一種利用銅綠假單胞菌高效降解高效氯氰菊酯的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種利用銅綠假單胞菌高效降解高效 氯氯菊醋的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 高效氯氯菊醋是一種常用的二代擬除蟲(chóng)菊醋類(lèi)農(nóng)藥，具有耐光、熱分解的特點(diǎn)，在 ±壤中的半衰期長(zhǎng)達(dá)94. 2~1103天。該農(nóng)藥已被廣泛用于防治作物害蟲(chóng)及家庭衛(wèi)生害蟲(chóng)， 是目前農(nóng)藥市場(chǎng)上的主要品種之一。隨著該農(nóng)藥的大量、頻繁使用及使用時(shí)間的延長(zhǎng)，高效 氯氯菊醋農(nóng)藥殘留問(wèn)題日益凸顯。近年來(lái)，高效氯氯菊醋在地表水和城市污水中頻頻被檢 出，也是我國(guó)蔬菜、水果中主要檢出農(nóng)藥之一。不僅如此，大量研究發(fā)現(xiàn)，高效氯氯菊醋殘留 對(duì)非祀標(biāo)生物具有嚴(yán)重的危害，如對(duì)一些有益昆蟲(chóng)如家蠶、蜜蜂和赤眼蜂等造成了極大危 害，對(duì)魚(yú)類(lèi)和水生無(wú)脊椎動(dòng)物具有很高的毒性，對(duì)人類(lèi)和其他哺乳動(dòng)物具有細(xì)胞毒性、神經(jīng) 毒性和生殖毒性，長(zhǎng)期接觸或攝入可誘發(fā)一序列慢性疾病，甚至有致癌、致崎、致突變的危 險(xiǎn)。
[0003] 高效氯氯菊醋殘留污染不僅導(dǎo)致食品安全問(wèn)題，同時(shí)給生態(tài)環(huán)境帶來(lái)嚴(yán)重污染， 甚至危害到人體健康。因此，消除環(huán)境及農(nóng)產(chǎn)品中高效氯氯菊醋的殘留污染已成為科研工 作者亟待解決的具有重大經(jīng)濟(jì)和社會(huì)意義的科研命題。W微生物為主體的生物修復(fù)技術(shù) (bioremediation)可用于降解各種環(huán)境污染物。生物修復(fù)技術(shù)與傳統(tǒng)物理、化學(xué)處理方法 相比具有操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)，擁有廣闊的應(yīng)用前景。但是，現(xiàn)有技術(shù)中 已報(bào)道的可降解高效氯氯菊醋的微生物降解效率低且不穩(wěn)定，而且微生物降解環(huán)境中高效 氯氯菊醋受到諸多條件影響，如微生物菌種接種量、溫度、pH、濕度和污染環(huán)境等等。因此， 篩選高效降解菌并優(yōu)化其降解工藝條件，使其降解效果達(dá)到最大化是科研工作者迫切需要 解決的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)中利用微生物降解高效氯氯菊醋的 效率低的缺陷，提供一種利用銅綠假單胞菌高效降解高效氯氯菊醋的方法。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過(guò)W下技術(shù)方案予W實(shí)現(xiàn)的： 一種利用銅綠假單胞菌高效降解高效氯氯菊醋的方法，即將銅綠假單胞菌PA01在溫 度30.6 ° C、pH 7. 7和接種量為0.2 g/L的條件下降解高效氯氯菊醋；所述銅綠假單胞菌 PA01于2014年12月5日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中也（CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCC NO: M 2014630,保藏地址為湖北省武漢市武漢大學(xué)。
[000引 所述銅綠假單胞菌aerwinosa)菌株P(guān)A01通過(guò)富集培養(yǎng)法對(duì)野生 型菌株進(jìn)行反復(fù)篩選復(fù)壯而來(lái)，使其具有高度耐藥、降解穩(wěn)定的能力。
[0007] 所述銅綠假單胞菌（Aew/offlmas aeru知fliosa)菌株P(guān)A01在LB固體平板中生長(zhǎng) 較快，菌落形態(tài)為黃綠色、中央凸起、邊緣扁平。通過(guò)生理生化特性測(cè)定，顯示該菌株屬于革 蘭氏陰性桿菌，好養(yǎng)，氧化酶、明膠液化、硝酸鹽還原反應(yīng)陽(yáng)性；剛巧反應(yīng)陰性。該菌可分解 利用葡萄糖和木糖；不分解利用藏糖和乳糖。
[0008] 本發(fā)明通過(guò)響應(yīng)曲面法優(yōu)化了銅綠假單胞菌PA01降解高效氯氯菊醋的降解工藝 條件，響應(yīng)曲面法可W減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)，同時(shí)可進(jìn)行因子的單次效應(yīng)、二次效應(yīng)W及交互效應(yīng) 的分析，因此用響應(yīng)曲面法可W快速獲得菌株P(guān)A01降解高效氯氯菊醋的最優(yōu)降解工藝條 件。
[0009] 具體地，所述響應(yīng)曲面法優(yōu)化包含W下步驟： 51. 將菌株P(guān)A01進(jìn)行單因素降解試驗(yàn)，通過(guò)依次改變影響降解率的因素，如溫度、抑 值、菌種接種量、裝液量、振蕩速率，測(cè)定菌株P(guān)A01對(duì)高效氯氯菊醋降解率，確定影響菌株 PA01降解率的顯著因素； 52. 選取顯著因素進(jìn)行響應(yīng)曲面優(yōu)化設(shè)計(jì)（Response Surface Methodology, RSM),根 據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原則進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，W顯著因素為自變量（屯也名)，W高效氯氯菊 醋降解率為響應(yīng)值（K)，建立多元二次回歸方程： K = 92. 53 + 1. 48Zi + 1. 46^2 + 1. 89名-6. 37杳-0. 43術(shù)乂2 + 0. 13Zi名-4. 29杳 -0. 35^2名-2. 09名2 53. 利用SAS 9.0統(tǒng)計(jì)軟件根據(jù)多元二次回歸方程進(jìn)行繪圖分析，得到回歸方程的響 應(yīng)曲面圖及其等高線(xiàn)圖； 54. 對(duì)多元二次回歸方程求一階偏導(dǎo)，通過(guò)解方程得到該模型的極值點(diǎn)，即理論最優(yōu)降 解工藝條件；溫度30. 6。C、pH 7. 7和菌種接種量0. 2 g/L。
[0010] 優(yōu)選地，所述銅綠假單胞菌PA01降解高效氯氯菊醋的時(shí)間為5 d。
[0011] 優(yōu)選地，所述銅綠假單胞菌PA01的基礎(chǔ)培養(yǎng)基組分為；2g (NH4)2S04、0. 2g M拆〇4、 0.0 lg CaCl2、0. 005g FeS〇4、0. 002g MnCl2、10. 5g 馬冊(cè)〇4、4. 5g K&PO"蒸觸水 1000 血，調(diào) 整培養(yǎng)基的抑為7. 7。
[0012] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有W下有益效果： 本發(fā)明提供了一種利用銅綠假單胞菌高效降解高效氯氯菊醋的方法，即將銅綠假單胞 菌PA01在溫度30. 6 ° C、pH 7. 7的條件下降解高效氯氯菊醋，所述銅綠假單胞菌PA01的 接種量為0. 2 g/L ;利用上述降解工藝條件，菌株P(guān)A01對(duì)100 y g/血的高效氯氯菊醋的降 解率達(dá)90% W上；本發(fā)明所述方法可W為W后大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用提供理論實(shí)踐依據(jù)，具有廣 泛的意義。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1.主要因子影響菌株P(guān)A01降解效果的預(yù)測(cè)模型。
[0014] 圖2.溫度與抑交互影響菌株P(guān)A01降解效果的響應(yīng)曲面圖（a)及其等高線(xiàn)圖 (b)。
[001引圖3.抑與接種量交互影響菌株P(guān)A01降解效果的響應(yīng)曲面圖（a)及其等高線(xiàn)圖 (b)。
[0016] 圖4.溫度與接種量交互影響菌株P(guān)A01降解效果的響應(yīng)曲面圖（a)及其等高線(xiàn)圖 (b)。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本 發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的簡(jiǎn)單 修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍；若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù) 人員所熟知的常規(guī)手段。
[0018] 本發(fā)明所述菌株降解高效氯氯菊醋的實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下： 菌株的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；2g (NH4)2S04、0. 2g M拆〇4、0.0 lg CaCl2、0. 005g FeS〇4、0. 002g MnCl2、10. 5g馬冊(cè)〇4、4. 5g K&PO"蒸觸水1000 mL，調(diào)整培養(yǎng)基的抑為7. 7。
[0019] 在菌株的液體培養(yǎng)基中加入高效氯氯菊醋進(jìn)行菌株P(guān)AOl降解高效氯氯菊醋的實(shí) 驗(yàn)，應(yīng)用高效液相色譜法（HPLC)測(cè)定菌株P(guān)A01對(duì)高效氯氯菊醋的降解率。
[0020] 實(shí)施例1單因素考察實(shí)驗(yàn) 選取溫度、pH值、菌種接種量、裝液量、振蕩速率作為影響農(nóng)藥降解率的主要因素，并依 次改變上述各個(gè)因素，考察降解菌皿was aerwiniosa PA01 (銅綠假單胞菌PA01)對(duì) 高效氯氯菊醋的降解效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，溫度、抑值和菌種接種量該H個(gè)因素對(duì)高效氯氯菊醋 的降解率影響顯著。
[0021] 實(shí)施例2響應(yīng)曲面優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取溫度、抑值和菌種接種量該H個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)曲面優(yōu)化設(shè) 計(jì)，利用SAS 9. 0統(tǒng)計(jì)軟件根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原則進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)，W溫度U；)、 抑值Op和菌種接種量（名）為自變量，W高效氯氯菊醋的降解率為響應(yīng)值（巧，建立多元 二次回歸方程： K = 92. 53 + 1. 48Zi + 1. 46^2 + 1. 89名-6. 37杳-0. 43術(shù)乂2 + 0. 13Zi名-4. 29杳 -0. 35^2名-2. 09名2
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種利用銅綠假單胞菌高效降解高效氯氰菊酯的方法，其特征在于，將銅綠假單胞 菌PAOl在溫度30.6 ° C、pH 7. 7和接種量為0.2 g/L的條件下降解高效氯氰菊酯，所述銅 綠假單胞菌PAOl于2014年12月5日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC M 2014630。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述銅綠假單胞菌PAOl降解高效氯氰菊 酯的工藝條件由響應(yīng)曲面優(yōu)化設(shè)計(jì)得到。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述銅綠假單胞菌PAOl降解高效氯氰菊 酯的時(shí)間為5 d。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述銅綠假單胞菌PAOl的 基礎(chǔ)培養(yǎng)基組分為：2g (NH4)2S04、0.2g MgS04、0.01g CaCl2、0.005g FeS04、0.002g MnCl2、 10. 5g K2HP04、4. 5g KH2PO4,蒸餾水 1000 mL，調(diào)整培養(yǎng)基的 pH 為 L 7。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體公開(kāi)了一種利用銅綠假單胞菌高效降解高效氯氰菊酯的方法，即將銅綠假單胞菌PAO1在溫度30.6℃、pH7.7和接種量為0.2g/L的條件下降解高效氯氰菊酯，利用上述降解條件，菌株P(guān)AO1對(duì)100μg/mL的高效氯氰菊酯的降解率達(dá)90%以上；本發(fā)明所述方法可為以后大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用提供理論實(shí)踐依據(jù)，具有廣泛的意義。CCTCC NO：M201463020141205
【IPC分類(lèi)】C02F101-38, C12N1-20, C02F3-34, C12R1-385, B09C1-10
【公開(kāi)號(hào)】CN104671430
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410774236
【發(fā)明人】陳少華, 廖立勝, 崔紫寧, 周佳暖, 賀飛
【申請(qǐng)人】華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年6月3日
【申請(qǐng)日】2014年12月16日