專利名稱：一種谷氨酰胺轉胺酶的分離純化方法
技術領域：
一種谷氨酰胺轉胺酶的分離純化方法，本發(fā)明涉及一種以陰離子交換層析為主要 手段的谷氨酰胺轉胺酶的分離純化方法，屬于生物制品分離純化技術領域。
背景技術：
谷氨酰胺轉胺酶(Transglutaminase，簡稱TGase，EC 2. 3. 2. 13)，又稱轉谷氨酰 胺酶，是一種催化?；D移反應的酶。它具有多種催化功能，既可以使蛋白質(zhì)分子內(nèi)、分子 間交聯(lián)，也可以使蛋白質(zhì)和氨基酸連接還可以水解蛋白質(zhì)分子內(nèi)的谷氨酰胺，從而改變蛋 白質(zhì)本身以及其所附著細胞和組織等的結構和功能，提高蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值，被譽為“21 世紀超級粘合劑”。成為目前食品加工領域最受關注和應用最為廣泛的酶制劑。此外，在生 物醫(yī)藥，組織工程，紡織和皮革處理等多個領域也有著潛在應用。然而，目前在國內(nèi)食品、生物醫(yī)藥領域應用的谷氨酰胺轉胺酶主要購自日 本公司，其原因在于日本公司生產(chǎn)的谷氨酰胺轉胺酶純度較高。而本發(fā)明旨在開發(fā)出一種 高純度、高得率的電泳級谷氨酰胺轉胺酶的純化方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種谷氨酰胺轉胺酶的分離純化方法。本發(fā)明的具體步驟如下
1)將發(fā)酵液去除菌體得到的上清液經(jīng)過硫酸銨分級沉淀，收集蛋白沉淀溶解后進行 透析；
2)將透析后的酶液加入到用pH 7. 5的Tris-HCl平衡好的陰離子交換柱Hitrap Q HP中，用0-1 mol/L氯化鈉線形梯度洗脫，收集活性部分；
3)將收集的活性部分用硫酸銨濃縮，將濃縮后的酶液加入Superdex 75 10/300GL 層析柱中，用0. 15 mol/L氯化鈉洗脫并收集活性部分；
4)將收集到的活性部分加入到用pH8. 5的Tris-HCl平衡好的陰離子交換柱Hitrap Q HP中，用0-0.4 mol/L氯化鈉進行線性梯度洗脫，收集活性部分。本發(fā)明所述發(fā)酵液是指以吸水鏈霉菌(Strep tomyces hygroscopicus) WSH03-13作為出發(fā)菌株，10%的接種量接菌至發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C，200 r/min培養(yǎng)60 h，得 到含谷氨酰胺轉胺酶的發(fā)酵液。吸水鏈霉菌〈Str印tomyces hygroscopicus)WSH03-13已 在中國專利ZL03152956. 9公開，授權公告號CN 1208452 C，授權公告日2005年6月29日。本發(fā)明的詳細的步驟為 (1)硫酸銨沉淀
將吸水鏈霉菌Streptomyces Aj^roscc^ic^s發(fā)酵液離心去除菌體后，上清液中加入硫 酸銨粉末，至飽和度為50%，緩慢攪拌使其完全溶解。調(diào)節(jié)pH值，使酶液的pH保持在7. 5， 靜置半小時后10000 Xg低溫離心10 min,收集上清液繼續(xù)加入硫酸銨至飽和度為80%，4°C 靜置數(shù)小時后，低溫離心收集蛋白沉淀。將沉淀溶解在20 mmol/L Tris-HCl pH 7. 5的緩沖液中并且4°C透析數(shù)小時；
(2)第一次離子交換層析
將透析后的酶液加入到預先用20 mmol/L Tris-HCl pH 7. 5的緩沖液平衡好的陰離子 交換柱Hitrap Q HP中。用含0-1 mol/L氯化鈉的相同緩沖液進行線性梯度洗脫，流速為
1mL/min，檢測波長為280 nm，收集有活性的部分；
(3)凝膠過濾層析
將收集到的全部活性部分用硫酸銨(飽和度80%)濃縮并用少量Tris-HCl pH 7. 5緩 沖液溶解，將濃縮后的酶液加入到預先用20 mmol/L Tris-HCl pH 7. 5緩沖液平衡好的 Superdex 75 10/300GL層析柱中，用含0. 15 mol/L氯化鈉的相同緩沖液進行洗脫，流速為 0. 4 mL/min，檢測波長為280 nm，收集有活性的部分；
(4)第二次離子交換層析
將收集到的活性部分經(jīng)20 mmol/L Tris-HCl pH 8. 5的緩沖液透析后再次加入到 預先用20 mmol/L Tris-HCl pH 8. 5緩沖液平衡好的Hitrap Q HP離子柱中，用含0-0. 4 mol/L氯化鈉的相同緩沖液進行線性梯度洗脫，收集活性部分，即為所制備的電泳純谷氨酰 胺轉胺酶。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供了一種谷氨酰胺轉胺酶的分離純化方法，該方法 工藝簡單，具有較高的得率，所得到的谷氨酰胺轉胺酶純度高。


圖1.第一次離子交換色譜圖 圖2.凝膠過濾色譜圖 圖3.第二次離子交換色譜圖
圖4.谷氨酰胺轉胺酶分離純化全過程的SDS-PAGE電泳圖
1、蛋白分子量標準；2、發(fā)酵上清液；3、鹽析后的酶液；4、第一次離子交換后的酶液；5、 Superdex 75凝膠過濾后的酶液；6、第二次離子交換后得到的TGase A ;7、第二次離子交換 后得到的TGase B。
具體實施例方式
材料和檢測方法
吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus) WSH03-13,巳在中國專利 ZL03152956. 9 公開，授權公告號CN 1208452 C，授權公告日2005年6月29日。發(fā)酵培養(yǎng)基糊精20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母提取物5 g/L,CaCl2 1 g/L,MgSO4
2g/L, K2HPO4 2 g/L, KH2PO4 2 g/L (pH 7.0)。谷氨酰胺轉胺酶活力測定方法以L-谷氨酸-g_單羥肟酸為標準品作標準曲線。 恒溫水浴鍋調(diào)到37°C，將底物(Z-Gln-Gly和羥胺)和待測樣品(40 μι)放入水浴鍋預熱10 min，在樣品中加入100 PL底物，反應10 min，然后加40 PL終止劑(三氯乙酸和三氯化鐵) 終止反應。取出樣品，SOOOXg離心5 min，在562 nm下用蛋白核酸定量測定儀比色測定酶 活。酶活力單位定義該酶在37°C時每分鐘催化底物生成1 mmol L-谷氨酸-g-單羥肟酸 所需要的酶量。實施例1
將吸水鏈霉菌(Sire^iofflj^^s hygroscopicus)WSH03-13以10%的接種量接菌至發(fā)酵
5培養(yǎng)基中，30°C，200 r/min培養(yǎng)60 h，發(fā)酵結束后測定谷氨酰胺轉胺酶活力為2. 5 U/mg。實施例2
(1)硫酸銨沉淀
將吸水鏈霉菌Streptomyces Aj^roscc^ic^s發(fā)酵液離心去除菌體后，上清液中加入硫 酸銨粉末，至飽和度為50%，緩慢攪拌使其完全溶解。調(diào)節(jié)pH值，使酶液的pH保持在7. 5， 靜置半小時后10000 Xg低溫離心10 min,收集上清液繼續(xù)加入硫酸銨至飽和度為80%，4°C 靜置數(shù)小時后，低溫離心收集蛋白沉淀。將沉淀溶解在20 mmol/L Tris-HCl pH 7. 5的緩 沖液中并且4°C透析數(shù)小時；
(2)第一次離子交換層析
將透析后的酶液加入到預先用20 mmol/L Tris-HCl pH 7. 5的緩沖液平衡好的陰離子 交換柱Hitrap Q HP中。用含0-1 mol/L氯化鈉的相同緩沖液進行線性梯度洗脫，流速為 1 mL/min，檢測波長為280 nm，收集有活性的部分(圖1)；
(3)凝膠過濾層析
將收集到的全部活性部分用硫酸銨(飽和度80%)濃縮并用少量Tris-HCl pH 7. 5緩 沖液溶解，將濃縮后的酶液加入到預先用20 mmol/L Tris-HCl pH 7. 5緩沖液平衡好的 Superdex 75 10/300GL層析柱中，用含0. 15 mol/L氯化鈉的相同緩沖液進行洗脫，流速為 0. 4 mL/min，檢測波長為280 nm，收集有活性的部分(圖2)；
(4)第二次離子交換層析
將收集到的活性部分經(jīng)20 mmol/L Tris-HCl pH 8. 5的緩沖液透析后再次加入到預先 用20 mmol/L Tris-HCl pH 8. 5緩沖液平衡好的Hitrap Q HP離子柱中，用含0-0. 4 mol/ L氯化鈉的相同緩沖液進行線性梯度洗脫，收集活性部分，即為所制備的電泳純谷氨酰胺轉 胺酶。TGase的回收率可以達到45. 9%,TGase A的比酶活可以達到14. 3 U/mg,TGase B的 比酶活可以達到17. 8 U/mg (圖3)。谷氨酰胺轉胺酶分離純化全過程的SDS-PAGE電泳圖見圖4所示。雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范 圍應該以權利要求書所界定的為準。
權利要求
一種谷氨酰胺轉胺酶的分離純化方法，是采用陰離子交換柱分離純化谷氨酰胺轉胺酶。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述陰離子交換柱為HitrapQ HP。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述陰離子交換柱用pH8. 5的Tris-HCl平 衡，用0-0. 4 mol/L氯化鈉進行線性梯度洗脫。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟如下1)將發(fā)酵液去除菌體得到的上清液經(jīng)過硫酸銨分級沉淀，收集的蛋白沉淀溶解后進行 透析；2)將透析后的酶液加入到用pH7. 5的Tris-HCl平衡好的陰離子交換柱Hitrap Q HP 中，用0-1 mol/L氯化鈉線性梯度洗脫，收集活性部分；3)將收集的活性部分用硫酸銨濃縮，將濃縮后的酶液加入Superdex75 10/300GL層 析柱中，用0. 15 mol/L氯化鈉洗脫并收集活性部分；4)將收集到的活性部分加入到用pH8. 5的Tris-HCl平衡好的陰離子交換柱Hitrap Q HP中，用0-0.4 mol/L氯化鈉進行線性梯度洗脫，收集活性部分。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，具體步驟如下1)硫酸銨沉淀將吸水鏈霉菌Streptomyces Aj^roscc^ic^s發(fā)酵液離心去除菌體后，上清液中加入硫 酸銨粉末，至飽和度為50%，緩慢攪拌使其完全溶解，調(diào)節(jié)pH值，使酶液的pH保持在7. 5，靜 置半小時后10000 Xg低溫離心10 min,收集上清液繼續(xù)加入硫酸銨至飽和度為80%，4°C靜 置數(shù)小時后，低溫離心收集蛋白沉淀，將沉淀溶解在20 mmol/L Tris-HCl pH 7. 5的緩沖液 中并且4°C透析數(shù)小時；2)第一次離子交換層析將透析后的酶液加入到預先用20 mmol/L Tris-HCl pH 7. 5的緩沖液平衡好的陰離子 交換柱Hitrap Q HP中，用含0-1 mol/L氯化鈉的相同緩沖液進行線性梯度洗脫，流速為1 mL/min，檢測波長為280 nm，收集有活性的部分；3)凝膠過濾層析將收集到的全部活性部分用硫酸銨(飽和度80%)濃縮并用少量Tris-HCl pH 7. 5緩 沖液溶解，將濃縮后的酶液加入到預先用20 mmol/L Tris-HCl pH 7. 5緩沖液平衡好的 Superdex 75 10/300GL層析柱中，用含0. 15 mol/L氯化鈉的相同緩沖液進行洗脫，流速為 0. 4 mL/min，檢測波長為280 nm，收集有活性的部分；4)第二次離子交換層析將收集到的活性部分經(jīng)20 mmol/L Tris-HCl pH 8. 5的緩沖液透析后再次加入到 預先用20 mmol/L Tris-HCl pH 8. 5緩沖液平衡好的Hitrap Q HP離子柱中，用含0-0. 4 mol/L氯化鈉的相同緩沖液進行線性梯度洗脫，收集活性部分。
6.如權利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，出發(fā)菌株為吸水鏈霉菌 (Streptomyces hygroscopicus) WSH03—13。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述吸水鏈霉菌WSH03-13培養(yǎng)方法為 30°C, 200 r/min 培養(yǎng) 60 h。
8.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述吸水鏈霉菌WSH03-13發(fā)酵培養(yǎng)基為糊精 20 g/L，蛋白胨 20 g/L，酵母提取物 5 g/L，CaCl2 1 g/L，MgSO4 2 g/L，K2HPO4 2 g/ L, KH2PO4 2 g/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種谷氨酰胺轉胺酶的分離純化方法，是采用陰離子交換柱分離純化谷氨酰胺轉胺酶，屬于生物制品分離純化技術領域。本發(fā)明方法工藝簡單，具有較高的得率，所得到的谷氨酰胺轉胺酶純度高。
文檔編號C12N9/10GK101984052SQ20101058095
公開日2011年3月9日 申請日期2010年12月9日 優(yōu)先權日2010年12月9日
發(fā)明者周哲敏, 楊曉燕 申請人:江南大學