專利名稱：固氮魚(yú)腥藻乙酰乳酸合酶基因的核苷酸序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物技術(shù)領(lǐng)域的基因序列，具體是一種固氮魚(yú)腥藻乙酰乳酸 合酶基因(ilvB)的核苷酸序列。
背景技術(shù)：
植物氨基酸合成中的關(guān)鍵酶一直是新型除草劑研發(fā)中重要的靶標(biāo)酶，在除草劑的 研究和應(yīng)用領(lǐng)域中，通過(guò)抑制氨基酸生物合成中關(guān)鍵酶的活性而發(fā)生作用的除草劑占很大 比重，而靶標(biāo)乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制劑類除草劑是目前開(kāi)發(fā)最活躍的領(lǐng)域之一。ALS抑 制劑具備生物活性高、殺草譜廣的優(yōu)點(diǎn)，由于其作用靶標(biāo)ALS酶不涉及人和動(dòng)物，因此該種 除草劑對(duì)人和動(dòng)物具有很高的安全性。乙酰乳酸合酶(acetolactate synthetase, ALS)，也稱乙酰羥酸合酶 (acetohydroxyacid synthetase，AHAS)，是支鏈氨基酸合成中的一個(gè)關(guān)鍵酶(Gaston S, Ribas-Carbo Μ, Busquets S,et al. Changes in mitochondrial electron partitioning in response to herbicides inhibiting branched—chain amino acid biosynthesis in soybean [J], Plant Physiology, 2003,133 :1351-1359.)。在纈氨酸和亮氨酸的合成中催化 二分子丙酮酸生成乙酰乳酸和二氧化碳，在異亮氨酸的合成中催化一分子丙酮酸與一分子 丁酮酸生成 2-乙醛基-2-羥基丁酸和二氧化碳(DugglebyR G，Pang S S. Acetohydroxyacid synthase[J]. Journal of Biochemistry and Molecular Biology，2000，33 :1_36. )。ALS 酶活性受到抑制，將造成支鏈氨基酸合成受阻，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)合成及植物生長(zhǎng)(Grandpmo J A,Peter J M. Inhibitors of branched—chain amino acid biosynthesis as potential antitaberculossis methyl[J]. Journal of Antimicrobial Chemotherapy,1998,42 475-482.)。固氮魚(yú)腥藻(Anabaena azotica)作為我國(guó)農(nóng)田中藏量豐富的優(yōu)質(zhì)資源，在生物 固氮、固碳、減排作用上具有極大的潛力和應(yīng)用價(jià)值。它能固定大氣中的游離氮并能合成 各種氮化物，固氮量達(dá)10-51N kg/ha，其藻體沉入土壤后被作物根系吸收，能改善土壤肥力 和結(jié)構(gòu)，不污染土壤、水與環(huán)境，其特有的藻促生長(zhǎng)素能促進(jìn)作物茁壯生長(zhǎng)(Vaishampagan A. , Sinha R. P. , Hader D.P., and Dey Τ. Cyanobacterial bio-fertilizers in rice agriculture. Botanical Review, 2001,67 :453_460.)。近年來(lái)，固氮藍(lán)藻的卓越生態(tài)功能 和其在精細(xì)化學(xué)品、清潔能源以及作為模式生物等方面的廣泛用途而倍受國(guó)內(nèi)外學(xué)者的青 睞。由于固氮藍(lán)藻具有與高等植物相似的光合系統(tǒng)及其靶標(biāo)ALS酶，ALS抑制劑類除草劑 在防除雜草的同時(shí)，必定對(duì)環(huán)境中，尤其是水環(huán)境中的固氮藍(lán)藻產(chǎn)生影響。但ALS抑制劑除 草劑如何作用于固氮藍(lán)藻靶標(biāo)ALS酶，其致毒分子機(jī)理怎樣至今尚未清楚。作為ALS抑制劑類除草劑的作用位點(diǎn)，ALS及其基因一直是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究的 熱點(diǎn)。ALS基因是一個(gè)十分保守的基因，這就決定著ALS功能的重要性和不可替代性，在生 物的進(jìn)化過(guò)程中作用突出。自在E. coli中被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，目前已報(bào)道來(lái)源于50多個(gè)不同生 物的ALS基因。其中酵母ALS基因的克隆、原核表達(dá)、純化和部分氨基酸的功能得到了系統(tǒng)的研究；煙草的ALS基因在E. coli中得以成功表達(dá)。但至今對(duì)固氮藍(lán)藻ALS基因的克隆、 表達(dá)和功能的研究未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種固氮魚(yú)腥藻乙酰乳酸合酶基 因的核苷酸序列。本發(fā)明公開(kāi)固氮魚(yú)腥藻(Anabaena azotica)基因組中一種編碼ALS酶的 基因ilvB的核苷酸序列及其蛋白質(zhì)序列，提供該基因的克隆和異源表達(dá)的方法，建立ALS 外源表達(dá)體系，并對(duì)該基因進(jìn)行了初步功能分析和表達(dá)蛋白的活性測(cè)定，對(duì)于新型除草劑 的分子藥物設(shè)計(jì)、酶抑制農(nóng)藥殘留速測(cè)以及固氮藍(lán)藻抗性種質(zhì)資源研究等方面具有重要的 指導(dǎo)作用。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明所提供的一種分離出的DNA分子，該分子編碼具有固氮魚(yú)腥藻乙酰乳酸合 酶蛋白質(zhì)活性的核苷酸序列，所述的序列具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的多肽，該多 肽由547個(gè)氨基酸組成，分子量為59. 292kDa;所述的序列具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸 序列。本發(fā)明還涉及如上述的固氮魚(yú)腥藻乙酰乳酸合酶基因的核苷酸序列，其克隆和表 達(dá)的方法，包括以下步驟①?gòu)墓痰~(yú)腥藻(Anabaena azotica)中提取總DNA，對(duì)其基因進(jìn)行克隆與測(cè)序；步驟①中所述的克隆與測(cè)序是指設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)體系、程序條件，通過(guò) PCR獲取ALS編碼基因ilvB，產(chǎn)物經(jīng)1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收后與pMD18_T Simple vector連接，得到重組質(zhì)粒，而后熱擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)E. coli DH5a,在含有Amp的LB平板上挑 取白色菌落，接種于含Amp的LB培養(yǎng)基中，抽提質(zhì)粒進(jìn)行PCR和酶切驗(yàn)證、測(cè)序。②設(shè)計(jì)去終止子下游引物，采用T7表達(dá)系統(tǒng)對(duì)固氮魚(yú)腥藻ALS基因進(jìn)行外源表 達(dá)，重組質(zhì)粒的篩選鑒定；步驟②中所述的篩選鑒定，選用載體pET_28a(+)，對(duì)重組子pMD18_ALS進(jìn)行EcoR I、Xho I雙酶切，膠回收后，通過(guò)T4DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)，進(jìn)行重組質(zhì) 粒的篩選鑒定。③通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)，鑒定重組菌表達(dá)產(chǎn)物的相對(duì)分子 質(zhì)量和表達(dá)量，確定目的蛋白。步驟③中所述的確定目的蛋白，其方法如下a.將鑒定為陽(yáng)性的重組菌按1 100比例接種于5ml培養(yǎng)液(含100 μ g/mL卡那 霉素)中，37°C振搖培養(yǎng)過(guò)夜，再取培養(yǎng)物200 μ 1接種于盛有20mlLB培養(yǎng)液(含100 μ g/ mL卡那霉素)的三角瓶中，振搖培養(yǎng)約2. 5h至0D600約為0. 6時(shí)，以IPTG進(jìn)行ALS的誘 導(dǎo)表達(dá)，并通過(guò)不同的濃度和時(shí)間的誘導(dǎo)確定優(yōu)化表達(dá)的條件，最終通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠 電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)推斷加入IPTG至終濃度為0. 6mmol/L、培養(yǎng)時(shí)間5h時(shí)蛋白表達(dá)量最 聞；b.以聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)鑒定重組菌表達(dá)產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量 和表達(dá)量，確定目的蛋白將誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌收集、離心、洗滌后，重懸于PBS中進(jìn)行反復(fù)凍融破碎，共約8次，期間加入微量溶菌酶至終濃度約為5mg/ml，對(duì)破碎后的細(xì)胞混合液離心(10，OOOr/ min, IOmin, 4°C )，然后取上清液。在上清液中按每IOOmL液體加入31. 3g硫酸銨晶體的比 例進(jìn)行蛋白質(zhì)的鹽析。0°C下鹽析2小時(shí)后，進(jìn)行離心(10，000r/min，30min，4°C )，然后棄 去上清液，留在離心管底部的即為ALS酶，加入適量酶溶解液攪拌溶解后黑暗下冰水浴中 保存?zhèn)溆?。步驟b中所述的離心所得沉淀即為包涵體，取少量包涵體作SDS — PAGE分析，觀 察重組蛋白的產(chǎn)量及破碎前后量的變化。同時(shí)以鎳柱親和層析進(jìn)行重組蛋白包涵體的純 化。④通過(guò)對(duì)ALS酶催化的以丙酮酸為底物的反應(yīng)后產(chǎn)物3-羥基-2-丁酮 (3-hydroxy-2-butanone, Acetoin)含量多少的測(cè)定 ALS 酶的活性；步驟④中所述的測(cè)定ALS酶的活性，包括步驟如下a.在離心管中加入0. 5mL酶液和0. 5mL酶反應(yīng)液?？瞻捉M加入0. 5mL100mmol/L 磷酸緩沖液和0. 5mL酶反應(yīng)液；b.搖勻后將各組試管同時(shí)放入37°C水浴中，水浴Ih后加入0. ImL的3mol/L硫酸， 作用是終止反應(yīng)；c.將試管轉(zhuǎn)入60°C水浴脫羧15min，然后加入0. 5mL0. 5%肌酸和0. 5mL5%甲萘酚 (溶于2. 5mol/L的NaOH溶液中)，作用是與產(chǎn)物Acetoin發(fā)生顯色反應(yīng)，保留在60°C水浴 中顯色15min ；d.顯色結(jié)束后將混合液移入比色皿，靜置30min后以對(duì)照為空白用722型光柵分 光光度計(jì)在525nm波長(zhǎng)處比色。結(jié)果用nmol3-羥基-2- 丁酮/mg(蛋白質(zhì))/h表示。經(jīng)本發(fā)明外源表達(dá)的固氮雨腥藻ALS酶比活力為134. 60。本發(fā)明目前乙酰乳酸合酶基因已公布的魚(yú)腥藻屬菌有Anabaena sp. PCC7120等， 通過(guò)在所克隆的固氮魚(yú)腥藻(Anabaena azotica)乙酰乳酸合酶基因兩端分別加上EcoR I、 Xho I限制酶識(shí)別序列，與經(jīng)相同限制酶消化的pMD18-T Simple Vector和pET28 (a) +連接 并轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆和表達(dá)宿主菌，實(shí)現(xiàn)了 ALS基因的克隆和外源表達(dá)。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌中的重組表達(dá)，可為深入研究固氮藍(lán)藻ALS酶的結(jié)構(gòu)和功 能部位，探索除草劑與靶分子的作用方式，在新型除草劑的分子藥物設(shè)計(jì)、酶抑制農(nóng)藥殘留 速測(cè)以及農(nóng)作物抗性種質(zhì)資源研究等方面具有重要的指導(dǎo)作用。本發(fā)明所涉及的固氮魚(yú)腥藻(Anabaena azotica)由中國(guó)科學(xué)院水生生物研 究所淡水藻種庫(kù)提供，并已在《Jianying Shen, Antonio DiTommaso, Mingquan Shen, Wei Lu, and ZhengmingLi ；Molecular basis for differential metabolic responses to monosulfuron in threenitrogen-fixing cyanobacteria, Weed Science,2009,57 178-188》等中公開(kāi)。本發(fā)明中所涉及的pMD18_T Simple Vector載體和菌株DH5 α基因工程菌已在 《陳秋晨，王琳，陳再興，王巖，孟繁浩，張岐山；大鼠血栓調(diào)節(jié)蛋白基因的克隆及在原核細(xì)胞 中的表達(dá)，中國(guó)生化藥物雜志，2008，30 (3) 171 177》中公開(kāi)，相關(guān)菌株可通過(guò)公開(kāi)市售 的商業(yè)渠道取得，如寶生物工程(大連)有限公司，公司地址遼寧省大連市經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā) 區(qū)東北二街19號(hào)。本發(fā)明中所涉及的帶有T7RNA聚合酶基因的菌株大腸桿菌BL21(DE3)已在《汪玲玲，楊輯，黃誠(chéng)之，王海洪；大腸桿菌holo-ACP的過(guò)表達(dá)、分離純化及長(zhǎng)鏈脂酰ACP的合成， 微生物學(xué)報(bào)，2008，48 (7) 963 969》中公開(kāi)，相關(guān)菌株可通過(guò)公開(kāi)市售的商業(yè)渠道取得， 如上海天根生物公司，公司地址上海市漕溪路258弄27號(hào)航星商務(wù)樓1號(hào)樓606室。


圖IALS基因PCR擴(kuò)增的瓊脂糖電泳結(jié)果M :DNA 標(biāo)準(zhǔn)分子量 SM0197 ；1、2、3 :PCR 溫度梯度依次為 48. 6°C >49. 4°C >50. 6°C 的
產(chǎn)物樣品編號(hào)圖2重組質(zhì)粒pMD18-ALS的雙酶切鑒定M :DNA 標(biāo)準(zhǔn)分子量 SM0197 ;N 空載體 pMD18-T Simple Vector ;1、2、3、4、5、6、7
重組子挑選質(zhì)粒提取樣品編號(hào)圖 3 固氮魚(yú)腥藻(Anabaena azotica)與 Anabaena sp. PCC7120 的 ALS 酶編碼序 列相似性比較圖4重組菌表達(dá)優(yōu)化條件及表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)M 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量；N 無(wú)ALS基因?qū)氲膒ET28(a) +轉(zhuǎn)化菌；0 未經(jīng)誘導(dǎo)的重 組菌產(chǎn)物；1、2、3、4、5 分別以0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. Ommol/L IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)產(chǎn)物圖5表達(dá)蛋白純化咪唑濃度選擇及檢測(cè)M 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量；L 樣品加入后穿透部分收集電泳條帶；0、1、2、3、4、5 咪唑 洗脫濃度分別為0、25、50、100、200、250mmol/L時(shí)蛋白純化效果圖6咪唑洗脫濃度為lOOmmol/L時(shí)蛋白純化效果M 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量；1、2、3、4、5、3C 依時(shí)間順序的洗脫收集體積(3C為3的重 復(fù)點(diǎn)樣)
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明以下實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為 前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施 例。下面實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè) (Molecular cloning :A laboratory manual,3rd ed. , Sambrook 等，Cold Spring Harbor Laboratory, 2001)和植物分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Plant Molecular Biology-Α Laboratory Manual, Clark等，Springer-Verlag，1997)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。以下實(shí)施例依據(jù)NCBI GenBank中已登錄的ALS基因序列，以“Primer Premier 5.0”軟件設(shè)計(jì)引物，提取藍(lán)藻總DNA，對(duì)ALS編碼基因PCR擴(kuò)增。采用pMD18_T Simple Vector載體和DH5 α基因工程菌進(jìn)行目的片段的克隆與測(cè)序，使用序列分析軟件DNAMAN對(duì) 所得序列進(jìn)行比較分析。以pET28(a) +載體和BL21(DE3)對(duì)ALS進(jìn)行外源表達(dá)，建立ALS酶 外源表達(dá)體系。對(duì)重組子PMD18-ALS進(jìn)行雙酶切，通過(guò)T4DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)入帶有T7RNA 聚合酶基因的大腸桿菌BL21 (DE3)，進(jìn)行重組質(zhì)粒pET-ALS的篩選鑒定。以IPTG進(jìn)行ALS 的誘導(dǎo)表達(dá)，并通過(guò)不同的濃度和時(shí)間的誘導(dǎo)確定優(yōu)化表達(dá)的條件。以聚丙烯酰胺凝膠電 泳(SDS-PAGE)檢測(cè)鑒定重組菌表達(dá)產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量和表達(dá)量，確定目的蛋白。以鎳柱 親和層析進(jìn)行重組蛋白包涵體的純化。
實(shí)施例1固氮魚(yú)腥藻ALS基因的克隆測(cè)序(1)藍(lán)藻總DNA的提取。操作步驟如下收集藻液于1. 5ml離心管中，離心 8000rpm, 5min。加入STE液，小心混勻后于室溫下放置lOmin，再次離心8000rpm，5min。棄 上清，加入裂解液，通過(guò)反復(fù)凍融藻液呈藍(lán)色狀。加入溶菌酶至終濃度為5mg/ml，37C水浴 放置30min。加入SDS至終濃度1 %，37C水浴lOmin。加入等體積的苯酚，氯仿異戊醇抽 提，37C水浴中放置5-10min，離心12000rpm, lOmin, 4°C (取上清液0. 5ml于另一離心管， 重復(fù)此步驟，直到溶液呈現(xiàn)很淡的紅色)。加入1/3體積的乙酸銨，2倍體積的異丙醇，混合 均勻，-20°C放置15min。12000rpm, 20min, 4°C離心，去上清液，加入400 μ L70%乙醇洗滌沉 淀，12000rpm, IOmin離心，重復(fù)上述步驟一次。干燥沉淀，加入30 50 μ L TE融解。(2)引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增。依據(jù)NCBI GenBank中已登錄的Anabaena sp. PCC7120ALS基因序列以及保守序列的比對(duì)，以“Primer Premier 5. O”軟件設(shè)計(jì)引物，進(jìn) 行ALS基因PCR擴(kuò)增(杭州博日科技TC-96型基因擴(kuò)增儀)上游弓丨物 5，ccggaattcatgaatacagcagaactgttag 3，Tm 69. 7下游弓I物 5，ccgctcgagctaaacagaacaacttaac 3，Tm :67· 5PCR反應(yīng)體系11管XBuffer 32 μ L, MgCl232 μ L, dNTP 6. 4 μ L，引物各 6. 4 μ L，DNA 聚合酶 3. 2 μ L， ddH20 204 μ L擴(kuò)增程序94°C3min ;94°C 45s，49°C lmin，72°C 2min ；72°C IOmin ;4°C保存。如圖1所示，PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳，切膠回收后清晰無(wú)雜帶(北京六一儀器廠， DYY-6C型電泳儀，DYCP-31DN型電泳槽)。將回收后的PCR產(chǎn)物與TaKaRa公司pMD18_T SimpleVector載體連接，以備轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞。(3)基因連接與轉(zhuǎn)化。感受態(tài)細(xì)胞的制備方法挑取大腸桿菌菌液，37°C，振蕩培 養(yǎng)5h ；吸取上述菌液Iml至Ep管，冰上放置lOmin，8000rpm離心4min棄上清，倒置離心管 控干液體；加入Iml預(yù)冷CaCl2溶液重懸于冰上30min ；8000rpm離心4min，加入60 μ LCaCl2 溶液，重懸于冰上。熱擊法轉(zhuǎn)化pMD18-ALS 加入5 μ L DNA樣品，搖勻，冰浴30min ；42°C，水浴90s ；放 置于冰上3min。加入800 μ L LB培養(yǎng)基，37°C，搖床放置lh。重組子的挑選與鑒定取100 μ L菌液涂于含有X-Gal和氨芐青霉素的LB平板， 37°C培養(yǎng)15h，挑取白色菌落，振蕩過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切和PCR檢測(cè)成功后送于上海 生工測(cè)序，如圖2所示。EcoR I和Xhol I對(duì)重組質(zhì)粒pMD18-ALS雙酶切，反應(yīng)體系如下 二種酶各 0. 5 μ L，Buffer 1 μ L,質(zhì)粒 DNA 4 μ L，ddH20 4 μ L。反應(yīng)時(shí)間 3h。(4)基因的測(cè)序分析。測(cè)序所得基因序列全長(zhǎng)1644bp，可編碼547個(gè)氨基酸 組成的蛋白質(zhì)序列。使用序列分析軟件DNAMAN對(duì)所得序列進(jìn)行比較分析，固氮魚(yú)腥藻 (Anabaenaazotica)與Anabaena sp. PCC7120的ALS酶編碼基因具有很高的同源性，高達(dá) 89. 54%,這一結(jié)果也說(shuō)明了在固氮藍(lán)藻中ALS編碼序列具有相對(duì)高的保守性，如圖3所示。實(shí)施例2固氮魚(yú)腥藻ALS酶外源表達(dá)載體pET-ALS的構(gòu)建設(shè)計(jì)去終止子下游引物序列
5， ccgctcgagaacagaacaacttaactcac 3，再次擴(kuò)增ALS基因，經(jīng)測(cè)序分析終止子序列TAG已去除，大量提取重組克隆質(zhì)粒， 以EcoRI和Xho I對(duì)重組質(zhì)粒pMD18-ALS雙酶切，切膠回收目的基因片段。同時(shí)振蕩培養(yǎng) 含pET28 (a) +空載體宿主菌，提取質(zhì)粒雙酶切，切膠回收大片段條帶。通過(guò)T4DNA連接酶將上述回收片段連接。連接體系10 μ L =DNA 5 μ L，載體3 μ L， Bufferl. 5 μ L,酶 0· 5 μ L0連接后轉(zhuǎn)入帶有T7RNA聚合酶基因的大腸桿菌BL21 (DE3)，進(jìn)行重組質(zhì)粒pET_ALS 的篩選鑒定。感受態(tài)細(xì)胞制備以及轉(zhuǎn)化方法同實(shí)施例1。實(shí)施例3固氮魚(yú)腥藻ALS酶外源誘導(dǎo)表達(dá)以IPTG進(jìn)行ALS的誘導(dǎo)表達(dá)，并通過(guò)不同的濃度和時(shí)間的誘導(dǎo)確定優(yōu)化表達(dá)的條 件。以聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)鑒定重組菌表達(dá)產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量和表達(dá) 量，確定目的蛋白。SDS-PAGE操作按常規(guī)分子學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)進(jìn)行。將鑒定為陽(yáng)性的重組菌按1 100比例接種于5ml培養(yǎng)液(含100 μ g/mL卡那霉 素)中，37°C振搖培養(yǎng)過(guò)夜；取培養(yǎng)物200 μ L接種于盛有20mlLB培養(yǎng)液(含100 μ g/mL卡 那霉素)的三角瓶中，200rpm振搖培養(yǎng)約3h至OD _約為0. 6時(shí)，加入IPTG使終濃度分 別為 0. 2mmol/L、0. 4mmol/L、0. 6mmol/L、0. 8mmol/L、l. Ommol/L，37°C誘導(dǎo)表達(dá) 5h，以確定 IPTG的最佳誘導(dǎo)濃度；在已確定的最適濃度下，于37°C分別誘導(dǎo)表達(dá)lh、3h、5h以確定最佳 誘導(dǎo)時(shí)間。分別取各實(shí)驗(yàn)組誘導(dǎo)表達(dá)菌液lml，12000rpm離心lmin，棄上清，于沉淀中加入 50 μ L，8mol/L尿素充分懸浮，室溫靜置0. 5h，加等體積的2*SDS_PAGE上樣緩沖液混勻，水 浴煮沸3min，進(jìn)行SDS-PAGE分析，參照蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)條帶判定結(jié)果，進(jìn)行重組蛋白相 對(duì)表達(dá)量的測(cè)定(北京六一儀器廠，DYY-6C型電泳儀，DYCZ-24D型電泳槽)。同時(shí)設(shè)未誘導(dǎo) 表達(dá)的該重組菌菌液為對(duì)照確定重組菌誘導(dǎo)表達(dá)優(yōu)化條件。經(jīng)分析，外源條帶大小在59KDa 左右，目的蛋白經(jīng)誘導(dǎo)后已大量表達(dá)，并且當(dāng)IPTG終濃度0. 6mmol/L時(shí)表達(dá)量最高，如圖4 所示，。實(shí)施例4外源重組表達(dá)ALS酶的活性測(cè)定通過(guò)反復(fù)凍融破碎細(xì)胞獲取包涵體以及含有可溶性表達(dá)蛋白的上清液。收集誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌全菌液，4°C，7500rpm離心lOmin，棄上清。分別用去離子 水和冰冷的l*PBS(pH7. 4)洗滌菌體沉淀各一次，每次4°C，7500rpm離心lOmin，棄上清。 按5mlPBS/100ml原菌液量重懸菌體沉淀，反復(fù)凍融破碎細(xì)胞，4°C，7500rpm離心lOmin， 即得上清液和包涵體沉淀。用細(xì)胞裂解液(50mmol/L Tris-HCl pH 8. 0U0mmol/L EDTA, 50mmol/LNaCl、0. 5% Triton-X 100)洗滌所得包涵體2到3次，去離子水洗滌1到2次，之 后將其置于一 20°C凍存?zhèn)溆?；IOOmL液體加入31. 3g硫酸銨晶體的比例對(duì)上清液中的蛋白 質(zhì)進(jìn)行鹽析。同時(shí)取少量包涵體和鹽析上清液蛋白作SDS — PAGE分析，觀察重組蛋白的產(chǎn)量及 破碎前后量的變化，得出在上清液中ALS蛋白含量較多。因表達(dá)載體pET-28 (a) +表達(dá)產(chǎn)物 含有組氨酸標(biāo)簽蛋白，對(duì)于重組蛋白包涵體的純化可用鎳柱親和層析進(jìn)行。本發(fā)明采用鎳親和層析試劑盒(上海生工BSP079，柱料為柱料為Ni-NTA His-Bind Resins)變性條件下 純化包涵體，具體洗脫步驟按操作手冊(cè)進(jìn)行。經(jīng)SDS-PAGE電泳圖片檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)咪唑濃度為 100mmol/L時(shí)洗脫純化效果最好，如圖5所示，因此取咪唑濃度為lOOmmol/L時(shí)收集的5管 再次點(diǎn)樣檢測(cè)，如圖6所示，。通過(guò)考馬斯亮藍(lán)測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)濃度(日本島津UV 2401型紫外分 光光度計(jì))。通過(guò)對(duì)ALS酶催化的以丙酮酸為底物的反應(yīng)后產(chǎn)物3-羥基-2-丁酮 (3-hydroxy-2-butanone, Acetoin)含量多少的測(cè)定來(lái)反映ALS酶的活性大小，步驟如下在試管中分別加入0. ImL不同濃度的待測(cè)藥劑溶液，再加入0. 5mL酶液和0. 5mL 酶反應(yīng)液。空白組加入0. 5mL100mmol/L磷酸緩沖液和0. 5mL酶反應(yīng)液。搖勻后將各組試 管同時(shí)放入37°C水浴中，水浴Ih后加入0. ImL的3mol/L硫酸，作用是終止反應(yīng)。將試管轉(zhuǎn) 入60°C水浴脫羧15min，然后加入0. 5mL0. 5%肌酸和0. 5mL5%甲萘酚(溶于2. 5mol/L的 NaOH溶液中)，作用是與產(chǎn)物Acetoin發(fā)生顯色反應(yīng)，保留在60°C水浴中顯色15min。顯色 結(jié)束后將混合液移入比色皿，靜置30min后以對(duì)照為空白用722型光柵分光光度計(jì)在525nm 波長(zhǎng)處比色。結(jié)果用nmol3-羥基-2- 丁酮/mg (蛋白質(zhì))/h表示。比活力計(jì)算公式比活力=AcetoinOD值 Xk/ 蛋白質(zhì)含量(mg)/lhour其中k表示Acetoin標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。經(jīng)計(jì)算，以上實(shí)施例外源表達(dá)的固氮雨腥藻ALS酶比活力為134. 60，與固氮魚(yú)腥 藻離體ALS酶活力110. 0相比，略有增加，進(jìn)一步證實(shí)了以上實(shí)施例外源表達(dá)ALS酶的可行 性及其在分子藥物設(shè)計(jì)、酶抑制農(nóng)藥殘留速測(cè)等方面的應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
一種固氮魚(yú)腥藻乙酰乳酸合酶基因的核苷酸序列，其特征在于，所述的序列具有SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列的多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固氮魚(yú)腥藻乙酰乳酸合酶基因的核苷酸序列，其特征是，所 述的序列具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的固氮魚(yú)腥藻乙酰乳酸合酶基因的核苷酸序列的克隆和 表達(dá)的方法，其特征在于包括以下步驟①?gòu)墓痰~(yú)腥藻中提取總DNA，對(duì)其基因進(jìn)行克隆與測(cè)序；②設(shè)計(jì)去終止子下游引物，采用T7表達(dá)系統(tǒng)對(duì)固氮魚(yú)腥藻ALS基因進(jìn)行外源表達(dá)，重 組質(zhì)粒的篩選鑒定；③通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，鑒定重組菌表達(dá)產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量和表達(dá)量，確 定目的蛋白；④通過(guò)對(duì)ALS酶催化的以丙酮酸為底物的反應(yīng)后產(chǎn)物3-羥基-2-丁酮含量多少的測(cè) 定ALS酶的活性。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的固氮魚(yú)腥藻乙酰乳酸合酶基因的核苷酸序列的克隆和表達(dá) 的方法，其特征是，步驟①中所述的克隆與測(cè)序是指設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)體系、程序條 件，通過(guò)PCR獲取ALS編碼基因ilvB，產(chǎn)物經(jīng)1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收后與pMD18_T Simplevector連接，得到重組質(zhì)粒，而后熱擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)Ε. coli DH5a，在含有Amp的LB平 板上挑取白色菌落，接種于含Amp的LB培養(yǎng)基中，抽提質(zhì)粒進(jìn)行PCR和酶切驗(yàn)證、測(cè)序。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的固氮魚(yú)腥藻乙酰乳酸合酶基因的核苷酸序列的克隆和表達(dá) 的方法，其特征是，步驟②中所述的篩選鑒定，選用載體pET-28a (+)，對(duì)重組子pMD18-ALS 進(jìn)行EcoR I, Xho I雙酶切，膠回收后，通過(guò)T4DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21，進(jìn)行 重組質(zhì)粒的篩選鑒定。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的固氮魚(yú)腥藻乙酰乳酸合酶基因的核苷酸序列的克隆和表達(dá) 的方法，其特征是，步驟③中所述的確定目的蛋白，其方法如下a.將鑒定為陽(yáng)性的重組菌按1 100比例接種于5ml含100 μ g/mL卡那霉素的培養(yǎng)液 中，37°C振搖培養(yǎng)過(guò)夜，再取培養(yǎng)物200 μ 1接種于盛有20mlLB含100 μ g/mL卡那霉素的培 養(yǎng)液的三角瓶中，振搖培養(yǎng)約2. 5h至0D600約為0. 6時(shí)，以IPTG進(jìn)行ALS的誘導(dǎo)表達(dá)，并 通過(guò)不同的濃度和時(shí)間的誘導(dǎo)確定優(yōu)化表達(dá)的條件，最終通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)推 斷加入IPTG至終濃度為0. 6mmol/L、培養(yǎng)時(shí)間5h時(shí)蛋白表達(dá)量最高；b.以聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)鑒定重組菌表達(dá)產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量和表達(dá)量，確定目 的蛋白將誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌收集、離心、洗滌后，重懸于PBS中進(jìn)行反復(fù)凍融破碎，共約8次， 期間加入微量溶菌酶至終濃度約為5mg/ml，對(duì)破碎后的細(xì)胞混合液離心，然后取上清液； 在上清液中按每IOOmL液體加入31. 3g硫酸銨晶體的比例進(jìn)行蛋白質(zhì)的鹽析；0°C下鹽析 2小時(shí)后，進(jìn)行離心，然后棄去上清液，留在離心管底部的即為ALS酶，加入適量酶溶解液攪 拌溶解后黑暗下冰水浴中保存?zhèn)溆谩?br> 7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的固氮魚(yú)腥藻乙酰乳酸合酶基因的核苷酸序列的克隆和表達(dá) 的方法，其特征是，步驟b中所述的離心所得沉淀即為包涵體，取少量包涵體作SDS — PAGE 分析，觀察重組蛋白的產(chǎn)量及破碎前后量的變化；同時(shí)以鎳柱親和層析進(jìn)行重組蛋白包涵體的純化。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的固氮魚(yú)腥藻乙酰乳酸合酶基因的核苷酸序列的克隆和表達(dá) 的方法，其特征是，步驟④中所述的測(cè)定ALS酶的活性，包括步驟如下a.在離心管中加入0.5mL酶液和0. 5mL酶反應(yīng)液，空白組加入0. 5mLIOOmmol/L磷酸緩 沖液和0. 5mL酶反應(yīng)液；b.搖勻后將各組試管同時(shí)放入37°C水浴中，水浴Ih后加入0.ImL的3mol/L硫酸，作 用是終止反應(yīng)；c.將試管轉(zhuǎn)入60°C水浴脫羧15min，然后加入0.5mL0. 5%肌酸和0. 5mL5%甲萘酚，甲 萘酚溶于2. 5mol/L的NaOH溶液中，與產(chǎn)物Acetoin發(fā)生顯色反應(yīng)，保留在60°C水浴中顯色 15min ；d.顯色結(jié)束后將混合液移入比色皿，靜置30min后以對(duì)照為空白用722型光柵分光光 度計(jì)在525nm波長(zhǎng)處比色。
全文摘要
一種生物技術(shù)領(lǐng)域的固氮魚(yú)腥藻乙酰乳酸合酶基因的核苷酸序列。所述的序列具有SEQID NO.2所示的氨基酸序列的多肽，該多肽由547個(gè)氨基酸組成，分子量為59.292kDa。該序列克隆和表達(dá)的方法從固氮魚(yú)腥藻中提取總DNA，對(duì)其基因進(jìn)行克隆與測(cè)序；重組質(zhì)粒的篩選鑒定；鑒定重組菌表達(dá)產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量和表達(dá)量，確定目的蛋白；通過(guò)對(duì)ALS酶催化的以丙酮酸為底物的反應(yīng)后產(chǎn)物3-羥基-2-丁酮含量多少的測(cè)定ALS酶的活性。本發(fā)明對(duì)于ALS酶編碼基因ilvB的克隆和異源表達(dá)，對(duì)進(jìn)一步理解除草劑與靶分子的作用方式具有重要的指導(dǎo)作用。
文檔編號(hào)C12N15/10GK101979592SQ20101052049
公開(kāi)日2011年2月23日 申請(qǐng)日期2010年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月27日
發(fā)明者萬(wàn)旗東, 沈健英, 鄭培忠, 陸貽通 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)