專利名稱：一種尼羅羅非魚性別差異性分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種尼羅羅非魚性別差異性分子標(biāo)記及其應(yīng)用，尤其是一種篩選尼羅 羅非魚雄魚的分子標(biāo)記，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
羅非魚(Tilapia)原產(chǎn)于非洲，因形似鯽魚故又稱非洲鯽魚，隸屬于鱸形目、鱸形 亞目、麗魚科Cichlidae、羅非魚屬Tilapia(亦稱麗鯛科，麗鯛屬)。經(jīng)統(tǒng)計，該屬有700多 種(林振亮，黃江康.廣東省羅非魚產(chǎn)業(yè)發(fā)展分析.廣東科技.2004，7:25-27)。由于生長 迅速、繁殖力強(qiáng)、食性雜，同時具有抗病性、適應(yīng)力強(qiáng)等特點(diǎn)，現(xiàn)已成為世界主要淡水養(yǎng)殖魚 類，在我國南方大部分地區(qū)和北方某些地區(qū)是重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖對象，是僅次于鯉科(Carps) 和鮭科(Salmonids)的世界上第三大養(yǎng)殖品種(鞏育軍，郭先霞，李瑞偉.羅非魚營養(yǎng)成分 研究進(jìn)展.中國食物與營養(yǎng).2009，11 :50-52)，也是聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)推廣養(yǎng)殖的品 種。羅非魚養(yǎng)殖效益高，國內(nèi)外市場相對穩(wěn)定，僅我國現(xiàn)在年產(chǎn)量就達(dá)70多萬噸，是我國水 產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中重要的出口創(chuàng)匯品種。商品魚生產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，最關(guān)鍵的問題是提高魚的生長速度和規(guī)格。而在羅非魚 中，普遍存在雄性比雌性個體生長快40% -50%的現(xiàn)象。另外，羅非魚成熟早、繁殖周期短、 繁殖力強(qiáng)，雌雄混合養(yǎng)殖時易繁殖過剩，導(dǎo)致密度過大，個體過小，嚴(yán)重影響了成品魚的質(zhì) 量與產(chǎn)量，同時還將增加養(yǎng)殖成本(萬松良，雷曉中，萬珊.羅非魚性別三系配套技術(shù)研究 進(jìn)展.水產(chǎn)科學(xué).2009，28 (9) :547-550)。但如果采用培育全雄魚的方法就可以解決以上 問題，提高成品魚質(zhì)量和產(chǎn)量。目前培育全雄的方法主要分為非遺傳手段和遺傳手段兩類。非遺傳手段控制為了優(yōu)化羅非魚的養(yǎng)殖種群，現(xiàn)多采用在飼料中添加雄性激素 的方法處理羅非魚魚苗，誘導(dǎo)遺傳上的雌魚轉(zhuǎn)換為功能上的雄魚。激素誘導(dǎo)雖然可以產(chǎn)生 較高的雄性率，但是也明顯存在局限性，可能造成雄性激素在魚體內(nèi)積蓄，并且污染水體環(huán) 境，因此人們一直擔(dān)心此類產(chǎn)品對人體健康不利，很多國家已經(jīng)禁止在飼料中添加激素類 物質(zhì)。遺傳手段控制我國現(xiàn)在主要推廣養(yǎng)殖的是奧尼魚，它是奧利亞羅非魚的雄魚 (ZZ)與尼羅羅非魚的雌魚(XX)雜交的后代(XZ)。由于這兩種魚不同的性別決定機(jī)制，XZ 后代的雄性率可達(dá)92-95%，能有效地控制繁殖力，再加上其雜種優(yōu)勢，使得這種魚具有生 長速度快，適應(yīng)性強(qiáng)，食性廣，群體產(chǎn)量高、出肉率高、食味鮮美，而且池塘產(chǎn)仔少等諸多優(yōu) 點(diǎn)ο奧尼雜交魚的親魚是以雌性尼羅羅非魚作母本、雄性奧利亞羅非魚作父本，如果 雌雄鑒別不準(zhǔn)確，則雄性比率必然不高。另外同種羅非魚交配的產(chǎn)卵率、受精率和出苗率都 比雜交魚高，即使混入極少量的奧利亞羅非魚母本或尼羅羅非魚父本，都會導(dǎo)致兩種羅非 魚的種內(nèi)繁殖，嚴(yán)重影響子代雄性率。為了獲得優(yōu)質(zhì)的奧尼羅非魚苗種，就必須把好親魚選 擇的雌雄篩選關(guān)。因此研究羅非魚的性別決定機(jī)制，實(shí)現(xiàn)性別控制就成了解決羅非魚商品 化養(yǎng)殖問題的當(dāng)務(wù)之急。
研究表明尼羅羅非魚和奧利亞羅非魚遺傳性別決定類型分別為XX/XY型和ZW/ZZ 型。對不同遺傳型的有絲分裂中期相染色體進(jìn)行熒光染色實(shí)驗(yàn)，可以看出X與Y染色體、 Z與W染色體之間都存在形態(tài)差異，顯示這兩對染色體之間都存在基因或堿基序列上的差 異。但熒光染色法很難大規(guī)模地使用于育苗生產(chǎn)。分子標(biāo)記方法簡便易行，可在短時間內(nèi)對大量樣本進(jìn)行分析。但到目前為止，羅非 魚穩(wěn)定的分子標(biāo)記依然很缺乏，國內(nèi)外尚沒有報道用于區(qū)分羅非魚性別的穩(wěn)定分子標(biāo)記， 更沒有用于篩選雄魚的分子標(biāo)記，對羅非魚的性別控制機(jī)制也了解甚少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種尼羅羅非魚性別差異性分子標(biāo)記及其應(yīng)用。尼羅羅非魚性別差異性分子標(biāo)記，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。上述尼羅羅非魚性別差異性分子標(biāo)記的PCR引物，正義引物序列如SEQ ID NO. 2 所示，反義引物如SEQ ID NO. 3所示。一種利用上述尼羅羅非魚性別差異性分子標(biāo)記檢測尼羅羅非魚性別的方法，步驟 如下1)提取尼羅羅非魚的基因組DNA ；2)以尼羅羅非魚的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，正義引物序列如SEQ ID NO. 2 所示，反義引物如SEQ ID NO. 3所示；3)對步驟2)制得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，當(dāng)PCR產(chǎn)物電泳圖譜顯示 被測樣品具有SEQ ID NO :1序列時，則該被測樣為尼羅羅非魚雄魚。所述步驟2)中PCR擴(kuò)增條件如下95 0C, 5min ；進(jìn)行 35 個循環(huán)的 94 °C 30sec,60. 5°C 30sec,72°C Imin ；72°C 延伸 7min。有益效果1、本發(fā)明所述的分子標(biāo)記為尼羅羅非魚雄魚特異性基因，為超雄性羅非魚的選育 提供簡便穩(wěn)定的分子標(biāo)記。2、本發(fā)明所述的SCAR引物用于預(yù)測尼羅羅非魚的性別，為鑒定親魚以提高和穩(wěn) 定奧尼魚雄性率，提供簡便穩(wěn)定的分子標(biāo)記，解決羅非魚全雄控制分子標(biāo)記輔助育種的關(guān) 鍵技術(shù)。3、本發(fā)明從分子水平探索不同羅非魚的性別特征，探索建立雄性羅非魚鑒別技 術(shù)，在生產(chǎn)方面具有重要應(yīng)用價值。4、本發(fā)明利用RAPD技術(shù)及其他包括蛋白分析等相關(guān)技術(shù)，對目前養(yǎng)殖上重要的 尼羅和奧利亞羅非魚進(jìn)行雌、雄性間分子差異分析，并將獲得的RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的 SCAR標(biāo)記。


圖1尼羅羅非魚雌雄個體基因組電泳檢測；其中泳道1、IKbp DNA Marker，泳道2、雄魚基因組，泳道3、雌魚基因組；
圖2RAPD-PCR結(jié)果電泳檢測；其中泳道1、DL2000DNA Marker，泳道2、雌魚，泳道3、雄魚；圖3尼羅羅非魚雄性特異性SCAR引物在大量樣品中檢測情況；其中中間泳道為DL2000 DNA Marker，其左側(cè)為雌魚，右側(cè)為雄魚；圖4尼羅羅非魚雄性特異性SCAR引物在大量樣品中檢測情況；其中中間泳道為DL2000 DNA Marker，其左側(cè)為雌魚，右側(cè)為雄魚；
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明的內(nèi)容做進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不 限于此。實(shí)施例1 SCAR弓丨物的獲得(1)尼羅羅非魚基因組DNA的提取采用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)， 取魚尾部組織30mg左右提取基因組DNA。的瓊脂糖凝膠電泳檢測(如圖1所示)合格 后，用于RAPD-PCR擴(kuò)增。(2)性別差異性分子標(biāo)記的篩選對步驟(1)中提取的基因組DNA利用上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司商品化 生產(chǎn)的RAPD Primers進(jìn)行RAPD-PCR擴(kuò)增.反應(yīng)條件為95°C，5min；進(jìn)行 40 個循環(huán)的 94°C lmin, 36°C lmin, 72°C 2min ；最后 72°C 延伸 7min。將上述PCR產(chǎn)物用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)其中RAPD Primer S92 (CAGCTCACGA)的RAPD結(jié)果中有一條約800bp的雄性特異性條帶(如圖2所示)。將上述雄性特異性的條帶切膠回收、連接T載體、轉(zhuǎn)化，富集培養(yǎng)單克隆，再經(jīng)過 菌液驗(yàn)證后，委托博尚生物技術(shù)有限公司測定該特異性片段的序列，經(jīng)檢測，該基因片段序 列如SEQ ID NO. 1所示。(3) SCAR引物的獲得根據(jù)測序結(jié)果，應(yīng)用引物設(shè)計軟件Primer 5. 0針對測序所得片段設(shè)計特異性和 穩(wěn)定性均較高的SCAR引物，委托博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行引物合成，并命名為ni $ 800， 引物序列如下正義引物5，GCGAATGGTGTTGAAGGCA3，(SEQ ID NO 2)反義引物5，CGACAGGAAATAAAATACTGGATCA3，(SEQ ID NO 3)實(shí)施例2(1)尼羅羅非魚基因組DNA的提取剪取尼羅羅非魚雌魚和雄魚尾鰭30mg左右，雌雄各20尾，采用海洋動物組織基因 組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取基因組DNA。(2) SCAR 引物驗(yàn)證用實(shí)施例1獲得的引物對步驟(1)提取的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為基因組DNA :1μ 1，正義引物1μ 1，反義引物1μ 1，dNTP :2μ 1， 10XPCR Buffer :2· 5μ 1，rTaq :0· 5μ 1，力口 ddH20 補(bǔ)充至 25 μ 1 體系。
PCR 反應(yīng)條件為95 "C，5min ；進(jìn)行 35 個循環(huán)的 94 "C 30sec，60. 5 "C 30sec, 72 °C Imin ； 72°C 延伸 7min。對擴(kuò)增產(chǎn)物用的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。檢測到一條約SOObp的特異性條 帶在尼羅羅非魚雄性群體中顯現(xiàn)率為70%，而在雌性群體中的全體不出現(xiàn)(如圖3和圖4 所示)，此標(biāo)記的有效性和穩(wěn)定性已在大量樣本DNA中進(jìn)一步驗(yàn)證。
權(quán)利要求
尼羅羅非魚性別差異性分子標(biāo)記，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.權(quán)利要求1所述的尼羅羅非魚性別差異性分子標(biāo)記的PCR引物，正義引物序列如 SEQID NO. 2所示，反義引物如SEQ ID NO. 3所示。
3.—種檢測尼羅羅非魚性別的方法，其特征在于，步驟如下1)提取尼羅羅非魚的基因組DNA；2)以尼羅羅非魚的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，正義引物序列如SEQID NO. 2所 示，反義引物如SEQ ID NO. 3所示;3)對步驟2)制得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，當(dāng)PCR產(chǎn)物電泳圖譜顯示被測 樣品具有SEQ ID NO. 1序列時，則該被測樣為尼羅羅非魚雄魚。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟2)中PCR擴(kuò)增條件如下 95°C，5min ；進(jìn)行 35 個循環(huán)的 94°C 30sec，60. 5°C 30sec，72°C Imin ；72°C延伸 7min。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種尼羅羅非魚性別差異性分子標(biāo)記及其應(yīng)用，尤其是一種篩選尼羅羅非魚超雄魚的分子標(biāo)記，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明公開了尼羅羅非魚性別差異性分子標(biāo)記，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，以及尼羅羅非魚性別差異性分子標(biāo)記的PCR引物，正義引物序列如SEQ ID NO.2所示，反義引物如SEQ ID NO.3所示。本發(fā)明從分子水平探索不同羅非魚的性別特征，探索建立雄性羅非魚鑒別技術(shù)，在生產(chǎn)方面具有重要應(yīng)用價值。
文檔編號C12Q1/68GK101984057SQ201010580350
公開日2011年3月9日 申請日期2010年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月9日
發(fā)明者劉增英, 寧萌, 張燕君, 楊永杰, 程娟 申請人:山東大學(xué)