專利名稱：一種利用稻稈制備細(xì)菌纖維素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)菌纖維素的制備領(lǐng)域，特別是涉及一種用稻稈制備細(xì)菌纖維素的方 法。
背景技術(shù)：
細(xì)菌纖維素(Bacterial cellulose, BC)是一種由微生物生產(chǎn)的纖維素。與植物 纖維相比，細(xì)菌纖維素具有高結(jié)晶度，高持水性，高楊氏模量，高純度，優(yōu)秀生物相容性等特 點(diǎn)，因此細(xì)菌纖維素在醫(yī)用敷料等生物醫(yī)學(xué)材料、食品、造紙、紡織等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用。 但是細(xì)菌纖維素的高生產(chǎn)成本限制了它的工業(yè)規(guī)模，因此降低細(xì)菌纖維素成本是當(dāng)前工業(yè) 生產(chǎn)的一個(gè)亟待解決的難題。細(xì)菌纖維素成本高的一個(gè)主要因素是培養(yǎng)基中碳源的成本 高，因此本實(shí)驗(yàn)公開(kāi)了發(fā)明利用農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品——稻稈生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的方法。稻稈等木質(zhì)纖維素秸稈是農(nóng)作物的副產(chǎn)品，我國(guó)每年該類作物秸稈約有7. 05億 噸。農(nóng)作物秸稈成分是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，其中纖維素含量接近40%。纖維素可 以水解為葡萄糖，半纖維素則水解為五碳糖和六碳糖，這些水解糖可以被醋酸桿菌利用來(lái) 生產(chǎn)細(xì)菌纖維素。但是由于秸稈的特殊結(jié)構(gòu)，木質(zhì)素對(duì)纖維素和半纖維素的包覆作用以及 結(jié)晶纖維素致密結(jié)構(gòu)造成的反應(yīng)惰性，使酶水解纖維素的效果受到嚴(yán)重限制。因此，必須 對(duì)木質(zhì)纖維材料進(jìn)行預(yù)處理，脫去木質(zhì)素或在一定程度上改變?cè)系奈锢砘瘜W(xué)結(jié)構(gòu)，譬如 降低結(jié)晶度、減小聚合度、增加孔隙度和表面積等，以促進(jìn)酶與底物相互接觸并發(fā)生生化反 應(yīng)，提高酶解速率和得糖率。目前秸稈的預(yù)處理方法有很多，比較普遍的有物理方法、化學(xué) 方法、生物方法，離子液體用來(lái)預(yù)處理秸稈的報(bào)道很少。目前國(guó)內(nèi)外也沒(méi)有用離子液體處理 稻稈用來(lái)培養(yǎng)細(xì)菌纖維素的報(bào)道。離子液體是一種新型綠色溶劑，沸點(diǎn)高，蒸汽可以忽略不計(jì)，不會(huì)對(duì)大氣造成污 染，不可燃，具有較好的化學(xué)穩(wěn)定性，可回收利用，利于環(huán)保。由于離子液體的這些特性，因 此可以被用來(lái)溶解秸稈。目前，有研究報(bào)道過(guò)用離子液預(yù)處理稻稈、木材、甘蔗渣、棉花稈， 處理后酶解率明顯提高。用于木質(zhì)纖維素溶解的離子液體有[EPy]Br和[AMIM] [HC02]等。 (AMIM)Cl未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道其用于秸稈的溶解。本實(shí)驗(yàn)采用(AMIM) Cl和(BMIM)Cl以及LiCl/ DMAc來(lái)處理秸稈，選用(AMIM)Cl是因?yàn)?AMIM) Cl合成溫度低，無(wú)毒，預(yù)處理溫度低并且時(shí) 間短，回收率高等特點(diǎn)，因此選用此種溶劑預(yù)處理稻稈。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種利用稻稈制備細(xì)菌纖維素的方法，該方法 以通常丟棄或焚燒的農(nóng)作物副產(chǎn)物——稻稈為原料，開(kāi)發(fā)為一種廉價(jià)的碳源，不但減少了 環(huán)境污染，而且可以用于生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品，為相關(guān)產(chǎn)業(yè)創(chuàng)造了良好的經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明的一種利用稻稈制備細(xì)菌纖維素的方法，包括(1)稻稈的離子液體預(yù)處理，再生及酶解反應(yīng)稻稈的離子液體預(yù)處理將稻稈粉碎后，以-15% (w/w)的比例加入到離子液體中，于90°C -120°C處理15min-21h，靜置冷卻；離子液體/稻稈混合液再生加入與離子液體5-10倍體積的去離子水，攪拌再生， 然后離心或者過(guò)濾，再用去離子水洗滌得到的沉淀或?yàn)V渣，直至上清或者濾液至無(wú)色；同時(shí)，將離心得到的上清液或者過(guò)濾得到的濾液置于蒸餾瓶中，在溫度100-170°c 下常壓蒸餾或者在溫度50-150°C和-0. 09 -0. IMpa的真空度條件下減壓蒸餾，去除與離 子液體共混的水，蒸餾至蒸不出水為止，蒸餾瓶中剩余的即為回收的離子液體；其中，蒸餾 過(guò)程中冷凝管所用冷卻液為10°C以下的冷卻液，連接真空泵前的系統(tǒng)中加裝一個(gè)冷阱，冷 阱置于盛有液氮冷卻劑的保溫瓶中；酶解向上述沉淀或?yàn)V渣中加入緩沖溶液至固液比為0.005g Iml Ig IOml, 再加入纖維素酶至終濃度為5-600U/mL，調(diào)節(jié)pH至4. 0-5. 5，在40-60°C條件下反應(yīng)l_60h， 離心或者過(guò)濾分離未降解稻稈和酶解液，將酶解液于4°C冷藏；(2)酶解液制備細(xì)菌纖維素將上述酶解液直接作為培養(yǎng)細(xì)菌纖維素的培養(yǎng)基，加入相對(duì)酶解液0. 1-1% (w/ ν)的酵母膏和0. 1-0.5% (w/v)的胰蛋白胨，配制成培養(yǎng)基，再加入6%-10%細(xì)菌纖維素 生產(chǎn)菌的種子液，25-30°C靜置培養(yǎng)8-28天得到細(xì)菌纖維素；或?qū)⒉襟E⑴制得的酶解液用Ca(OH)Jjf pH至9. 5-11. 0，于25°C -60°C水浴里 脫毒反應(yīng)12h-24h，然后過(guò)濾并微調(diào)pH至4. 5-5. 0,加入活性炭室溫下攪拌反應(yīng)5-lOmin， 過(guò)濾得到脫毒處理的酶解液；將脫毒處理的酶解液作為培養(yǎng)細(xì)菌纖維素的培養(yǎng)基，加入相 對(duì)酶解液0. 1-1% (w/v)的酵母膏和0. 1-0.5% (w/v)的胰蛋白胨，配制成培養(yǎng)基，再加入 6% -10%細(xì)菌纖維素生產(chǎn)菌的種子液，25-30°C靜置培養(yǎng)8-28天得到細(xì)菌纖維素。所述步驟(1)中的離子液體為(AMIM)Cl、(BMIM)Cl或者LiCl/DMAc。所述步驟(1)中的稻稈粉碎數(shù)目為40目以上，在離子液體中的濃度為3% (w/w), 稻稈在溫度110°C處理Ih。所述步驟(1)中的離心的條件為，速度4000-10000rpm，時(shí)間5_20min。所述步驟(2)中的活性炭的加入量為相對(duì)于酶解液質(zhì)量的_6%。所述步驟(2)中的細(xì)菌纖維素生產(chǎn)菌株為醋酸菌屬(Acetobacter sp.)、葡萄糖 酸桿菌屬(Gluconobacter sp.)、葡糖酸醋桿菌屬(Gluconacetobacter sp.)、根瘤菌屬 (Rhizobium sp·)、八疊球菌屬(Sarcina sp.)、假單胞菌屬(Pseudomounas sp.)、無(wú)色桿菌 屬(Achromobacter sp.)、產(chǎn)喊菌屬(Alcaligenes sp.)、氣桿菌屬(Aerobacter sp.)、固氮 菌屬(Azotobacter sp. )、土壤桿菌屬(Agrobacterium sp·)、洋蔥假單胞菌(Seudomonas c印acia)、空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)或紅茶菌(kombucha)；其中優(yōu)選菌株為木 醋桿菌(Acetobacter xylinum)或紅茶菌。本發(fā)明采用離子液體預(yù)處理稻稈，可以提高酶解率，制備含高濃度糖的酶解液，并 分析預(yù)處理后稻稈酶解效率提高的原因；然后再用此酶解液發(fā)酵制備細(xì)菌纖維素，并對(duì)細(xì) 菌纖維素進(jìn)行表征，最后探討該方法制備的細(xì)菌纖維素與傳統(tǒng)方法制備的細(xì)菌纖維素之間 的差別。采用的酶解原料是再生后的稻稈，直接酶解，沒(méi)有歷經(jīng)烘干。這樣保持了原料經(jīng)預(yù) 處理后疏松的結(jié)構(gòu)，有利于酶的接觸和催化水解，而且省掉一步工序，節(jié)省能源和人力。紅外光譜分析可知離子液體具有抽提稻稈中纖維素的能力；X-射線衍射分析發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)離子液體處理過(guò)的稻稈的結(jié)晶度比未處理的低，因此也利于酶解反應(yīng)進(jìn)行；掃描電 鏡SEM照片顯示稻稈表面經(jīng)離子液體預(yù)處理后，一些稻稈組織表面的凸起被打穿，出現(xiàn)孔 洞和裂隙，便于酶的侵入，提高了酶的可及度。這些都是解釋預(yù)處理后稻稈酶解得率提高的 原因。脫毒酶解液培養(yǎng)的細(xì)菌纖維素膜產(chǎn)量高(7. 90g/L)，而以葡萄糖為碳源，水為溶劑 培養(yǎng)的細(xì)菌纖維素膜的產(chǎn)量是3. 74g/L，以葡萄糖為碳源，緩沖溶液為溶劑培養(yǎng)的細(xì)菌纖維 素膜的產(chǎn)量是4. 47g/L。通過(guò)比對(duì)細(xì)菌纖維素與微晶纖維素的紅外圖譜可知稻稈酶解液培 養(yǎng)得到的產(chǎn)物是純纖維素。相比于水和緩沖液為溶劑葡萄糖為碳源培養(yǎng)得到的細(xì)菌纖維 素，稻稈酶解液培養(yǎng)得到的細(xì)菌纖維素膜干重的產(chǎn)量高，而以葡萄糖為碳源，緩沖溶液為溶 劑培養(yǎng)的纖維素膜絕對(duì)拉力最高。有益效果本發(fā)明通過(guò)離子液體預(yù)處理稻稈，提高了酶水解效率，得到的酶解液經(jīng)過(guò)脫毒能 培養(yǎng)出細(xì)菌纖維素，為工業(yè)化低成本生產(chǎn)細(xì)菌纖維素提供了一條可行的途徑，有利于工業(yè) 化規(guī)模生產(chǎn)該纖維素；另外稻稈作為農(nóng)作物的副產(chǎn)品，一般都是丟棄或焚燒，即污染環(huán)境又 耗費(fèi)人力，現(xiàn)在用它來(lái)培養(yǎng)細(xì)菌纖維素，將會(huì)是一種非常廉價(jià)的碳源，既可以給農(nóng)民增加一 條創(chuàng)收的渠道，又可以變廢為寶。


圖1離子液體中稻稈的添加量對(duì)預(yù)處理效果的影響。圖2稻稈粉的目數(shù)對(duì)離子液體預(yù)處理效果的影響，A為未預(yù)處理稻稈的酶水解結(jié) 果，B為離子液體預(yù)處理的稻稈的酶水解結(jié)果。圖3預(yù)處理時(shí)間和溫度對(duì)預(yù)處理效果的影響。圖4最優(yōu)預(yù)處理?xiàng)l件下的酶解曲線圖。圖5稻稈再生后形成的絮狀物質(zhì)的紅外光譜表征。圖6離子液體處理前后稻稈的掃描電鏡照片，左圖為處理前，右圖為處理后。圖7離子液體處理前后稻稈的X-射線衍射圖。圖8脫毒酶解液培養(yǎng)的細(xì)菌纖維素膜的產(chǎn)量。圖9酶解液培養(yǎng)的細(xì)菌纖維素與微晶纖維素的紅外光譜譜圖。圖10酶解液培養(yǎng)的細(xì)菌纖維素的X-射線衍射圖。圖11酶解液培養(yǎng)的細(xì)菌纖維素膜的拉力強(qiáng)度。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。實(shí)施例1(1)稻稈的預(yù)處理100°C，500rpm磁力攪拌轉(zhuǎn)速下，將150mg 40-60目的稻稈分別置于1. 5g、3g、5g的離子液體(AMIM)Cl中，預(yù)處理2h。(2)稻稈的再生在以上處理后的稻稈離子液體混合液中加入5倍于離子液體體積的去離子水再 生，攪拌30min，將混合物在4000rpm轉(zhuǎn)速下離心lOmin，沉淀反復(fù)沖洗，直至上清液為無(wú)色 透明，收集沉淀備用。(3)再生稻稈的酶解將150mg沉淀完全轉(zhuǎn)移到50ml三角瓶中，加入30ml，50mmol pH 4. 8的醋酸緩沖 液，再加入90mg的纖維素酶(11000U/g)，放于震蕩水浴鍋中，50°C，IOOrpm下進(jìn)行酶解反 應(yīng)，每隔一定時(shí)間吸取反應(yīng)液，在4000-10000rpm條件下離心5-20min分離未降解稻稈和酶 解液，取酶解液用DNS法測(cè)定還原糖濃度，計(jì)算還原糖得率。
TPf雔僻+ ,。/、還原糖濃度*酉每解液體體積
還原糖得率(％):——^丄丫^曰-XlOO
稻桿的質(zhì)量* 0.5426根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道稻稈含纖維素36. 20%,半纖維素18. 06%。酶解時(shí)主要水解的是半 纖維素和纖維素，這兩部分組分占稻稈重量的54. 26%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明稻稈在離子液體中的加入量越少，預(yù)處理就越充分，則 后面酶水解的還原糖得率就越高。實(shí)施例2(1)稻稈的預(yù)處理90 °C, 500rpm磁力攪拌轉(zhuǎn)速下，將150mg不同目數(shù)(40-60目、60-80目、80目以上、 混合目數(shù))的稻稈置于50ml盛有5g的離子液體(AMIM)Cl中的三角瓶中，預(yù)處理10h。(2)稻稈的再生在以上處理后的稻稈離子液體混合液中加入5倍于離子液體體積的去離子水于 三角燒瓶，攪拌30min，將混合物倒入布氏漏斗抽濾，濾渣反復(fù)沖洗，直至濾液為無(wú)色透明， 收集濾渣和濾液備用。(3)離子液體的蒸餾回收將收集的濾液置于蒸餾瓶中，在溫度130°C下和-0. 09 -0. IMpa的真空度條件下 減壓蒸餾去除與離子液體共混的水，蒸餾至蒸不出水為止，蒸餾瓶中剩余的即為回收的離 子液體。蒸餾中冷凝管所用冷卻液為10°c以下的冷卻液，連接真空泵前的系統(tǒng)中加裝一個(gè) 冷阱，冷阱置于盛有液氮冷卻劑的保溫瓶中。離子液體回收率約為98%。該回收的離子液 體用于處理稻稈效果良好。(4)再生稻稈的酶解將150mg的濾渣和未處理的不同目數(shù)的稻稈粉完全轉(zhuǎn)移到50ml三角瓶，加入 30ml,50mmol pH 4. 8的醋酸緩沖液，再加入90mg的纖維素酶(llU/mg)，放于震蕩水浴鍋 中，50°C，IOOrpm下進(jìn)行酶解反應(yīng)，每隔一定時(shí)間(分別為2、6、10、24h)吸取反應(yīng)液，在 4000-10000rpm條件下離心5-20min分離未降解稻稈和酶解液，取酶解液用DNS法測(cè)定還原 糖濃度，計(jì)算還原糖得率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。試驗(yàn)結(jié)果表明稻稈的目數(shù)對(duì)預(yù)處理效果有一定影響，其中40-60目的預(yù)處理效果 最好，后面酶水解的還原糖得率最高。未處理稻稈的酶水解結(jié)果是80目以上的還原糖得率最聞。實(shí)施例3(1)稻稈的預(yù)處理將150mg 40-60目的稻稈分別在90°C、100°C、110°C和120°C四個(gè)溫度下置于5g 的離子液體(AMIM)Cl中，500rpm轉(zhuǎn)速磁力攪拌下，90°C溫度下處理6、10、12、15和18h， 100°C下處理 1、2、3、4 和 5h，110°C下處理 0. 5、1、1· 5 和 2h，120°C下處理 15、30、45、60 和 75min。(2)稻稈的再生在以上處理后的稻稈離子液體混合液中加入5倍于離子液體體積的去離子水，攪 拌30min，將混合物在4000rpm轉(zhuǎn)速下離心lOmin，沉淀反復(fù)沖洗，直至上清液為無(wú)色透明， 收集沉淀備用。(3)再生稻稈的酶解將150mg沉淀完全轉(zhuǎn)移到50ml三角瓶，加入30ml，50mmol pH 4. 8的醋酸緩沖液， 再加入90mg的纖維素酶(llU/mg)，放于震蕩水浴鍋中，50°C，IOOrpm下進(jìn)行酶解反應(yīng)6h， 反應(yīng)結(jié)束后在4000-10000rpm條件下離心5-20min分離未降解稻稈和酶解液，取酶解液用 DNS法測(cè)定還原糖濃度，計(jì)算還原糖得率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。試驗(yàn)結(jié)果表明溫度越低，達(dá)到最優(yōu)預(yù)處理效果的時(shí)間越長(zhǎng)，溫度越高，達(dá)到最優(yōu)預(yù) 處理效果的時(shí)間越短，而且每個(gè)溫度下的最佳預(yù)處理效果(酶解還原糖得率)接近。其中， 110°C處理lh，還原糖得率即可達(dá)到41. 7%o實(shí)施例4(1)稻稈的預(yù)處理將150mg 40-60目的稻稈在110°C，500rpm的條件下溶于5g的離子液體(AMIM) Cl 處理Ih。(2)稻稈的再生在以上處理后的稻稈離子液體混合液中加入5倍于離子液體體積的去離子水，攪 拌30min，將混合物在4000rpm轉(zhuǎn)速下離心lOmin，沉淀反復(fù)沖洗，直至上清液為無(wú)色透明， 收集沉淀備用。(3)再生稻稈的酶解將150mg沉淀完全轉(zhuǎn)移到50ml三角瓶，加入30ml，50mmol pH 4. 8的醋酸緩沖液， 再加入90mg的纖維素酶(llU/mg)，放于震蕩水浴鍋中，50°C，IOOrpm進(jìn)行酶解反應(yīng)，每隔一 定時(shí)間吸取反應(yīng)液，在4000-10000rpm條件下離心5-20min分離未降解稻稈和酶解液，取酶
解液用DNS法測(cè)定還原糖濃度，計(jì)算還原糖得率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。酶解58h后還原糖得率達(dá)到56. 1 %，而未經(jīng)過(guò)離子液體處理的 稻稈酶解還原糖得率只有29. 8%。實(shí)施例5(1)稻稈的預(yù)處理將150mg40-60目的稻稈在110°C，500rpm的條件下置于5g的離子液體(AMIM) Cl、 (BMIM) Cl或者LiCl/DMAc處理lh，將稻稈離子液體混合液4000rpm離心lOmin，取上清液備用。
(2)離子液上清液中溶質(zhì)的再生在以上獲得的上清液中加入5倍于上清液體積的去離子水，攪拌30min，將混合物 在4000rpm轉(zhuǎn)速下離心lOmin，沉淀反復(fù)沖洗，直至上清液為無(wú)色透明，收集再生絮狀沉淀(3)紅外表征將再生絮狀沉淀物質(zhì)冷凍干燥，用型號(hào)為NEXUS-670紅外-拉曼光譜儀掃描測(cè)定。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。溶解于離子液體中稻稈再生絮狀物質(zhì)經(jīng)紅外分析得知主要是纖維素，表明 離子液體可以將稻稈中的纖維素抽提出，增加稻稈組織空隙，不僅提高了酶的可及度，而且 溶出的纖維素更易水解，從而加速酶解反應(yīng)的進(jìn)行。實(shí)施例6(1)稻稈的預(yù)處理將150mg 40-60目的稻稈在110°C，500rpm的條件下溶于5g的離子液體(BMIM) Cl 處理Ih。(2)稻稈的再生在以上處理后的稻稈離子液體混合液中加入5倍于離子液體體積的去離子水，攪 拌30min，將混合物在4000rpm轉(zhuǎn)速下離心lOmin，沉淀反復(fù)沖洗，直至上清液為無(wú)色透明， 收集沉淀備用。(3)形態(tài)觀察將再生稻稈沉淀冷凍干燥，用型號(hào)為TM-IOOO電子掃描顯微鏡觀察其形態(tài)。實(shí)驗(yàn) 結(jié)果見(jiàn)圖6。照片顯示稻稈表面的白色凸起在離子液體處理后破裂，增加了酶滲入的機(jī)會(huì)。實(shí)施例7(1)稻稈的預(yù)處理將150mg 40-60目的稻稈在110°C，500rpm的條件下置于5g的離子液體(AMIM) Cl 處理Ih。(2)稻稈的再生在以上處理后的稻稈離子液體混合液中加入5倍于離子液體體積的去離子水，攪 拌30min，將混合物在4000rpm轉(zhuǎn)速下離心lOmin，沉淀反復(fù)沖洗，直至上清液為無(wú)色透明， 收集沉淀備用。(3)結(jié)晶度測(cè)定將再生稻稈冷凍干燥，用型號(hào)為D/MaX-2550PCX_射線衍射測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7。 處理后再生稻稈的結(jié)晶度為44. 78%，未處理稻稈的結(jié)晶度為50. 26%，處理后稻稈的結(jié)晶 度下降了 5.48%。結(jié)晶度的下降，有利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行。實(shí)施例8(1)稻稈的預(yù)處理將5g混合目數(shù)的稻稈在110°C，500rpm的條件下溶于150g的離子液體處理lh。(2)稻稈的再生在以上處理后的稻稈離子液體混合液中加入5倍于離子液體體積的去離子水，攪 拌30min，將混合物在4000rpm轉(zhuǎn)速下離心lOmin，沉淀反復(fù)沖洗，直至上清液為無(wú)色透明， 收集沉淀備用。
(3)再生稻稈的酶解將150mg沉淀完全轉(zhuǎn)移到250ml三角瓶，加入60ml，50mmol pH 4. 8的醋酸緩沖液， 再加入3g的纖維素酶(llU/mg)，放于震蕩水浴鍋中，50°C，IOOrpm下進(jìn)行酶解反應(yīng)60h，在 4000rpm條件下離心5-20min分離稻稈殘?jiān)兔附庖?，取酶解液用DNS法測(cè)定還原糖濃度。(4)酶解液脫毒以Ca(OH)2調(diào)酶解液pH值到10. 0，30°C水浴里脫毒反應(yīng)12h，然后過(guò)濾并微調(diào) PH5. 0，加入相對(duì)于酶解液質(zhì)量的活性炭室溫下反應(yīng)5-lOmin，過(guò)濾得到酶解液；(5)培養(yǎng)基配制及細(xì)菌纖維素的制備以上述脫毒酶解液作為碳源，再加入0.3% (w/v)的酵母浸膏和0.5% (w/v)的胰 蛋白胨，配制成培養(yǎng)基，121°C滅菌20min，以6%的接種量加入醋酸桿菌、葡萄糖酸桿菌或 者紅茶菌，30°C靜置培養(yǎng)12天即可得到細(xì)菌纖維素膜，其中空白對(duì)照為分別以水和醋酸緩 沖溶液為溶劑，加入相同濃度的葡萄糖作為碳源。(6)膜的干重培養(yǎng)得到的細(xì)菌纖維素含有大量的雜質(zhì)，為了除去這些雜質(zhì)，首先采用清水沖去 部分雜質(zhì)，接著全部轉(zhuǎn)移至經(jīng)預(yù)先恒重的G3玻砂坩鍋中，在105°C 士0. 1的烘箱里烘至恒 重，經(jīng)分析天平稱重計(jì)算，即得到細(xì)菌纖維素的絕干重。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖8。脫毒酶解液培養(yǎng)的細(xì)菌纖維素產(chǎn)量要比以葡萄糖為碳源(水和緩沖溶液為試劑) 得到的細(xì)菌纖維素產(chǎn)量要高，因此通過(guò)離子液體處理稻稈這種方法得到的碳源是一種優(yōu)質(zhì) 碳源。實(shí)施例9細(xì)菌纖維素膜的處理發(fā)酵培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)18天后，取出細(xì)菌纖維素膜，蒸餾水 沖洗多次后，加入的NaOH溶液，80°C保溫120min，去除殘存的菌體和培養(yǎng)基，用去離子 水反復(fù)沖洗至中性，此時(shí)細(xì)菌纖維素膜變?yōu)榘胪该鞯娜榘咨?。紅外表征將處理備用的細(xì)菌纖維素膜冷凍干燥，干燥后的樣品經(jīng)KBr壓片法，經(jīng) 傅立葉紅外儀掃描得到樣品圖譜。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖9。紅外光譜結(jié)果顯示酶解液培養(yǎng)的細(xì)菌 纖維素是純纖維素。實(shí)施例10細(xì)菌纖維素膜的處理發(fā)酵培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)18天后，取出細(xì)菌纖維素膜，蒸餾水 沖洗多次后，加入的NaOH溶液，80°C保溫120min，去除殘存的菌體和培養(yǎng)基，用去離子 水反復(fù)沖洗至中性，此時(shí)細(xì)菌纖維素膜變?yōu)榘胪该鞯娜榘咨?。X-射線衍射表征將處理備用的細(xì)菌纖維素冷凍干燥。結(jié)晶度測(cè)試條件功率 40kV，300mA ；掃描范圍5-60° ；步寬0.02°。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖10。X-射線衍射得到酶解液 培養(yǎng)的細(xì)菌纖維素結(jié)晶度，要比分別用水和緩沖液為溶劑，葡萄糖為碳源培養(yǎng)的細(xì)菌纖維 素結(jié)晶度高。實(shí)施例11細(xì)菌纖維素膜的處理發(fā)酵培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)18天后，取出細(xì)菌纖維素膜，蒸餾水 沖洗多次后，加入的NaOH溶液，80°C保溫120min，去除殘存的菌體和培養(yǎng)基，用去離子 水反復(fù)沖洗至中性，此時(shí)細(xì)菌纖維素膜變?yōu)榘胪该鞯娜榘咨?。?xì)菌纖維拉力表征將處理備用的細(xì)菌纖維素膜用剪刀為3cmXlcm的條狀，每個(gè)樣品四條做平行試驗(yàn)，用萬(wàn)能材料測(cè)試機(jī)測(cè)試?yán)?qiáng)度，設(shè)定兩個(gè)夾具之間的距離為3cm， 速度為lOOmm/min。BC膜的絕對(duì)拉力=直接測(cè)得的拉力。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖11。酶解液培養(yǎng)的 細(xì)菌纖維素膜的拉力比緩沖液為溶劑葡萄糖為碳源的低，比水為溶劑葡萄糖為碳源培養(yǎng)的 拉力高。實(shí)施例12(1)稻稈的預(yù)處理將5g混合目數(shù)的稻稈在110°C，500rpm的條件下溶于150g的離子液體處理lh。(2)稻稈的再生在以上處理后的稻稈離子液體混合液中加入5倍于離子液體體積的去離子水，攪 拌30min，將混合物在4000rpm轉(zhuǎn)速下離心lOmin，沉淀反復(fù)沖洗，直至上清液為無(wú)色透明， 收集沉淀備用。(3)再生稻稈的酶解將150mg沉淀完全轉(zhuǎn)移到250ml三角瓶，加入60ml，50mmol pH 4. 8的醋酸緩沖液， 再加入3g的纖維素酶(llU/mg)，放于震蕩水浴鍋中，50°C，IOOrpm下進(jìn)行酶解反應(yīng)60h，在 4000rpm條件下離心5-20min分離稻稈殘?jiān)兔附庖?，取酶解液用DNS法測(cè)定還原糖濃度。(4)培養(yǎng)基配制及細(xì)菌纖維素的制備以上述酶解液作為碳源，再加入0.3% (w/v)的酵母浸膏和0.5% (w/v)的胰蛋白 胨，配制成培養(yǎng)基，121°C滅菌20min，以10 %的接種量加入醋酸桿菌、葡萄糖酸桿菌或者紅 茶菌，30°C靜置培養(yǎng)28天即可得到細(xì)菌纖維素膜，其中空白對(duì)照為分別以水和醋酸緩沖溶 液為溶劑，加入相同濃度的葡萄糖作為碳源。(5)膜的干重培養(yǎng)得到的細(xì)菌纖維素含有大量的雜質(zhì)，為了除去這些雜質(zhì)，首先采用清水沖去 部分雜質(zhì)，接著全部轉(zhuǎn)移至經(jīng)預(yù)先恒重的G3玻砂坩鍋中，在105°C 士0. 1的烘箱里烘至恒 重，經(jīng)分析天平稱重計(jì)算，即得到細(xì)菌纖維素的絕干重。
權(quán)利要求
一種利用稻稈制備細(xì)菌纖維素的方法，包括(1)稻稈的離子液體預(yù)處理、再生及酶解反應(yīng)稻稈的離子液體預(yù)處理將稻稈粉碎后，以1％ 15％(w/w)的比例加入到離子液體中，于90℃ 120℃處理15min 21h，靜置冷卻；離子液體/稻稈混合液再生加入與離子液體5 10倍體積的去離子水，攪拌再生，然后離心或者過(guò)濾，再用去離子水洗滌得到的沉淀或?yàn)V渣，直至上清或者濾液至無(wú)色；同時(shí)，將離心得到的上清液或者過(guò)濾得到的濾液在溫度100 170℃下常壓蒸餾或者在溫度50 150℃和 0.09～ 0.1Mpa的真空度條件下減壓蒸餾，去除與離子液體共混的水，蒸餾至蒸不出水為止，回收即得離子液體；酶解向上述沉淀或?yàn)V渣中加入緩沖溶液至固液比為0.005g∶1ml～1g∶10ml，再加入纖維素酶至終濃度為5 600U/mL，調(diào)節(jié)pH至4.0 5.5，在40 60℃條件下反應(yīng)1 60h，離心或者過(guò)濾分離未降解稻稈和酶解液，將酶解液于4℃冷藏；(2)酶解液制備細(xì)菌纖維素將上述酶解液直接作為培養(yǎng)細(xì)菌纖維素的培養(yǎng)基，加入相對(duì)酶解液0.1 1％(w/v)的酵母膏和0.1 0.5％(w/v)的胰蛋白胨，配制成培養(yǎng)基，再加入6％ 10％細(xì)菌纖維素生產(chǎn)菌的種子液，25 30℃靜置培養(yǎng)8 28天得到細(xì)菌纖維素；或?qū)⒉襟E(1)制得的酶解液用Ca(OH)2調(diào)pH至9.5 11.0，于25℃ 60℃水浴里脫毒反應(yīng)12h 24h，然后過(guò)濾并微調(diào)pH至4.5 5.0，加入活性炭室溫下攪拌反應(yīng)5 10min，過(guò)濾得到脫毒處理的酶解液；將脫毒處理的酶解液作為培養(yǎng)細(xì)菌纖維素的培養(yǎng)基，加入相對(duì)酶解液0.1 1％(w/v)的酵母膏和0.1 0.5％(w/v)的胰蛋白胨，配制成培養(yǎng)基，再加入6％ 10％細(xì)菌纖維素生產(chǎn)菌的種子液，25 30℃靜置培養(yǎng)8 28天得到細(xì)菌纖維素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用稻稈制備細(xì)菌纖維素的方法，其特征在于所述步 驟(1)中的離子液體為(AMIM)Cl, (BMIM) Cl或者LiCl/DMAc。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用稻稈制備細(xì)菌纖維素的方法，其特征在于所述 步驟(1)中的稻稈粉碎數(shù)目為40目以上，在離子液體中的濃度為3% (w/w)，稻稈在溫度 110°C處理 Ih。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用稻稈制備細(xì)菌纖維素的方法，其特征在于所述步 驟(1)中的離心的條件為，速度4000-10000rpm，時(shí)間5-20min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用稻稈制備細(xì)菌纖維素的方法，其特征在于所述步 驟(2)中的活性炭的加入量為相對(duì)于酶解液質(zhì)量的_6%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用稻稈制備細(xì)菌纖維素的方法，其特征在于所 述步驟(2)中的細(xì)菌纖維素生產(chǎn)菌株為醋酸菌屬(Acetobacter sp.)、葡萄糖酸桿菌屬 (Gluconobacter sp·)、葡糖酸醋桿菌屬(Gluconacetobacter sp.)、根瘤菌屬(Rhizobium sp.)、八疊球菌屬(Sarcina sp.)、假單胞菌屬(Pseudomounas sp.)、無(wú)色桿菌屬 (Achromobacter sp·)、產(chǎn)喊菌屬(Alcaligenes sp·)、氣桿菌屬(Aerobacter sp·)、固氮 菌屬(Azotobacter sp·)、土壤桿菌屬(Agrobacterium sp·)、洋蔥假單胞菌(Seudomonas c印acia)、空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)或紅茶菌(kombucha)；其中優(yōu)選菌株為木 醋桿菌(Acetobacter xylinum)或紅茶菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用稻稈制備細(xì)菌纖維素的方法，包括稻稈在離子液體中于90℃-120℃預(yù)處理15min-21h，然后加入去離子水，攪拌再生，再加入纖維素酶進(jìn)行酶解，得酶解液；將酶解液進(jìn)行脫毒處理后，作為培養(yǎng)細(xì)菌纖維素的培養(yǎng)基，加入酵母膏和胰蛋白胨，配制成培養(yǎng)基，再加入細(xì)菌纖維素生產(chǎn)菌的種子液，25-30℃靜置培養(yǎng)8-28天得到細(xì)菌纖維素。本發(fā)明以通常丟棄或焚燒的農(nóng)作物副產(chǎn)物稻稈為原料，開(kāi)發(fā)為一種廉價(jià)的碳源，不但減少了環(huán)境污染，而且可以用于生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品，為相關(guān)產(chǎn)業(yè)創(chuàng)造了良好的經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號(hào)C12R1/065GK101985642SQ20101058081
公開(kāi)日2011年3月16日 申請(qǐng)日期2010年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月9日
發(fā)明者楊雪霞, 洪楓, 韓士芬 申請(qǐng)人:東華大學(xué)