專利名稱：Ura3缺陷型畢赤酵母x-33菌株的構(gòu)建及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一株乳清酸核苷-5’ -磷酸脫羧酶(urU)缺陷型畢赤酵母(P. pastoris)X-33菌 株的構(gòu)建及利用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
酵母嘧啶核苷酸的從頭生物合成以谷氨酰胺為原料，經(jīng)多步生物催化生成乳清昔 酸(OMP)，再由OMP脫羧酶催化脫羧生成尿苷酸(UMP)，后者進一步催化生成尿苷三磷酸 (UTP)和胞苷三磷酸(CTP)。酵母的AMP脫羧酶(URA!3)通常由ura3基因編碼，是嘧啶生物 合成所必需的酶；若OMP脫羧酶功能缺失，嘧啶生物合成途徑將中斷，在沒有外源尿嘧啶補 給條件下酵母無法存活。乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶編碼基因ura3做為一種選擇性標(biāo)記 基因，常用于釀酒酵母、假絲酵母、克魯維酵母和裂殖酵母等酵母菌的遺傳操作或遺傳操作 系統(tǒng)的構(gòu)建。一般來講，通過部分或全部缺失ura3基因可構(gòu)建乳清酸核苷_5’ -磷酸脫羧酶功 能缺失的工程菌株，即尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株；而ura3基因連接到載體的適當(dāng)位置后，就 可以作為負(fù)向選擇標(biāo)記基因進行遺傳操作。或用于向尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株中引入新基 因，構(gòu)建各種下程菌株。而且，工程菌株構(gòu)建時不要求載體攜帶的ura3基因來源于相同微 生物種屬。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有像原核生物生長速度快、便于基因操作、成本低廉、便于大 規(guī)模培養(yǎng)和高密度發(fā)酵等特性，同時又具有真核細(xì)胞的大部分翻譯后加工修飾功能(如糖 基化過程等)，已廣泛用于各種蛋白的表達(dá)，因而用畢赤酵母細(xì)胞生產(chǎn)藥用蛋白日益引起人 們的青睞。畢赤酵母X-33是^vitrogen公司推出的野生型沒有轉(zhuǎn)化過任何基因的畢赤酵 母原始菌株為甲醇快速利用型，耐受性比較好，轉(zhuǎn)化率和表達(dá)量相對而言較高被廣泛應(yīng)用 于外源蛋白的表達(dá)。因此構(gòu)建X-33的ura3基因缺陷性菌株對各種藥用蛋白工程菌的開發(fā) 以及進一步的X-33工程化改造如糖基化改造提供了很好的平臺。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于構(gòu)建得到ura3基因缺陷型的X-33(AUra3)菌株。本發(fā)明構(gòu)建 獲得URA3突變菌株的方法如下.1)URA3基因的同源置換DNA片段的構(gòu)建根據(jù)GenBank (AF321098)中報道的畢赤 酵母URA3(orotidine-5’-Phosphate decarboxylase)基因序列設(shè)計兩對寡核苷酸引物。以 X-33菌株基因組為模板，用引物URA5F、URA5R和URA3F、URA3R，分別PCR擴增URA3基因兩 端同源臂片段URA5，和URA3，，各700bp、600bp左右。然后以URA5，和URA3，為模板，URA5F 和URA3R為引物，用重疊PCR擴增URA3基因同源置換DNA片段URA 5，-3，，約1300bp。引 物序列分別為URA5F 5' -ATTTGCGGCCGCCTGCAGAAATGGGGAGATAACCACC-3’URA3R 5' -ATTTGCGGCCGCACTAGTGGTTTTCTGGGGGTATTTGCTG-3’
URA5R :5’ -CAATTGATCCCCTGTACATACTTGTAATTAGGTATCTATCCCTTTGATCAGGTT-3’URA3F :5’ -AACCTGATCAAAGGGATAGATACCTAATTACAAGTATGTACAGGGGATCAATTG-3'2)敲除畢赤酵母X-33的URA3基因，構(gòu)建營養(yǎng)缺陷型菌株將URA3基因兩端同 源臂融合片段URA5，-3，電擊轉(zhuǎn)入X-33感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有5-F0A和尿嘧啶的MD培養(yǎng) 基(YNB1. ；34%，葡萄糖 2%，瓊脂粉 1. 5%，尿嘧啶 100ug/mL，5-F0A lmg/mL)上，30°C培養(yǎng) 3-5d。挑選上述培養(yǎng)基上長出的單菌落，用牙簽分別點種于MD培養(yǎng)基(YNBl.34%，葡萄糖 2%，瓊脂粉1. 5% )和MDU培養(yǎng)基(YNB1. 34%，葡萄糖2%，瓊脂粉1.5%,尿嘧啶IOOug/ mL)上，30°C培養(yǎng)3-5d，然后選擇在MDU培養(yǎng)基上生長良好而在MD培養(yǎng)基上不能生長的菌 株，反復(fù)篩選三輪至性狀穩(wěn)定，提取基因組用URA3基因兩端引物URA5F、URA3R進行PCR鑒 定，篩選出X-33 ( Δ ura3)菌株。本發(fā)明獲得的畢赤酵母X33菌種經(jīng)過多次傳代，遺傳性狀穩(wěn)定。同時 X-33 ( Δ ura3)菌還可以用于進一步的工程化改造，從而獲得更適合生產(chǎn)各種藥用蛋白的酵 母工程菌。


圖1重疊PCR得到的URA3基因同源置換DNA片段M =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 重疊PCR得到的URA3基因同源置換DNA片段。圖 2P.pastoris X-33 ( Δ ura3)菌株的鑒定。M :DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 野生型P. pastor is X-33以URA5F和URA3R為引物的PCR 結(jié)果；2 :P. pastor is X-33 ( Δ ura3)以 URA5F 和 URA3R 為引物的 PCR 結(jié)果。
具體實施例方式實施例一URA3基因的克隆及其同源置換DNA片段的構(gòu)建從畢赤酵母X_33基因組PCR擴 增的URA3基因兩端同源臂片段URA5，、URA3，和融合同源臂片段分別為0. 7kb,0. 6kb和 1. 3kb(圖1)。測序結(jié)果表明各序列、及融合順序均正確。實施例二URA3基因的敲除和鑒定URA5’ _3’融合同源臂片段電擊轉(zhuǎn)入酵母后，與基因組 中的URA3基因發(fā)生雙交換同源重組，置換掉URA3基因編碼框中約700bp的序列。而未 發(fā)生同源重組的菌株由于攜帶URA3基因不能在含有5-F0A的培養(yǎng)基上生長，因此可以在 含5-F0A和尿嘧啶的MD培養(yǎng)基上篩選出ura3缺失菌株。挑選經(jīng)過表型鑒定且性狀穩(wěn)定 的菌株，用外部引物URA5F和URA3R進行基因組PCR鑒定，野生型X-33菌的URA3基因大 小為2043bp，因此擴增產(chǎn)物為2000bp左右；ura3缺失菌的URA3基因編碼框中約700bp 的序列被置換掉，擴增產(chǎn)物應(yīng)為1300bp左右，電泳結(jié)果與預(yù)期一致(圖2)，說明篩選的為 P.pastorisX-33(Δura3)。
權(quán)利要求
1.一種 P. pastoris X-33 的 OCHl 缺陷型菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述基因工程菌，其構(gòu)建方法為采用同源重組敲除URA3基因。
3.權(quán)利要求1或2在以利用URA3基因作為選擇標(biāo)記，構(gòu)建各種工程菌株方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶(ura3)缺陷型畢赤酵母(P.pastoris)X-33菌株的構(gòu)建及利用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。該下程菌株P(guān).pastoris X-33(Δura3)是通過采用同源重組敲除目的基因的方法而獲得。該菌株可以利用URA3基因作為選擇標(biāo)記，構(gòu)建各種工程菌株。而且，工程菌株構(gòu)建時不要求載體攜帶的ura3基因來源于相同微生物種屬。同時提供了一個對X33后續(xù)的工程化改造如糖基化改造提供了更好的平臺菌株，具有非常大的潛在應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/09GK102120966SQ201010580120
公開日2011年7月13日 申請日期2010年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月9日
發(fā)明者張大成, 朱瑞宇, 許永利, 金堅, 陳蘊, 雷楗勇 申請人:江南大學(xué)