專利名稱：一株具誘導大豆抗寒的銅綠假單胞菌及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于微生物農(nóng)藥技術領域，具體涉及一種誘導大豆抗寒的銅綠假單胞菌及 應用。
背景技術：
東北是我國大豆主產(chǎn)區(qū)，低溫是降低大豆產(chǎn)量的主要因子。大豆整個生育期的各 個階段都易出現(xiàn)冷害，從而降低產(chǎn)量和品質，尤其萌發(fā)初期對低溫敏感。在早春下播種時， 由于低溫常容易引起出苗時間延長造成畸形苗，或者種子霉爛變質而喪失發(fā)芽能力，造成 大豆減產(chǎn)，為此加強大豆出苗耐低溫性的相關研究對大豆生產(chǎn)具有積極的意義。采用施放 煙霧、地膜覆蓋、抗寒力強的品種或晚熟品種適時早播等措施可提高植物的抗寒力，但都有 局限性。目前提高大豆抗寒性的方法是使用一些化學物質或者抗寒劑等，這對作物品質和 土壤可能會造成一定的影響。由于人們環(huán)境保護意識的提高，而大部分的誘導物對環(huán)境無 污染，并且誘導抗性具有廣譜、持續(xù)時間較長、抗性表達時間和空間的相對可控性等特點。 這些特點決定了植物誘導抗性具有良好的應用前景。利用細菌作為生物防治因子防治植物 病害已成為國內外生物防治研究中的一個熱點。PGPR的促生防病研究已成為熱點方向之一，其研究主要集中在假單胞菌和芽孢桿 菌類，該類群能夠抑制多種植物病害特別是土傳病害。作用機理主要包括有效根部定殖、抗 生作用、根際營養(yǎng)競爭、分泌降解病原微生物的酶等。因此，PGI^R制劑在農(nóng)林牧業(yè)、環(huán)境保 護等方面具有重大應用潛力和價值。據(jù)此本研究旨在提出創(chuàng)新思路，篩選出可誘導大豆產(chǎn)生系統(tǒng)抗寒性的細菌菌株用 以抵抗低溫。該研究將為控制低溫冷害提供新思路和新方法，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、尤其是大豆生產(chǎn) 起到絕對的推動作用，具有重要的理論意義和實際應用價值。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是獲得一株可誘導大豆在種子萌發(fā)和生長期間能抵抗低溫的菌株， 將菌株按常規(guī)液體發(fā)酵培養(yǎng)后，可以用該菌或該菌的代謝產(chǎn)物，開發(fā)出處理大豆種子的種 子處理劑，經(jīng)過處理的大豆種子可以使大豆抵御早春低溫。本發(fā)明篩選獲得的一株細菌菌株是銅綠假單胞菌(I^eudomonas aeruginosa) Snebl79，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址中國.北京市 朝陽區(qū)北辰西路1號院3號；保藏日期2010年11月02日；保藏登記入冊的編號=CGMCC No. 4295。銅綠假單胞菌是從大量土壤細菌菌株中篩選出的一株對大豆具有強誘導活性的 細菌菌株。銅綠假單胞菌O^seudomonas aeruginosa) Snebl79該菌株是黃姍姍于2008年 7月從中國遼寧省沈陽市沈陽農(nóng)業(yè)大學試驗田土壤細菌菌株中篩選出的一個細菌菌株。本發(fā)明通過研究發(fā)現(xiàn)，土壤細菌有很多株細菌都具有一定的活性，從這些細菌中 篩選出一株性狀相對較好的菌株銅綠假單胞菌O^seudomonas aeruginosa) Snebl79進行了 進一步的研究。
本發(fā)明還涉及用于誘導大豆種子的細菌代謝物，其是由本發(fā)明的細菌菌株銅綠假 單胞菌O^seudomonas aeruginosa) Snebl79經(jīng)過常規(guī)的液體發(fā)酵培養(yǎng)后提取制備的。本發(fā)明的細菌菌株銅綠假單胞菌O^seudomonas aeruginosa) Snebl79是通過試管 種培養(yǎng)后，再經(jīng)擴大發(fā)酵培養(yǎng)來制備，其具體方法如下1.試管種培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為牛肉膏蛋白胨(NA)培養(yǎng)基，即成分牛肉浸膏3g，蛋白胨10g，酵母 浸膏l(xiāng)g，蔗糖10g，瓊脂20g，加水至IOOOmL02.液體發(fā)酵培養(yǎng)其中液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為以重量百分比計，含有牛肉浸膏0. 2% -0. 4%、蛋白 胨_2%、酵母浸膏0. 1% -0.5%、蔗糖_2%、余下為蒸餾水，pH為7-9。將試管種接種到250mL三角瓶(每瓶裝IOOmL)液體培養(yǎng)基中，25°C 下，搖 床轉速以150r · mirT1 200r · mirT1、發(fā)酵45-50小時。液體發(fā)酵的菌種可以通過大型發(fā)酵罐進行規(guī)模生產(chǎn)，其產(chǎn)品為發(fā)酵液或發(fā)酵液的 制成品。本發(fā)明還涉及一種大豆種子處理劑，其包含有效量的本發(fā)明所述的銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) Snebl79本身或其代謝物作為有效活性成分。本發(fā)明的銅綠假單胞菌O^seudomonas aeruginosa) Snebl79或其代謝物具有對大 豆的誘導活性，可用于大豆的種子處理，處理后的大豆可以在苗期抵御早春低溫的侵害，解 決東北高緯度地區(qū)全年大豆生長的有效積溫少，適宜大豆生長的季節(jié)短的情況。
具體實施例方式為了更詳細地進一步闡明而不是為了限制本發(fā)明，給出了下列實施例。實施例1 銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) Snebl79 的獲得取大豆田的土壤lg，加入無菌水100ml，取200 μ 1，加入冷卻至35°C以下的滅菌的 20ml NA液體培養(yǎng)基，25°C下培養(yǎng)待菌落長出后，根據(jù)菌落色澤和邊緣狀態(tài)，挑取銅綠假單 胞菌(I^eudomonas aeruginosa)菌落單獨保存，進行擴繁和生理生化測定，培養(yǎng)性狀符合 銅綠假單胞菌O^seudomonas aeruginosa)特征的保存?zhèn)溆?。實施? 銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) Snebl79 的培養(yǎng)首先對銅綠假單胞菌O^seudomonas aeruginosa) Snebl79菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，然 后對發(fā)酵培養(yǎng)后的代謝產(chǎn)物進行大豆誘導活性試驗，確定其對大豆的誘導作用。將銅綠假單胞菌O^seudomonas aeruginosa) Snebl79的菌體接種到試管瓊脂培養(yǎng) 基上，培養(yǎng)基配方為NA培養(yǎng)基，即成分牛肉浸膏3g，蛋白胨10g，酵母浸膏l(xiāng)g，蔗糖10g，瓊 脂20g，加水至IOOOmL0 25°C培養(yǎng)10d，獲得試管種。再將試管種接種到250mL三角瓶(每瓶裝IOOmL)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為 以重量百分比計，含有牛肉浸膏0. 2%、蛋白胨1%、酵母浸膏0. 5%、蔗糖1%、余下為蒸餾 7jC, pH為8。在25°C下培養(yǎng)，搖床轉速以180r · mirT1、發(fā)酵48h，形成的發(fā)酵液或發(fā)酵液的 制成品可以直接或間接處理大豆種子。被處理的大豆種子可以在早春低溫播種種植在土壤 中，抵御早春低溫。
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實施例3 銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) Snebl79 的發(fā)酵基本同實施例一，不同之處是將液體培養(yǎng)的菌種接種到1000L的發(fā)酵罐進行發(fā) 酵，在25°C下培養(yǎng)，pH為8，發(fā)酵48h。實施例4 銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) Snebl79 的發(fā)酵基本同實施例一，不同之處是液體培養(yǎng)基配方，其配方為以重量百分比計，含有牛肉浸膏0. 3%、蛋白胨1%、酵母浸膏0. 1%、蔗糖2%、余 下為蒸餾水，PH為7。實施例5 銅綠假單胞菌O^seudomonas aeruginosa) Snebl79發(fā)酵產(chǎn)品的使用用濃度為103cfu/ml、106cfu/ml、109cfu/ml發(fā)酵液按1 50的比例處理包衣大豆 種子，晾干后做發(fā)芽試驗，30粒/皿，5次重復，每天夜間低溫(設兩組，一組為O 2°C，一 組為2 4°C )處理12h，白天(15 20°C )處理12h。處理7d。4d后記錄發(fā)芽勢，7d后記 錄發(fā)芽率和畸形率。試驗結果發(fā)現(xiàn)在O 2°C，用濃度為106cfu/ml和103cfu/ml的Snebl79 包衣后發(fā)芽勢和發(fā)芽率均明顯高于對照，畸形率均明顯低于對照。在2 4°C，用濃度為 103CfU/ml的Snebl79包衣后發(fā)芽勢和發(fā)芽率明顯高于對照，畸形率明顯低于對照。(如下 表)
權利要求
1.一株處理大豆種子后具有誘導大豆產(chǎn)生抗寒性的細菌菌株，其特征在于該菌株為 銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) Snebl79,已于2010年11月02日保藏在中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 4295。
2.具有誘導大豆產(chǎn)生抗寒性的細菌代謝物，其特征在于，是由權利要求1所述的細菌 菌株經(jīng)過液體發(fā)酵后形成的發(fā)酵液制備的，液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為以重量百分比計，含有 牛肉浸膏0. 2% -0. 4%、蛋白胨_2%、酵母浸膏0. 1%-0. 5%、蔗糖_2%、余下為蒸 餾水，PH為7-9。
3.權利要求1所述的細菌菌株的液體發(fā)酵方法，其特征在于液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為 以重量百分比計，含有牛肉浸膏0.2% -0.4%、蛋白胨_2%、酵母浸膏0. 1% -0.5%, 蔗糖-2%、余下為蒸餾水，pH為7-9，發(fā)酵溫度為2548°C，搖床轉速150r · mirT1 200r · mirT1、發(fā)酵時間 45_50h。
4.根據(jù)權利要求3所述的液體發(fā)酵方法，其特征在于所述的發(fā)酵時間為48h。
5.具有誘導大豆產(chǎn)生抗寒性的細菌代謝物的制備方法，其特征在于是由權利要 求1所述的細菌菌株經(jīng)過液體發(fā)酵后形成的發(fā)酵液制備的，液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為以 重量百分比計，含有牛肉浸膏0.2% -0.4%、蛋白胨1(%-2(%、酵母浸膏0.1(%-0.5(%、 蔗糖-2%、余下為蒸餾水，pH為7-9，發(fā)酵溫度為2548°C，搖床轉速150r · mirT1 200r · mirT1、發(fā)酵時間 45_50h。
6.根據(jù)權利要求5所述的制備方法，其特征在于所述的發(fā)酵時間為48h。
7.一種用于發(fā)酵權利要求1所述的細菌菌株的培養(yǎng)基，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng) 基配方為以重量百分比計，含有牛肉浸膏0.2% -0.4%、蛋白胨1%-2(%、酵母浸膏 0. 1% -0. 5%、蔗糖_2%、余下為蒸餾水。
8.權利要求7所述的培養(yǎng)基，其特征在于培養(yǎng)基的pH為7-9。
9.一種大豆種子處理劑，其特征在于，包含有效量的權利要求1所述的細菌菌株或權 利要求2所述的細菌代謝物作為活性成分，用于誘導大豆抵御早春低溫。
10.權利要求1所述的細菌菌株或權利要求2所述的細菌代謝物在誘導大豆抗寒中的 應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株處理大豆種子后具誘導大豆抵御早春低溫的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)Sneb179的培養(yǎng)方法及其應用，屬于微生物農(nóng)藥技術領域。本發(fā)明涉及的細菌菌株Sneb179，已于2010年11月02日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.4295。通過液體發(fā)酵培養(yǎng)制備，其代謝物處理大豆種子后，大豆能夠抵御早春低溫。通過該細菌的代謝產(chǎn)物處理后的大豆可以在早春播種，具有一定的抗寒性。解決了高緯度地區(qū)全年大豆生長的有效積溫少，適宜大豆生長的季節(jié)短的難題，具良好的應用開發(fā)前景。
文檔編號C12N1/20GK102108338SQ201010560320
公開日2011年6月29日 申請日期2010年11月26日 優(yōu)先權日2010年11月26日
發(fā)明者朱曉峰, 段玉璽, 王媛媛, 陳立杰, 黃姍姍 申請人:沈陽農(nóng)業(yè)大學