專利名稱：一株降解毒死蜱的多功能工程菌株及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于化學(xué)農(nóng)藥生物降解技術(shù)領(lǐng)域，涉及一株對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱具高效降 解能力，同時(shí)具有固氮、解磷、解鉀和生防功能的多功能工程菌株及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
毒死蜱(chlorpyrifos)，又稱樂斯本、氯吡硫磷等，化學(xué)名稱為0，0_ 二乙 基-0-(3，5,6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酸酯，1965年由美國陶氏化學(xué)公司開發(fā)研制，具高 效、廣譜、高效等特性，廣泛用于大田作物、果蔬、花卉及家庭害蟲的防治。我國自2007年1月1日全面禁止高毒有機(jī)磷農(nóng)藥后，毒死蜱作為低毒、高效的有 機(jī)磷農(nóng)藥替代品迅速占據(jù)主導(dǎo)地位。毒死蜱的頻繁大量使用不僅造成農(nóng)產(chǎn)品殘留超標(biāo)，嚴(yán) 重影響出口創(chuàng)匯和國民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展；而且對(duì)水體及土壤生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重的污染，尤其是 對(duì)土壤的污染，不僅影響土壤肥力，且對(duì)土壤微生物種群、微生物多樣性、固氮菌活性、土壤 酶活性等影響極大。因此，毒死蜱污染土壤的治理問題越來越受到人們的關(guān)注。在過去的研究工作中，各國學(xué)者已分離到了多種不同來源的毒死蜱降解菌。但這 些降解菌株的篩選只是從毒死蜱降解一個(gè)方面獲得，對(duì)土壤病蟲害的防治考慮較少，大多 不具有促生作用，農(nóng)民不易接受。同時(shí)，與兩種原始菌株同時(shí)發(fā)酵生產(chǎn)相比較，重組多功能 工程菌株在生產(chǎn)工藝環(huán)節(jié)可大大降低成本、減少污染；而且，重組多功能工程菌株在制劑使 用時(shí)，可避免2種或多種菌劑同時(shí)使用所產(chǎn)生的可能相互抑制作用。因此利用基因工程手 段構(gòu)建多功能工程菌株，開發(fā)既具有降解農(nóng)藥殘留，同時(shí)又具備防治植物病害和促進(jìn)農(nóng)作 物生長(zhǎng)的菌劑，用于農(nóng)藥污染土壤的修復(fù)，具有較高的社會(huì)和生態(tài)效益。越南伯克霍爾德氏菌(Burkholderia vietnamiensis)P418分離自白俄羅斯明斯 克市的大麥根際土壤中，經(jīng)研究該菌株具有根際定殖能力，解磷、解鉀、固氮及促進(jìn)植物生 長(zhǎng)作用，是一株多功能生防菌株，對(duì)植物根結(jié)線蟲也具有一定的防治效果。通過基因?qū)耄?使該生防菌同時(shí)具備了降解有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱的功能，為該工程菌株的制劑研究及開發(fā)打 下了良好的基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)我國農(nóng)藥污染的實(shí)際問題和需求，提供一株毒死蜱污染土壤 修復(fù)的越南伯克霍爾德氏菌多功能工程菌株(BurWiolderia vietnamiensis)P418-M及其 構(gòu)建方法。本發(fā)明所提供的降解毒死蜱的越南伯克霍爾德氏菌多功能工程菌株 (Burkholderia vietnamiensis)P418-M，已于2010年9月13日提交中國微生物菌種保藏 管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院生 物研究所，保藏編號(hào)=CGMCC No. 4166。本發(fā)明利用的原始菌株是一株越南伯克霍爾德氏菌P418，具有解磷、解鉀、固氮、 防土傳病害和根際定殖能力。本發(fā)明利用基因工程手段，通過Tn5轉(zhuǎn)座，將來自不動(dòng)桿菌的有機(jī)磷降解酶基因通過自殺性質(zhì)粒整合到P418的染色體上，使其在具有解磷、解鉀、固氮、 防病和根際定殖能力的基礎(chǔ)上，增加降解農(nóng)藥殘留的功能，實(shí)現(xiàn)伯克氏菌的多重功能。本發(fā)明所述的降毒死蜱多功能工程菌株的構(gòu)建方法，包括以下步驟1)重組質(zhì)粒pUT-M的構(gòu)建根據(jù)有機(jī)磷降解酶基因序列設(shè)計(jì)引物mf和mr (引入Not I酶切位點(diǎn)及SD序列)， 利用PCR技術(shù)擴(kuò)增有機(jī)磷降解酶基因，Not I分別酶切有機(jī)磷降解酶基因和質(zhì)粒pUT-Kml， 再將酶切后的基因和質(zhì)粒pUT-Kml連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌S17-1 ( λ -pir)，得到重組質(zhì)粒 pUT-M ；2)轉(zhuǎn)化越南伯克氏菌P418含重組質(zhì)粒的大腸桿菌S17-1，與越南伯克氏菌P418混合進(jìn)行轉(zhuǎn)化，經(jīng)抗性平板 篩選，得到68個(gè)單菌株；3)篩選通過PCR擴(kuò)增、電泳、Southern雜交及對(duì)毒死蜱的降解能力檢測(cè)，對(duì)步驟2)中的 68個(gè)單菌株進(jìn)行篩選，最終獲得1個(gè)對(duì)毒死蜱降解活性最高的單菌株，即為降毒死蜱的越 南伯克霍爾德氏菌多功能工程菌(Burkholderia vietnamiensis)P418-M。上述的降毒死蜱多功能工程菌的篩選主要采用以下三個(gè)步驟進(jìn)行(I)PCR擴(kuò)增和電泳利用mf和mr通過PCR擴(kuò)增和電泳技術(shù)對(duì)步驟2)中的68個(gè)單菌株進(jìn)行篩選，有 26個(gè)單菌株擴(kuò)增出目的條帶；(2) Southern 雜交對(duì)上述步驟(1)得到的沈個(gè)單菌株在同等條件下分別進(jìn)行Southern雜交，所用 探針為有機(jī)磷降解酶基因全長(zhǎng)序列。經(jīng)檢測(cè)有20個(gè)單菌株的有機(jī)磷降解酶基因是單拷貝 插入到P418染色體中，保留這20個(gè)單菌株備用。(3)突變菌株對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥降解能力的檢測(cè)通過降解能力檢測(cè)對(duì)上述步驟O)中的20個(gè)菌株進(jìn)行進(jìn)一步篩選。相同條件下 接種到含有機(jī)磷農(nóng)藥的無機(jī)鹽培養(yǎng)基平板上，通過透明圈篩選，參見圖4，其中7個(gè)菌株產(chǎn) 生透明圈；再將這7個(gè)菌株分別接到含有機(jī)磷農(nóng)藥的液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48小時(shí)，利 用HPLC檢測(cè)各菌株對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的降解率，得到1株降解率最高的菌株，即為本發(fā)明的目 標(biāo)產(chǎn)物-降毒死蜱的越南伯克霍爾德氏菌多功能工程菌株(Burldiolderiavietnamiensis) P418-M。上述步驟1)的引物mf和mr序列如下mf 5' -GATCGCGGCCGCAGGAGGTTGATATGCCCCTGAAGAAC-3，mr 5' -GATAGCGGCCGCCTTGGGGTTGACGACCG-3，本發(fā)明降毒死蜱多功能工程菌株的生物學(xué)特性研究(1)多功能工程菌P418-M與原始菌株P(guān)418的生長(zhǎng)曲線研究，參見圖5(2)對(duì)得到的多功能工程菌P418-M進(jìn)行解磷、解鉀和固氮能力的檢測(cè)，參見表2。(3)越南伯克氏菌P418及降毒死蜱多功能工程菌P418-M在小麥根部的定殖能力 檢測(cè)，參見圖6。(4)越南伯克氏菌P418及降毒死蜱多功能工程菌P418-M對(duì)土傳病原菌的抑制能力檢測(cè)，參見表3。(5)對(duì)多功能工程菌P418-M和原始有機(jī)磷降解菌株me進(jìn)行土壤中毒死蜱降解能 力的檢測(cè)，參見表4本發(fā)明降毒死蜱多功能工程菌P418-M的應(yīng)用本發(fā)明降毒死蜱多功能工程菌株P(guān)418-M可用于土壤有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱殘留 的生物降解；同時(shí)還可用于常見植物病害的防治及促生，如立枯絲核病菌(Miizoctonia solani),尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum),禾谷絲核菌(Rhizoctonia cerealis),植物 根結(jié)線蟲等。因此，該多功能工程菌株可作為主要有效成分用于微生物肥料的制備。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是針對(duì)目前化學(xué)農(nóng)藥尤其是有機(jī)磷農(nóng)藥帶來嚴(yán)重的環(huán)境污染等問 題，應(yīng)用基因工程手段，通過Tn5轉(zhuǎn)座，將有機(jī)磷降解酶編碼基因整合到越南伯克氏菌Ρ418 染色體上，使多功能微生物在具有防病、解磷、解鉀、固氮，促進(jìn)植物生長(zhǎng)和根際定殖能力的 基礎(chǔ)上，增加其降農(nóng)殘功能，實(shí)現(xiàn)降農(nóng)殘、防病和促生等多重功能。在平板拮抗實(shí)驗(yàn)中，工程 菌株與原始菌株越南伯克氏菌Ρ418相比，其抑菌能力沒有受到影響；降解能力檢測(cè)，構(gòu)建 的工程菌5天對(duì)室內(nèi)模擬污染土壤的降解率達(dá)82%。工程菌Ρ418-Μ與原始菌Ρ418的生長(zhǎng) 曲線相近，利用原始菌株的培養(yǎng)基對(duì)工程菌進(jìn)行發(fā)酵后，以草炭土為載體制成粉劑，該制 劑對(duì)小區(qū)模擬污染土壤的降解率7天達(dá)到70%左右。本發(fā)明將來自不動(dòng)桿菌的有機(jī)磷降解酶基因通過自殺性質(zhì)粒整合到越南伯克氏 菌Ρ418的染色體DNA上，獲得了穩(wěn)定高效的降毒死蜱多功能工程菌Ρ418-Μ。以原始菌株的 培養(yǎng)基發(fā)酵后制成的粉劑，對(duì)毒死蜱污染土壤有很好的修復(fù)效果。


圖1是重組質(zhì)粒pUT-M的酶切圖譜，其中泳道1為11Λ的標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量Marker， 泳道23為陽性質(zhì)粒酶切結(jié)果。圖2是工程菌株的PCR電泳圖譜，其中泳道1為11Λ的標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量Marker，其 它為部分工程菌株的PCR結(jié)果。圖3是Southern雜交照片，以有機(jī)磷降解酶基因序列全長(zhǎng)作為DNA探針，對(duì)步驟 3)中的第(1)步得到的沈個(gè)單菌落進(jìn)行Southern雜交。經(jīng)檢測(cè)這沈個(gè)單菌株中有20個(gè) 單菌株的有機(jī)磷降解酶基因是單拷貝插入到越南伯克氏菌P418的染色體中，圖3是部分單 菌株的Southern雜交照片。圖4是毒死蜱平板照片，對(duì)步驟幻中的第( 步得到的20個(gè)單菌株接種到含有 機(jī)磷的無機(jī)鹽平板上，通過透明圈篩選菌株，圖中7個(gè)單菌株能正常生長(zhǎng)并產(chǎn)生透明圈，具 有有機(jī)磷降解酶活性。圖5是工程菌株P(guān)418-M與原始菌株P(guān)418生長(zhǎng)曲線。圖6是降毒死蜱多功能工程菌株P(guān)418-M與原始菌株P(guān)418在小麥根尖的定殖數(shù) 量，其中，A圖是滅菌土中多功能工程菌株P(guān)418-M與原始菌株P(guān)418在小麥根尖的定殖數(shù)量 關(guān)系圖；B圖是自然土中二者在小麥根尖的定殖數(shù)量關(guān)系圖。圖7是工程菌制劑對(duì)大田模擬污染土壤的降解能力，其中，左圖中毒死蜱按推薦 劑量(0. 5kg. a. i. ha—1)，右圖中毒死蜱為加倍劑量(1kg. a. i. ha—1)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1 降毒死蜱多功能工程菌株的構(gòu)建1)重組質(zhì)粒pUT-M的構(gòu)建
根據(jù)有機(jī)磷降解酶基因設(shè)計(jì)引物mf 5' GATCGCGGCCGCAGGAGGTTGATATGCCCCTGAAGAAC-3，mr 5' -GATAGCGGCCGCCTTGGGGTTGACGACCG-3，在該基因兩端引入Not I酶切位點(diǎn)及SD序列，以pGM-T-M為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3min，94°C變性30min，55°C退火50min，72°C延伸Imin，共30個(gè)循 環(huán)，最后72°C延伸IOmin0利用Not I單酶切有機(jī)磷降解酶基因和質(zhì)粒pUT-Kml，進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化入E. coli S17-1 ( λ -pir)，轉(zhuǎn)化子利用上述引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，反應(yīng)條件同上。通過PCR檢測(cè)得到的陽性克隆，提取質(zhì)粒，利用Not I進(jìn)一步進(jìn)行酶切鑒定，參見 圖1，陽性克隆即為重組質(zhì)粒PUT-M2)轉(zhuǎn)化將重組質(zhì)粒pUT-M轉(zhuǎn)化到E. coli S17-1 ( λ-pir)感受態(tài)細(xì)胞中，用其作為供體 菌，以菌株P(guān)418作受體菌，二者混合，使有機(jī)磷降解酶基因整合到原始菌P418染色體上。即 將過夜培養(yǎng)的供體菌懸液、受體菌懸液以1:1(體積比)于1. 5ml離心管中混合，收集菌 體，無菌水沖洗一次，再次收集菌體懸浮于200 μ 1的無菌水中，將菌液點(diǎn)接于Ρ418菌平板 上，培養(yǎng)6- 后，用無菌水收集菌體，稀釋后涂于含Kan的P418平板上，培養(yǎng)48h， 得到68個(gè)單菌株。挑取部分單菌落涂片鏡檢，轉(zhuǎn)化后的菌株菌體很小，呈小短桿狀，與原始 菌株形態(tài)一致。3)降毒死蜱多功能工程菌P418M的篩選主要采用以下三個(gè)步驟進(jìn)行降農(nóng)殘多功能工程菌株的篩選(1) PCR擴(kuò)增和電泳技術(shù)利用mf和mr通過PCR擴(kuò)增和電泳技術(shù)對(duì)步驟2)中的68個(gè)單菌株進(jìn)行突變子篩 選，PCR反應(yīng)條件參見實(shí)施例1中的PCR反應(yīng)條件。經(jīng)PCR擴(kuò)增和電泳技術(shù)檢測(cè)得到沈個(gè) 單菌株，結(jié)果見圖2。(2) Southern 雜交通過Southern雜交對(duì)(1)中的沈個(gè)單菌種進(jìn)行驗(yàn)證，方法參照分子克隆試驗(yàn) 指南(第三版)。以有機(jī)磷降解酶基因序列全長(zhǎng)作為探針，用DIG HIGH PRIME LABELING MIX(Roche)標(biāo)示DNA探針。經(jīng)檢測(cè)實(shí)施例1中幻中第(1)步得到的沈個(gè)單菌株中有20 個(gè)單菌株的有機(jī)磷降解酶基因是單拷貝插入到P418的染色體中，結(jié)果見圖3。(3)有機(jī)磷降解能力檢測(cè)將步驟幻中的( Southern雜交后獲得的20個(gè)單菌株同時(shí)接種到含有機(jī)磷(毒 死蜱)的無機(jī)鹽平板上，培養(yǎng)3-5天后，通過透明圈檢測(cè)篩選到7個(gè)單菌株具有有機(jī)磷 降解酶活性，參見圖4。將這7個(gè)單菌株接種到無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中(含毒死蜱IOOmg -Γ1)， 搖床培養(yǎng)4 后，利用高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)各菌株對(duì)有機(jī)磷(毒死蜱)的降解能力。由表1可以看出編號(hào)為43的工程菌株降解活性較高，為70%，將其確定為目的產(chǎn) 物-降毒死蜱多功能工程菌株(Burkholderia vietnamiensis)P418-M。表1 經(jīng)無機(jī)鹽平板檢測(cè)后7個(gè)單菌株的降解活性檢測(cè)
權(quán)利要求
1.一株降解毒死蜱的越南伯克霍爾德氏菌多功能工程菌株(BurW10Ideria vietnamiensis)P418-M，已于2010年09月13日提交中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通 微生物中心(CGMCC)保藏，保藏編號(hào)CGMCC No. 4166。
2.如權(quán)利要求1所述降解毒死蜱的越南伯克霍爾德氏菌多功能工程菌株的構(gòu)建方法， 其特征在于包括以下步驟(1)重組質(zhì)粒PUT-M的構(gòu)建根據(jù)有機(jī)磷降解酶基因序列設(shè)計(jì)引物mf和mr (引入NotI酶切位點(diǎn))，利用PCR技術(shù)擴(kuò) 增有機(jī)磷降解酶基因，NotI分別酶切有機(jī)磷降解酶基因和質(zhì)粒pUT-Kml，再將酶切后的基 因和質(zhì)粒pUT-Kml連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌S17-1 ( λ -pir)，得到重組質(zhì)粒pUT_M ；(2)轉(zhuǎn)化含重組質(zhì)粒的大腸桿菌S17-1，與越南伯克霍爾德氏菌P418混合進(jìn)行轉(zhuǎn)化，經(jīng)抗性平 板篩選，得到68個(gè)單菌株；(3)篩選通過PCR擴(kuò)增、電泳、、Southern雜交及對(duì)毒死蜱的降解能力檢測(cè)步驟O)中的68個(gè) 單菌株，篩選獲得1個(gè)對(duì)毒死蜱降解活性最高的單菌株，即為降解毒死蜱的越南伯克霍爾 德氏菌多功能工程菌(Burkholderia vietnamiensis)P418-M。
3.權(quán)利要求1所述的降解毒死蜱的多功能工程菌株的用途，其特征在于既能用于毒死 蜱污染土壤的修復(fù)治理，又能防治植物病原菌，還具有解磷、解鉀、固氮促生作用，。
4.如權(quán)利要求3所述的降解毒死蜱的多功能工程菌株的用途，其特征在于所述植物病 原菌是立枯絲核病菌(Rhizoctonia solani)，尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)，禾谷絲 核菌(Rhizoc tonia cerealis)。
5.權(quán)利要求3所述的降解毒死蜱的多功能工程菌株的用途，其特征在于用于微生物肥 料的制備。
全文摘要
本發(fā)明為一株降解毒死蜱的多功能工程菌株及其構(gòu)建方法，涉及伯克氏菌多功能工程菌株(Burkholderia vietnamiensis)P418-M，該菌種保藏號(hào)為CGMCC No.4166。伯克氏菌多功能工程菌株的構(gòu)建方法是利用越南伯克氏菌，通過Tn5轉(zhuǎn)座，將來自不動(dòng)桿菌的有機(jī)磷降解酶基因通過自殺性質(zhì)粒整合到越南伯克氏菌的染色體上，使多功能微生物在具有解磷、解鉀、固氮，促進(jìn)植物生長(zhǎng)和根際定殖能力的基礎(chǔ)上，增加降解農(nóng)藥殘留的功能，實(shí)現(xiàn)伯克氏菌的多重功能。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102071163SQ20101056180
公開日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2010年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月29日
發(fā)明者任艷, 張新建, 扈進(jìn)冬, 李紅梅, 李紀(jì)順, 楊合同, 魏艷麗, 黃玉杰 申請(qǐng)人:山東省科學(xué)院中日友好生物技術(shù)研究中心