr Pharm Biotechnol 3:361-71)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體展現(xiàn)大于60°C (例如大于65°C或大于70°C)的 Tm (初始解折疊溫度）。可使用差示掃描量熱法（Chen等人（2003) Pharm Res 20:1952-60 ; Ghirlando 等人（1999) Immunol Lett68:47-52)或圓二色性（Murray 等人，（2002) J.Chromatogr Sci 40:343-9)來測(cè)量抗體的烙點(diǎn)。
[0012] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體的特征在于其對(duì)快速降解的抗性?？墒褂妹?xì)管 電泳（CE)及 MALDI-MS 測(cè)量抗體降解（Alexander AJ 和 Hughes DE (1995) Anal Chem 67:3626-32)。
[0013] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體展現(xiàn)最小聚集效應(yīng)，例如25%或更?。ɡ?0% 或更小、15%或更小、10%或更小、5%或更小、或4%或更?。┑木奂?。聚集可導(dǎo)致觸發(fā)不 期望的免疫反應(yīng)和/或改變或不利的藥物動(dòng)力學(xué)特性，可通過幾種技術(shù)（包括大小排阻柱 (SEC)、高效液相層析（HPLC)及光散射）來測(cè)量聚集。
[0014] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體還展現(xiàn)至少一種以下特性：
[0015] (a)結(jié)合猴 LAG-3 ;
[0016] (b)缺少對(duì)小鼠 LAG-3的結(jié)合；
[0017] (c)抑制LAG-3對(duì)主要組織相容性（MHC) II類分子的結(jié)合；和
[0018] (d)刺激免疫反應(yīng)，特定而言抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)。
[0019] 優(yōu)選地，所述抗體展現(xiàn)特性（a)、（b)、（C)及（d)中的至少兩種。更優(yōu)選地，所述 抗體展現(xiàn)特性（a)、(b)、（c)及（d)中的至少三種。甚至更優(yōu)選地，所述抗體展現(xiàn)特性（a)、 (b)、（c)及（d)中的所有四種特性。
[0020] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體刺激抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)，例如抗原特異性T細(xì) 胞反應(yīng)中的白介素-2 (IL-2)產(chǎn)生。在其他實(shí)施方案中，抗體刺激免疫反應(yīng)，例如抗腫瘤反 應(yīng)（例如抑制體內(nèi)腫瘤移植物模型中的腫瘤生長(zhǎng)）或自體免疫反應(yīng)（例如在NOD小鼠中發(fā) 生糖尿?。?。
[0021] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體結(jié)合包括氨基酸序列PGHPLAPG(SEQ ID N0:21)的 人LAG-3的表位。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體結(jié)合包括氨基酸序列HPAAPSSW(SEQ ID N0:22)或 PAAPSSWG(SEQ ID N0:23)的人 LAG-3 的表位。
[0022] 在其他實(shí)施方案中，所述抗體通過免疫組織化學(xué)將垂體組織染色，或通過免疫組 織化學(xué)不會(huì)將垂體組織染色。
[0023] 本發(fā)明的抗體可為全長(zhǎng)抗體（例如IgGl、IgG2或IgG4同種型的全長(zhǎng)抗體），任 選地在重鏈恒定區(qū)鉸鏈區(qū)中具有絲氨酸至脯氨酸突變（在對(duì)應(yīng)于位置241的位置處，如在 Angal等人（1993)Mol. Immunol. 30:105-108中描述的），從而減小或消除重鏈間二硫鍵的 異質(zhì)性。在一個(gè)方面，恒定區(qū)同種型是在氨基酸殘基228處具有突變（例如S228P)的IgG4。 或者，所述抗體可為抗體片段（例如Fab、Fab'或Fab' 2片段）或單鏈抗體。
[0024] 在本發(fā)明的另一方面，抗體（或其抗原結(jié)合部分）是免疫綴合物的一部分，所述免 疫綴合物包含連接于該抗體的治療劑（例如細(xì)胞毒素或放射性同位素）。在另一方面，抗體 是雙特異性分子的一部分，所述雙特異性分子包含具有不同于該抗體或其抗原結(jié)合部分的 結(jié)合特異性的第二功能模塊（例如第二抗體）。
[0025] 亦提供組合物，其包含本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分、免疫綴合物或雙特異性 分子，任選地在藥學(xué)可接受的載體中配制。
[0026] 亦提供編碼本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分（例如可變區(qū)和/或CDR)的核酸分 子、以及包含這類核酸的表達(dá)載體及包含這類表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。亦提供使用包含這類 表達(dá)載體的宿主細(xì)胞制備抗LAG-3抗體的方法，且可包含以下步驟：（i)在宿主細(xì)胞中表達(dá) 該抗體及（ii)自宿主細(xì)胞分離抗體。
[0027] 在另一方面，本發(fā)明提供使用本發(fā)明的抗LAG-3抗體刺激免疫反應(yīng)的方法。在一 個(gè)實(shí)施方案中，該方法涉及通過使T細(xì)胞與本發(fā)明抗體接觸來刺激抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)， 從而刺激抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，刺激通過抗原特異性T細(xì)胞 的白介素-2產(chǎn)生。在另一個(gè)實(shí)施方案中，受試者是具腫瘤的受試者且刺激對(duì)腫瘤的免疫反 應(yīng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，受試者是攜帶病毒的受試者且刺激針對(duì)病毒的免疫反應(yīng)。
[0028] 在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種用于抑制受試者中的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法， 包括對(duì)受試者施用本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合部分，從而抑制受試者中的腫瘤生長(zhǎng)。在再一 實(shí)施例中，本發(fā)明提供治療受試者的病毒感染的方法，其包括向受試者施用本發(fā)明抗體或 其抗原結(jié)合部分，從而治療受試者的病毒感染。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該等方法包括施用本 發(fā)明的組合物、雙特異性分子或免疫綴合物。
[0029] 在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種用于刺激受試者中的免疫反應(yīng)的方法，其包 括對(duì)受試者施用本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分及至少一種另外的免疫刺激性抗體（例 如抗ro-Ι抗體、抗ro-Ll抗體和/或抗CTLA-4抗體），從而刺激受試者中的免疫反應(yīng)（例如 抑制腫瘤生長(zhǎng)或刺激抗病毒反應(yīng)）。在一個(gè)實(shí)施方案中，另外的免疫刺激性抗體是抗ro-i 抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，另外的免疫刺激劑是抗ro-Li抗體。在又一實(shí)施方案中，另外 的免疫刺激劑是抗CTLA-4抗體。在又一實(shí)施方案中，將本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分與 細(xì)胞因子（例如IL-2和/或IL-21)或共刺激性抗體（例如抗CD137和/或抗GITR抗體） 一起施用?？贵w可為例如人抗體、嵌合抗體或人源化抗體。
[0030] 在另一方面，本發(fā)明提供用于前述方法或用于制造供在前述方法中使用（例如用 于治療）的藥物的本發(fā)明的抗LAG-3抗體及組合物。
[0031] 本公開的其他特征及優(yōu)點(diǎn)自下列詳細(xì)說明及實(shí)例是顯而易見的，其不應(yīng)理解為限 制性的。在本申請(qǐng)案通篇中所引用的所有參考文獻(xiàn)、GenBank條目、專利及公開專利申請(qǐng)的 內(nèi)容皆通過提述明確并入本文中。
[0032] 附圖簡(jiǎn)述
[0033] 圖IA展示25F7人單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列（SEQ ID NO: 1)及氨基 酸序列（SEQ ID N0:2)qCDR1(SEQ ID N0:5)、CDR2(SEQ ID N0:6)及 CDR3(SEQ ID N0:7)區(qū) 劃線且指示V、D及J種系衍生。使用Kabat系統(tǒng)對(duì)Q)R區(qū)劃線（Kabat等人（1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5版，U. S. Department of Health and Human Services，NIH 公開案第 91-3242 號(hào)）。
[0034] 圖IB展示25F7人單克隆抗體的κ輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列（SEQ ID NO: 3)及氨 基酸序列（SEQ ID NO: 4)。CDRl (SEQ ID NO: 8)、CDR2 (SEQ ID NO: 9)及CDR3 (SEQ ID NO: 10) 區(qū)劃線且指示V及J種系衍生。抗體25F7的全長(zhǎng)重鏈及輕鏈氨基酸序列分別展示于SEQ ID NO:32 及 34 中。
[0035] 圖2A展示LAG3. 5單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列（SEQ ID N0:12)。 CDR1(SEQ ID N0:15)、CDR2(SEQ ID N0:16)及 CDR3(SEQ ID N0:17)區(qū)劃線?？贵w LAG3.5 的全長(zhǎng)重鏈及輕鏈氨基酸序列分別展示于SEQ ID NO:35及37中。
[0036] 圖2B展示LAG3. 5單克隆抗體的κ輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列（SEQ ID NO: 13)及 氨基酸序列（SEQ ID N0:14)。CDR1(SEQ ID N0:18)、CDR2(SEQ ID N0:19)及 CDR3(SEQ ID NO :20)區(qū)劃線。
[0037] 圖 3 展示 LAG-3 變體 LAG3.5(SEQ ID N0:16)、LAG3.6(SEQ ID N0:24)、LAG3.7(SEQ ID NO :25)及LAG3. 8 (SEQ ID NO :26)的CDR2重鏈可變區(qū)序列的氨基酸序列，將其與抗體 25F7(LAG3. I) (SEQ ID N0:6)的CDR2重鏈可變區(qū)序列的氨基酸序列及相應(yīng)人種系序列（SEQ ID N0:27)進(jìn)行比較。LAG3. 5的⑶R2重鏈可變區(qū)與25F7的⑶R2重鏈可變區(qū)的不同之處 在于54位處的精氨酸（R)(相對(duì)于天冬酰胺（N))及56位處的絲氨酸（S)(相對(duì)于天冬酰 胺（N))。LAG3. 5與25F7的其余CDR相同。
[0038] 圖 4A 及 4B 是展示抗體 LAG3. I (25F7)、LAG3. 2、LAG3. 5、LAG3. 6、LAG3. 7 及 LAG3. 8 對(duì)活化的人CD4+T細(xì)胞的結(jié)合活性（分別為EC5tl及親和力）的圖形。
[0039] 圖 5A、5B、5C、ro 及 5E 是分別展示抗體 LAG3. I (25F7)、LAG3. 5、LAG3. 6、LAG3. 7 及 LAG3. 8的熱熔解曲線（即熱穩(wěn)定性）的圖形。
[0040] 圖 6A、6B、6C、6D 及 6E 是分別展示抗體 LAG3. I (25F7)、LAG3. 5、LAG3. 6、LAG3. 7 及 LAG3. 8的熱可逆性曲線（即熱穩(wěn)定性）的圖形。
[0041] 圖7是展示抗體LAG3. I (25F7)及LAG3. 5對(duì)活化的人⑶4+T細(xì)胞的結(jié)合活性及抗 原結(jié)合（Biacore)的圖形。
[0042] 圖8展示使用質(zhì)譜術(shù)對(duì)抗體LAG3. I (25F7)及LAG3. 5實(shí)施肽圖譜法的結(jié)果（化學(xué) 修飾/分子穩(wěn)定性），其反映了在如本文所闡述的加速應(yīng)激條件下溫育5天后的去酰胺化及 異構(gòu)化。
[0043] 圖9是比較抗體LAG3. I (25F7)及LAG3. 5的親水性概況（profile)的圖形。
[0044] 圖10A、10B、10C及IOD是比較抗體LAG3. 1及LAG3. 5在4°C及40°C (即如本文所 闡述的兩種加速應(yīng)激條件和"實(shí)時(shí)"穩(wěn)定性研究）的親和力及物理穩(wěn)定性（即熱穩(wěn)定性及 化學(xué)穩(wěn)定性）的圖形。
[0045] 圖IlA及IlB是比較抗體LAG3. 1及LAG3. 5在4°C及40°C的氨基酸序列的百分比 修飾的圖形。
[0046] 發(fā)明詳述
[0047] 為可更易于理解本揭示內(nèi)容，首先定義某些術(shù)語。其他定義闡述于整個(gè)詳細(xì)說明 中。
[0048] 術(shù)語"25F7"、"抗體 25F7"、"抗體 LAG3. 1"及"LAG3. 1"指 US2011/0150892A1 中所 闡述的抗人LAG-3抗體。編碼25F7(LAG3. 1)的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列（SEQ ID N0:1) 及相應(yīng)氨基酸序列（SEQ ID NO: 2)展示于圖IA中（其中⑶R序列分別稱為SEQ ID NO: 4、 5及7)。編碼25F7(LAG3. 1)的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列（SEQ ID N0:3)及相應(yīng)氨基酸序 列（SEQ ID NO:4)展示于圖IB中（其中CDR序列分別稱為SEQ ID NO:8、9及10)。
[0049] 術(shù)語"LAG-3"是指淋巴細(xì)胞活化基因-3。術(shù)語"LAG-3"包含變體、同等型 (isoform)、同源物、直系同源體（ortholog)及旁系同源體（paralog)。舉例而言，在某些 情形下，人LAG-3蛋白的特異性抗體可與來自人外的物種的LAG-3蛋白交叉反應(yīng)。在其他 實(shí)施方案中，人LAG-3蛋白的特異性抗體可對(duì)人LAG-3蛋白具有完全特異性且不展現(xiàn)物種 或其他類型的交叉反應(yīng)性，或可與來自某些其他物種（但并非所有其他物種）的LAG-3交 叉反應(yīng)（例如與猴L(fēng)AG-3交叉反應(yīng)但不與小鼠 LAG-3交叉反應(yīng)）。術(shù)語"人LAG-3"指人 序列LAG-3,例如人LAG-3的具有Genbank登錄編號(hào)：NP_002277的完整氨基酸序列（SEQ ID N0:29)。術(shù)語"小鼠 LAG-3"指小鼠序列LAG-3,例如小鼠 LAG-3的具有Genbank登錄編 號(hào)：NP_032505的完整氨基酸序列。本領(lǐng)域中亦已知LAG-3,例如⑶223。人LAG-3序列與 Genbank登錄編號(hào)：NP_002277的人LAG-3的不同之處可在于具有例如保守突變或在非保守 區(qū)中的突變，且LAG-3與Genbank登錄編號(hào)：NP_002277的人LAG-3具有實(shí)質(zhì)上相同的生物 功能。舉例而言，人LAG-3的生物功能是在LAG-3的胞外域中具有表位，該表位被本公開的 抗體特異性結(jié)合，或人LAG-3的生物功能是結(jié)合MHC II類分子。
[0050] 術(shù)語"猴L(fēng)AG-3"意圖涵蓋由舊大陸猴（Old World monkey)及新大陸猴（New World monkey)表達(dá)的LAG-3蛋白（包含但不限于獼猴L(fēng)AG-3及恒河猴L(fēng)AG-3)。猴L(fēng)AG-3的代表性 氨基酸序列是恒河猴L(fēng)AG-3氨基酸序列，其亦存放為Genbank登錄編號(hào)：XM_001108923。猴 LAG-3的另一代表性氨基酸序列是克隆pa23-5的備選恒河猴序列，如US 2011/0150892A1 中所闡述的。與Genbank存放的序列相比，這一備選的恒河猴序列在419位處展現(xiàn)單氨基 酸差異。
[0051] 特定人LAG-3序列在氨基酸序列中通常與Genbank登錄編號(hào)：NP_002277的人 LAG-3至少90%相同，且含有在與其他物種（例如鼠類）的LAG-3氨基酸序列相比時(shí)鑒別 為人氨基酸序列的氨基酸殘基。在某些情形下，人LAG-3在氨基酸序列中可與Genbank登 錄編號(hào)：NP_002277的LAG-3至少95%或甚至至少96%、97%、98%或99%相同。在某些實(shí) 施方案中，人LAG-3序列較Genbank登錄編號(hào)：NP_002277的LAG-3序列顯示不超過10個(gè) 氨基酸差異。在某些實(shí)施方案中，人LAG-3可較Genbank登錄編號(hào)：NP_002277的LAG-3序 列顯示不超過5或甚至不超過4、3、2或1個(gè)氨基酸差異。可如本文所闡述的測(cè)定百分比同 一性。
[0052] 術(shù)語"免疫反應(yīng)"指例如淋巴細(xì)胞、抗原呈現(xiàn)細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、粒細(xì)胞及由上述細(xì)胞 或肝產(chǎn)生的可溶性大分子（包含抗體、細(xì)胞因子及補(bǔ)體）的作用，該作用可使得選擇性損 害、破壞或從人體消除侵入的病原體、感染病原體的細(xì)胞或組織、癌細(xì)胞或（在自體免疫性 或病理學(xué)驗(yàn)證的情形下）正常人細(xì)胞或組織。
[0053] "抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)"是指源于使用T細(xì)胞特異性抗原刺激T細(xì)胞的T細(xì)胞 反應(yīng)。在抗原特異性刺激后的T細(xì)胞反應(yīng)的非限制性實(shí)例包含增殖及細(xì)胞因子產(chǎn)生（例如 IL-2產(chǎn)生）。
[0054] 如本文所提及的術(shù)語"抗體"包含全抗體及其任一抗原結(jié)合片段（即"抗原結(jié)合部 分"）或單鏈。全抗體是包括通過二硫鍵互連的至少兩條重（H)鏈及兩條輕（L)鏈的糖蛋 白。每一重鏈包括重鏈可變區(qū)（本文縮寫為V h)及重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包括三個(gè)域： CH1、CH2&CH3。每一輕鏈包括輕鏈可變區(qū)（本文縮寫為VJ及輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包 括一個(gè)域Q。可將V h及'區(qū)進(jìn)一步細(xì)分成高可變區(qū)（稱為互補(bǔ)決定區(qū)（CDR))及較為保守 的區(qū)（稱為框架區(qū)（FR))，二者間雜排列。每一 VH及VL由三個(gè)CDR及四個(gè)FR構(gòu)成，其自 氨基末端至羧基末端按下列順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈 的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合域?？贵w的恒定區(qū)可介導(dǎo)免疫球蛋白對(duì)宿主組織或因 子（包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞（例如效應(yīng)器細(xì)胞）及經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分（Clq))的 結(jié)合。
[0055] 本文所用的術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"（或簡(jiǎn)稱為"抗體部分"）是指保留特異性 結(jié)合至抗原（例如LAG-3蛋白）的能力的一或多個(gè)抗體片段。已展示，抗體的抗原結(jié)合功 能可由全長(zhǎng)抗體的片段來實(shí)施。涵蓋于術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"內(nèi)的結(jié)合片段的實(shí)例包 含⑴Fab片段，其是由V h、(^及ChI域組成的單價(jià)片段；（ii) F (ab'）2片段，其是包含兩 個(gè)通過鉸鏈區(qū)處的二硫鍵連接的Fab片段的二價(jià)片段；（iii)由V h及Chi域組成的Fd片段； (iv)由Vh及Chi域組成的Fv片段；（V)由抗體單臂的V lj及Vh域組成的Fv片段；（vi) dAb 片段（Ward等人，（1989)Nature 341:544-546)，其由\^域組成；（vii)分離的互補(bǔ)決定區(qū) (CDR);及（viii)納米抗體（nanobody)，其是含有單一可變域及兩個(gè)恒定域的重鏈可變區(qū)。 另外，盡管Fv片段的兩個(gè)域（'及V h)是由分開的基因編碼，但可使用重組方法通過合成接 頭將此兩個(gè)域連接在一起，此合成接頭使其能夠以單一蛋白質(zhì)鏈制備，其中 '及Vh區(qū)配對(duì) 形成單價(jià)分子（稱為單鏈Fv(scFv);例如參見Bird等人（1988) Science 242:423-426;及 Huston 等人（1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。這類單鏈抗體亦意圖涵蓋 于術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"內(nèi)。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常見技術(shù)獲得這些抗體片 段，并以與完整抗體相同的方式篩選片段以供使用。
[0056] 本文所用的"分離的抗體"意圖指實(shí)質(zhì)上不含具有不同抗原特異性的其他抗體的 抗體（舉例而言，與LAG-3蛋白特異性結(jié)合的分離的抗體實(shí)質(zhì)上沒有特異性結(jié)合除LAG-3 蛋白外的抗原的抗體）。然而，特異性結(jié)合人LAG-3蛋白的分離的抗體可與其他抗原（例如 來自其他物種的LAG-3蛋白）具有交叉反應(yīng)性。另外，分離的抗體可實(shí)質(zhì)上沒有其他細(xì)胞 材料和/或化學(xué)物。
[0057] 本文所用的術(shù)語"單克隆抗體"或"單克隆抗體組合物"是指具有單一分子組成的 抗體分子制備物。單克隆抗體組合物對(duì)于特定表位顯示單一結(jié)合特異性及親和力。
[0058] 本文所用的術(shù)語"人抗體"意圖包含具有其中框架及CDR區(qū)兩者衍生自人種系免 疫球蛋白序列的可變區(qū)的抗體。另外，若抗體含有恒定區(qū)，則恒定區(qū)亦衍生自人種系免疫球 蛋白序列。本發(fā)明的人抗體可包含并非由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基（例如 通過體外隨機(jī)隨機(jī)或定點(diǎn)誘變或通過體內(nèi)體細(xì)胞突變引入的突變）。然而，本文所用的術(shù)語 "人抗體"不意圖包含其中將衍生自另一哺乳動(dòng)物物種（例如小鼠）種系的CDR序列移植到 人框架序列上的抗體。
[0059] 術(shù)語"人單克隆抗體"是指顯示單一結(jié)合特異性的抗體，其具有其中框架及CDR區(qū) 皆衍生自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，人單克隆抗體可通過雜交 瘤產(chǎn)生，該雜交瘤包含自轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物（例如轉(zhuǎn)基因小鼠）獲得的B細(xì)胞，其具有包含人 重鏈轉(zhuǎn)基因及輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組，所述B細(xì)胞融合至永生化細(xì)胞。
[0060] 本文所用的術(shù)語"重組人抗體"包含通過重組方式制備、表現(xiàn)、創(chuàng)建或分離的所有 人抗體，例如（a)自對(duì)于人免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體的動(dòng)物（例如小鼠）或從其 制備的雜交瘤分離的抗體（進(jìn)一步闡述于下文中）；(b)自經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達(dá)人抗體的宿主細(xì)胞 (例如自轉(zhuǎn)染瘤）分離的抗體；（c)自重組、組合人抗體文庫分離的抗體；和（d)及通過涉及 將人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他手段所制備、表達(dá)、創(chuàng)建或分離 的抗體。這類重組人抗體具有其中框架及⑶R區(qū)衍生自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)。 然而，在某些實(shí)施方案中，這類重組人抗體可經(jīng)受體外誘變（或在使用對(duì)于人Ig序列轉(zhuǎn)基 因的動(dòng)物時(shí)經(jīng)受體內(nèi)體細(xì)胞誘變），且由此重組抗體的V h及 '區(qū)的氨基酸序列盡管源自人 種系Vh及 '序列并與其相關(guān)，但其是不可天然存在于體內(nèi)人抗體種系儲(chǔ)庫中的序列。
[0061] 術(shù)語"同種型"是指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體種類（例如IgM或IgGl)。
[0062] 短語"識(shí)別抗原的抗體"及"抗原特異性抗體"在本文中可與術(shù)語"特異性結(jié)合抗 原的抗體"互換使用。
[0063] 術(shù)語"人抗體衍生物"是指人抗體的任一修飾形式，例如抗體與另一藥劑或抗體的 綴合物。
[0064] 術(shù)語"人源化抗體"意圖指其中將衍生自另一哺乳動(dòng)物物種（例如小鼠）種系的 CDR序列移植到人框架序列上的抗體。可在人框架序列內(nèi)作出其他框架區(qū)修飾。
[0065] 術(shù)語"嵌合抗體"意圖指其中可變區(qū)序列衍生自一種物種且恒定區(qū)序列衍生自另 一物種的抗體，例如其中可變區(qū)序列衍生自小鼠抗體且恒定區(qū)序列衍生自人抗體的抗體。 [0066] 如本文中所使用，"特異性結(jié)合人LAG-3"的抗體意圖指結(jié)合人LAG-3蛋白（及可 能的來自一或多種非人物種的LAG-3蛋白）但不實(shí)質(zhì)性結(jié)合非LAG-3蛋白的抗體。優(yōu)選地， 抗體以"高親和力"結(jié)合人LAG-3蛋白，即Kd為I X KT7M或更小、更優(yōu)選地I X KT8M或更小、 更優(yōu)選地5 X KT9M或更小、更優(yōu)選地I X KT9M或更小。
[0067] 本文所用的術(shù)語"不實(shí)質(zhì)性結(jié)合"蛋白質(zhì)或細(xì)胞意指不結(jié)合或不以高親和力結(jié)合 蛋白質(zhì)或細(xì)胞，即以以下K d結(jié)合蛋白質(zhì)或細(xì)胞：I X KT6M或更高、更優(yōu)選地I X KT5M或更高、 更優(yōu)選地I X KT4M或更高、更優(yōu)選地I X KT3M或更高、甚至更優(yōu)選地I X KT2M或更高。
[0068] 本文所用的術(shù)語"Kass。。"或"Ka"意圖指特定抗體-抗原相互作用的締合速率，而本 文所用的術(shù)語"K dis"或"Kd"意圖指特定抗體-抗原相互作用的解離速率。本文所用的術(shù)語 "KD"意圖指解離常數(shù)，其是自&對(duì)1( 3的比率（即Kd/Ka)獲得且表示為摩爾濃度（M)?？墒?用本領(lǐng)域中充分確立的方法測(cè)定抗體的K d值。測(cè)定抗體的Kd的優(yōu)選方法是通過使用表面 等離振子共振，優(yōu)選地使用生物傳感器系統(tǒng)（例如：Biaa>rek系統(tǒng)）。
[0069] 術(shù)語"高親和力"對(duì)于IgG抗體是指抗體對(duì)于靶抗原具有以下Kd =IXKT7M或更小、 更優(yōu)選地5 X KT8M或更小、甚至更優(yōu)選地I X KT8M或更小、甚至更優(yōu)選地5 X KT9M或更小及 甚至更優(yōu)選地I X KT9M或更小。然而，對(duì)于其他抗體同種型而言，"高親和力"結(jié)合可有所 變化。舉例而言，IgM同種型的"高親和力"結(jié)合是指抗體具有KT 6M或更小、更優(yōu)選地KT7M 或更小、甚至更優(yōu)選地KT8M或更小的KD。
[0070] 術(shù)語"去酰胺化"是指自發(fā)性發(fā)生于蛋白質(zhì)（例如抗體）中的化學(xué)降解過程。去 酰胺化自氨基酸殘基（例如天冬酰胺及谷氨酰胺）去除酰胺官能團(tuán)，由此破壞其含有酰胺 的側(cè)鏈。具體而言，天冬酰胺的側(cè)鏈攻擊毗鄰肽基團(tuán)，從而形成對(duì)稱的琥珀酰亞胺中間體。 中間體的對(duì)稱性產(chǎn)生兩種水解產(chǎn)物，即天冬氨酸或異天冬氨酸。類似反應(yīng)亦可發(fā)生于天冬 氨酸側(cè)鏈中，從而使得部分轉(zhuǎn)化成異天冬氨酸。在谷氨酰胺的情形下，去酰胺化速率通常比 天冬酰胺小10倍，然而，機(jī)制基本相同，從而僅需水分子即可進(jìn)行。
[0071] 術(shù)語"受試者"包含任一人或非人動(dòng)物。術(shù)語"非人動(dòng)物"包含所有脊椎動(dòng)物，例 如哺乳動(dòng)物及非哺乳動(dòng)物，例如非人靈長(zhǎng)類、綿羊、犬、貓、牛、馬、雞、兩棲動(dòng)物及爬行類，但 優(yōu)選哺乳動(dòng)物，例如非人靈長(zhǎng)類、綿羊、犬、貓、牛及馬。
[0072] 本發(fā)明的多個(gè)方面進(jìn)一步詳細(xì)闡述于下列小節(jié)中。
[0073] 具有增加的穩(wěn)定件及有利功能特件的抗LAG-3抗體
[0074] 本發(fā)明的抗體特異性結(jié)合人LAG-3且與先前所闡述抗LAG-3抗體相比，尤其是與 抗體25F7(LAG3. 1)相比具有優(yōu)化的穩(wěn)定性。此優(yōu)化包括降低的去酰胺化（例如增加的化 學(xué)穩(wěn)定性）及增加的熱重折疊（例如增加的物理穩(wěn)定性），同時(shí)仍保留對(duì)人LAG-3的高親和 力結(jié)合。
[0075] 用于鑒別去酰胺化位點(diǎn)的方法是本領(lǐng)域中已知的（例如參見離子交換、反相和疏 水性相互作用層析、和蛋白水解消化的肽圖譜法（LC-MS))。用于測(cè)量物理穩(wěn)定性的適宜測(cè) 定法包括，例如熔點(diǎn)分析和/或在變性后抗體結(jié)構(gòu)的重折疊（例如如記載于例如實(shí)施例3 第3部分中的百分比可逆性）。
[0076] 可使用一或多種亦在本領(lǐng)域中充分確立的技術(shù)來評(píng)價(jià)對(duì)人LAG-3的結(jié)合。舉例 而言,可通過流式細(xì)胞術(shù)分析來測(cè)試抗體,其中使抗體與表達(dá)人LAG-3的細(xì)胞系（例如經(jīng) 轉(zhuǎn)染以在其細(xì)胞表面上表達(dá)LAG-3 (例如人LAG-3或猴L(fēng)AG-3 (例如恒河猴或獼猴）或小 鼠 LAG-3)的CHO細(xì)胞）進(jìn)行反應(yīng)。適用于流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定的其他細(xì)胞包括抗CD3刺激的 ⑶4+活化T細(xì)胞，其表達(dá)天然LAG-3。另外或備選地，可在BIAcore測(cè)定法中測(cè)試抗體結(jié)合 (包含結(jié)合動(dòng)力學(xué)（例如K d值））。其他適宜的結(jié)合測(cè)定法包括例如使用重組LAG-3蛋白 的ELISA測(cè)定法。
[0077] 本發(fā)明的抗體優(yōu)選地以以下Kd結(jié)合人LAG-3蛋白：1 X KT7M或更小及更優(yōu)選地 I X KT8M或更小、5 X HT9M或更小或I X KT9M或更小。
[0078] 通常，抗體結(jié)合淋巴組織（例如扁桃體、脾或胸腺）中的LAG-3,這可以通過免疫組 織化學(xué)進(jìn)行檢測(cè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體將垂體組織染色（例如保留于垂體中），如 通過免疫組織化學(xué)所測(cè)量的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體不將垂體組織染色（即不保 留于垂體中），如通過免疫組織化學(xué)所測(cè)量的。
[0079] 其他功能特性包括與來自其他物種的LAG-3的交叉反應(yīng)性。舉例而言，抗體可結(jié) 合猴L(fēng)AG-3 (例如獼猴、恒河猴），但不實(shí)質(zhì)性結(jié)合至來自小鼠 LAG-3的LAG-3。優(yōu)選地，本 發(fā)明抗體以高親和力結(jié)合人LAG-3。
[0080] 其他功能特性包括抗體能夠刺激免疫反應(yīng)，例如抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)的能力。 這可以例如通過評(píng)價(jià)抗體刺激抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)中的白介素-2(IL-2)產(chǎn)生的能力進(jìn) 行測(cè)試。在某些實(shí)施方案中，抗體結(jié)合人LAG-3且刺激抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)。在其他實(shí) 施方案中，抗體結(jié)合人LAG-3但不刺激抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)。用于評(píng)估抗體刺激免疫反 應(yīng)的能力的其他手段包括測(cè)試其抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力，如在體內(nèi)腫瘤移植物模型中（例如 見實(shí)施例6)，或刺激自體免疫反應(yīng)的能力，如促進(jìn)自體免疫模型中的自體免疫疾病形成的 能力，例如促進(jìn)NOD小鼠模型中的糖尿病形成的能力。
[0081] 本發(fā)明的優(yōu)選抗體是人單克隆抗體。另外或備選地，所述抗體可為例如嵌合或人 源化單克隆抗體。
[0082] 單克降抗體LAG3. 5
[0083] 本發(fā)明的優(yōu)選抗體是人單克隆抗體LAG3. 5,其結(jié)構(gòu)及化學(xué)表征如下文及下列實(shí)施 例中所闡述。LAG3. 5的Vh氨基酸序列展示于SEQ ID NO: 12中（圖2A)。LAG3. 5的八氨 基酸序列展示于SEQ ID NO: 14中（圖2B)。
[0084] 結(jié)合人LAG-3的其他抗LAG-3抗體的Vh及 '序列（或⑶R序列）可與抗體LAG3. 5 的Vh及\序列（或CDR序列）"混合且匹配"。優(yōu)選地，在Vh及\鏈（或這類鏈內(nèi)的⑶R) 混合且匹配時(shí),使用結(jié)構(gòu)類似的V h序列代替來自特定VH/\配對(duì)的Vh序列。同樣，優(yōu)選地， 使用結(jié)構(gòu)類似的 '序列代替來自特定VH/\配對(duì)的 '序列。
[0085] 因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分包含：
[0086] (a)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 12的重鏈可變區(qū)（即LAG3. 5的Vh);及
[0087] (b)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 14的輕鏈可變區(qū)（即LAG3. 5的VJ或另一抗LAG3 抗體（即其不同于LAG3.5)的
[0088] 其中所述抗體特異性結(jié)合人LAG-3。
[0089] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分包含：
[0090] (a)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 12的重鏈可變區(qū)的⑶R1XDR2及⑶R3區(qū)（即分 別為 LAG3. 5 的 CDR 序列 SEQ ID NO: 15、16 及 17);及
[0091] (b)包含氨基酸序列SEQ ID NO: 14的輕鏈可變區(qū)的⑶RlXDR2及⑶R3區(qū)（即分 別為L(zhǎng)AG3. 5的CDR序列SEQ ID勵(lì):18、19及20)或另一抗1^3抗體（即其不同于1^3.5) 的 CDR ;
[0092] 其中所述抗體特異性結(jié)合人LAG-3。
[0093] 在又一實(shí)施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分包含與結(jié)合人LAG-3的其他抗體 的CDR(例如不同的抗LAG-3抗體的重鏈可變區(qū)的CDRl和/或CDR3,和/或輕鏈可變區(qū)的 ⑶R1、⑶R2和/或⑶R3)組合的LAG3. 5的重鏈可變⑶R2區(qū)。
[0094] 此外，在本領(lǐng)域中已眾所周知，⑶R3域（獨(dú)立于⑶Rl和/或⑶R2域）單獨(dú)即可決 定抗體對(duì)于同類抗原的結(jié)合特異性，且基于共同CDR3序列可以可預(yù)測(cè)地生成具有相同結(jié)合 特異性的多種抗體。例如參見 Klimka 等人，British J. of Cancer 83(2):252-260(2000); Beiboer 等人，J. Mol. Biol. 296:833-849(2000) ;Rader 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 95:8910-8915 (1998) ;Barbas 等人，J. Am. Chem.Soc. 116: 2161-2162 (1994); Barbas 等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:2529-2533 (1995) ;Ditzel 等人， J. Immunol. 157:739-749(1996) ;Berezov 等人，BIAjournal 8:Scientific Review 8(2001) ;Igarashi 等人，J. Biochem(Tokyo) 117:452-7(1995) !Bourgeois 等人， J. Virol 72:807-10(1998) ;Levi 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 90:4374-8 (1993); Polymenis 及 Stoller，J. Immunol. 152:5218-5329(1994)以及 Xu 及 Davis, Immunity 13:37-45(2000)。亦參見美國專利第 6, 951，646 號(hào)、第 6, 914, 128 號(hào)、第 6, 090, 382 號(hào)、第 6, 818, 216 號(hào)、第 6, 156, 313 號(hào)、第 6, 827, 925 號(hào)、第 5, 833, 943 號(hào)、第 5, 762, 905 號(hào)及第 5, 760, 185號(hào)。這類參考文獻(xiàn)中的每一篇均通過提述完整并入本文。
[0095] 因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含LAG3. 5的重鏈可變區(qū)的⑶R2和至 少LAG3. 5的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的CDR3 (SEQ ID NO: 17和/或20)，或另一 LAG-3抗體 的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的CDR3,其中所述抗體能夠特異性結(jié)合人LAG-3。這些抗體優(yōu)選 地與LAG3. 5(a)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合；(b)保留功能特征；（c)結(jié)合相同表位；和/或（d)具有類似的 結(jié)合親和力。在又一實(shí)施方案中，所述抗體進(jìn)一步可包含LAG3. 5的輕鏈可變區(qū)的⑶R2(SEQ ID NO: 17和/或20)，或另一 LAG-3抗體的輕鏈可變區(qū)的CDR2,其中該抗體能夠特異性結(jié)合 人LAG-3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體還可包含LAG3. 5的重鏈和/或輕鏈可變區(qū) 的CDRl (SEQ ID NO: 17和/或20)，或另一 LAG-3抗體的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的CDR1，其 中該抗體能夠特異性結(jié)合人LAG-3。
[0096] 保守修飾
[0097] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含具有⑶R1、⑶R2及⑶R3序列的重鏈 和/或輕鏈可變區(qū)序列，其與LAG3. 5的那些序列的不同之處在于一或多種保守修飾。然 而，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，Vh CDR2的殘基54及56分別保持為精氨酸及絲氨酸（即 并未突變）。在本領(lǐng)域中應(yīng)理解，可進(jìn)行某些保守序列修飾，其不消除抗原結(jié)合。例如參 見 Brummell 等人（1993)Biochem32:1180-8 ;de Wildt 等人（1997)Prot. Eng. 10:835-41 ; Komissarov 等人（1997)J.Biol. Chem. 272:26864-26870 ;Hall 等人（1992) J. Tmmunol. 149:1605-12 ;Kelley 及 0，Connell(1993)Biochem. 32:6862-35 ;Adib_Conquy 等人（1998) Int. Immunol. 10:341-6 及 Beers 等人（2000) Clin. Can. Res. 6:2835-43。因此， 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體包含含有⑶RU⑶R2及⑶R3序列的重鏈可變區(qū)和/或含有 ⑶R1、⑶R2及⑶R3序列的輕鏈可變區(qū)，其中：
[0098] (a)重鏈可變區(qū)CDRl序列包括SEQ ID NO: 15和/或其保守修飾（54及56位除 外）；且/或
[0099] (b)重鏈可變區(qū)CDR3序列包括SEQ ID NO: 17及其保守修飾；且/或
[0100] (c)輕鏈可變區(qū)CDRl和/或CDR2和/或CDR3序列包含SEQ ID NO: 18和/或SEQ ID NO: 19和/或SEQ ID NO:20和/或其保守修飾；且 [0101] (d)抗體特異性結(jié)合人LAG-3。
[0102] 另外或備選地，所述抗體可擁有諸如下列上述功能特性中的一或多種，如以高親 和力結(jié)合人LAG-3、結(jié)合猴L(fēng)AG-3、缺少對(duì)小鼠 LAG-3的結(jié)合、抑制LAG-3對(duì)MHC II類分子 的結(jié)合的能力和/或刺激抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)的能力。
[0103] 在各種實(shí)施方案中，抗體可為例如人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。
[0104] 如本文中所使用，術(shù)語"保守序列修飾"意圖指不顯著影響或改變含有氨基酸序列 的抗體的結(jié)合特征的氨基酸修飾。這類保守修飾包含氨基酸取代、添加及缺失?？赏ㄟ^本 領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)（例如定點(diǎn)誘變及PCR介導(dǎo)的誘變）將修飾引入本發(fā)明抗體中。保 守氨基酸取代是使用具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基代替氨基酸殘基。本領(lǐng)域中已定義具有類 似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包含具有以下側(cè)鏈的氨基酸：堿性側(cè)鏈（例如賴氨 酸、精氨酸、組胺酸）、酸性側(cè)鏈（例如天冬氨酸、谷氨酸）、不帶電荷的極性側(cè)鏈（例如甘氨 酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸）、非極性側(cè)鏈（例如丙 氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸）、β-支鏈側(cè)鏈（例如蘇氨 酸、纈氨酸、異亮氨酸）及芳族側(cè)鏈（例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸）。因此，本發(fā) 明抗體的CDR區(qū)內(nèi)的一或多個(gè)氨基酸殘基可經(jīng)來自相同側(cè)鏈家族的其他氨基酸殘基代替， 且可使用本文所闡述的功能測(cè)定法測(cè)試經(jīng)改變抗體的保留功能（即上文所述的功能）。
[0105] 工稈化和經(jīng)修飾的抗體
[0106] 可使用具有LAG3. 5的一個(gè)或多個(gè)Vh和/或' 序列的抗體作為起始材料來工程化 改造經(jīng)修飾的抗體以制備本發(fā)明抗體?？赏ㄟ^對(duì)一個(gè)或兩個(gè)可變區(qū)（即％和/或^內(nèi) (例如一或多個(gè)CDR區(qū)內(nèi)和/或一或多個(gè)框架區(qū)內(nèi)）的一或多個(gè)殘基進(jìn)行修飾來工程化抗 體。另外或備選地，可通過對(duì)恒定區(qū)內(nèi)的殘基進(jìn)行修飾來工程化抗體以例如改變抗體的效 應(yīng)器功能。
[0107] 在某些實(shí)施方案中，可利用CDR嫁接來工程化抗體的可變區(qū)。抗體與靶抗原主要 經(jīng)由位于6個(gè)重鏈及輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R)中的氨基酸殘基發(fā)生相互作用。出于此原因， CDR內(nèi)的氨基酸序列較CDR外側(cè)的序列在各抗體之間更為不同。由于CDR序列負(fù)責(zé)大部分抗 體-抗原相互作用，所以可以表達(dá)模擬特定天然存在抗體的特性的重組抗體，其通過構(gòu)建 包含來自特定天然存在抗體的CDR序列嫁接到來自具有不同特性的不同抗體的框架序列 上的表達(dá)載體（例如參見 Riechmann 等人（1998) Nature 332:323-327 ;Jones 等人（1986) Nature 321:522-525 ;Queen 等人（1989) Proc. Natl. Acad.參見· U. S. A. 86:10029-10033 ; 美國專利第5, 225, 539號(hào)、第5, 530, 101號(hào)、第5, 585, 089號(hào)、第5, 693, 762號(hào)及第 6, 180, 370 號(hào)）。
[0108] 因此，本發(fā)明的另一實(shí)施方案是關(guān)于一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分， 其包含重鏈可變區(qū)（包括分別包含SEQ ID NO: 15、16、17的CDRUCDR2及CDR3序列）和/ 或輕鏈可變區(qū)（包括分別包含SEQ ID N0:18、19、20的CDRUCDR2及CDR3序列）（即LAG3. 5 的⑶R)。盡管這些抗體含有單克隆抗體LAG3. 5的Vh及 '⑶R序列，但其可含有不同框架 序列。
[0109] 這類框架序列可自包含種系抗體基因序列的公開DNA數(shù)據(jù)庫或公開參考文獻(xiàn)獲 得。舉例而言，人重鏈及輕鏈可變區(qū)基因的種系DNA序列可見于"VBase"人種系序列數(shù)據(jù)庫 (可在因特網(wǎng)上于www. mrc-cpe. cam. ac. uk/vbase處獲得）以及Kabat等人（1"1)(引用 于上文中）；Tomlinson 等人（1992) "The Repertoire of Human Germline Vh Sequences Reveals about Fifty Groups of VaSegments with Different Hypervariable Loops"J. Mol.Biol. 227:776-798;及 Cox 等人（1994) "A Directory of Human Germ-line Vh Segments Reveals a Strong Bias in their Usage，'Eur. J. Immunol. 24:827-836 ;其中每 篇的內(nèi)容均通過提述明確并入本文。作為另一個(gè)例子，人重鏈及輕鏈可變區(qū)基因的種系DNA 序列可見于Genbank數(shù)據(jù)庫。舉例而言，在HC〇7HuMAb小鼠中發(fā)現(xiàn)的下列重鏈種系序列可以 隨附Genbank登錄編號(hào)獲得：1-69 (NG_0010109、NT_024637 及 BC070333)、3-33(NG_0010109 及 NT_024637)及 3-7 (NG_0010109 及 NT_024637)。根據(jù)另一例子，在 HCol2HuMAb 小鼠中 發(fā)現(xiàn)的下列重鏈種系序列可以隨附Genbank登錄編號(hào)獲得：1-69 (NG_0010109、NT_024637 及 BC070333)、5-51(NG_0010109 及 NT_024637)、4-34(NG_0010109 及 NT_024637)、 3-30. 3 (CAJ556644)及 3-23(AJ406678)。
[0110] 使用稱為Gapped BLAST (Altschul等人（1997)，參見上文）且為本領(lǐng)域技術(shù)人員 熟知的序列類似性搜尋方法之一來將抗體蛋白序列與經(jīng)編譯蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫比較。
[0111] 用于本發(fā)明抗體的優(yōu)選框架序列是那些在結(jié)構(gòu)上類似于本發(fā)明所選抗體所使用 的框架序列的（例如類似于本發(fā)明的優(yōu)選單克隆抗體所使用的ν Η4-34框架序列和/或Vk L6框架序列）?？蓪h OTR1、⑶R2及⑶R3序列及Vk OTR1、⑶R2及⑶R3序列嫁接到與在 衍生框架序列的種系免疫球蛋白基因中所發(fā)現(xiàn)序列具有相同序列的框架區(qū)上，或可將CDR 序列嫁接到與種系序列相比含有一或多個(gè)突變的框架區(qū)上。舉例而言，已發(fā)現(xiàn)在某些情況 下，可有益地使框架區(qū)內(nèi)的殘基突變以維持或增強(qiáng)抗體的抗原結(jié)合能力（例如參見美國專 利第 5, 530, 101 號(hào)、第 5, 585, 089 號(hào)、第 5, 693, 762 號(hào)及第 6, 180, 370 號(hào)）。
[0112] 另一類型的可變區(qū)修飾是使VjP/或' CDRUCDR2和/或CDR3區(qū)內(nèi)的氨基酸殘 基突變以由此改進(jìn)目的抗體的一或多種結(jié)合特性（例如親和力）?？蓪?shí)施定點(diǎn)誘變或PCR 介導(dǎo)的誘變以引入突變，并且可在體外或體內(nèi)測(cè)定法（如本文所闡述且提供于實(shí)施例中） 中評(píng)估對(duì)于抗體結(jié)合或感興趣的其他功能特性的影響。優(yōu)選地，引入保守修飾（如上文所 論述）。所述突變可為氨基酸取代、添加或缺失，但優(yōu)選地是取代。另外，通常改變CDR區(qū)內(nèi) 的不超過一處、兩處、三處、四處或五處殘基。
[0113] 因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的抗LAG-3單克隆抗體或其抗原結(jié) 合部分，其包含含有以下的重鏈可變區(qū)：（a)V h OTRl區(qū)，其包含SEQ ID NO: 15或與SEQ ID NO: 15相比具有一處、兩處、三處、四處或五處氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；(b)Vh ⑶R2區(qū)，其包含SEQ ID NO: 16或與SEQ ID NO: 16相比具有一處、兩處、三處、四處或五處氨 基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列（優(yōu)選地其中54及56位與SEQ ID NO: 16相同）；（c) Vh CDR3區(qū)，其包含SEQ ID NO: 17或與SEQ ID NO: 17相比具有一處、兩處、三處、四處或五 處氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；（d)\ OTRl區(qū)，其包含SEQ ID NO: 18或與SEQ ID NO: 18相比具有一處、兩處、三處、四處或五處氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；（e)' ⑶R2區(qū)，其包含SEQID NO: 19或與SEQ ID NO: 19相比具有一處、兩處、三處、四處或五處氨 基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；及（f)'⑶R3區(qū)，其包含SEQ ID N0:20或與SEQ ID N0:20相比具有一處、兩處、三處、四處或五處氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列。
[0114] 本發(fā)明的工程化抗體包括其中已對(duì)Vh和/或 '內(nèi)的框架殘基實(shí)施修飾以例如改 進(jìn)抗體的特性那些抗體。通常，實(shí)施這類框架修飾以降低抗體的免疫原性。舉例而言，一種 方式是將一或多種框架殘基"回復(fù)突變"至相應(yīng)的種系序列。更具體而言，發(fā)生體細(xì)胞突變 的抗體可含有與衍生該抗體的種系序列不同的框架殘基。可通過比較抗體框架序列與衍生 該抗體的種系序列來鑒別這類殘基。
[0115] 另一類型的框架修飾涉及使框架區(qū)內(nèi)或甚至一或多個(gè)CDR區(qū)內(nèi)的一或多種殘基 發(fā)生突變以去除T細(xì)胞表位，由此減小抗體的潛在免疫原性。此辦法亦稱為"去免疫化"且 進(jìn)一步詳細(xì)闡述于美國專利公開案第20030153043號(hào)中。
[0116] 在框架或CDR區(qū)內(nèi)做出的修飾外或作為該修飾的替代方式，可工程化本發(fā)明抗體 以包含F(xiàn)c區(qū)內(nèi)的修飾，從而通常改變抗體的一或多種功能特性，例如血清半衰期、補(bǔ)體固 定、Fc受體結(jié)合和/或抗原依賴性細(xì)胞性細(xì)胞毒性。另外，可以化學(xué)方式對(duì)本發(fā)明抗體實(shí) 施修飾（例如可將一或多個(gè)化學(xué)模塊附接至抗體）或經(jīng)修飾以改變其糖基化，從而也去改 變抗體的一或多種功能特性。這類實(shí)施方案中的每一種進(jìn)一步詳細(xì)闡述于下文中。Fc區(qū)中 的殘基編號(hào)是Kabat的EU索引中的編號(hào)。
[0117] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗體是IgG4同種型抗體，其在重鏈恒定區(qū)的鉸鏈 區(qū)中對(duì)應(yīng)于228位的位置處包括絲氨酸至脯氨酸的突變（S228P ;EU索引）。已報(bào)導(dǎo)，此突變 可消除鉸鏈區(qū)中的重鏈間二硫鍵的異質(zhì)性（Angal等人,參見上文；241位是基于Kabat編 號(hào)系統(tǒng)）。
[0118] 在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)CHl的鉸鏈區(qū)實(shí)施修飾，從而改變（例如增加或降低）鉸鏈 區(qū)中的半胱氨酸殘基的數(shù)目。此辦法進(jìn)一步闡述于美國專利第5, 677, 425號(hào)中。改變CHl 的鉸鏈區(qū)中半胱氨酸殘基的數(shù)目以例如促進(jìn)輕鏈及重鏈的裝配或增加或降低抗體的穩(wěn)定 性。
[0119] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，使抗體的Fc鉸鏈區(qū)突變以降低抗體的生物半衰期。更具體 而言，將一或多種氨基酸突變引入Fc鉸鏈片段的CH2-CH3域界面區(qū)中，從而使該抗體相對(duì) 于天然的Fc鉸鏈域葡萄球菌蛋白A(SpA)結(jié)合具有受損的SpA結(jié)合。此辦法進(jìn)一步詳細(xì)闡 述于美國專利第6, 165, 745號(hào)中。
[0120] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)抗體實(shí)施修飾以增加其生物半衰期。各種辦法皆是 可行的。舉例而言，可引入下列突變中的一或多者：T252L、T254S、T256F，如美國專利第 6, 277, 375號(hào)中所闡述。備選地，為增加生物半衰期，抗體可在CHl或CL區(qū)內(nèi)改變以含有自 IgG的Fc區(qū)中CH2域的兩個(gè)環(huán)獲取的補(bǔ)救受體結(jié)合表位，如美國專利第5, 869, 046號(hào)及第 6, 121，022號(hào)中所闡述。
[0121] 在其他實(shí)施方案中，通過使用不同氨基酸殘基代替至少一種氨基酸殘基來改變Fc 區(qū)以改變抗體的效應(yīng)器功能。舉例而言，可使用不同氨基酸殘基代替一或多種選自氨基酸 殘基234、235、236、237、297、318、320及322的氨基酸，從而抗體對(duì)效應(yīng)器配體具有改變的 親和力但保留親本抗體的抗原結(jié)合能力。對(duì)其親和力發(fā)生改變的效應(yīng)器配體可為例如Fc 受體或補(bǔ)體的Cl組分。此辦法進(jìn)一步詳細(xì)闡述于美國專利第5, 624, 821號(hào)及第5, 648, 260 號(hào)中。
[0122] 在另一例子中，可使用不同氨基酸殘基代替一或多種選自氨基酸殘基329、331及 322的氨基酸，從而抗體具有改變的Clq結(jié)合和/或降低或消除的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性 (⑶C)。此辦法進(jìn)一步詳細(xì)闡述于美國專利第6, 194, 551號(hào)中。
[0123] 在另一例子中，改變第231及239處氨基酸位置內(nèi)的一或多種氨基酸殘基以由此 改變抗體固定補(bǔ)體的能力。此辦法進(jìn)一步闡述于PCT公開文本W(wǎng)094/29351中。
[0124] 在又一例子中，通過對(duì)下列位置處的一或多種氨基酸進(jìn)行修飾來對(duì)Fc區(qū)實(shí)施修 飾以增加抗體介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性（ADCC)的能力和/或增加抗體對(duì)Fe γ受體的親 和力：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、 283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、 322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、 389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。此辦法進(jìn)一步闡述于？(：1'公開文本冊(cè) 00/42072中。另外，已定位人IgGl上對(duì)Fe γ Rl、Fc γ RII、Fc γ RIII及FcRn的結(jié)合位點(diǎn)且已 闡述具有改進(jìn)的結(jié)合的變體（參見Shields等人（2001)J. Biol. Chem. 276:6591-6604)。在 256、290、298、333、334及339位處的特定突變已展示可改進(jìn)對(duì)？(^1?111的結(jié)合。另外，顯 示下列組合突變體改進(jìn)Fc ^1?111結(jié)合：12564/32984、32984/^3334、32984/1(2244及3298八/ E333A/K334A。
[0125] 在再一實(shí)施方案中，對(duì)抗體的糖基化實(shí)施修飾。舉例而言，可制備無糖基化抗體 (即抗體缺少糖基化）?？筛淖兲腔岳缭黾涌贵w對(duì)抗原的親和力。可通過例如改變 抗體序列內(nèi)的一或多個(gè)糖基化位點(diǎn)來完成這類糖類修飾。舉例而言，可實(shí)施一或多種氨基 酸取代以消除一或多個(gè)可變區(qū)框架糖基化位點(diǎn)，由此消除該位點(diǎn)處的糖基化。這類無糖基 化可增加抗體對(duì)抗原的親和力。例如參見美國專利第5, 714, 350號(hào)及第6, 350, 861號(hào)。
[0126] 另外或備選地，可制備具有改變類型的糖基化的抗體，例如具有減小量的巖藻糖 基殘基的低巖藻糖化抗體或具有增加的等分GlcNac結(jié)構(gòu)的抗體。這類改變的糖基化模式 已顯示可增加抗體的ADCC能力。可通過例如在具有改變的糖基化體系的宿主細(xì)胞中表現(xiàn) 抗體來實(shí)現(xiàn)這類糖類修飾。具有改變的糖基化體系的細(xì)胞已在本領(lǐng)域中闡述，且可用作其 中表達(dá)本發(fā)明的重組抗體以由此產(chǎn)生具有改變的糖基化的抗體的宿主細(xì)胞。舉例而言,細(xì) 胞系Ms704、Ms705及Ms709缺乏巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因 FUT8 ( α (1，6)-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶）， 從而在Ms704、Ms705及Ms709細(xì)胞系中表達(dá)的抗體在其糖類上缺乏巖藻糖。通過使用兩 種代替載體靶向破壞CH0/DG44細(xì)胞中的FUT8基因來創(chuàng)建Ms704、Ms705及Ms709FUT8+細(xì) 胞系（參見美國專利公開案第20040110704號(hào)及Yamane-Ohnuki等人（2004)Biotechnol Bioeng 87:614-22)。根據(jù)另一例子，EP 1，176, 195描述了具有功能受破壞的編碼巖藻糖 基轉(zhuǎn)移酶的FUT8基因的細(xì)胞系，從而在這類細(xì)胞系中表達(dá)的抗體通過減少或消除α -1，6 鍵相關(guān)酶來展現(xiàn)低巖藻糖化。EP 1，176, 195還描述了具有向結(jié)合抗體Fe區(qū)的N-乙酰葡糖 胺添加巖藻糖的低酶活性或不具有該酶活性的細(xì)胞系，例如大鼠骨髓瘤細(xì)胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。PCT公開文本W(wǎng)O 03/035835描述了一種變體CHO細(xì)胞系Lecl3細(xì)胞，其中使巖 藻糖附接至Asn (297)-連接的糖類的能力降低，從而亦導(dǎo)致在該宿主細(xì)胞中表達(dá)的抗體的 低巖藻糖化（亦參見Shields等人（2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740)。具有經(jīng)修飾的 糖基化概況的抗體亦可產(chǎn)生于雞蛋中，如PCT公開文本W(wǎng)O 06/089231中所闡述。備選地， 具有經(jīng)修飾的糖基化概況的抗體可產(chǎn)生于植物細(xì)胞（例如青萍（Lemna))中。在植物系統(tǒng) 中產(chǎn)生抗體的方法公開在對(duì)應(yīng)于Alston及Bird LLP代理檔案號(hào)：040989/314911的2006 年8月11日提出申請(qǐng)的美國專利申請(qǐng)案中。PCT公開文本W(wǎng)O 99/54342描述了經(jīng)工程化以 表達(dá)糖蛋白修飾糖基轉(zhuǎn)移酶（例如β (1，4)-N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶III (GnTIII))的細(xì)胞 系，從而在該工程化細(xì)胞系中表達(dá)的抗體展現(xiàn)增加的等分GlcNac結(jié)構(gòu)，其導(dǎo)致增加的抗體 的ADCC活性（亦參見Umana等人（1999) Nat. Biotech. 17:176-180)。備選地，可使用巖藻 糖苷酶切除抗體的巖藻糖殘基；舉例而言，巖藻糖苷酶a-L-巖藻糖苷酶自抗體去除巖藻 糖基殘基（Tarentino 等人（1975)Biochem. 14:5516-23)。
[0127] 本公開所涵蓋的另一種對(duì)本文抗體的修飾是聚乙二醇化（pegylation)。可對(duì)抗體 實(shí)施聚乙二醇化以例如增加抗體的生物（例如血清）半衰期。為將抗體乙二醇化，通常使抗 體或其片段與聚乙二醇（PEG)(例如PEG的反應(yīng)性酯或醛衍生物）在其中一或多個(gè)PEG基團(tuán) 變得附接至抗體或抗體片段的條件下發(fā)生反應(yīng)。優(yōu)選地，經(jīng)由使用反應(yīng)性PEG分子（或類似 反應(yīng)性水溶性聚合物）進(jìn)行酰化反應(yīng)或燒基化反應(yīng)來實(shí)施聚乙二醇化。如本文中所使用， 術(shù)語"聚乙二醇"意圖涵蓋已用于衍生化其他蛋白質(zhì)的PEG的任一形式，例如單（Cl-ClO)烷 氧基-或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇-馬來酰亞胺。在某些實(shí)施方案中，要聚乙二醇化的 抗體是無糖基化抗體。本領(lǐng)域中已知的使蛋白質(zhì)聚乙二醇化的方法且可應(yīng)用于本發(fā)明的抗 體。例如參見 EP 0154316 及 EP 0401384。
[0128] 抗體物理特件
[0129] 可通過各種物理特性來表征本發(fā)明抗體，從而檢測(cè)和/或區(qū)分其不同種類。
[0130] 舉例而言，抗體可在輕鏈或重鏈可變區(qū)中含有一或多個(gè)糖基化位點(diǎn)。這類糖基化 位點(diǎn)可使得增加抗體的免疫原性或改變抗體的pK(因抗原結(jié)合有所改變）（Marshall等人 (1972)Annu Rev Biochem 41:673-702 ;Gala 及 Morrison(2004)J Tmmunol 172:5489-94 ； Wallick 等人（1988)J Exp Med 168:1099-109 ;Spiro(2002)Glycobiology 12:43R-56R; Parekh 等人（1985) Nature 316:452-7 ;Mimura 等人（2000) Mol Tmmunol 37:697-706)。已 知糖基化發(fā)生于含有N-X-S/T序列的基序處。在一些情況下，優(yōu)選地，抗LAG-3抗體不含有 可變區(qū)糖基化。此可通過選擇在可變區(qū)中不含有糖基化基序的抗體或通過使糖基化區(qū)內(nèi)的 殘基發(fā)生突變來達(dá)成。
[0131] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗體不含有天冬酰胺異構(gòu)位點(diǎn)。天冬酰胺的去酰 胺化可發(fā)生于N-G或D-G序列上且使得產(chǎn)生異天冬氨酸殘基，該異天冬氨酸殘基在多肽鏈 中引入紐結(jié)（kink)并降低其穩(wěn)定性（異天冬氨酸效應(yīng)）。
[0132] 每種抗體均具有獨(dú)特的等電點(diǎn)（pi)，其通常在6至9. 5的pH范圍內(nèi)。IgGl抗體 的Pl通常在7-9. 5的pH范圍內(nèi)且IgG4抗體的pi通常在6-8的pH范圍內(nèi)。據(jù)推測(cè)，pi在 正常范圍以外的抗體體內(nèi)條件下可能具有一定解折疊和不穩(wěn)定性。因此，優(yōu)選地，抗LAG-3 抗體含有在正常范圍內(nèi)的Pl值。此可通過選擇Pl在正常范圍內(nèi)的抗體或通過使帶電荷的 表面殘基突變來達(dá)成。
[0133] 編碼本發(fā)明抗體的核酸分子
[0134] 在另一方面，本發(fā)明提供編碼本發(fā)明抗體的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)或CDR的核酸 分子。核酸可存在于全細(xì)胞、細(xì)胞裂解物或部分純化或?qū)嵸|(zhì)性純的形式中。在通過標(biāo)準(zhǔn)技 術(shù)（包含堿性/SDS處理、CsCl顯帶、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳及本領(lǐng)域中熟知的其他技術(shù)） 自其他細(xì)胞組分或其他污染物（例如其他細(xì)胞核酸或蛋白質(zhì)）純化時(shí)，核酸是"分離的"或 "達(dá)成實(shí)質(zhì)性純"的核酸。參見Ausubel等人編輯，（1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York。本發(fā)明核酸可為例如 DNA或RNA，且可含有或不含有內(nèi)含子序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸是cDNA分子。
[0135] 可使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)獲得本發(fā)明核酸。對(duì)于由雜交瘤（例如自攜載人免疫 球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠制得的雜交瘤，如下文進(jìn)一步所闡述）表達(dá)的抗體而言，可通過 標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增或cDNA克隆技術(shù)獲得編碼由該雜交瘤制得的抗體的輕鏈及重鏈的cDNA。對(duì) 于自免疫球蛋白基因文庫獲得的抗體而言（例如使用噬菌體顯示技術(shù)），可自基因文庫回 收編碼這類抗體的核酸。
[0136] 本發(fā)明的優(yōu)選核酸分子包含那些編碼LAG3. 5單克隆抗體的VH& '序列（分別為 SEQ ID NO: 12及14)或⑶R的。在獲得編碼Vh及'區(qū)段的DNA片段后，可進(jìn)一步通過標(biāo) 準(zhǔn)重組DNA技術(shù)操作這些DNA片段以例如將可變區(qū)基因轉(zhuǎn)化成全長(zhǎng)抗體鏈基因、Fab片段 基因或scFv基因。在這些操作中，編碼 '或Vh的DNA片段可操作連接至編碼另一蛋白質(zhì) (例如抗體恒定區(qū)或柔性接頭）的另一 DNA片段。此背景中所用的術(shù)語"可操作連接"意圖 意指連接兩個(gè)DNA片段，從而使得由這兩個(gè)DNA片段編碼的氨基酸序列保持為符合閱讀框 (in-frame)〇
[0137] 可通過使編碼VH的DNA可操作連接至另一編碼重鏈恒定區(qū)（CHI、CH2及CH3)的 DNA分子來將編碼Vh區(qū)的分離的DNA轉(zhuǎn)化成全長(zhǎng)重鏈基因。本領(lǐng)域中已知人重鏈恒定區(qū)基 因的序列（例如參見Kabat等人（1991)，參見上文）且可通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增獲得涵蓋這些 區(qū)的DNA片段。重鏈恒定區(qū)可為IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定區(qū)，但最 優(yōu)選地是IgGl或IgG4恒定區(qū)。對(duì)于Fab片段重鏈基因而言，可將編碼V h的DNA可操作連 接至另一僅編碼重鏈CHl恒定區(qū)的DNA分子。
[0138] 可通過使編碼 '的DNA可操作連接至另一編碼輕鏈恒定區(qū)CL的DNA分子來將編 碼 '區(qū)的分離的DNA轉(zhuǎn)化成全長(zhǎng)輕鏈基因（以及Fab輕鏈基因）。本領(lǐng)域中已知人輕鏈恒 定區(qū)基因的序列（例如參見Kabat等人的參考文獻(xiàn)，參見上文）且可通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增獲 得涵蓋這些區(qū)的DNA片段。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，輕鏈恒定區(qū)可為κ或λ恒定區(qū)。
[0139] 為創(chuàng)建scFv基因，將編碼Vh及 '的DNA片段可操作地連接于另一編碼柔性接頭 (例如編碼氨基酸序列（Gly4-Ser)3)的片段，從而V H&'序列可表達(dá)為鄰接的單鏈蛋白，其 中'區(qū)及Vh區(qū)由柔性接頭連接（例如參見Bird等人（1988) Science 242:423-426 ;Huston 等人（I988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA85:5879-5883 ;McCafferty 等人，（I99O)Nature 348:552-554)。
[0140] 本發(fā)明的單克降抗體的產(chǎn)牛
[0141] 可使用Kohler及Milstein(1975)Nature 256:495中的公知的體細(xì)胞雜交（雜交 瘤）技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體（mAb)。產(chǎn)生單克隆抗體的其他實(shí)施方案包含B淋巴細(xì) 胞的病毒或致癌性轉(zhuǎn)化及噬菌體展示技術(shù)。嵌合或人源化抗體亦在本領(lǐng)域中眾所周知。例 如參見美國專利第4, 816, 567號(hào)、第5, 225, 539號(hào)、第5, 530, 101號(hào)、第5, 585, 089號(hào)、第 5, 693, 762號(hào)及第6, 180, 370號(hào)，其內(nèi)容通過提述完整特定地并入本文。
[0142] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是人單克隆抗體?？墒褂脭y載人免疫系 統(tǒng)而非小鼠系統(tǒng)的部分的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠來生成這類針對(duì)人LAG-3的人單克隆抗 體。這些轉(zhuǎn)基因及轉(zhuǎn)染色體小鼠包含在本文中分別稱為HuMAb小鼠+?及KM小鼠5的小鼠， 且在本文中統(tǒng)稱為"人Ig小鼠"。
[0143] HuMb小鼠? (Medarex?公司）含有人免疫球蛋白基因微衛(wèi)星基因 座（miniloci)(其編碼未重排的人重鏈（μ及Y)及κ輕鏈免疫球蛋白序列）以 及靶向突變（其使內(nèi)源性μ及κ鏈基因座失活）（例如參見Lonberg等人（1994) Nature368 (6474) : 856-859)。因此，小鼠展現(xiàn)降低的小鼠 IgM或κ表達(dá)，且引入的 人重鏈及輕鏈轉(zhuǎn)基因應(yīng)答免疫發(fā)生類轉(zhuǎn)換及體細(xì)胞突變以生成高親和力人IgGK 單克隆抗體（Lonberg等人（1994)，參見上文；參見Lonberg (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101 ；Lonberg, N.及 Huszar,D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 以及 Harding 及 Lonberg(1995)Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546)。 HuMb小鼠?的制備及應(yīng)用及由這類小鼠攜載的基因組修飾進(jìn)一步闡述于以下參考文 獻(xiàn)中：Taylor 等人（1992)Nucleic Acids Research 20:6287-6295 ;Chen 等人（1993) International Immunology 5:647-656 ;Tuaillon 等人（1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724 ;Choi 等人（1993)Nature Genetics 4:117-123 ;Chen 等人（1993)EMBO J. 12:821-830 Juaillon 等人（1994)J. Immunol. 152:2912-2920 ;Taylor 等人（1994) International Immunology 6:579-591 ;及 Fishwild 等人（1996)Nature Biotechnology 14:845-851，其內(nèi)容通過提述完整明確并入本文中。進(jìn)一步參見美國專利第5, 545, 806號(hào)、 第 5, 569, 825 號(hào)、第 5, 625, 126 號(hào)、第 5, 633, 425 號(hào)、第 5, 789, 650 號(hào)、第 5, 877, 397 號(hào)、第 5, 661，016 號(hào)、第 5, 814, 318 號(hào)、第 5, 874, 299 號(hào)、第 5, 770, 429 號(hào)及第 5, 545, 807 號(hào)、PCT 公開文本第 WO 92/03918 號(hào)、第 WO 93/12227 號(hào)、第 WO 94/25585 號(hào)、第 WO 97/13852 號(hào)、第 WO 98/24884號(hào)、第WO 99/45962號(hào)及第WO 01/14424號(hào)，其內(nèi)容通過提述完整并入本文中。
[0144] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，可使用在轉(zhuǎn)基因及轉(zhuǎn)染色體上攜載人免疫球蛋白序列的小 鼠（例如攜載人重鏈轉(zhuǎn)基因及人輕鏈轉(zhuǎn)染色體的小鼠）來產(chǎn)生本發(fā)明的人抗體。此小鼠 在本文中稱為"KM小鼠 *"，且詳細(xì)闡述于PCT公開文本W(wǎng)O 02/43478中。此小鼠的修飾 形式（其進(jìn)一步包括內(nèi)源性Fe γ RIIB受體基因的純合性破壞）亦闡述于PCT公開文本W(wǎng)O 02/43478中且在本文中稱為"KM/FCGR2D小鼠?"。此外,可使用具有HCo7或Col2重鏈轉(zhuǎn) 基因或二者的小鼠。
[0145] 其他轉(zhuǎn)基因動(dòng)物實(shí)施方案包括Xenomouse(Abgenix公司，美國專利第5,939,598 號(hào)、第6, 075, 181號(hào)、第6, 114, 598號(hào)、第6, 150, 584號(hào)及第6, 162, 963號(hào)）。其他實(shí)施方案 包括 "TC 小鼠 "（Tomizuka 等人（2000) Proc. Natl. Acad Sci. USA97:722-727)及攜載人重 鏈及輕鏈轉(zhuǎn)染色體的牛（Kuroiwa等人（2002) NatureBiotechnology 20:889-894 ;PCT 公開 文本W(wǎng)O 02/092812)。這些專利及公開文本的內(nèi)容通過提述完整明確并入本文中。
[0146] 在一個(gè)實(shí)施方案中，使用用于篩選人免疫球蛋白基因文庫的噬菌體顯示方法來 制備本發(fā)明的人單克隆抗體。例如參見美國專利第5, 223, 409號(hào)、第5, 403, 484號(hào)、第 5, 571，698 號(hào)、第 5, 427, 908 號(hào)、第 5, 580, 717 號(hào)、第 5, 969, 108 號(hào)、第 6, 172, 197 號(hào)、第 5,885,793 號(hào)、第 6,521,404 號(hào)、第 6,544,731 號(hào)、第 6,555,313 號(hào)、第 6,582,915 號(hào)及第 6, 593, 081號(hào)，其內(nèi)容通過提述完整并入本文中。
[0147] 本發(fā)明的人單克隆抗體亦可使用SCID小鼠來制備，其中人免疫細(xì)胞已經(jīng)重構(gòu)以 便可在實(shí)施免疫后生成人抗體反應(yīng)。例如參見美國專利第5, 476, 996號(hào)及第5, 698, 767號(hào)， 其內(nèi)容通過提述完整并入本文中。
[0148] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用噬菌體展示來制備人抗LAG-3抗體，其中所述噬菌體 包含編碼在先前使用LAG-3免疫的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中所生成抗體的核酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方 案中，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是HuMab、KM或Kirin小鼠。例如參見美國專利第6, 794, 132號(hào)，其 內(nèi)容通過提述完整并入本文中。
[0149] 人Ig小鼠的免疫
[0150] 在本發(fā)明的一實(shí)施方案中，使用LAG-3抗原的純化或富集配制物、重組LAG-3蛋 白、或表達(dá)LAG-3蛋白的細(xì)胞對(duì)人Ig小鼠實(shí)施免疫。例如參見Lonberg等人（1994)，參見 上文；Fishwild等人（1996)，參見上文；PCT公開文本W(wǎng)O 98/24884或WO 01/14424,其內(nèi)容 通過提述完整并入本文中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用5-50 μ g LAG-3蛋白對(duì)6-16周 齡小鼠實(shí)施免疫。或者，使用融合至非LAG-3多肽的LAG-3的部分。
[0151] 在一個(gè)實(shí)施方案中，在腹膜內(nèi)（IP)或靜脈內(nèi)（IV)使用在完全弗氏佐劑（complete Freund's adjuvant)中的LAG-3抗原對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)施免疫，隨后使用在不完全弗氏佐劑 中的抗原實(shí)施后續(xù)IP或IV免疫。在其他實(shí)施方案中，使用除弗氏佐劑外的佐劑或在不存 在佐劑的全細(xì)胞。可通過ELISA篩選血漿且可使用來自小鼠的具有足夠抗LAG-3人免疫球 蛋白效價(jià)的細(xì)胞進(jìn)行融合。
[0152] 產(chǎn)牛本發(fā)明的人單克降抗體的雜奪瘤的牛成
[0153] 為生成產(chǎn)生本發(fā)明的人單克隆抗體的雜交瘤，可分離來自經(jīng)免疫小鼠的脾細(xì)胞和 /或淋巴結(jié)細(xì)胞且融合至適宜的永生化細(xì)胞系（例如小鼠黑素瘤細(xì)胞系）?？珊Y選所得雜 交瘤以用于產(chǎn)生抗原特異性抗體。雜交瘤的生成在本領(lǐng)域中已眾所周知。例如參見Harlow 及 Lane(1988)Antibodies, A LaboratoryManual,冷 Spring Harbor Publications, New York。
[0154] 產(chǎn)牛本發(fā)明的單克降抗體的轉(zhuǎn)染瘤的牛成
[0155] 亦可在宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染瘤中使用例如本領(lǐng)域中熟知的重組DNA技術(shù)及基因轉(zhuǎn)染方 法的組合來產(chǎn)生本發(fā)明抗體（例如Morrison, S. (1985) Science229:1202)。在一個(gè)實(shí)施方 案中，將通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物技術(shù)獲得的編碼部分或全長(zhǎng)輕鏈及重鏈的DNA插入一或多種表 達(dá)載體中，從而使該基因可操作連接于轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列。在此背景中，術(shù)語"可操作連 接"意圖指使抗體基因連接于載體以便使該載體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄及翻譯控制序列發(fā)揮其調(diào)控抗體 基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯的預(yù)期功能。
[0156] 術(shù)語"調(diào)控序列"意圖包含控制抗體鏈基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及其 他表達(dá)控制元件（例如聚腺苷酸化信號(hào)）。這類調(diào)控序列闡述于（例如）Goeddel (Gene Expression Technology.Methods in Enzymology 185, Academic Press,San Diego, CA(1990))中。用于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞表達(dá)的優(yōu)選調(diào)控序列包括在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中 指導(dǎo)高水平的蛋白質(zhì)表達(dá)的病毒元件，例如衍生自巨細(xì)胞病毒（CMV)、猿病毒40 (SV40)、腺 病毒（例如腺病毒主要晚期啟動(dòng)子（AdMLP))及多瘤病毒的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子?；蛘?，可 使用非病毒調(diào)控序列，例如泛素啟動(dòng)子或β_球蛋白啟動(dòng)子。另外，調(diào)控元件是由來自不同 來源的序列構(gòu)成，例如SRa啟動(dòng)子系統(tǒng)，其含有來自SV40早期啟動(dòng)子及1型人T細(xì)胞白血 病病毒的長(zhǎng)末端重復(fù)的序列（Takebe等人（1988)Mol. Cell. Biol. 8:466-472)。選擇與所用 表達(dá)宿主細(xì)胞相容的表達(dá)載體及表達(dá)控制序列。
[0157] 可將抗體輕鏈基因及抗體重鏈基因插入相同或分別的表達(dá)載體中。在優(yōu)選實(shí)施方 案中，使用可變區(qū)通過以下方式產(chǎn)生任一抗體同種型的全長(zhǎng)抗體基因：將其插入已編碼期 望同種型的重鏈恒定區(qū)及輕鏈恒定區(qū)的表達(dá)載體中，從而使得Vh區(qū)段可操作連接于載體內(nèi) 的Ch區(qū)段且'區(qū)段可操作連接于載體內(nèi)的Q區(qū)段。另外或備選地，重組表達(dá)載體可編碼促 進(jìn)抗體鏈從宿主細(xì)胞分泌的信號(hào)肽?？蓪⒖贵w鏈基因克隆至載體中，從而信號(hào)肽符合閱讀 框地連接至抗體鏈基因的氨基末端。所述信號(hào)肽可為免疫球蛋白信號(hào)肽或異源信號(hào)肽（即 來自非免疫球蛋白的信號(hào)肽）。
[0158] 除抗體鏈基因及調(diào)控序列外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體可攜載其他序列，例如調(diào)控 宿主細(xì)胞中的載體復(fù)制的序列（例如復(fù)制起點(diǎn)）及可選標(biāo)記物基因。可選標(biāo)記物基因促進(jìn) 了引入載體的宿主細(xì)胞的選擇（例如參見美國專利第4, 399, 216號(hào)、第4, 634, 665號(hào)及第 5, 179, 017號(hào)）。舉例而言，可選標(biāo)記物基因通常賦予已引入載體的宿主細(xì)胞對(duì)藥物（例如 G418、潮霉素或甲氨蝶呤（methotrexate))的抗性。優(yōu)選的可選標(biāo)記物基因包括二氫葉酸 還原酶（DHFR)基因（用于經(jīng)甲氨蝶呤選擇/擴(kuò)增的dhfr-宿主細(xì)胞）及neo基因（用于 G418選擇）。
[0159] 為表達(dá)輕鏈及重鏈，通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將編碼重鏈及輕鏈的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞 中。術(shù)語"轉(zhuǎn)染"的各種形式意圖涵蓋眾多種通常用于將外源性DNA引入原核或真核宿主 細(xì)胞中的很多種技術(shù)，例如電穿孔、磷酸鈣沈淀、DEAE-右旋糖酐轉(zhuǎn)染及諸如此類。盡管理 論上可在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的抗體，但在真核細(xì)胞，且最優(yōu)選地在哺乳動(dòng) 物宿主細(xì)胞中表達(dá)抗體是最優(yōu)選的，因?yàn)檫@類真核細(xì)胞特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞比原核細(xì)胞更 有可能裝配并分泌經(jīng)適當(dāng)折疊且具有免疫活性的抗體。
[0160] 用于表達(dá)本發(fā)明的重組抗體的優(yōu)選哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括中國倉鼠卵巢（CH0 細(xì)胞）（包括 dhfrXHO 細(xì)胞，闡述于 Urlaub 及 Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220 中且與 DHFR 可選標(biāo)記物（例如，如 R. J. Kaufman 及 P. A. Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159:601-621中所闡述）一起使用）、NS0黑素瘤細(xì)胞、COS細(xì)胞及SP2細(xì)胞。具體地，對(duì) 于與NSO黑素瘤細(xì)胞一起使用，另一優(yōu)選的表達(dá)系統(tǒng)是披露于WO 87/04462、WO 89/01036 及EP 338, 841中的GS基因表達(dá)系統(tǒng)。在將編碼抗體基因的重組表達(dá)載體引入哺乳動(dòng)物宿 主細(xì)胞中時(shí)，通過將宿主細(xì)胞培養(yǎng)一定時(shí)間段以足以在宿主細(xì)胞中表達(dá)抗體或更優(yōu)選地將 抗體分泌至生長(zhǎng)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中來產(chǎn)生抗體。可使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化方法自培養(yǎng)基回 收抗體。
[0161] 免疫綴合物
[0162] 可將本發(fā)明抗體綴合至治療劑以形成免疫綴合物，例如抗體-藥物綴合物（ADC)。 適宜的治療劑包含抗代謝物、烷化劑、DNA小溝結(jié)合劑、DNA嵌入劑、DNA交聯(lián)劑、組蛋白去 乙酰基酶抑制劑、核輸出抑制劑、蛋白酶體抑制劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶I或Π 抑制劑、熱激蛋白抑 制劑、酪氨酸激酶抑制劑、抗生素及抗有絲分裂劑。在ADC中，抗體及治療劑優(yōu)選地經(jīng)由可 裂解的接頭（例如肽基、二硫化物或腙接頭）進(jìn)行綴合。更優(yōu)選地，所述接頭是肽基接頭， 例如 Val-Cit、Ala-Val、Val-Ala-Val、Lys-Lys、Pro-Val-Gly-Val-Val (SEQ ID NO: 15)、 Ala-Asn-Val、Val-Leu-Lys、Ala-Ala-Asn、Cit-Cit、Val-Lys、Lys、Cit、Ser 或 Glu0 可如以 下案件中所闡述的來制備ADC :美國專利第7, 087, 600號(hào)、第6, 989, 452號(hào)及第7, 129, 261 號(hào)、PCT 公開文本 WO 02/096910、WO 07/038658、WO 07/051081、WO 07/059404、WO 08/083312 及 WO 08/103693、美國專利公開案 20060024317、20060004081 及 20060247295 ; 其公開內(nèi)容通過提述并入本文中。
[0163] 雙特異件分子
[0164] 在另一方面，本公開的特征是雙特異性分子，其包含一或多種連接至至少一種另 外的功能分子（例如另一肽或蛋白質(zhì)（例如用于受體的另一抗體或配體））的本發(fā)明抗體， 從而生成結(jié)合至少兩種不同結(jié)合位點(diǎn)或靶分子的雙特異性分子。因此，如本文所使用，"雙 特異性分子"包含具有三種或更多種特異性的分子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，雙特異性分 子包含用于LAG-3的第一結(jié)合特異性及用于觸發(fā)分子（其募集可殺傷表達(dá)LAG-3的靶細(xì)胞 的細(xì)胞毒性效應(yīng)器細(xì)胞）的第二結(jié)合特異性。適宜的觸發(fā)分子的例子是⑶64、⑶89、⑶16 及 CD3。例如參見 Kufer 等人，TRENDS in Biotechnology, 22 (5)，238-244 (2004)。
[0165] 在一個(gè)實(shí)施方案中，除抗Fe結(jié)合特異性及抗LAG-3結(jié)合特異性外，所述雙特異性 分子還具有第三特異性。第三特異性可針對(duì)抗增強(qiáng)因子（EF)，例如結(jié)合涉及細(xì)胞毒性活性 的表面蛋白且由此增加對(duì)靶細(xì)胞的免疫反應(yīng)的分子。舉例而言，抗增強(qiáng)因子可結(jié)合細(xì)胞毒 性T細(xì)胞（例如經(jīng)由⑶2、⑶3、⑶8、⑶28、⑶4、⑶40或ICAM-1)或其他免疫細(xì)胞，從而增加 對(duì)靶細(xì)胞的免疫反應(yīng)。
[0166] 雙特異性分子可具有許多不同形式和大小。在大小譜的一端，雙特異性分子 保留傳統(tǒng)的抗體形式，只是其具有兩個(gè)各自具有不同特異性的結(jié)合臂而非具有兩個(gè)具 有相同特異性的結(jié)合臂。在另一端是由通過肽鏈連接的兩個(gè)單鏈抗體片段（scFv)組 成的雙特異性分子，即所謂的B s(ScFv)2構(gòu)筑體。中間大小的雙特異性分子包含兩個(gè) 由肽基接頭連接的不同F(xiàn)(ab)片段?？赏ㄟ^基因工程、體細(xì)胞雜交或化學(xué)方法來制 備這些和其他格式的雙特異性分子。例如參見Kufer等人，參見上文所引用；Cao及 Suresh, Bioconjugate Chemistry, 9 (6), 635-644 (1998) van Spriel 等人，Immunology Today, 21 (8)，391-397 (2000)及其中所引用的參考文獻(xiàn)。
[0167] 藥物纟目合物
[0168] 在另一方面，本公開提供一種藥物組合物，其包括與藥學(xué)可接受的載體一起配制 的一或多種本發(fā)明的抗體。所述組合物任選地可含有一或多種其他藥學(xué)活性成份，例如另 一抗體或藥物。本發(fā)明的藥物組合物亦可以組合療法與例如另一免疫刺激劑、抗癌劑、抗病 毒劑或疫苗一起施用，從而使得抗LAG-3抗體增強(qiáng)對(duì)疫苗的免疫反應(yīng)。
[0169] 所述藥物組合物可包括任意數(shù)量的賦形劑?？墒褂玫馁x形劑包含載體、表面 活性劑、增稠劑或乳化劑、固體黏合劑、分散劑或懸浮助劑、增溶劑、染色劑、增味劑、涂 層、崩解劑、潤(rùn)滑劑、甜味劑、防腐劑、等滲劑及其組合。適宜賦形劑的選擇及應(yīng)用教示于 Gennaro 編輯，Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第 20 版（Lippincott Williams&Wilkins 2003)中，其公開通過提述并入本文中。
[0170] 優(yōu)選地，所述藥物組合物適于靜脈內(nèi)施用、肌內(nèi)施用、皮下施用、胃腸外施用、脊椎 或表皮施用（例如通過注射或輸注）。根據(jù)施用路徑，可將活性化合物涂覆于一定材料中 以保護(hù)其免受酸作用及其他可將其鈍化的天然條件影響。本文所用的短語"胃腸外施用" 意指除經(jīng)腸及局部施用外的施用模式，通常是通過注射且包括但不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈 內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眼窩內(nèi)、心內(nèi)、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜 下、經(jīng)脊柱內(nèi)、經(jīng)硬膜外及經(jīng)胸骨內(nèi)注射及輸注?；蛘?，本發(fā)明的抗體可經(jīng)由非胃腸外路徑 (例如局部、表皮）或黏膜施用途徑（例如經(jīng)鼻內(nèi)、經(jīng)口、經(jīng)陰道、經(jīng)直腸、經(jīng)舌下或局部）施 用。
[0171] 本發(fā)明的藥物組合物可包含藥學(xué)接受的鹽。"藥學(xué)可接受的鹽"是指保留母體化合 物的期望生物活性且不賦予任何不期望的毒理學(xué)效應(yīng)的鹽。這類鹽的實(shí)例包括酸加成鹽及 堿加成鹽。酸加成鹽包含那些衍生自以下酸的：無毒無機(jī)酸，例如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫 溴酸、氫碘酸、亞磷酸及諸如此類；以及無毒有機(jī)酸，例如脂肪族單羧酸及二羧酸、經(jīng)苯基取 代的鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳族酸、脂肪族及芳族磺酸及諸如此類。堿加成鹽包含那些衍生 自以下物質(zhì)的：堿土金屬，例如鈉、鉀、鎂、鈣及諸如此類；以及無毒有機(jī)胺，例如Ν，Ν'-二芐 基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因（chloroprocaine)、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡 因（procaine)及諸如此類。
[0172] 藥物組合物可呈無菌水溶液或分散物的形式。其亦可配制于微乳液、脂質(zhì)體或其 他適用于高藥物濃度的有序結(jié)構(gòu)中。
[0173] 可與載體材料組合產(chǎn)生單一劑量形式的活性成份的量將隨所治療受試者及特定 施用模式而有所變化，且通常是產(chǎn)生治療效應(yīng)的組合物量。通常，在100個(gè)百分比中，此量 的范圍為約0. 01 %至約99 %活性成份、優(yōu)選地約0. 1 %至約70 %活性成份、最佳地約1 %至 約30%活性成份（與藥學(xué)可接受的載體組合）。
[0174] 調(diào)節(jié)劑量方案以提供最佳期望反應(yīng)（例如治療性反應(yīng)）。舉例而言，可施用單一推 注，可在一段時(shí)間內(nèi)施用數(shù)個(gè)細(xì)分劑量或可如治療狀況緊急程度指示的按比例減小或增加 劑量。以劑量單元形式來配制胃腸外組合物特別有利于方便施用及達(dá)成劑量一致性。本文 所用的劑量單位形式是指適合作為單位劑量供擬治療受試者使用的物理分散單位；每一單 位含有預(yù)定量的活性化合物，此預(yù)定量經(jīng)計(jì)算可與所需的藥學(xué)載體一起產(chǎn)生期望的治療效 應(yīng)。或者，可以持續(xù)釋放制劑形式施用抗體，在該情形下需要更小的施用頻率。
[0175] 對(duì)于抗體施用而言，劑量范圍為約0. 0001mg/kg至100mg/kg宿主體重，更通常而 言0· 01mg/kg至5mg/kg宿主體重。舉例而言，齊[J量可為0· 3mg/kg體重、lmg/kg體重、3mg/ kg體重、5mg/kg體重或10mg/kg體重、或在l-10mg/kg范圍內(nèi)。例示性治療方案需要以以 下方式施用：每周一次、每?jī)芍芤淮?、每三周一次、每四周一次、每月一次、?個(gè)月一次或 每3至6個(gè)月一次。本發(fā)明的抗LAG-3抗體的優(yōu)選劑量方案包含經(jīng)由靜脈內(nèi)施用來施用 lmg/kg體重或3mg/kg體重，其中使用下列給藥時(shí)間表中的一種來給予抗體：（i)每四周給 予6個(gè)劑量，然后每三個(gè)月一次；（ii)每三周一次；（iii)每三周給予一次3mg/kg體重隨 后給予lmg/kg體重。在一些方法中，調(diào)整劑量以達(dá)成約1-1000 μ g/ml及在一些方法中約 25-300 μ g/ml的血楽抗體濃度。
[0176] 本發(fā)明的抗LAG-3抗體的"治療有效劑量"優(yōu)選地使得可降低疾病癥狀的嚴(yán)重程 度，增加疾病無癥狀期的頻率及持續(xù)時(shí)間，或預(yù)防由染病所致的損傷或失能。舉例而言，為 治療帶腫瘤的受試者，相對(duì)于未治療受試者，"治療有效劑量"優(yōu)選地將腫瘤生長(zhǎng)抑制至少 約20 %、更優(yōu)選地至少約40 %、甚至更優(yōu)選地至少約60 %及更優(yōu)選地至少約80 %。治療有 效量的治療性化合物可減小腫瘤大小，或以其他方式改善受試者（其通常是人或可為另一 哺乳動(dòng)物）中的癥狀。
[0177] 藥物組合物可為受控釋放的制劑，包含植入物、經(jīng)皮貼片及微膠囊化的遞送系 統(tǒng)?？墒褂蒙锟山到獾纳锵嗳莸木酆衔?，例如乙烯基乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠 原、聚原酸酯及聚乳酸。例如參見 Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson 編輯，Marcel Dekker 公司，New York, 1978。
[0178] 可經(jīng)由醫(yī)學(xué)裝置施用治療性組合物，例如⑴無針皮下注射裝置（例如 US5,399，163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941，880、4,790,824 及 4,596,556); (2)微輸注泵（US 4, 487, 603) ; (3)經(jīng)皮裝置（US 4, 486, 194) ; (4)輸注裝置（US4, 447, 233 及4, 447, 224);及（5)滲透裝置（US 4, 439, 196及4, 475, 196);其公開內(nèi)容以引用方式并 入本文中。
[0179] 在某些實(shí)施方案中，可將本發(fā)明的人單克隆抗體配制為確保在體內(nèi)合理分 布。舉例而言，為確保本發(fā)明的治療性化合物穿過血-腦屏障，可將其配制在脂質(zhì)體 中，所述脂質(zhì)體可另外包括靶向性模塊以增強(qiáng)至特定細(xì)胞或器官的選擇性運(yùn)輸。例如 參見 US 4,522,811;5,374,548;5,416,016; & 5,399,331;V.V.Ranade(1989)J.Clin. Pharmacol. 29:685 ;Umezawa 等人，（1988)Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038 ; Bloeman 等人（1995)FEBS Lett. 357:140 ;Μ·Owais 等人（1995)Antimicrob. Agents Chemother. 39:180 ;Briscoe 等人（1995) Am. J. Physiol. 1233:134 ;Schreier 等人（1994) J. Biol. Chem. 269:9090 ;Keinanen 及 LAukkanen(1994)FEBS Lett. 346:123 ;及 Killion 及 Fidler(1994)Immunomethods 4:273〇
[0180] 本發(fā)明的用涂及方法
[0181] 本發(fā)明的抗體（組合物、雙特異性分子及免疫綴合物）具有多種涉及（例如）檢 測(cè)LAG-3或通過阻斷LAG-3來增強(qiáng)免疫反應(yīng)的體外及體內(nèi)用途。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中， 所述抗體是人抗體?？蓪⑦@類抗體施用到體外或離體培養(yǎng)的細(xì)胞中或?qū)θ耸茉囌撸ɡ珞w 內(nèi)）施用以增強(qiáng)各種情形下的免疫性。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供對(duì)受試者中的免疫反 應(yīng)實(shí)施修改的方法，其包括向該受試者施用本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分，從而對(duì)受試 者中的免疫反應(yīng)實(shí)施修改。優(yōu)選地，反應(yīng)得以增強(qiáng)、刺激或上調(diào)。
[0182] 優(yōu)選的受試者包含需要增強(qiáng)免疫反應(yīng)的人患者。所述方法尤其適于治療患有可通 過增大免疫反應(yīng)（例如T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)）來治療的病癥的人患者。在一具體的實(shí)施 方案中，所述方法尤其適于治療體內(nèi)癌癥。為實(shí)現(xiàn)免疫性的抗原特異性增強(qiáng)，可將抗LAG-3 抗體與感興趣的抗原一起施用或該抗原可已存在于擬治療的受試者（例如帶腫瘤或攜帶 病毒的受試者）中。在將LAG-3抗體與另一藥劑一起施用時(shí)，二者可以任一順序或同時(shí)施 用。
[0183] 本發(fā)明進(jìn)一步提供檢測(cè)樣品中人LAG-3抗原的存在、或測(cè)量人LAG-3抗原的量的 方法，其包括使樣品及對(duì)照樣品與人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分（其特異性結(jié)合至人 LAG-3)在容許在抗體或其部分與人LAG-3之間形成復(fù)合物的條件下接觸。然后檢測(cè)復(fù)合物 的形成，其中樣品與對(duì)照樣品之間復(fù)合物形成的差異可指示樣品中人LAG-3抗原的存在。 另外，可使用本發(fā)明的抗LAG-3抗體經(jīng)由免疫親和純化來純化人LAG-3。
[0184] 鑒于本發(fā)明的抗LAG-3抗體能夠抑制LAG-3對(duì)MHC II類分子的結(jié)合并刺激抗原 特異性T細(xì)胞反應(yīng)，本發(fā)明亦提供使用該抗體來刺激、增強(qiáng)或上調(diào)抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)的 體外及體內(nèi)方法。舉例而言，本發(fā)明提供刺激抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)的方法，其包括使所述 T細(xì)胞與本發(fā)明的抗體接觸，從而刺激抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)。可使用抗原特異性T細(xì)胞反 應(yīng)的任一適宜指示物來測(cè)量抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)。這類適宜指示物的非限制性例子包含 在抗體存在下增加的T細(xì)胞增殖和/或在抗體存在下增加細(xì)胞因子產(chǎn)生。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí) 施方案中，刺激通過抗原特異性T細(xì)胞來產(chǎn)生白介素-2。
[0185] 本發(fā)明亦提供刺激受試者中的免疫反應(yīng)（例如抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)）的方法， 其包括向受試者施用本發(fā)明抗體，從而刺激受試者中的免疫反應(yīng)（例如抗原特異性T細(xì)胞 反應(yīng)）。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，受試者是帶腫瘤受試者且刺激對(duì)腫瘤的免疫反應(yīng)。在另 一優(yōu)選實(shí)施方案中，受試者是帶病毒的受試者且刺激對(duì)病毒的免疫反應(yīng)。
[0186] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抑制受試者中的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，其包括 向受試者施用本發(fā)明抗體，從而抑制受試者中的腫瘤生長(zhǎng)。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供 治療受試者的病毒感染的方法，其包括向受試者施用本發(fā)明抗體，從而治療受試者的病毒 感染。
[0187] 本發(fā)明的這類及其他方法進(jìn)一步詳細(xì)論述于下文中。
[0188] 癌癥
[0189] 通過抗體阻斷LAG-3可增強(qiáng)患者對(duì)癌細(xì)胞的免疫反應(yīng)。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及 使用抗LAG-3抗體在體內(nèi)治療受試者，從而抑制癌癥性腫瘤的生長(zhǎng)?？蓡为?dú)使用抗LAG-3 抗體來抑制癌癥性腫瘤的生長(zhǎng)?；蛘?，抗LAG-3抗體可與其他免疫原性劑、標(biāo)準(zhǔn)癌癥治療或 其他抗體結(jié)合使用，如下文所描述的。
[0190] 因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抑制受試者中腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)的方法，其包 括向受試者施用治療有效量的抗LAG-3抗體或其抗原結(jié)合部分。優(yōu)選地，所述抗體是人抗 LAG-3抗體（例如本文所闡述的人的抗人LAG-3抗體中的任一者）。另外或備選地，所述抗 體可為嵌合或人源化抗LAG-3抗體。
[0191] 可使用本發(fā)明抗體抑制生長(zhǎng)的優(yōu)選癌癥包括通常對(duì)免疫療法具有反應(yīng)的癌癥。用 于治療的優(yōu)選癌癥的非限制性實(shí)例包含黑素瘤（例如轉(zhuǎn)移性惡性黑素瘤）、腎癌（例如透明 細(xì)胞癌瘤）、前列腺癌（例如激素難治性前列腺腺癌）、乳腺癌、結(jié)腸癌及肺癌（例如非小細(xì) 胞肺癌）。另外，本發(fā)明包括可使用本發(fā)明抗體抑制生長(zhǎng)的難治性或復(fù)發(fā)性惡性腫瘤。
[0192] 可使用本發(fā)明方法治療的其他癌癥的實(shí)例包含骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭和頸癌、 皮膚或眼內(nèi)惡性黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區(qū)癌、胃癌、睪丸癌、輸卵管癌、子宮 內(nèi)膜癌、宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金氏病（Hodgkin's Disease)、非霍奇金氏淋巴瘤 (non-Hodgkin's lymphoma)、食道癌、小腸癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌、甲狀腺癌、副甲狀腺癌癥、腎 上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、慢性或急性白血?。ò毙怨撬栊园籽　⒙怨?髓性白血病、急性淋巴母細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血?。?、兒童實(shí)體腫瘤、淋巴細(xì)胞 性淋巴瘤、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS)贅瘤、原發(fā)性CNS淋巴瘤、 腫瘤血管生成、脊柱瘤、腦干膠質(zhì)瘤、垂體腺瘤、卡波西氏肉瘤（Kaposi's sarcoma)、表皮樣 癌、鱗狀細(xì)胞癌、T細(xì)胞淋巴瘤、環(huán)境誘導(dǎo)的癌癥（包含那些由石棉誘導(dǎo)的者）及所述癌癥的 組合。本發(fā)明亦可用于治療轉(zhuǎn)移性癌癥，尤其表達(dá)PD-Ll的轉(zhuǎn)移性癌癥（Iwai等人（2005) Int. Immunol. 17:133-144)。
[0193] 任選地，可將LAG-3抗體與免疫原性劑（例如癌細(xì)胞、經(jīng)純化腫瘤抗原（包含重 組蛋白、肽及碳水化合物分子）、細(xì)胞及經(jīng)編碼免疫刺激細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞）組合 (He等人（2004) J. Immunol. 173:4919-28)?？墒褂玫哪[瘤疫苗的非限制性實(shí)例包括黑素瘤 抗原的肽（例如gpl〇〇、MAGE抗原、Trp-2、MART1和/或酪氨酸酶的肽）或經(jīng)轉(zhuǎn)染以表達(dá)細(xì) 胞因子GM-CSF的腫瘤細(xì)胞（進(jìn)一步論述于下文中）。
[0194] 在人中，已展示一些腫瘤具有免疫原性，例如黑素瘤。通過以LAG-3阻斷提高T細(xì) 胞活化的臨限值，可活化宿主中的腫瘤反應(yīng)。
[0195] 在與疫苗接種方案組合時(shí)，LAG-3阻斷很可能更為有效。已設(shè)計(jì)用于對(duì)腫 瘤進(jìn)行疫苗接種的許多實(shí)驗(yàn)策略（參見Rosenberg, S.，2000, Development ofCancer VaccinesjASCO Educational Book Spring:60-62 ；Logothetis,C.,2000,ASCO Educational Book Spring:300-302 ；Khayat,D. 2000,ASCO Educational Book Spring:414_428;Foon，K· 2000, ASCO Educational Book Spring:730_738;亦參見 Restifo, N.及 Sznol, M. , Cancer Vaccines,第 61 章，第 3023-3043 頁，DeVita 等人（編 輯），1997, Cancer !Principles and Practice of Oncology，第 5 版）。在其中一種策略 中，使用自體或同種異體腫瘤細(xì)胞制備疫苗。這些細(xì)胞疫苗已展示在轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤細(xì)胞以表達(dá) GM-CSF時(shí)最有效。已展示GM-CSF是用于腫瘤疫苗接種的抗原呈現(xiàn)的強(qiáng)力活化劑（DranofT 等人（1993) Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A. 90:3539-43)。
[0196] 在各種腫瘤中對(duì)于基因表達(dá)及大規(guī)模基因表達(dá)模式的研究已定義了所謂的腫瘤 特異性抗原（Rosenberg, SA(1999) Immunity 10:281-7)。在許多情形下，這類腫瘤特異性 抗原是表達(dá)于腫瘤及發(fā)生腫瘤的細(xì)胞中的分化抗原，例如黑素細(xì)胞抗原gpl〇〇、MGE抗原 及Trp-2。更重要的是，許多這些抗原可顯示為是在宿主中發(fā)現(xiàn)的腫瘤特異性T細(xì)胞的靶 物?？蓪AG-3阻斷與表達(dá)于腫瘤中的重組蛋白和/或肽的集合組合以生成對(duì)這類蛋白質(zhì) 的免疫反應(yīng)。這些蛋白質(zhì)通常被免疫系統(tǒng)視為自體抗原且由此對(duì)其耐受。腫瘤抗原可包括 蛋白質(zhì)端粒末端轉(zhuǎn)移酶，其是合成染色體的端粒所需且表達(dá)于超過85%的人癌癥中及僅有 限數(shù)量的體細(xì)胞組織中（Kim等人（1994)Science 266:2011-2013)。（可通過各種方式保 護(hù)這些體細(xì)胞組織免受免疫攻擊）。腫瘤抗原亦可為因體細(xì)胞突變（其改變蛋白質(zhì)序列或 在兩個(gè)非相關(guān)序列之間創(chuàng)建融合蛋白（即費(fèi)城染色體（Philadelphia chromosome)中的 bcr-abl))表達(dá)于癌細(xì)胞中的"新抗原"，或來自B細(xì)胞腫瘤的獨(dú)特型。
[0197] 其他腫瘤疫苗可包含來自與人癌癥有關(guān)的病毒（例如人乳頭瘤病毒（HPV)、肝炎 病毒（HBV及HCV)及卡波西氏皰疹肉瘤病毒（KHSV))的蛋白質(zhì)?？膳cLAG-3阻斷結(jié)合使用的 腫瘤特異性抗原的另一形式是自腫瘤組織本身分離的經(jīng)純化熱激蛋白（HSP)。這些熱激蛋 白含有來自腫瘤細(xì)胞的蛋白質(zhì)片段且這些HSP可高度有效地遞送至抗原呈現(xiàn)細(xì)胞以用于 引發(fā)腫瘤免疫性（Suot 及 Srivastava (1995) Science 269:1585-1588 ;Tamura 等人（1997) Science278:117-120)。
[0198] 樹突細(xì)胞（DC)是可用于引發(fā)抗原特異性反應(yīng)的強(qiáng)力抗原呈現(xiàn)細(xì)胞。DC可離體產(chǎn) 生且載有各種蛋白質(zhì)及肽抗原以及腫瘤細(xì)胞提取物（Nestle等人（1998)Nature Medicine 4:328-332)。亦可通過遺傳手段轉(zhuǎn)導(dǎo)DC以亦表達(dá)這類腫瘤抗原。亦將DC直接融合至腫瘤 細(xì)胞以用于免疫目的（Kugler等人（2000)Nature Medicine 6:332-336)。作為一種疫苗接 種方法，DC免疫可與LAG-3阻斷有效組合以活化更強(qiáng)力的抗腫瘤反應(yīng)。
[0199] LAG-3阻斷亦可與標(biāo)準(zhǔn)癌癥治療進(jìn)行組合。LAG-3阻斷可與化學(xué)治療方案有 效組合。在這類情況下，可減小所施用化學(xué)治療試劑的劑量（Mokyr等人（1998) Cancer Research 58:5301-5304)。此一組合的一實(shí)例是抗LAG-3抗體與達(dá)卡巴嚷（decarbazine) 的用于治療黑素瘤的組合。此一組合的另一實(shí)例是抗LAG-3抗體與白介素-2 (IL-2)的用于 治療黑素瘤的組合。組合使用LAG-3阻斷及化療的科學(xué)原理在于，細(xì)胞死亡（其是大部分 化療化合物的細(xì)胞毒性作用的結(jié)果）應(yīng)使得抗原呈現(xiàn)路徑中的腫瘤抗原的水平有所增加。 可與LAG-3阻斷經(jīng)由細(xì)胞死亡產(chǎn)生協(xié)同作用的其他組合療法是放射、手術(shù)及激素剝奪。這 類方案中的每一者皆產(chǎn)生宿主中的腫瘤抗原的來源。亦可組合血管生成抑制劑與LAG-3阻 斷。對(duì)血管生成的抑制會(huì)引起腫瘤細(xì)胞死亡，此可將腫瘤抗原供給至宿主抗原呈現(xiàn)途徑中。
[0200] LAG-3阻斷抗體亦可與使Fe α或Fe Y受體表達(dá)效應(yīng)器細(xì)胞靶向腫瘤細(xì)胞的雙特 異性抗體組合使用（例如參見美國專利第5, 922, 845號(hào)及第5, 837, 243號(hào)）?？墒褂秒p特 異性抗體靶向兩種分別的抗原。舉例而言，使用抗Fc受體/抗腫瘤抗原（例如Her-2/neu) 雙特異性抗體將巨噬細(xì)胞靶向至腫瘤位點(diǎn)。此靶向可更有效地活化腫瘤特異性反應(yīng)。通過 使用LAG-3阻斷來增大這類反應(yīng)的T細(xì)胞分支?；蛘?，可通過使用結(jié)合腫瘤抗原及樹突細(xì) 胞特異性細(xì)胞表面標(biāo)記物的雙特異性抗體來將抗原直接遞送至DC。
[0201] 腫瘤通過諸多機(jī)制逃避宿主免疫監(jiān)控?？赏ㄟ^鈍化由腫瘤表達(dá)且是免疫 阻抑性的蛋白質(zhì)來克服許多這類機(jī)制。這些包括TGF-β (Kehrl等人（1986) J. Exp. Med. 163:1037-1050)、IL-10(Howard 及 0' Garra(1992)Immunology Todayl3:198-200)及 Fas配體（Hahne等人（1996) Science 274:1363-1365)等。針對(duì)這些實(shí)體中每一種的抗體 可與抗LAG-3組合使用以抵抗免疫阻抑劑的作用且有益于宿主的腫瘤免疫反應(yīng)。
[0202] 其他活化宿主免疫反應(yīng)性的抗體可與抗LAG-3組合使用。這些抗體包括位于樹突 細(xì)胞表面上的活化DC功能及抗原呈現(xiàn)的分子。抗CD40抗體能夠有效替代T輔助細(xì)胞活性 (Ridge 等人（1998)Nature 393:474-478)且可與 LAG-3 抗體結(jié)合使用（Ito 等人（2000) Immunobiology 201(5)527-40)?；罨槍?duì)T細(xì)胞共刺激性分子（例如CTLA-4(例如美國專 利第 5, 811，097 號(hào)）、0X-40 (Weinberg 等人（2000) Immunol 164:2160-2169)、4_1BB (Melero 等人（1997)Nature Medicine 3:682-685(1997)及 ICOS(Hutloff 等人（1999)Nature 397:262-266))亦可提供增加的T細(xì)胞活化水平。
[0203] 當(dāng)前使用骨髓移植來治療各種造血源的腫瘤。盡管移植物對(duì)宿主病是此治療的結(jié) 果，但可自移植物對(duì)腫瘤反應(yīng)獲得治療益處?？墒褂肔AG-3阻斷來增加供體植入的腫瘤特 異性T細(xì)胞的有效性。
[0204] 亦存在若干實(shí)驗(yàn)治療方案，其涉及離體活化及擴(kuò)展抗原特異性T細(xì)胞且將這 類細(xì)胞過繼性轉(zhuǎn)移至接受者中以刺激針對(duì)腫瘤的抗原特異性T細(xì)胞（Greenberg及 Riddell (1999)Science 285:546-51)。這類方法亦可用于活化對(duì)感染劑（例如CMV)的T 細(xì)胞反應(yīng)。在抗LAG-3抗體存在下的離體活化可增加過繼性轉(zhuǎn)移的T細(xì)胞的頻率及活性。
[0205] 傳染病
[0206] 使用本發(fā)明的其他方法來治療已暴露于特定毒素或病原體的患者。因此，本發(fā)明 的另一方面提供治療受試者中的傳染病的方法，其包括向受試者施用抗LAG-3抗體或其抗 原結(jié)合部分，從而治療受試者的傳染病。優(yōu)選地，所述抗體是人的抗人LAG-3抗體（例如本 文所闡述人抗LAG-3抗體中的任一者）。另外或備選地，所述抗體可為嵌合或人源化抗體。
[0207] 類似于如上文所論述在腫瘤中的應(yīng)用，可單獨(dú)使用抗體介導(dǎo)的LAG-3阻斷或作為 輔助方式與疫苗組合使用以刺激對(duì)病原體、毒素及自體抗原的免疫反應(yīng)。此治療方式可尤 其有用的病原體的實(shí)例包含當(dāng)前并無有效疫苗的病原體或常規(guī)疫苗不能完全有效的病原 體。這些病原體包含但不限于HIV、肝炎（A、B及C)、流感、皰疹、梨形鞭毛蟲屬（Giardia)、 痕疾、利什曼蟲（Leishmania)、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)、綠膿假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)。LAG-3阻斷尤其可用于在感染過程中呈現(xiàn)改變的抗原的因子 (例如HIV)的確立感染。這類新的表位在施用抗人LAG-3時(shí)可識(shí)別為外來物，由此引起較 強(qiáng)的T細(xì)胞反應(yīng)，其不通過經(jīng)由LAG-3的負(fù)信號(hào)減弱。
[0208] 引起可通過本發(fā)明方法治療的感染的病原性病毒的一些實(shí)例包含HIV、肝炎（A、 B或C)、皰疹病毒（例如VZV、HSV-l、HAV-6、HSV-II及CMV、愛潑斯坦巴爾病毒（Epstein Barr virus))、腺病毒、流感病毒、黃病毒、埃可病毒（echovirus)、鼻病毒、柯薩奇病毒 (coxsackie virus)、冠狀病毒、呼吸道合胞病毒、腿腺炎病毒、輪狀病毒、麻疫病毒、風(fēng)疫病 毒、細(xì)小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革病毒（dengue virus)、乳頭狀瘤病毒、軟疣病毒、脊 髓灰質(zhì)炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒及蟲媒病毒性腦炎病毒。
[0209] 引起可通過本發(fā)明方法治療的感染的病原性細(xì)菌的一些實(shí)例包含衣原體 (chlamydia)、立克次氏體細(xì)菌（rickettsial bacteria)、分枝桿菌（mycobacteria)、 葡萄球菌（staphylococci)、鏈球菌（streptococci)、肺炎球菌（pneumonococci)、腦膜 炎球菌及淋球菌（meningococci and gonococci)、克雷伯菌（klebsiella)、變形桿菌 (proteus)、沙雷氏菌（serratia)、假單胞菌（pseudomonas)、軍團(tuán)桿菌（Iegionella)、白喉 (diphtheria)、沙門氏菌（salmonella)、桿菌（bacilli)、霍亂、破傷風(fēng)（tetanus)、肉毒桿 菌（botulism)、炭疽熱、痕疫、鉤端螺旋體（leptospirosis)及萊姆病細(xì)菌（Lymes disease bacteria)〇
[0210] 引起可通過本發(fā)明方法治療的感染的病原性真菌的一些實(shí)例包含假絲酵母 (Candida)(白色（albicans)、克魯斯氏（krusei)、光滑（glabrata)、熱帶（tropicalis) 假絲酵母等）、新型隱球菌（Cryptococcus neoformans)、曲霉菌（Aspergillus)(煙曲菌 (fumigatus)、黑曲霉（niger)等）、毛霉菌屬（Genus Mucorales)(毛霉菌（mucor)、犁頭 霉菌（absidia)、根霉菌（rhizopus))、申克氏孢絲菌（Sporothrix schenkii)、皮炎芽生菌 (Blastomyces dermatitidis)、巴西副球抱子菌（Paracoccidioides brasiliensis)、粗球 抱子菌（Coccidioides immitis)及夾膜組織胞菜菌（Histoplasma capsulatum)。
[0211] 引起可通過本發(fā)明方法治療的感染的病原性寄生蟲的一些實(shí)例包含溶組織 內(nèi)阿米巴（Entamoeba histolytica)、大腸纖毛蟲（Balantidium coli)、福氏耐格 里變形蟲（Naegleriafowleri)、棘阿米巴屬的種（Acanthamoeba sp.)、梨形鞭毛蟲 (Giardia Iambia)、隱抱子蟲屬的種（Cryptosporidium sp·)、卡氏肺囊蟲（Pneumocystis carinii)、間日癥原蟲（Plasmodium vivax)、巴貝亞原蟲（Babesia microti)、布魯斯錐 蟲（Trypanosoma brucei)、克氏維蟲（Trypanosoma cruzi)、多氏利什曼蟲（Leishmania donovani)、剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii)、巴西日?qǐng)A線蟲（Nippostrongylus brasiliensis)〇
[0212] 在所有上述方法中，LAG-3阻斷可與其他形式的免疫療法（例如細(xì)胞因子治療（例 如干擾素、GM-CSF、G-CSF、IL-2)或雙特異性抗體療法）組合，這會(huì)提供增強(qiáng)的腫瘤抗原 呈現(xiàn)（例如參見 Holliger (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 ;Poljak(1994) Structure 2:1121-1123)。
[0213] 自體免疫反應(yīng)
[0214] 抗LAG-3抗體可引起且擴(kuò)大自體免疫反應(yīng)。實(shí)際上，使用腫瘤細(xì)胞及肽疫苗誘 導(dǎo)抗腫瘤反應(yīng)揭示，許多抗腫瘤反應(yīng)涉及抗自身反應(yīng)性（van Elsas等人（2001) J. Exp. Med.l94:48卜489;0verwijk 等人（1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:2982-2987; Hurwitz, (2000),參見上文；Rosenberg 及 White (1996) J. Immunother Emphasis Tumor Immunol 19(1) :81-4)。因此，可考慮將各種自體蛋白質(zhì)與使用抗LAG-3阻斷結(jié)合以設(shè)計(jì)疫 苗接種方案，從而有效生成針對(duì)這類自體蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)以用于疾病治療。舉例而言，阿 茲海默氏?。ˋlzheimer' s disease)涉及淀粉樣蛋白沉積物中的Αβ肽在腦中的不恰當(dāng) 積累；針對(duì)淀粉樣蛋白的抗體反應(yīng)能夠清除這些淀粉樣蛋白沉積物（Schenk等人，（1999) Nature 400:173-177)。
[0215] 亦可使用其他自體蛋白質(zhì)作為靶物，例如IgE(用于治療過敏及哮喘）及 TNFa (用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎）。最后，可通過使用抗LAG-3抗體來誘導(dǎo)對(duì)各種激素的抗體 反應(yīng)。可使用針對(duì)生殖激素的中和抗體反應(yīng)來進(jìn)行避孕。針對(duì)激素及特定腫瘤的生長(zhǎng)所需 的其他可溶性因子的中和抗體反應(yīng)亦可視為可能的疫苗接種靶物。
[0216] 可使用如上文所闡述使用抗LAG-3抗體的類似方法來誘導(dǎo)治療性自體免疫反應(yīng) 以治療具有其他自體抗原（例如淀粉樣蛋白沉積物（包括阿茲海默氏病中的Αβ)、細(xì)胞因 子（例如TNFa )及IgE)的不恰當(dāng)積累的患者。
[0217] 疫苗
[0218] 可使用抗LAG-3抗體來刺激抗原特異性免疫反應(yīng)，其通過將抗LAG-3抗體與感興 趣的抗原（例如疫苗）共施用。因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供增強(qiáng)受試者中對(duì)抗原的免 疫反應(yīng)的方法，其包括向受試者施用：（i)該抗原；及（ii)抗LAG-3抗體或其抗原結(jié)合部 分，從而增強(qiáng)受試者中對(duì)該抗原的免疫反應(yīng)。優(yōu)選地，所述抗體是人的抗人LAG-3抗體（例 如本文所闡述人抗LAG-3抗體中的任一者）。另外或備選地，所述抗體可為嵌合或人源化抗 體。所述抗原可為例如腫瘤抗原、病毒抗原、細(xì)菌抗原或來自病原體的抗原。這類抗原的非 限制性實(shí)例包含上文部分中論述的那些，例如上述腫瘤抗原（或腫瘤疫苗）、或來自病毒、 細(xì)菌或上述其他病原體的抗原。
[0219] 在體內(nèi)及體外施用本發(fā)明的抗體組合物（例如人單克隆抗體、多特異性及雙特異 性分子及免疫綴合物）的適宜路徑在本領(lǐng)域中已眾所周知且可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員進(jìn) 行選擇。舉例而言，可通過注射（例如靜脈內(nèi)或皮下）施用抗體組合物。所用分子的適宜 劑量取決于受試者的年齡及體重及抗體組合物的濃度和/或劑型。
[0220] 如先前所闡述，本發(fā)明的人抗LAG-3抗體可與一或多種其他治療劑（例如細(xì)胞 毒性劑、放射性毒性劑或免疫阻抑劑）共施用?？贵w可連接至藥劑（呈免疫復(fù)合物形式） 或可與藥劑分開施用。在后一情形（分開施用）下，抗體可在藥劑之前、之后或與該藥劑 同時(shí)施用，或可與其他已知療法（例如抗癌療法，例如放射）共施用。這類治療劑包括本 身僅在對(duì)患者具有毒性或亞毒性的水平有效的抗腫瘤劑，例如多柔比星（doxorubicin) (阿霉素（adriamycin))、順鉬（cisplatin)、硫酸博來霉素 （bleomycin sulfate)、卡莫 司?。╟armustine)、苯丁酸氮芥（chlorambucil)、達(dá)卡巴嗪（dacarbazine)及環(huán)憐醜胺 (cyclophosphamide)、輕基脲（hydroxyurea)。以100mg/ml劑量每四周一次經(jīng)靜脈內(nèi)施用 順鉬，且以60-75mg/ml劑量每21天一次靜脈內(nèi)施用阿霉素。將本發(fā)明的人抗LAG-3抗體 或其抗原結(jié)合片段與化學(xué)治療劑共施用會(huì)提供兩種抗癌劑，該兩種抗癌劑經(jīng)由不同機(jī)制發(fā) 揮作用以得到對(duì)人腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性效應(yīng)。這類共施用可解決由對(duì)藥物產(chǎn)生抗性或腫瘤 細(xì)胞的抗原性發(fā)生變化（這會(huì)使得其與抗體無反應(yīng)性）所致的問題。
[0221] 試劑盒亦在本發(fā)明范圍內(nèi)，其包括本發(fā)明的抗體組合物（例如人抗體、雙特異性 或多特異性分子、或免疫綴合物）及使用說明書。試劑盒可進(jìn)一步含有至少一種另外的試 齊[J、或本發(fā)明的一或多種其他人抗體（例如具有互補(bǔ)活性的人抗體，其結(jié)合LAG-3抗原中與 第一人抗體不同的表位）。試劑盒通常包含指示試劑盒內(nèi)容物的預(yù)期用途的標(biāo)簽。術(shù)語標(biāo) 簽包括提供于試劑盒上或與試劑盒一起提供或以其他方式伴隨試劑盒的任意書寫或記錄 材料。
[0222] 鉬合療法
[0223] 在另一方面，本發(fā)明提供組合療法的方法，其中將本發(fā)明的抗LAG-3抗體（或其抗 原結(jié)合部分）與一或多種其他抗體（其有效刺激免疫反應(yīng)以由此進(jìn)一步增強(qiáng)、刺激或上調(diào) 受試者中的免疫反應(yīng)）共施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供刺激受試者中的免疫反應(yīng) 的方法，其包括向受試者施用抗LAG-3抗體及一或多種其他免疫刺激性抗體（例如抗Η)-1 抗體、抗I 3D-Ll抗體和/或抗CTLA-4抗體），從而刺激受試者中的免疫反應(yīng)（例如抑制腫 瘤生長(zhǎng)或刺激抗病毒反應(yīng)）。在另一個(gè)實(shí)施方案中，向受試者施用抗LAG-3抗體及抗Η)-1 抗體。在再一實(shí)施方案中，向受試者施用抗LAG-3抗體及抗F 1D-Ll抗體。在又一實(shí)施方案 中，向受試者施用抗LAG-3抗體及抗CTLA-4抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗LAG-3抗體是人 抗體（例如本公開的抗體）?；蛘?，所述抗LAG-3抗體可為例如嵌合或人源化抗體（例如自 小鼠抗LAG-3mAb制得）。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種另外的免疫刺激性抗體（例如抗 PD-1、抗H)-L1和/或抗CTLA-4抗體）是人抗體?；蛘撸辽僖环N另外的免疫刺激性抗體 可為例如嵌合或人源化抗體（例如自小鼠抗ro-Ι、抗ro-Ll和/或抗CTLA-4抗體制得）。
[0224] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療過度增殖性疾病（例如癌癥）的方法， 其包括向受試者施用LAG-3抗體及CTLA-4抗體。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，以亞治療性 (subtherapeutic)劑量施用抗LAG-3抗體，以亞治療性劑量施用抗CTLA-4抗體，或以亞 治療性劑量施用二者。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供改變與使用免疫刺激劑治療過度 增殖性疾病有關(guān)的不良事件的方法，其包括向受試者施用抗LAG-3抗體及亞治療性劑量的 抗CTLA-4抗體。在某些實(shí)施方案中，受試者是人。在其他實(shí)施方案中，抗CTLA-4抗體是 人序列單克隆抗體IODl (闡述于PCT公開文本W(wǎng)O 01/14424中）且抗LAG-3抗體是人序 列單克隆抗體（例如本文中所闡述的LAG3. 5)。本發(fā)明方法所涵蓋的其他抗CTLA-4抗體 包含例如披露在以下中的那些抗體=WO 98/42752 ;W000/37504 ;美國專利第6, 207, 156號(hào)； Hurwitz 等人（1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (17) : 10067-10071 ;Camacho 等人（2004) J. Clin. Oncology 22 (145):摘要編號(hào)：2505 (抗體 CP-675206);及 Mokyr 等人（1998) Cancer Res. 58:5301-5304。在某些實(shí)施方案中，抗CTLA-4抗體以5 X KT8M或更小的Kd結(jié)合 人CTLA-4,以I X KT8M或更小的Kd結(jié)合人CTLA-4,以5 X KT9M或更小的Kd結(jié)合人CTLA-4， 或以介于IX KT8M至IX KTwM之間或更小的Kd結(jié)合人CTLA-4。
[0225] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療過度增殖性疾?。ɡ绨┌Y）的方法，其包 括向受試者施用LAG-3抗體及Η)-1抗體。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，以亞治療性劑量施用抗 LAG-3抗體，以亞治療性劑量施用抗Η)-1抗體，或以亞治療性劑量施用二者。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，本發(fā)明提供改變與使用免疫刺激劑治療過度增殖性疾病有關(guān)的不良事件的方法， 其包括向受試者施用抗LAG-3抗體及亞治療性劑量的抗F 1D-I抗體。在某些實(shí)施方案中，受 試者是人。在某些實(shí)施方案中，抗Η)-1抗體是人序列單克隆抗體且抗LAG-3抗體是人序列 單克隆抗體（例如本文中所闡述的LAG3. 5)。人序列抗ro-Ι抗體的實(shí)例包括PCT公開文本 TO 06/121168中所闡述的1708、203、紐1、504及4411。其他抗^)-1抗體包括（例如）拉 姆珠單抗（Iambrolizumab) (W02008/156712)及 AMP514(W02010/027423、W02010/027827、 W02010/027828、W02010/098788)。在某些實(shí)施方案中，抗ro-1抗體以5X KT8M或更小的Kd 結(jié)合人ro-i，以IX KT8M或更小的Kd結(jié)合人ro-i，以5 X io_9m或更小的Kd結(jié)合人ro-i，或 以介于IX KT8M與IX KTkiM之間或更小的Kd結(jié)合人ro-1。
[0226] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療過度增殖性疾?。ɡ绨┌Y）的方法，其 包括向受試者施用LAG-3抗體及H)-L1抗體。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，以亞治療性劑量 施用抗LAG-3抗體，以亞治療性劑量施用抗H)-L1抗體，或以亞治療性劑量施用二者。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供改變與使用免疫刺激劑治療過度增殖性疾病有關(guān)的不良 事件的方法，其包括向受試者施用抗LAG-3抗體及亞治療性劑量的抗F 1D-Ll抗體。在某 些實(shí)施方案中，受試者是人。在其他實(shí)施方案中，抗ro-Li抗體是人序列單克隆抗體且抗 LAG-3抗體是人序列單克隆抗體（例如本文中所闡述的LAG3. 5)。人序列抗I3D-Ll抗體的 實(shí)例包括 PCT 公開文本 WO 07/005874 中所闡述的 3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、 11E6、12B7 及 13G4。其他抗 PD-Ll 抗體包括例如 MPDL3280A(RG7446) (W02010/077634)、 MEDI4736(W02011/066389)及 MDX1105(W02007/005874)。在某些實(shí)施方案中，抗 PD-Ll 抗 體以5父1〇1或更小的1(1)結(jié)合人^)-1^，以1\1〇1或更小的1(1)結(jié)合人^)-1^，以5\1〇1 或更小的K d結(jié)合人H)-L1，或以介于I X KT8M與I X KTkiM之間或更小的Kd結(jié)合人H)-L1。
[0227] 通過抗體阻斷LAG-3及一或多種第二靶抗原（例如CTLA-4和/或ro-1和/或 ro-Li)可增強(qiáng)患者中對(duì)于癌細(xì)胞的免疫反應(yīng)?？墒褂帽竟_的抗體抑制生長(zhǎng)的癌癥包括通 常對(duì)免疫療法具有響應(yīng)性的癌癥。使用本公開的組合療法治療的癌癥的代表性實(shí)例包括在 論述抗LAG-3抗體單一療法時(shí)于上文中具體列示的那些癌癥。
[0228] 在某些實(shí)施方案中，本文所論述治療性抗體的組合可作為在藥學(xué)可接受的載體中 的單一組合物同時(shí)施用，或作為分開的組合物（其中每一抗體皆在藥學(xué)可接受的載體中） 同時(shí)施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可序貫施用治療性抗體的組合。舉例而言，可序貫施用抗 CTLA-4抗體及抗LAG-3抗體，例如首先施用抗CTLA-4抗體然后施用抗LAG-3抗體，或首先 施用抗LAG-3抗體然后施用抗CTLA-4抗體。另外或備選地，可序貫施用抗ro-Ι抗體及抗 LAG-3抗體，例如首先施用抗ro-Ι抗體然后施用抗LAG-3抗體，或首先施用抗LAG-3抗體然 后施用抗ro-Ι抗體。另外或備選地，可序貫施用抗ro-Ll抗體及抗LAG-3抗體，例如首先 施用抗I 3D-Ll抗體然后施用抗LAG-3抗體，或首先施用抗LAG-3抗體然后施用抗H)-L1抗 體。
[0229] 另外，若序貫施用超過一劑的組合療法，則在每一施用時(shí)間點(diǎn)可逆轉(zhuǎn)序貫施用 的次序或保持同一次序，序貫施用可與同時(shí)施用組合，或使用其任一組合。舉例而言，抗 CTLA-4抗體及抗LAG-3抗體的組合的第一施用可同時(shí)進(jìn)行，第二施用可為序貫的，即首先 施用抗CTLA-4且然后施用抗LAG-3，而第三施用可為序貫的，即首先施用抗LAG-3且然后施 用抗CTLA-4,等等。另外或備選地，抗ro-Ι抗體及抗LAG-3抗體的組合的第一施用可同時(shí) 進(jìn)行，第二施用可為首先施用抗ro-Ι然后施用抗LAG-3的序貫施用，而第三施用可為首先 施用抗LAG-3然后施用抗ro-Ι的序貫施用，等等。另外或備選地，抗H)-L1抗體及抗LAG-3 抗體的組合的第一施用可同時(shí)進(jìn)行，第二施用可為首先施用抗H)-L1然后施用抗LAG-3的 序貫施用，而第三施用可為首先施用抗LAG-3然后施用抗F 1D-Ll的序貫施用，等等。另一 代表性投藥方案可涉及為首先施用抗LAG-3然后施用抗CTLA-4 (和/或抗ro-1和/或抗 F1D-Ll)的序貫施用的第一施用，及隨后可同時(shí)施用。
[0230] 任選地，抗LAG-3及一或多種其他抗體（例如抗CTLA-4和/或抗ro-Ι和/或抗 PD-Ll抗體）的組合可進(jìn)一步與免疫原性劑（例如癌細(xì)胞、經(jīng)純化腫瘤抗原（包括重組蛋 白、肽及碳水化合物分子）、細(xì)胞及經(jīng)編碼免疫刺激細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞）組合（He 等人（2004) J. Immunol. 173:4919-28)?？墒褂玫哪[瘤疫苗的非限制性實(shí)例包括黑素瘤抗 原的肽（例如gpl〇〇、MAGE抗原、Trp-2、MARTI和/或酪氨酸酶的肽），或經(jīng)轉(zhuǎn)染以表達(dá)細(xì) 胞因子GM-CSF的腫瘤細(xì)胞（進(jìn)一步論述于下文中）。組合的LAG-3及CTLA-4和/或ro-1 和/或H)-L1阻斷可進(jìn)一步與疫苗接種方案（例如上文針對(duì)使用抗LAG-3抗體的單一療法 詳細(xì)論述的疫苗接種方案中的任一者）組合。
[0231] 組合的LAG-3及CTLA-4和/或ro-Ι和/或H)-L1阻斷亦可進(jìn)一步與標(biāo)準(zhǔn)癌癥治 療組合。舉例而言，組合的LAG-3及CTLA-4和/或ro-Ι和/或H)-L1阻斷可與化學(xué)治療 方案有效組合。在這類情況下，可減小與本公開的組合一起施用的另一化學(xué)治療試劑的劑 量（Mokyr 等人（1998) Cancer Research 58:5301-5304)。這類組合的一個(gè)例子是抗 LAG-3 及抗CTLA-4抗體和/或抗ro-i抗體和/或抗ro-Li抗體的組合進(jìn)一步與達(dá)卡巴嗪組合 以用于治療黑素瘤。另一個(gè)例子是抗LAG-3及抗CTLA-4抗體和/或抗ro-Ι抗體和/或 抗H)-L1抗體的組合進(jìn)一步與白介素-2(IL-2)組合用于治療黑素瘤。組合使用LAG-3及 CTLA-4和/或ro-i和/或H)-L1阻斷及化學(xué)療法的科學(xué)原理在于，細(xì)胞死亡（其是大部 分化療化合物的細(xì)胞毒性作用的結(jié)果）應(yīng)使得抗原呈現(xiàn)途徑中的腫瘤抗原水平增加?？膳c 組合的LAG-3及CTLA-4和/或ro-Ι和/或PD-Ll阻斷經(jīng)由細(xì)胞死亡產(chǎn)生協(xié)同作用的其他 組合療法包含放射、手術(shù)或激素剝奪。這類方案中的每一者皆產(chǎn)生宿主中的腫瘤抗原的來 源。血管生成抑制劑亦可與組合的LAG-3及CTLA-4和/或ro-Ι和/或H)-L1阻斷組合。 對(duì)血管生成的抑制會(huì)引起腫瘤細(xì)胞死亡，此可為供給至宿主抗原呈現(xiàn)途徑中的腫瘤抗原的 來源。
[0232] LAG-3及CTLA-4和/或ro-Ι和/或I3D-Ll阻斷抗體的組合亦可與使Fe α或 Fcy受體表達(dá)效應(yīng)器細(xì)胞靶向腫瘤細(xì)胞的雙特異性抗體組合使用（例如參見美國專利第 5,922,845號(hào)及第5,837,243號(hào)）?？墒褂秒p特異性抗體靶向兩種分別的抗原。通過使用 組合的LAG-3及CTLA-4和/或ro-Ι和/或H)-L1阻斷來增大這類反應(yīng)的T細(xì)胞分支。
[0233] 在另一例子中，抗LAG-3及抗CTLA-4和/或抗ro-Ι抗體和/或抗H)-L1抗體的 組合可與抗腫瘤性抗體（例如RJtuxan:s:+ (利妥昔單抗（rituximab))、Herceptini"(曲 妥珠單抗（trastuzumab))、Bexxar* (托西莫單抗（tositumomab))、Zevalinfc'(替伊莫 單抗（ibritumomab))、Campatll*.(阿來組單抗（alemtuzumab))、Lymphocide* (依帕 珠單抗（eprtuzumab))、Avastin^ (貝伐珠單抗（bevacizumab))及Tarceva# (厄洛替尼 (erlotinib))及諸如此類）結(jié)合使用。舉例且不希望受理論束縛地，使用抗癌性抗體或綴 合于毒素的抗癌性抗體進(jìn)行治療可引起癌細(xì)胞死亡（例如腫瘤細(xì)胞），此將強(qiáng)化由CTLA-4、 ro-l、PD-Ll或LAG-3介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。在一例示性實(shí)施方案中，對(duì)過度增殖性疾?。ɡ?癌癥腫瘤）的治療可包括抗癌癥抗體與抗LAG-3及抗CTLA-4和/或抗ro-Ι和/或抗H)-L1 抗體的組合（同時(shí)或序貫或其任一組合），此可強(qiáng)化宿主的抗腫瘤免疫反應(yīng)。
[0234] 腫瘤通過諸多機(jī)制逃避宿主免疫監(jiān)控?？赏ㄟ^鈍化由腫瘤表達(dá)且是免疫阻 抑性的蛋白質(zhì)來克服許多這類機(jī)制。這些機(jī)制包括TGF-β (Kehrl等人（1986) J. Exp. Med. 163:1037-1050)、IL-10(Howard 及 0' Garra(1992)ImmunologyToday 13:198-200)及 Fas配體（Hahne等人（1996) Science 274:1363-1365)等。在另一例子中，針對(duì)這些實(shí)體中 每一種的抗體可進(jìn)一步與抗LAG-3及抗CTLA-4和/或抗Η)-1和/或抗H)-L1抗體組合進(jìn) 行組合以抵抗免疫阻抑劑的作用且有益于宿主的抗腫瘤免疫反應(yīng)。
[0235] 可將可用于活化宿主免疫反應(yīng)性的其他抗體進(jìn)一步用于與抗LAG-3及抗CTLA-4 和/或抗ro-i和/或抗H)-L1抗體組合。這些抗體包含樹突細(xì)胞表面上的活化DC功能及 抗原呈現(xiàn)的分子?？耿?0抗體（Ridge等人，參見上文）可與抗LAG-3及抗CTLA-4和/或 抗ro-i和/或抗ro-Li的組合結(jié)合使用（Ito等人，參見上文）。對(duì)τ細(xì)胞共刺激性分子 的其他活化抗體（Weinberg等人，參見上文；Melero等人，參見上文；Hutloff等人，參見上 文）亦可提供增加的T細(xì)胞活化水平。
[0236] 如上文所論述，當(dāng)前使用骨髓移植來治療各種造血源腫瘤。可使用組合的LAG-3 及CTLA-4和/或Η)-1和/或PD-Ll阻斷來增加供體植入的腫瘤特異性T細(xì)胞的有效性。
[0237] 幾種實(shí)驗(yàn)治療方案涉及離體活化及擴(kuò)展抗原特異性T細(xì)胞且將這類細(xì)胞過繼性 轉(zhuǎn)移至接受者以獲得針對(duì)腫瘤的抗原特異性T細(xì)胞（Greenberg及Riddell的參考文獻(xiàn)，參 見上文）。這類方法亦可用于活化對(duì)感染劑（例如CMV)的T細(xì)胞反應(yīng)。在抗LAG-3及抗 CTLA-4和/或抗ro-i和/或抗I3D-Ll抗體存在下的離體活化預(yù)期可增加過繼性轉(zhuǎn)移的T 細(xì)胞的頻率及活性。
[0238] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供改變與使用免疫刺激劑治療過度增殖性疾病（例 如癌癥）有關(guān)的不良事件的方法，其包括向受試者施用抗LAG-3抗體及亞治療性劑量的抗 CTLA-4和/或抗ro-i和/或抗H)-L1抗體。舉例而言，本發(fā)明方法提供通過向患者施用 不可吸收性類固醇來減小免疫刺激性治療性抗體誘導(dǎo)的結(jié)腸炎或腹瀉的發(fā)病率的方法。由 于任一接受免疫刺激性治療性抗體的患者皆有形成由這類抗體誘導(dǎo)的結(jié)腸炎或腹瀉的風(fēng) 險(xiǎn)，因此這整個(gè)患者群體適用于根據(jù)本發(fā)明方法的療法。盡管已施用類固醇來治療炎性腸 ?。↖BD)且預(yù)防IBD的加重，但尚未使用其來預(yù)防（降低發(fā)病率）并未診斷有IBD患者的 IBD。與類固醇（即使是不可吸收性類固醇）有關(guān)的顯著副作用已阻礙了預(yù)防性應(yīng)用。
[0239] 在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，LAG-3及CTLA-4和/或Η)-1和/或H)-L1阻斷的組合 (即免疫刺激性治療性抗體抗LAG-3及抗CTLA-4和/或抗Η)-1抗體和/或抗PD-Ll抗 體）可進(jìn)一步與任意不可吸收性類固醇的使用組合。如本文中所使用，"不可吸收性類固 醇"是一種糖皮質(zhì)激素，其展現(xiàn)出廣泛首過代謝從而使得在肝中代謝后，類固醇的生物可用 度較低（即小于約20%)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述不可吸收性類固醇是布地奈 德（budesonide)。布地奈德是局部作用性糖皮質(zhì)激素，其在口服施用后主要由肝充分代 謝。ENTOCORTEC? (Astra-Zeneca)是布地奈德的pH及時(shí)間依賴性口服制劑，其被開發(fā)以 用于優(yōu)化至回腸及在整個(gè)結(jié)腸內(nèi)的藥物遞送。ENT0C0RT EC?.在美國經(jīng)批準(zhǔn)用于治療涉及 回腸和/或升結(jié)腸的輕度至中等克羅恩氏?。–rohn's disease)。用于治療克羅恩氏病的 ENT0C0RT ECf的常用口服劑量為6至9mg/天。ENT0C0RT EG'*;釋放于腸中，然后被吸收且 保留于腸黏膜中。在通過腸黏膜靶組織后，ENT0C0RT 由肝中的細(xì)胞色素 P450系統(tǒng)充 分代謝成具有可忽略的糖皮質(zhì)激素活性的代謝物。因此，生物可用度較低（約10%)。布 地奈德的較低的生物可用度使得與其他具有較小廣泛首過代謝的糖皮質(zhì)激素相比具有改 進(jìn)的治療比率。布地奈德產(chǎn)生較少不良效應(yīng)，包含下丘腦-垂體阻抑小于全身作用的皮質(zhì) 類固醇。然而，長(zhǎng)期施用ENTOCORT EC?可導(dǎo)致全身性糖皮質(zhì)激素效應(yīng)，例如腎上腺功能亢 進(jìn)及腎上腺阻抑。參見PDR第58版，2004 ;608-610。
[0240] 在仍進(jìn)一步的實(shí)施方案中，結(jié)合不可吸收性類固醇的組合LAG-3及CTLA-4和/或 ro-i和/或ro-Li阻斷（即免疫刺激性治療性抗體抗lag-3及抗CTLA-4和/或抗ro-i 和/或抗ro-Ll抗體）可進(jìn)一步與水楊酸鹽組合。水楊酸鹽包含5-ASA藥劑，例如：柳氮磺 批陡（sulfasalazine) ( AZULJ.'Π )丨NL.::'、.，Pharmacia&UpJohn);奧色拉嗪（olsalazine) (DIPENTUM?:，Pharmacia&UpJohn);巴柳氮（balsalazide) ( COLAZAL*.，Salix Pharmaceuticals 公司）；和美色拉嚷（mesalamine) ( ASACOLs, ,Procter&Gamble Pharmaceuticals ; PENTASA*:.，Shire US ; CANASA'.?.，Axcan Scandipharm 公司； ROWASA* ,Solvay)〇
[0241] 根據(jù)本發(fā)明方法，出于降低由免疫刺激性抗體誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的發(fā)病率的目的，與 抗LAG-3及抗CTLA-4和/或抗Η)-1和/或抗H)-L1抗體及不可吸收性類固醇組合施用的 水楊酸鹽可包含水楊酸鹽及不可吸收性類固醇的任一重疊或序貫施用。因此，舉例而言，根 據(jù)本發(fā)明減小由免疫刺激性抗體誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的發(fā)病率的方法涵蓋同時(shí)或序貫施用水楊 酸鹽及不可吸收性類固醇（例如在不可吸收性類固醇之后6小時(shí)施用水楊酸鹽），或其任一 組合。另外，根據(jù)本發(fā)明，可通過相同途徑（例如二者皆經(jīng)口施用）或通過不同途徑（例如 經(jīng)口施用水楊酸鹽且經(jīng)直腸施用不可吸收性類固醇）施用水楊酸鹽及不可吸收性類固醇， 其可不同于用于施用抗LAG-3及抗CTLA-4和/或抗Η)-1和/或抗H)-L1抗體的途徑。
[0242] 通過下列實(shí)例進(jìn)一步闡釋本公開，不能將其視為進(jìn)一步限制。貫穿本申請(qǐng)中所引 用的所有圖及所有參考文獻(xiàn)、Genbank序列、專利及公開專利申請(qǐng)案的內(nèi)容均通過提述明 確并入本文中。具體地，PCT公開文本W(wǎng)O 09/045957、WO 09/073533、WO 09/073546及WO 09/054863的公開內(nèi)容均通過提述明確并入本文中。 實(shí)施例
[0243] 實(shí)施例I :LAG3. 1 (抗體25F7)的變體的設(shè)計(jì)
[0244] 創(chuàng)建先前描述的抗LAG-3抗體25F7 (在本文中稱為L(zhǎng)AG3. 1)的抗體變體，其通過 首先分析抗體的氨基酸序列的潛在降解位點(diǎn)。使用QuikChange II XL?定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?(Agilent Technologies)來實(shí)施LAG3. IVh區(qū)的定點(diǎn)誘變的表達(dá)。然后將改變的Vh區(qū)亞克 隆至含有人IgG4-S228P恒定區(qū)的UGOEe (EMD Millipore)載體中。將各重鏈載體各自 與表達(dá)LAG3. Ik鏈的載體一起共轉(zhuǎn)染至CHO-S細(xì)胞中，且選擇穩(wěn)定的集合物（pool)用于 表達(dá)。
[0245] 在可變區(qū)重鏈⑶R2內(nèi)鑒別5個(gè)潛在的去酰胺化基序。這些位點(diǎn)位于LAG3. 1的重 鏈可變區(qū)（SEQ ID N0:2)的52、54、56、58及60位處（參見圖認(rèn)）。具體地，在所有條件下 皆觀察到VH⑶R2(SEQ ID NO: 6)內(nèi)的"NG"序列發(fā)生去酰胺化且序列進(jìn)一步發(fā)生異構(gòu)化。 起始材料的去酰胺化約為10%。另外，發(fā)現(xiàn)此"NG"序列不對(duì)應(yīng)于種系序列（參見圖3)。然 而，共有種系序列是潛在的糖基化位點(diǎn)且由此不包含于抗體變體間。
[0246] 設(shè)計(jì)4個(gè)變體（在本文中稱為L(zhǎng)AG3. 5、LAG3. 6、LAG3. 7及LAG3. 8)，其尋址于兩個(gè) 潛在的去酰胺化基序（54及56位），如圖3中所展示。使這類變體經(jīng)受如下表1中所概述 的各種條件且分析下列特征：(a)化學(xué)及熱穩(wěn)定性（物理穩(wěn)定性）；(b)大小排阻層析（聚 集）；（c)等電聚焦凝膠（IEF)(電荷異質(zhì)性）；（d)通過Biacore分析得到的活性（結(jié)合及 功能活性）；及（e)通過質(zhì)譜分析得到的肽圖譜（mapping)(化學(xué)修飾/分子穩(wěn)定性）。
[0247] 表 1
[0248]
【權(quán)利要求】
1. 一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其結(jié)合人LAG-3且包含重鏈和輕鏈可變 區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)包含來自SEQ ID NO: 12的重鏈可變區(qū)的⑶R1、⑶R2和⑶R3區(qū)。
2. 權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述重鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3區(qū)分別包 括SEQ ID NO: 15、16和17的氨基酸序列。
3. 權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述輕鏈可變區(qū)包含來自SEQ ID NO: 14 的輕鏈可變區(qū)的⑶R1、⑶R2和⑶R3區(qū)。
4. 權(quán)利要求3的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)分別包 含SEQ ID NO: 18、19和20的氨基酸序列。
5. 權(quán)利要求1或3的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO: 12 的氨基酸序列。
6. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO: 14的氨基酸序列。
7. -種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其結(jié)合人LAG-3且包含重鏈和輕鏈 CDR1、CDR2 和 CDR3 區(qū)，所述重鏈 CDR1、CDR2 和 CDR3 區(qū)分別包含 SEQ ID NO: 15、16、17 的氨 基酸序列，所述輕鏈⑶R1XDR2和⑶R3區(qū)分別包含SEQ ID NO: 18、19和20的氨基酸序列。
8. -種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其結(jié)合人LAG-3且包含重鏈和輕鏈可變 區(qū)，所述重鏈和輕鏈可變區(qū)分別包含SEQ ID NO: 12和14的氨基酸序列。
9. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其展現(xiàn)下列特性的一種或組合： (a) 結(jié)合猴L(fēng)AG-3 ; (b) 缺少對(duì)小鼠LAG-3的結(jié)合； (c) 結(jié)合LAG-3主要組織相容性（MHC) II類分子； (d) 抑制LAG-3對(duì)主要組織相容性（MHC) II類分子的結(jié)合；或 (e) 刺激免疫反應(yīng)。
10. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其刺激抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng) 中的白介素-2(IL-2)產(chǎn)生。
11. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其刺激抗腫瘤免疫反應(yīng)。
12. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其結(jié)合人LAG-3的表位，所述表 位包含氨基酸序列PGHPLAPG(SEQ ID N0:21)。
13. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其結(jié)合人LAG-3的表位，所述表 位包含氨基酸序列 HPAAPSSW(SEQ ID N0:22)或 PAAPSSWG(SEQ ID N0:23)。
14. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其以0.27x 1(T9M或更小的KD結(jié) 合人LAG-3。
15. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其是人抗體、人源化抗體或嵌合 抗體。
16. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其為IgGl、IgG2或IgG4同種型。
17. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其為抗體片段或單鏈抗體。
18. -種雙特異性分子，其包含前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，和第 二抗體或其抗原結(jié)合部分。
19. 一種免疫綴合物，其包含連接于治療劑的權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的抗體或其抗原 結(jié)合部分。
20. 權(quán)利要求19的免疫綴合物，其中所述治療劑是細(xì)胞毒素或放射性同位素。
21. -種組合物，其包含權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分、權(quán)利要求 18的雙特異性分子、或權(quán)利要求19或20的免疫綴合物、和藥學(xué)可接受的載體。
22. 權(quán)利要求21的組合物，其還包含抗癌劑。
23. 權(quán)利要求22的組合物，其中所述抗癌劑是抗體或化學(xué)治療劑。
24. -種分離的核酸，其編碼權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分的重鏈 和/或輕鏈可變區(qū)。
25. -種表達(dá)載體，其包括權(quán)利要求24的核酸。
26. -種宿主細(xì)胞，其包括權(quán)利要求25的表達(dá)載體。
27. -種用于制備抗LAG-3抗體的方法，包括在權(quán)利要求26的宿主細(xì)胞中表達(dá)該抗體， 并自該宿主細(xì)胞分離該抗體。
28. -種刺激受試者中的免疫反應(yīng)的方法，包括對(duì)所述受試者施用權(quán)利要求1至17中 任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分、權(quán)利要求18的雙特異性分子、或權(quán)利要求19或20的免 疫綴合物，從而刺激所述受試者中的免疫反應(yīng)。
29. 權(quán)利要求28的方法，其中所述受試者是攜帶腫瘤的受試者且刺激針對(duì)所述腫瘤的 免疫反應(yīng)。
30. 權(quán)利要求28的方法，其中所述受試者是攜帶病毒的受試者且刺激針對(duì)該病毒的免 疫反應(yīng)。
31. 權(quán)利要求28的方法，其中所述免疫反應(yīng)是抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)，從而刺激了抗原 特異性T細(xì)胞反應(yīng)。
32. 權(quán)利要求31的方法，其中所述抗原特異性T細(xì)胞的白介素-2生成被刺激。
33. -種用于抑制受試者中的腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)的方法，包括對(duì)所述受試者施用權(quán)利要 求1至17中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分、權(quán)利要求18的雙特異性分子、或權(quán)利要求19 或20的免疫綴合物，從而在所述受試者中抑制腫瘤生長(zhǎng)。
34. -種用于治療受試者的病毒感染的方法，包括對(duì)所述受試者施用權(quán)利要求1至17 中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分、權(quán)利要求18的雙特異性分子、或權(quán)利要求19或20的 免疫綴合物，從而在所述受試者中治療病毒感染。
35. 權(quán)利要求30的方法，其進(jìn)一步包括施用至少一種另外的免疫刺激性抗體。
36. 權(quán)利要求35的方法，其中所述至少一種另外的免疫刺激性抗體是抗H)-l抗體。
37. 權(quán)利要求36的方法，其中所述至少一種另外的免疫刺激性抗體是抗H)-L1抗體。
38. 權(quán)利要求36的方法，其中所述至少一種另外的免疫刺激性抗體是抗CTLA-4抗體。
39. 權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分、權(quán)利要求18的雙特異性分 子、或權(quán)利要求19或20的免疫綴合物在受試者中刺激免疫反應(yīng)或抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或治 療病毒感染的用途，其中所述免疫反應(yīng)任選為抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)。
40. 權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分、權(quán)利要求18的雙特異性分 子、或權(quán)利要求19或20的免疫綴合物在制備用于在受試者中刺激免疫反應(yīng)或抑制腫瘤細(xì) 胞生長(zhǎng)或治療病毒感染的藥物中的用途，其中所述免疫反應(yīng)任選為抗原特異性T細(xì)胞反 應(yīng)。
【文檔編號(hào)】C07K16/28GK104411723SQ201380035443
【公開日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2013年7月2日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月2日
【發(fā)明者】N.朗伯格, M.斯里尼瓦桑 申請(qǐng)人:百時(shí)美施貴寶公司