專利名稱：一株具誘導(dǎo)大豆抗逆的巨大芽孢桿菌及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種誘導(dǎo)大豆抗逆的巨大芽孢桿菌及 應(yīng)用。
背景技術(shù)：
東北是我國大豆主產(chǎn)區(qū)，低溫是降低大豆產(chǎn)量的主要因子。大豆整個(gè)生育期的各 個(gè)階段都易出現(xiàn)冷害，從而降低產(chǎn)量和品質(zhì)，尤其萌發(fā)初期對低溫敏感。在早春下播種時(shí)， 由于低溫常容易引起出苗時(shí)間延長造成畸形苗，或者種子霉?fàn)€變質(zhì)而喪失發(fā)芽能力，造成 大豆減產(chǎn)，為此加強(qiáng)大豆出苗耐低溫性的相關(guān)研究對大豆生產(chǎn)具有積極的意義。采用施放 煙霧、地膜覆蓋、抗寒力強(qiáng)的品種或晚熟品種適時(shí)早播等措施可提高植物的抗寒力，但都有 局限性。目前提高大豆抗寒性的方法是使用一些化學(xué)物質(zhì)或者抗寒劑等，這對作物品質(zhì)和 土壤可能會(huì)造成一定的影響。由于人們環(huán)境保護(hù)意識(shí)的提高，而大部分的誘導(dǎo)物對環(huán)境無 污染，并且誘導(dǎo)抗性具有廣譜、持續(xù)時(shí)間較長、抗性表達(dá)時(shí)間和空間的相對可控性等特點(diǎn)。 這些特點(diǎn)決定了植物誘導(dǎo)抗性具有良好的應(yīng)用前景。利用細(xì)菌作為生物防治因子防治植物 病害已成為國內(nèi)外生物防治研究中的一個(gè)熱點(diǎn)。PGPR的促生防病研究已成為熱點(diǎn)方向之一，其研究主要集中在假單胞菌和芽孢桿 菌類，該類群能夠抑制多種植物病害特別是土傳病害。作用機(jī)理主要包括有效根部定殖、抗 生作用、根際營養(yǎng)競爭、分泌降解病原微生物的酶等。因此，PGI^R制劑在農(nóng)林牧業(yè)、環(huán)境保 護(hù)等方面具有重大應(yīng)用潛力和價(jià)值。據(jù)此本研究旨在提出創(chuàng)新思路，篩選出可誘導(dǎo)大豆產(chǎn)生系統(tǒng)抗性的根際促生菌用 以抵抗低溫同時(shí)能夠抵抗病菌和線蟲。該研究將為控制低溫冷害提供新思路和新方法，對 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、尤其是大豆生產(chǎn)起到絕對的推動(dòng)作用，具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是獲得一株可誘導(dǎo)大豆在種子萌發(fā)和生長期間能抵抗低溫和大豆 胞囊線蟲病的菌株，將菌株按常規(guī)液體發(fā)酵培養(yǎng)后，可以用該菌或該菌的代謝產(chǎn)物，開發(fā)出 處理大豆種子的種子處理劑，經(jīng)過處理的大豆種子可以使大豆產(chǎn)生對低溫和大豆胞囊線蟲 病的抗性。本發(fā)明篩選獲得的一株細(xì)菌菌株是巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium) Sneb69，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；地址中國.北京市 朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)；保藏日期2010年11月02日；保藏登記入冊的編號(hào)=CGMCC No. 4296。巨大芽孢桿菌是從大量土壤細(xì)菌菌株中篩選出的一株對大豆具有強(qiáng)誘導(dǎo)活性的 細(xì)菌菌株。本發(fā)明通過研究發(fā)現(xiàn)，土壤細(xì)菌有很多株細(xì)菌都具有一定的活性，從這些細(xì)菌中 篩選出一株性狀相對較好的菌株巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium) Sneb69進(jìn)行了進(jìn)一 步的研究。
本發(fā)明還涉及用于誘導(dǎo)大豆種子的細(xì)菌代謝物，其是由本發(fā)明的細(xì)菌菌株巨大芽 孢桿菌(Bacillus megaterium)Sneb69經(jīng)過常規(guī)的液體發(fā)酵培養(yǎng)后提取制備的。本發(fā)明的細(xì)菌菌株巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium) Sneb69是通過試管種培
養(yǎng)后，再經(jīng)擴(kuò)大發(fā)酵培養(yǎng)來制備，其具體方法如下1.試管種培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為牛肉膏蛋白胨(NA)培養(yǎng)基，即成分牛肉浸膏3g，蛋白胨10g，酵母 浸膏l(xiāng)g，蔗糖10g，瓊脂20g，加水至IOOOmL02.液體發(fā)酵培養(yǎng)其中液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為以重量百分比計(jì)，含有牛肉浸膏0. 2% -0. 4%、蛋白 胨_2%、酵母浸膏0. 1% -0.5%、蔗糖_2%、余下為蒸餾水，pH為7-9。將試管種接種到250mL三角瓶(每瓶裝IOOmL)液體培養(yǎng)基中，25°C 下，搖 床轉(zhuǎn)速以150r · mirT1 200r · mirT1、發(fā)酵45-50小時(shí)，優(yōu)選48h。液體發(fā)酵的菌種可以通過大型發(fā)酵罐進(jìn)行規(guī)模生產(chǎn)，其產(chǎn)品為發(fā)酵液或發(fā)酵液的 制成品。本發(fā)明還涉及一種大豆種子處理劑，其包含有效量的本發(fā)明所述的巨大芽孢桿菌 (Bacillus megaterium) Sneb69本身或其代謝物作為有效活性成分。本發(fā)明的巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium) Sneb69或其代謝物具有對大豆的 誘導(dǎo)活性，可用于大豆的種子處理，處理后的大豆可以在苗期抵御早春低溫和大豆胞囊線 蟲侵害，解決東北大豆胞囊線蟲病為害嚴(yán)重和早春低溫的情況。
具體實(shí)施例方式為了更詳細(xì)地進(jìn)一步闡明而不是為了限制本發(fā)明，給出了下列實(shí)施例。實(shí)施例1 巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium) Sneb69的獲得取大豆田的土壤lg，加入無菌水100ml，取200 μ 1，加入冷卻至35°C以下的滅菌的 20ml NA液體培養(yǎng)基，25°C下培養(yǎng)待菌落長出后，根據(jù)菌落色澤和邊緣狀態(tài)，挑取巨大芽孢 桿菌(Bacillus megaterium)菌落單獨(dú)保存，進(jìn)行擴(kuò)繁和生理生化測定，培養(yǎng)性狀符合巨大 芽孢桿菌(Bacillus megaterium)特征的保存?zhèn)溆?。?shí)施例2 巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium) Sneb69的培養(yǎng)首先對巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium) Sneb69菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，然后對 發(fā)酵培養(yǎng)后的代謝產(chǎn)物進(jìn)行大豆誘導(dǎo)活性試驗(yàn)，確定其對大豆的誘導(dǎo)作用。將巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium) Sneb69的菌體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基 上，培養(yǎng)基配方為NA培養(yǎng)基，即成分牛肉浸膏3g，蛋白胨10g，酵母浸膏l(xiāng)g，蔗糖10g，瓊脂 20g，加水至1000mL。25°C培養(yǎng)10d，獲得試管種。再將試管種接種到250mL三角瓶(每瓶裝IOOmL)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為 以重量百分比計(jì)，含有牛肉浸膏0. 2%、蛋白胨1%、酵母浸膏0. 5%、蔗糖1%、余下為蒸餾 7jC, pH為8。在25°C下培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速以180r · mirT1、發(fā)酵48h，形成的發(fā)酵液或發(fā)酵液的 制成品可以直接或間接處理大豆種子。被處理的大豆種子可以在早春低溫播種種植在土壤 中，并且在大豆苗期時(shí)可以抵抗大豆胞囊線蟲病的為害。
實(shí)施例3 巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium) Sneb69的發(fā)酵基本同實(shí)施例一，不同之處是將液體培養(yǎng)的菌種接種到1000L的發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā) 酵，在25°C下培養(yǎng)，pH為8，發(fā)酵48h。實(shí)施例4 巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium) Sneb69的發(fā)酵基本同實(shí)施例一，不同之處是液體培養(yǎng)基配方，其配方為以重量百分比計(jì)，含有牛肉浸膏0. 3%、蛋白胨1%、酵母浸膏0. 1%、蔗糖2%、余 下為蒸餾水，PH為7。實(shí)施例5 巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium) Sneb69發(fā)酵產(chǎn)品的使用將發(fā)酵液稀釋為106cfu/L，按1 50的比例處理包衣大豆種子，晾干后，將處理過 的大豆種子播種在遼寧省康平縣，黑龍江省大慶市兩地自然發(fā)病土壤中，進(jìn)行5次重復(fù)試 驗(yàn)以NA液體培養(yǎng)基處理為對照。試驗(yàn)田為重茬大豆田。35d后從根上胞囊量、土中胞囊量、 根內(nèi)線蟲量三個(gè)方面調(diào)查發(fā)現(xiàn)對大豆胞囊線蟲有顯著的抑制作用，且在不同地區(qū)不同重復(fù) 中均保持穩(wěn)定的抗病能力。(如下表)
權(quán)利要求
1.一株處理大豆種子后具有誘導(dǎo)大豆產(chǎn)生抗逆性的細(xì)菌菌株，其特征在于該菌株為 巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)Sneb69，已于2010年11月02日保藏在中國微生物 菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No. 4296。
2.具有誘導(dǎo)大豆產(chǎn)生抗逆性的細(xì)菌代謝物，其特征在于，是由權(quán)利要求1所述的細(xì)菌 菌株經(jīng)過液體發(fā)酵后形成的發(fā)酵液制備的，液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為以重量百分比計(jì)，含有 牛肉浸膏0. 2% -0. 4%、蛋白胨_2%、酵母浸膏0. 1%-0. 5%、蔗糖_2%、余下為蒸 餾水，PH為7-9。
3.權(quán)利要求1所述的細(xì)菌菌株的液體發(fā)酵方法，其特征在于液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為 以重量百分比計(jì)，含有牛肉浸膏0.2% -0.4%、蛋白胨_2%、酵母浸膏0. 1% -0.5%, 蔗糖-2%、余下為蒸餾水，pH為7-9，發(fā)酵溫度為2548°C，搖床轉(zhuǎn)速150r · mirT1 200r · mirT1、發(fā)酵時(shí)間 45_50h。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的液體發(fā)酵方法，其特征在于所述的發(fā)酵時(shí)間為48h。
5.具有誘導(dǎo)大豆產(chǎn)生抗逆性的細(xì)菌代謝物的制備方法，其特征在于是由權(quán)利要 求1所述的細(xì)菌菌株經(jīng)過液體發(fā)酵后形成的發(fā)酵液制備的，液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為以 重量百分比計(jì)，含有牛肉浸膏0.2% -0.4%、蛋白胨1(%-2(%、酵母浸膏0.1(%-0.5(%、 蔗糖-2%、余下為蒸餾水，pH為7-9，發(fā)酵溫度為2548°C，搖床轉(zhuǎn)速150r · mirT1 200r · mirT1、發(fā)酵時(shí)間 45_50h。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述的發(fā)酵時(shí)間為48h。
7.一種用于發(fā)酵權(quán)利要求1所述的細(xì)菌菌株的培養(yǎng)基，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng) 基配方為以重量百分比計(jì)，含有牛肉浸膏0.2% -0.4%、蛋白胨1%-2(%、酵母浸膏 0. 1% -0. 5%、蔗糖_2%、余下為蒸餾水。
8.權(quán)利要求7所述的培養(yǎng)基，其特征在于培養(yǎng)基的pH為7-9。
9.一種大豆種子處理劑，其特征在于，包含有效量的權(quán)利要求1所述的細(xì)菌菌株或權(quán) 利要求2所述的細(xì)菌代謝物作為活性成分，用于誘導(dǎo)大豆產(chǎn)生對低溫及大豆胞囊線蟲病的 抗性。
10.權(quán)利要求1所述的細(xì)菌菌株或權(quán)利要求2所述的細(xì)菌代謝物在誘導(dǎo)大豆抗寒及抗 大豆胞囊線蟲病中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株處理大豆種子后具誘導(dǎo)大豆抵御早春低溫和大豆胞囊線蟲病的巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)Sneb69的培養(yǎng)方法及其應(yīng)用，屬于微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及的細(xì)菌菌株Sneb69，已于2010年11月02日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No.4296。通過液體發(fā)酵培養(yǎng)制備，其代謝物處理大豆種子后，大豆能夠抵御早春低溫和大豆胞囊線蟲病。通過該細(xì)菌的代謝產(chǎn)物處理后的大豆可以在早春播種，并且在大豆胞囊線蟲病發(fā)生嚴(yán)重的土壤中也能生長。解決了高緯度地區(qū)全年大豆生長的有效積溫少，適宜大豆生長的季節(jié)短的難題，具良好的應(yīng)用開發(fā)前景。
文檔編號(hào)C12R1/11GK102108339SQ201010560329
公開日2011年6月29日 申請日期2010年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月26日
發(fā)明者朱曉峰, 段玉璽, 王媛媛, 陳立杰, 黃姍姍 申請人:沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)