專利名稱：一種氯霉素單克隆抗體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于單克隆抗體制備技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種氯霉素單克隆抗體的制備方法。
背景技術(shù)：
氯霉素(CAP)是一種廣譜性抗生素，對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均有很好的抑制作用。由于其優(yōu)良的抗菌性、穩(wěn)定的藥性和低廉的價格，因此作為細菌性疾病的治療藥物應用于人和動物臨床，并作為飼料添加劑廣泛應用于畜牧業(yè)和人工水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)。 但是，氯霉素具有毒性，易引起人體血中毒，長期應用可導致再生障礙性貧血和粒細胞缺乏癥。嬰兒長期食用氯霉素污染的乳汁，可能會引起“灰嬰綜合征”。此外長期微量攝入氯霉素，不僅使大腸桿菌、沙門氏菌等產(chǎn)生耐藥性，而且會引起機體正常菌群失調(diào)，使人們易感染各種疾病。如果氯霉素在食用動物中殘留，可通過食物鏈傳給人類，對人類的健康造成危害，因此，抗氯霉素單克隆抗體的制備對動物性食品檢測以及人類健康具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種抗氯霉素單克隆抗體的制備方法，其特征在于包括以下步驟
(1)用重氮化方法制備CAP-BSA的抗原；
(2)免疫用CAP-BSA抗原淋巴免疫小鼠，第一次免疫與弗氏完全佐劑充分乳化，第二次和第三次免疫與弗氏不完全佐劑充分乳化，每次間隔7天，融合前三天腹腔直接注射抗原加強免疫；
(3)篩選用酶聯(lián)免疫吸附法測小鼠血清效價；
(4)細胞融合選擇血清效價最高的小鼠取脾細胞與骨髓瘤細胞體外融合；
(5)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選融合細胞，檢測篩選陽性細胞，克隆化培養(yǎng)，進一步克隆篩選陽性細胞，陽性克隆擴培與凍存；
(6)腹水制備將擴大培養(yǎng)后的細胞株注射入小鼠腹腔以生產(chǎn)大量腹水；
(7)腹水純化用層析柱純化腹水中的抗氯霉素單克隆抗體。進一步地，步驟(2)所述的小鼠為6周齡的BALB/c小鼠，每次抗原免疫量為 iooyg/只，抗原與弗氏完全佐劑的混合比例為ι山抗原與弗氏不完全佐劑的混合比例為 1 :1。步驟(4)中，洗滌調(diào)整小鼠脾B淋巴細胞濃度為(1-5) X107mL，將淋巴細胞與處于對數(shù)生長期的骨髓瘤細胞按10:1混合后離心棄上清，緩慢加入分子質(zhì)量1500D的 50%PEG進行融合，將融合后的細胞加入含有HAT選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)。步驟(5)中，用HAT選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)融合后的細胞，接種到96孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，用間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法篩選陽性孔，將陽性孔中的細胞用有限稀釋法進行克隆篩選，直至獲得分泌單一的單克隆抗體的雜交瘤細胞。
步驟(6)中，用弗氏不完全佐劑0.5 mL/只注射小鼠腹腔，一周后腹腔注射雜交瘤細胞5X IO6/只，7日后每日觀察小鼠的腹部情況及精神狀況，待腹部凸起，顏色變黑，小鼠精神差，即可抽取腹水，每隔1天抽取一次。步驟(7)中，所述的層析柱為HiTrap r-Protein A FF預裝層析柱，取適量腹水， 10,000 r/min離心15 min，取上清，經(jīng)過0. 22 μ m微孔濾膜過濾后，用pH7. 0，20mmol/L磷酸緩沖液+ 3.0 mol/L NaCl上樣，pH3.0，0.1 mol/L甘氨酸一鹽酸緩沖液洗脫，收集洗脫液，調(diào)PH值后脫鹽凍存。采用本發(fā)明中可分泌抗氯霉素單克隆抗體的雜交瘤細胞的擴培技術(shù)和制備腹水抗體技術(shù)，可大量生產(chǎn)抗CAP單克隆抗體，并且隨著生產(chǎn)規(guī)模的擴大，可以大大降低生產(chǎn)成本。由于細胞的背景、細胞培養(yǎng)液的成分以及腹水的純化都是明確可控的，用這種方法所生產(chǎn)出的單克隆抗體的質(zhì)量具有很強的可控性和可重復性。并通過對所得抗體特性的初步分析及鑒定，為特異、靈敏的CAP免疫測定方法的進一步建立和應用提供了實驗依據(jù)。


圖1是單克隆抗體層析結(jié)果圖。圖2是單克隆抗體電泳鑒定結(jié)果圖。
具體實施例方式1、材料
1.1動物、細胞株
BALB/c小鼠，浙江省動物實驗中心；Fl小鼠，浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心；SP2/0 骨髓瘤細胞，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。1.2主要儀器
層流超凈臺SCV-4A1，Streaml ine Laboratory Products ；三目倒置相差顯微鏡 ELWD0. 3T1-SNCP，Nikon ； 二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱 3111，Thermo Electron Corporation ； HiTrap r-Protein A FF 層析柱(5mL)、AKTA purifier, GE Healthcare ；無菌培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、離心管，Corning公司。1.3主要試劑
免疫原CAP-BSA和檢測抗原CAP-0VA，本實驗室合成；氯霉素，上海晶純試劑有限公司； HAT培養(yǎng)液、HT培養(yǎng)液、PEG (1500D), Sigma公司；胎牛血清，民海生物工程有限公司；RPML 1640培養(yǎng)液，吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；羊抗小鼠IgG-HRP，博士德生物工程有限公司
2、方法
2. 1 免疫取6周齡的BALB/c小鼠，用重氮化方法合成的氯霉素-BSA (CAP-BSA)抗原淋巴免疫，每次免疫量為IOOyg/只，第一次免疫與等量的弗氏完全佐劑充分乳化，第二次、第三次免疫與等量的弗氏不完全佐劑充分乳化，每次間隔7天，融合前三天腹腔直接注射IOOyg抗原加強免疫。2. 2 細胞融合將小鼠處死，無菌摘取脾臟，研磨制取脾B淋巴細胞懸液，洗滌調(diào)整細胞濃度為(1-5) X IOVmL備用。將免疫脾B淋巴細胞與處于對數(shù)生長期的骨髓瘤細胞按10:1混合后離心棄上清，緩慢加入分子質(zhì)量1500D的50%PEG lmL，間隔1 min后，緩慢滴入無血清培養(yǎng)液，終止融合劑的作用，經(jīng)洗滌去除融合劑后加入所含有HAT的細胞培養(yǎng)液，分種于96孔培養(yǎng)板孔內(nèi)，每孔200 μ L。2. 3 雜交瘤細胞的篩選在接種96孔培養(yǎng)板，經(jīng)過1周的培養(yǎng)后，骨髓瘤細胞與 B淋巴細胞的雜交瘤細胞即被選擇培養(yǎng)出，然后進行單克隆化。克隆化方法用有限稀釋法， 一般克隆化3—4次，直至克隆細胞生長的各個孔檢測100%抗體陽性為止。2. 4 腹水抗體的制備用弗氏不完全佐劑0. 5mL/只注射小鼠腹腔，一周后腹腔注射雜交瘤細胞5X106/只，待7日后每日觀察小鼠的腹部情況及精神狀況，待腹部凸起， 顏色變黑，小鼠精神差，即可抽取腹水，每隔1天抽取一次。2. 5 間接競爭ELISA測抗體效價及陽性孔將氯霉素_卵清蛋白(CAP-OVA)抗原1 μ g/孔包被酶標板，設(shè)置空白對照孔，37 °C包被過夜；PBS-T溶液浸洗三次，每孔加入 200 μ L待測樣，以PBS稀釋，37°C孵育1小時；PBS-T溶液浸洗三次，每孔加入100 μ L用 1%BSA溶液按1 :3000稀釋的羊抗小鼠IgG-HRP，37°C孵育1小時；PBS-T溶液浸洗三次，雙蒸水浸洗三次，每孔加入100 μ L鄰苯二胺底物溶液，置于暗處反應5分鐘，陽性孔變?yōu)樽攸S色，每孔加入IOOyL 2Μ 終止反應。篩選出的陽性孔再用CAP-OVA包被的酶標板進行競爭抑制性ELISA法，先將細胞培養(yǎng)上清與2 X IO-3M的CAP溶液等量混合，37°C感作1小時， 再加入已包被的酶標板中。同時用0. 01M, Ph7. 4的PBS替代CAP溶液作對照，其余步驟同上。若經(jīng)抑制后的OD值降至對照孔50%以下，則判為陽性孔。2.6 抗體的純化選擇5mL HiTrap r-Protein A FF預裝層析柱純化抗體。取適量腹水，10，000 r/min離心15 min，取上清，經(jīng)過0. 22 μ m微孔濾膜過濾后，用20mmol/L磷酸緩沖液上樣，用0. lmol/L甘氨酸-鹽酸緩沖液洗脫?？疾爝x擇上樣緩沖液的pH值和離子強度、洗脫緩沖液的PH值，控制樣品流速。2. 7 SDS-PAGE法鑒定單抗純度分離膠濃度12%，濃縮膠濃度4%，還原狀態(tài)下處理樣品，電泳后用考馬斯亮藍R250染色，乙醇乙酸脫色，然后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)掃描分析其純度。3、結(jié)果
3. 1 CAP雜交瘤細胞株的建立
3. 1. 1小鼠血清抗體效價檢測=CAP-BSA抗原免疫的BALB/c小鼠共四只，眼眶取血檢測效價。四只小鼠的血清抗體效價都達到了 10_6以上，免疫效果較好，可進行細胞融合。3. 1. 2雜交瘤細胞株的建立細胞融合后鋪三塊96孔板，經(jīng)HAT培養(yǎng)液篩選后，測出9個陽性孔，取上清效價最高(10_4)的兩孔細胞株(ID1JG12)單克隆化4次，第2，3，4次單克隆時，2株細胞的陽性率均為100%。雜交瘤細胞株經(jīng)14周的培養(yǎng)后依舊能穩(wěn)定分泌單克隆抗體。經(jīng)液氮凍存復蘇后仍能穩(wěn)定分泌抗CAP單克隆抗體。3. 2單克隆抗體的制備及其性質(zhì)的鑒定
3. 2. 1雜交瘤細胞上清抗體效價的檢測細胞上清抗體效價達到了 10_4以上。3. 2. 2腹水抗體效價的檢測2株雜交瘤細胞株注射小鼠腹腔產(chǎn)生的抗體效價均在10_7以上。3. 3腹水抗體的純化
在上樣緩沖液PH6. 5、7. 0、7. 5條件下，目的單抗基本保留在層析介質(zhì)上。在pH7. 0的上樣條件下，洗脫的目的蛋白峰中雜蛋白含量較少，純度略高。
上樣緩沖液的離子強度大于4mol/L時會產(chǎn)生鹽析效應，影響抗體的穩(wěn)定性。在 (0 3.0)mol/L NaCl的離子強度下，目的單抗均能較好地與層析介質(zhì)結(jié)合，在3. Omol/L NaCl的離子強度下，洗脫的目的蛋白峰中雜蛋白含量較少，純度較高。采用pH值為3. 0的0. lmol/L甘氨酸-鹽酸緩沖液進行洗脫時，洗脫峰為單一峰， 而且峰形較好，洗脫較完全，回收率高。樣品在各個流速下進行上樣和洗脫，都可以得到較高的純度和回收率，流速對其影響較小。因此為了提高效率，可以采用5. Oml/min的流速進行上樣和洗脫。綜上所述，本發(fā)明確定pH7.0，20mmol/L磷酸緩沖液+ 3. Omol/L NaCl為最佳上樣條件，pH3.0，0. 1 mol/L甘氨酸-鹽酸緩沖液為最佳洗脫條件。純化后抗體純度達95% 以上，回收率達80%。層析結(jié)果如圖1所示(1.穿透峰；2.抗體洗脫峰)。電泳鑒定結(jié)果如圖2所示(1.標準蛋白marker ;2.腹水；3.穿透峰；4.洗脫峰)。
權(quán)利要求
1.一種抗氯霉素單克隆抗體的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)用重氮化方法制備CAP-BSA的抗原；(2)免疫用CAP-BSA抗原淋巴免疫小鼠，第一次免疫與弗氏完全佐劑充分乳化，第二次和第三次免疫與弗氏不完全佐劑充分乳化，每次間隔7天，融合前三天腹腔直接注射抗原加強免疫；(3)篩選用酶聯(lián)免疫吸附法測小鼠血清效價；(4)細胞融合選擇血清效價最高的小鼠取脾細胞與骨髓瘤細胞體外融合；(5)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選融合細胞，檢測篩選陽性細胞，克隆化培養(yǎng)，進一步克隆篩選陽性細胞，陽性克隆擴培與凍存；(6)腹水制備將擴大培養(yǎng)后的細胞株注射入小鼠腹腔以生產(chǎn)大量腹水；(7)腹水純化用層析柱純化腹水中的抗氯霉素單克隆抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(2)所述的小鼠為6周齡的BALB/c 小鼠，每次抗原免疫量為IOOyg/只，抗原與弗氏完全佐劑的混合比例為1 :1，抗原與弗氏不完全佐劑的混合比例為1 :1。
3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(4)中，洗滌調(diào)整小鼠脾B淋巴細胞濃度為(1-5) X 107mL，將淋巴細胞與處于對數(shù)生長期的骨髓瘤細胞按10:1混合后離心棄上清，緩慢加入分子質(zhì)量1500D的50%PEG進行融合，將融合后的細胞加入含有HAT選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)。
4.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(5)中，用HAT選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)融合后的細胞，接種到96孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，用間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法篩選陽性孔，將陽性孔中的細胞用有限稀釋法進行克隆篩選，直至獲得分泌單一的單克隆抗體的雜交瘤細胞。
5.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(6)中，用弗氏不完全佐劑0.5mL/ 只注射小鼠腹腔，一周后腹腔注射雜交瘤細胞5 X IO6/只，7日后每日觀察小鼠的腹部情況及精神狀況，待腹部凸起，顏色變黑，小鼠精神差，即可抽取腹水，每隔1天抽取一次。
6.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(7)中，所述的層析柱為HiTrap r-Protein A FF預裝層析柱，取適量腹水，10，000 r/min離心15 min，取上清，經(jīng)過0. 22 μ m微孔濾膜過濾后，用ρΗ7· 0，20mmol/L磷酸緩沖液+3.0 mol/L NaCl上樣，ρΗ3· 0,0. 1 mol/L甘氨酸一鹽酸緩沖液洗脫，收集洗脫液，調(diào)PH值后脫鹽凍存。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種氯霉素(CAP)單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟(1)用重氮化方法制備CAP-BSA的抗原；(2)用CAP-BSA抗原淋巴免疫小鼠，第一次免疫與弗氏完全佐劑充分乳化，第二次和第三次免疫與弗氏不完全佐劑充分乳化，每次間隔7天，融合前三天腹腔直接注射抗原加強免疫；(3)用酶聯(lián)免疫吸附法測小鼠血清效價；(4)選擇血清效價最高的小鼠取脾細胞與骨髓瘤細胞體外融合；(5)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選融合細胞，檢測篩選陽性細胞，克隆化培養(yǎng)，進一步克隆篩選陽性細胞，陽性克隆擴培與凍存；(6)將擴大培養(yǎng)后的細胞株注射入小鼠腹腔以生產(chǎn)大量腹水；(7)用層析柱純化腹水中的抗氯霉素單克隆抗體。制備得到的抗CAP-BSA單克隆抗體靈敏性高、特異性強、實用性好。
文檔編號C12R1/91GK102477097SQ20101056172
公開日2012年5月30日 申請日期2010年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月26日
發(fā)明者應國清, 易喻, 梅建鳳, 汪竹環(huán), 王鴻, 陳建澍 申請人:杭州博林生物技術(shù)有限公司, 浙江工業(yè)大學