專利名稱：一段人乳頭狀瘤病毒58亞型dna序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一段人乳頭狀瘤病毒58亞型DNA序列及其應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人類乳突病毒(Human Papillomavirus，簡(jiǎn)稱HPV)是一種嗜上皮性病毒，有高度的特異性。在1%4年，HPV便被證實(shí)是性傳播疾病的病原之一，與泌尿生殖系尖銳濕疣有關(guān)，并具有傳染性。研究表明，HPV還是誘發(fā)宮頸癌的元兇。國(guó)際癌癥研究協(xié)會(huì)IARC資料表明，13種低危型HPV主要引起生殖道、肛門周圍皮膚等濕疣類病和低度子宮頸上皮內(nèi)瘤變； 15種高危型HPV，尤其是16和18型，主要導(dǎo)致高度子宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌的發(fā)生。在各國(guó)、各地區(qū)致癌HPV有不同，在中國(guó)是16、18、58亞型，并且58亞型有一種比 18亞型還要多的趨勢(shì)。因此，準(zhǔn)確的診斷，特別是準(zhǔn)確的分型診斷，對(duì)于HPV感染的治療， 以及宮頸癌的預(yù)防有著非常重要的意義。PCR和基因芯片診斷是一種快速而準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。而這一類的診斷方法依賴于獲得特異的核酸序列。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)之不足，而提供一段人乳頭狀瘤病毒58亞型DNA 序列及其應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案如下1. 一段乳頭狀瘤病毒58亞型(HPV58)特異DNA的克隆通過生物信息學(xué)分析和PCR擴(kuò)增，獲得了一段HPV58亞型的特異DNA片段，該片段共227bp，其序列如下caaatgcagg caaagattca cgatggccat atttgcacag tagactaaca gtatttgaat 60ttaacaatcc atttccattt gatgcaaatg gtaatccagt gtataaaata aatgatgaaa 120attggaaatc ctttttctca aggacgtggt gcaaattagg cttaatagag gaagaggaca 180aggaaaacga tggaggaaat atcagcacgt ttaagtgcag tgcagga2272.在PCR中的應(yīng)用用 5，-caaatgcaggcaaagattca-3，作上游弓丨物，5，_tcctgcactgcacttaaacg_3，作下游引物，進(jìn)行HPV58的特異片段的PCR擴(kuò)增。3.在基因芯片中的應(yīng)用用如下序列g(shù)atggccata tttgcacagt agactaacag tatttgaatt taacaatcca tttccatttg 60atgcaaatgg taatccagtg tataaaataa atgatgaaaa ttggaaatcc tttttctcaa 120ggacgtggtg caaattaggc ttaatagagg aagaggacaa ggaaaacgat ggaggaa177作為基因芯片上的檢測(cè)探針，制作基因芯片。用 5，-caaatgcaggcaaagattca-3，作上游弓丨物，用 5，-tcctgcactgcacttaaacg-3‘作下游引物對(duì)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物能夠與芯片上的探針序列進(jìn)行雜交檢測(cè)。本發(fā)明通過基因數(shù)據(jù)庫資料的搜索和分析，確定了一段人乳頭狀瘤病毒58亞型的特異性，通過PCR擴(kuò)增克隆了該序列。該序列長(zhǎng)度為227bp，作為乳頭狀瘤病毒檢測(cè)的靶序列。用該序列建立PCR和基因芯片檢測(cè)方法診斷乳頭狀瘤病毒58亞型。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明涉及的序列與PCR檢測(cè)和基因芯片技術(shù)相結(jié)合，應(yīng)用于臨床樣品的核酸檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)在人乳頭狀瘤病毒感染的分型檢測(cè)中HPV58 亞型的準(zhǔn)確分型和定位。特別是在基因芯片的應(yīng)用中，配合基因芯片高通量的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了一次取樣、單次操作完成多項(xiàng)檢測(cè)。極大的提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性和效率。


圖1為臨床標(biāo)本的PCR擴(kuò)增圖譜，左邊道為DNA分子量Marker，大小為100_600bp ； 右邊道為特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，大小在200與300之間。圖2、為該序列的測(cè)序圖。圖3為基因芯片雜交結(jié)果。
具體實(shí)施例方式1. 一段乳頭狀瘤病毒58亞型(HPV58)特異DNA的克隆在基因數(shù)據(jù)庫GenBank中搜索HPV58亞型DNA序列，將搜索到的HPV58亞型DNA 序列用Blast進(jìn)行序列比對(duì)，找出HPV58特有而其它亞型不具有的特異DNA序列。針對(duì)每一段HPV58亞型特異序列設(shè)計(jì)多對(duì)PCR引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，挑選PCR擴(kuò)增產(chǎn)物效率高，特異性好的PCR引物。比較多對(duì)PCR引物的擴(kuò)增產(chǎn)物，挑出其中一對(duì)引物，其擴(kuò)增產(chǎn)物如圖1。 該P(yáng)CR引物符合挑選標(biāo)準(zhǔn)。將該引物擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到T-vector載體上，并進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果見圖2。將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行blast搜索，發(fā)現(xiàn)所有與克隆序列完全匹配的序列全是HPV58亞型的病毒序列，而其它亞型病毒序列與之差異很大，PCR引物不能很好的擴(kuò)增。2. PCR 擴(kuò)增用常規(guī)臨床樣本采集方法，如棉拭子等，采集生殖道分泌物，按常規(guī)方法提取DNA。用本發(fā)明提供的引物上游弓丨物 5，-caaatgcaggcaaagattca-3，下游弓I物 5，-tcctgcactgcacttaaacg-3，按常規(guī)PCR方法擴(kuò)增，即獲得特異PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，產(chǎn)物大小與分子量Marker比較， 大小為227bp，表明該樣本擴(kuò)增為陽性，如圖1，否則為陰性。該序列用于熒光定量PCR擴(kuò)增，只要用熒光探針檢測(cè)，按常規(guī)熒光定量PCR擴(kuò)增即可。如圖2顯示，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物特異性高，擴(kuò)增產(chǎn)率高，適合進(jìn)行PCR檢測(cè)。3.基因芯片應(yīng)用(1)用下列引物5， -gatggccatatttgcacagt-3，5， -ttcctccatcgttttccttg-3，擴(kuò)增本發(fā)明獲得的克隆DNA，得到DNA探針，按常規(guī)方法打印到支持介質(zhì)，如包被處理過的玻璃片或者尼龍膜上，作為探針。 (2)用上述PCR擴(kuò)增方法擴(kuò)增臨床樣本，擴(kuò)增時(shí)按基因芯片檢測(cè)方法進(jìn)行標(biāo)記，包括擴(kuò)增標(biāo)記或末端標(biāo)記方法，擴(kuò)增的標(biāo)記產(chǎn)物按常規(guī)基因芯片方法進(jìn)行雜交檢測(cè)，如圖3。 圖3所示基因芯片檢測(cè)圖中，包含其它14種HPV亞型的探針位點(diǎn)，基因芯片檢測(cè)結(jié)果只有本發(fā)明所指序列能有效的雜交，信號(hào)很強(qiáng)，而其它序列均無雜交信號(hào)，顯示其在基因芯片檢測(cè)方法中應(yīng)用時(shí)特異性很好。
權(quán)利要求
1.一段人乳頭狀瘤病毒58亞型DNA序列，其特征在于a.采用生物信息學(xué)分析和PCR擴(kuò)增，獲得一段HPV58亞型的特異DNA片段，該片段共 227bp，其序列如下caaatgcagg caaagattca cgatggccat atttgcacag tagactaaca gtatttgaat 60 ttaacaatcc atttccattt gatgcaaatg gtaatccagt gtataaaata aatgatgaaa 120 attggaaatc ctttttctca aggacgtggt gcaaattagg cttaatagag gaagaggaca 180 aggaaaacga tggaggaaat atcagcacgt ttaagtgcag tgcagga227 ；b.該序列的檢測(cè)引物序列為檢測(cè)上游弓丨物 5，-caaatgcaggcaaagattca-3， 檢測(cè)下游弓I物 5，-tcctgcactgcacttaaacg-3，；c.探針制備引物序列為探針制備上游引物 5，-gatggccatatttgcacagt-3， 探針制備下游引物 5’ -ttcctccatcgttttccttg-3’。
2.權(quán)利要求1所述的一段人乳頭狀瘤病毒58亞型DNA序列，其特征在于該序列克隆 DNA在臨床樣本的PCR法和基因芯片方法檢測(cè)中，用于確定乳頭狀瘤病毒58亞型的存在。
全文摘要
本發(fā)明涉及一段人乳頭狀瘤病毒58亞型DNA序列及其應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明采用生物信息學(xué)手段和PCR方法，通過基因數(shù)據(jù)庫資料的搜索和分析，確定了一段人乳頭狀瘤病毒58亞型的特異性，通過PCR擴(kuò)增克隆了該序列。該序列長(zhǎng)度為227bp，作為乳頭狀瘤病毒檢測(cè)的靶序列。用該序列建立PCR和基因芯片檢測(cè)方法診斷乳頭狀瘤病毒58亞型。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明涉及的序列與PCR檢測(cè)和基因芯片技術(shù)相結(jié)合，應(yīng)用于臨床樣品的核酸檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)在人乳頭狀瘤病毒感染的分型檢測(cè)中HPV58亞型的準(zhǔn)確分型和定位。特別是在基因芯片的應(yīng)用中，配合基因芯片高通量的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了一次取樣、單次操作完成多項(xiàng)檢測(cè)。極大的提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性和效率。
文檔編號(hào)C12N15/37GK102533794SQ20101058036
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2010年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月9日
發(fā)明者杜凌琳, 譚德勇 申請(qǐng)人:昆明云大生化科技有限責(zé)任公司