專利名稱：一種假單胞菌及用其對普瑞巴林中間體進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種假單胞菌(Pseudomonas sp.)和對普瑞巴林中間體進(jìn)行微生物轉(zhuǎn) 化的方法，特別涉及對消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化的方法。
背景技術(shù)：
(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯(簡稱(S)-CNDE)是合成普瑞巴林 (Pregabalin, PGB)的關(guān)鍵手性中間體，其消旋物為2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯 (簡稱CNDE)。PGB是Y-氨基丁酸(GABA)的三位異丁基取代物，對神經(jīng)性疼痛、癲痛癥的 輔助治療顯示出強(qiáng)大優(yōu)勢，且對伴有睡眠障礙的神經(jīng)性疼痛病人有治療效果。普瑞巴林及其手性中間體的制備方法，主要可分為外消旋體拆分法和不對稱合成 法。目前報(bào)道的不對稱合成方法往往需要昂貴的過渡金屬或手性配體，操作條件比較苛 亥IJ，有機(jī)溶劑使用量太大。在拆分法中，化學(xué)拆分要找出一個(gè)合適的手性拆分劑十分苦難， 難度大，費(fèi)用高，且必需先合成外消旋目標(biāo)產(chǎn)物，拆分的最高收率一般不會(huì)超過50%。相 對地，利用微生物或酶拆分法具備立體選擇性強(qiáng)，條件溫和，成本較低，對環(huán)境友好，減少原 料浪費(fèi)等優(yōu)點(diǎn)。2008年，輝瑞公司的Martinez等人利用脂肪酶作為拆分劑選擇性地水解 (S)-CNDE，得到(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸(簡稱(S)-CNME)的鉀鹽，再以其作 為原料化學(xué)合成制備獲得普瑞巴林，此化學(xué)-酶法工藝路線可使普瑞巴林收率高達(dá)45%， 且能夠大大減少有機(jī)溶劑的使用量，并實(shí)現(xiàn)了(R)-CNDE的有效循環(huán)利用。然而，這些酶催 化劑價(jià)格較高，對底物的適用也存在一定的局限性。相對地，如果利用微生物作為拆分劑， 則可大大降低原料成本，目前尚未見有關(guān)于利用假單胞菌(Pseudomonas sp.)對2-羧乙 基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種假單胞菌及用其對普瑞巴林中間體進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化的 方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，發(fā)明人首次分離純化到一株能高選擇性水解CNDE的微生物菌 株。經(jīng)過16S rDNA和生理生化鑒定，該菌株為假單胞菌(Pseudomonas sp.)屬，命名為假 單胞菌YZ05 (pseudomonas sp. YZ05)。該菌株保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保 藏日期為2010年9月17日，保藏號(hào)為CGMCCNo. 4184。本發(fā)明利用所述假單胞菌對普瑞巴林中間體進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化的方法，包括如下步 驟(1)將保藏號(hào)為CGMCC No. 4184的假單胞菌加入到培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；(2)按以下方案A或方案B對普瑞巴林中間體進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，得到轉(zhuǎn)化液，所述普 瑞巴林中間體為消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯方案A 將消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯直接加入經(jīng)步驟⑴培養(yǎng)后的發(fā)酵液中進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，得到轉(zhuǎn)化液；方案B 將經(jīng)步驟⑴培養(yǎng)后的發(fā)酵液離心得到濕菌體，先將所述濕菌體加入到磷酸緩沖溶液中，后再加入消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，得到轉(zhuǎn) 化液；(3)將所述轉(zhuǎn)化液用溶劑萃取，將萃取得到的有機(jī)相脫水后蒸發(fā)溶劑得到 (S) -2"羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯。進(jìn)一步地，在本發(fā)明步驟(2)的方案A中，所述消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基 己酸乙酯相對于所述發(fā)酵液的加入量為1 50g/L ；在步驟(2)的方案B中，所述消旋2-羧 乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯相對于所述磷酸緩沖溶液的加入量為1 50g/L。進(jìn)一步地，在本發(fā)明步驟(2)的方案B中，所述濕菌體相對于所述磷酸緩沖溶液的 加入量為20 100g/L。進(jìn)一步地，在本發(fā)明步驟⑵中，轉(zhuǎn)化反應(yīng)溫度為25 45°C，轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間為 10 60h。進(jìn)一步地，在本發(fā)明步驟(2)的方案B中，所述磷酸緩沖溶液的濃度為0. 1Μ、ρΗ為 5 9。進(jìn)一步地，在本發(fā)明步驟(1)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度25 40°C，培養(yǎng)1 4天。進(jìn)一步地，在本發(fā)明步驟(1)中，所述培養(yǎng)基的成分為蛋白胨5 15g/L、甘油 0 6g/L、酵母膏1 5g/L、硫酸銨0 4g/L、磷酸二氫鉀0 4g/L、氯化鈉0. 5 10g/L 和硫酸鎂0 0. 5g/L，所述培養(yǎng)基的PH值為6 8。本發(fā)明方法相對于傳統(tǒng)的化學(xué)拆分方法和不對稱合成法具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)由于化學(xué)拆分法和不對稱合成法具有反應(yīng)條件苛亥IJ、難度大、需要使 用大量有機(jī)溶劑、對環(huán)境造成污染的缺點(diǎn)，而相比之下，本發(fā)明采用微生物假單胞菌 YZ05 (Pseudomonas sp. YZ05)轉(zhuǎn)化底物(消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯)，不 僅具有高效選擇性和反應(yīng)條件溫和的優(yōu)點(diǎn)，而且可以從工藝上大量減少有機(jī)溶劑的使用， 對環(huán)境友好。(2)本發(fā)明的微生物轉(zhuǎn)化法是利用微生物菌體作為催化劑，可以自行發(fā)酵制備，質(zhì) 量穩(wěn)定，且能大大降低原料成本，極具廣大應(yīng)用前景；(3)采用本發(fā)明的微生物轉(zhuǎn)化法，最終生成的(S)-CNDE其對映體過量值高達(dá)99% 以上；且反應(yīng)生成的部分產(chǎn)物(2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸)可以酯化后再消旋化成 底物(消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯)，從而提高底物利用率。生物材料樣品的保藏信息保藏的生物材料樣品假單胞菌YZ05 (Pseudomonas sp. YZ05)；保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCC)；保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院中國科學(xué)院微生物研究所(郵編100101);保藏日期2010年9月17日；保藏登記號(hào)CGMCCNo. 4184。


圖1是底物(2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯)和產(chǎn)物(2-羧乙基-3-氰 基-5-甲基己酸)的氣相色譜分析譜圖。從左到右各峰所對應(yīng)的化合物分別為產(chǎn)物 (R)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸出峰位置在13.007min和(S)-2-羧乙基-3-氰 基-5-甲基己酸出鋒位置在13. 907min，底物(R) _2_羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯出 峰位置在50. 957min和(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯出峰位置在52. 490min。圖2是不同反應(yīng)時(shí)間下轉(zhuǎn)化率和底物對映體過量值的變化曲線。
具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例中，在對普瑞巴林中間體進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)過程中，對反應(yīng)液進(jìn)行底物轉(zhuǎn) 化率、產(chǎn)物對映體過量值(eep)和底物對映體過量值(ees)的測定方法具體如下(其中，所 述底物為消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯，簡寫為CNDE)在轉(zhuǎn)化反應(yīng)過程中，5mL反應(yīng)液用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至2_3，再用乙酸乙酯萃取，離心 (4°C,10000Xg,5min)得到有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥過夜后，對底物及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行手性 氣相色譜分析。該手性氣相色譜分析的體系如下檢測儀器GC_950氣相色譜儀；手性氣相柱AstecCHIRALDEX G-TA (30mX0. 25mmX0. 12 μ m)；檢測條件柱溫125°C，檢測器和進(jìn)樣器溫度為250°C，載氣(N2) 30mL/min，空氣 300mL/min,氧氣 30mL/mino計(jì)算公式底物轉(zhuǎn)化率(％ )=(初始底物濃度_剩余底物濃度)/初始底物濃度X 100% ；eep(% ) = [ (Ar-As) / (AS+AE) ] X100%ees = cXeep/(1-c) X 100%E = ln[l-c(l+eep% ) ]/In[1-c (l-eep% )]其中，c為轉(zhuǎn)化率，eep為產(chǎn)物對映體過量值，其中As、Ak分別為氣相色譜所測樣品 中(S)-構(gòu)型產(chǎn)物和(R)-構(gòu)型產(chǎn)物的峰面積，E為對映體選擇率。實(shí)施例1 菌種篩選及鑒定本發(fā)明從杭州及其附近地區(qū)的油脂化工廠、藥廠等處采集土壤，經(jīng)過富集、初篩、 復(fù)篩三個(gè)步驟，進(jìn)行假單胞菌YZ05(pSeudomonas Sp.YZ05)的篩選。方法如下富集培養(yǎng)培養(yǎng)基成分為(g/L)酵母膏1. 0，硫酸銨2. 0，磷酸氫二鉀1. 0，氯化鈉 0. 5，硫酸鎂0. 5，硫酸亞鐵0. 01，pH為7. 0。120°C滅菌20min。底物CNDE紫外照射滅菌后， 添加入滅菌好的培養(yǎng)基中，濃度為10g/L。稱取新鮮土樣Ig加入到裝有80ml富集培養(yǎng)基的 250mL搖瓶中，置于30°C、200r/min搖床中培養(yǎng)。按5%的接種量，每隔一天進(jìn)行一次轉(zhuǎn)接， 重復(fù)三次。將第三次富集后的菌液保存于甘油管中，4°C冷藏。平板初篩培養(yǎng)基成分為(g/L):酵母膏1.0，甘油6.0，硫酸銨4.0，磷酸氫二鉀 4. 0，氯化鈉2. 0，硫酸鎂0. 4，瓊脂20. 0，ρΗ為7. 0。120°C滅菌20min。底物CNDE與吐溫以 2 l(w/V)制成乳化液，紫外照射滅菌后，添加入滅菌好的溫度約在50°C的培養(yǎng)基中，倒成 平板，冷卻凝固。采用稀釋涂布分離法，將己保存的富集菌液適度稀釋，各取200 μ L涂布在平板培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)1 3天。挑取平板上單菌落接種于新鮮平板培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng) 至出現(xiàn)豐滿的菌體細(xì)胞后置于4°C冰箱保存。搖瓶復(fù)篩培養(yǎng)基成分為(g/L):蛋白胨5.0，甘油3.0，酵母膏2.0，硫酸銨2.0，磷 酸二氫鉀2.0，氯化鈉1.0，硫酸鎂0.2，pH為7.0。120滅菌20min。底物CNDE紫外照射滅 菌。將初篩獲得的單菌落接入IOmL復(fù)篩培養(yǎng)基中，300C，200rpm下生長1天后，添加已滅菌 好的底物CNDE于IOmL發(fā)酵液中，相對于發(fā)酵液的加入量為10g/L，30°C，200rpm下進(jìn)行轉(zhuǎn) 化18 36h，加入稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2 3，加入乙酸乙酯混勻萃取，離心得到有機(jī)相，用 于手性氣相色譜進(jìn)行分析，將底物轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物對映體過量值均較高的菌株保藏備用。菌種鑒定油鏡觀察、16S rDNA鑒定和生理生化鑒定。經(jīng)過篩選，編號(hào)為YZ05的菌株，其對映體對量值最高，且具有相對較好的轉(zhuǎn)化 率，氣相譜圖見圖1。從圖1可知，產(chǎn)物(R)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸出峰位 置在13.007min，產(chǎn)物(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸出鋒位置在13. 907min，底 物(R)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯出峰位置在50.957min，底物(S)_2_羧乙 基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯出峰位置在52. 490min。對菌株YZ05作16S rDNA PCR測序 分析和生理生化實(shí)驗(yàn)(見表1)，測序結(jié)果如SEQ No. 1所示，由測序分析和生理生化實(shí)驗(yàn) 的結(jié)果可確定所篩選出的菌株為假 單胞菌屬，該菌株命名為假單胞菌YZ05(pSeUdomonas sp. YZ05)。表1假單胞菌YZ05 (pseudomonas sp. YZ05)的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
一種假單胞菌，其特征是其保藏號(hào)為CGMCC No.4184。
2.一種利用權(quán)利要求1的假單胞菌對普瑞巴林中間體進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化的方法，包括如 下步驟(1)將保藏號(hào)為CGMCCNo. 4184的假單胞菌加入到培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；(2)按以下方案A或方案B對普瑞巴林中間體進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，得到轉(zhuǎn)化液，所述普瑞巴 林中間體為消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯方案A 將消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯直接加入經(jīng)步驟(1)培養(yǎng)后的發(fā) 酵液中進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，得到轉(zhuǎn)化液；方案B 將經(jīng)步驟(1)培養(yǎng)后的發(fā)酵液離心得到濕菌體，先將所述濕菌體加入到磷酸緩 沖溶液中，后再加入消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，得到轉(zhuǎn)化液；(3)將所述轉(zhuǎn)化液用溶劑萃取，將萃取得到的有機(jī)相脫水后蒸發(fā)溶劑得到(S)-2-羧乙 基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯。
3.如權(quán)利要求2所述的對普瑞巴林中間體進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于步驟(2)的方案A中，所述消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯相對于所述發(fā)酵液的加入量為1 50g/L ；步驟(2)的方案B中，所述消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯相對于所述磷酸 緩沖溶液的加入量為1 50g/L。
4.如權(quán)利要求2或3所述的對普瑞巴林中間體進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于 步驟(2)的方案B中，所述濕菌體相對于所述磷酸緩沖溶液的加入量為20 100g/L。
5.如權(quán)利要求2或3所述的對普瑞巴林中間體進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于 步驟(2)中，轉(zhuǎn)化反應(yīng)溫度為25 45°C，轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間為10 60h。
6.如權(quán)利要求2或3所述的對普瑞巴林中間體進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于 步驟(2)的方案B中，所述磷酸緩沖溶液的濃度為0. 1Μ、ρΗ為5 9。
7.如權(quán)利要求2所述的對普瑞巴林中間體進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于步驟 (1)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度25 40°C，培養(yǎng)1 4天。
8.如權(quán)利要求2或7所述的對普瑞巴林中間體進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于 步驟⑴中，所述培養(yǎng)基的成分為蛋白胨5 15g/L、甘油0 6g/L、酵母膏1 5g/L、硫 酸銨0 4g/L、磷酸二氫鉀0 4g/L、氯化鈉0. 5 10g/L和硫酸鎂0 0. 5g/L，所述培養(yǎng) 基的PH值為6 8。
全文摘要
本發(fā)明公開一種假單胞菌及用其對普瑞巴林中間體進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化的方法。該假單胞菌保藏號(hào)為CGMCC No.4184；用其對普瑞巴林中間體進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化的方法包括如下步驟(1)將該假單胞菌加入到培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；(2)利用培養(yǎng)后的發(fā)酵液對普瑞巴林中間體進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，得到轉(zhuǎn)化液，所述普瑞巴林中間體為消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯；(3)將所述轉(zhuǎn)化液用溶劑萃取，將萃取得到的有機(jī)相脫水后蒸發(fā)溶劑得到(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯。本發(fā)明通過所述假單胞菌轉(zhuǎn)化消旋-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯制備(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯，收率可以達(dá)到43.0％，底物對映體過量值(ees)達(dá)到98.3％。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101985609SQ201010520179
公開日2011年3月16日 申請日期2010年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月26日
發(fā)明者吳堅(jiān)平, 吳薇, 楊立榮 申請人:浙江大學(xué)