專利名稱：東方伊薩酵母菌、其組合物和應(yīng)用的制作方法
東方伊薩酵母菌、其組合物和應(yīng)用發(fā)明所屬領(lǐng)域 本發(fā)明屬于白酒釀造領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及東方伊薩酵母菌、含該菌的釀酒 菌劑組合物，及該酵母菌和其組合物在白酒釀造中的應(yīng)用
背景技術(shù)：
中國白酒香味物質(zhì)種類繁多，包括醇、醛、酮、酸、酯、縮醛、芳香族化合物、含氮 化合物、含硫化合物、醚類、內(nèi)酯類等化合物達(dá)數(shù)百種之多(莊名揚(yáng)，釀酒，2007，34(2) 109-113)。中國白酒風(fēng)味物質(zhì)的形成，是微生物代謝的產(chǎn)物，同時(shí)也是原料中基本組分及非 基本組分，在各類生物酶的直接或間接催化下的生物合成、非酶促化學(xué)反應(yīng)和熱降解反應(yīng) 等多種因素共同作用結(jié)果。白酒的風(fēng)味與釀造微生物及釀造工藝也有直接關(guān)系。釀造基酒質(zhì)量的高低對(duì)產(chǎn)品 的最終質(zhì)量的好壞起決定性的作用。白酒釀造中的生香酵母又稱產(chǎn)酯酵母，主要屬于產(chǎn)膜 酵母和假絲酵母，大多為異型漢遜酵母及少數(shù)小圓型酵母屬，是白酒和黃酒發(fā)酵產(chǎn)香的重 要菌種(熊子書，釀酒科技，2002，5 :19-21)。濃香型白酒以己酸乙酯為主的復(fù)合香，是由梭 狀芽孢桿菌，俗稱己酸菌的作用，產(chǎn)于泥質(zhì)發(fā)酵老窖或人工培養(yǎng)泥窖中，發(fā)酵周期長；清香 型白酒以醋酸乙酯為主體香，在小曲、麩曲或液態(tài)法白酒中添加生香酵母，在發(fā)酵過程中生 成醋酸及其乙酯。酒精發(fā)酵過程中酯的產(chǎn)生量與特殊的酵母菌種類有密切關(guān)系。白酒發(fā)酵要求釀酒菌劑具有產(chǎn)酯率高、產(chǎn)酒精率高并耐高溫。重量和質(zhì)量相同的 原料使用不同的釀酒菌劑，形成不同的酒精產(chǎn)量和酯含量。好的釀酒菌劑使同樣的原料酒 精產(chǎn)量高、富含酯類，并使白酒純香。但傳統(tǒng)大曲雖然產(chǎn)酯率高，產(chǎn)酒率卻較低，特別是大曲 構(gòu)成成份復(fù)雜，使白酒質(zhì)量不穩(wěn)定；而單個(gè)酵母菌或釀酒菌劑組合物不耐高溫，雖發(fā)酵產(chǎn)酒 率高但產(chǎn)酯率低，白酒品質(zhì)較差。在中國專利CN200710175714. 6中公開了一種東方伊薩酵母在木質(zhì)纖維素水解產(chǎn) 物中的應(yīng)用；中國專利CN200810180438. 7公開了東方伊薩酵母和其組合物制劑降解除去 存在于半纖維素水解物中微生物代謝抑制物；中國專利CN200710026730. 9也公開了東方 伊薩酵母在楊梅果酒中降酸的應(yīng)用。目前還沒有東方伊薩酵母菌應(yīng)用于白酒發(fā)酵的報(bào)道。發(fā)明技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新的東方伊薩酵母菌株，該菌株耐高溫，使用該菌 株發(fā)酵生產(chǎn)白酒，具有高產(chǎn)酯率和高酒精產(chǎn)率，并形成白酒獨(dú)特風(fēng)味。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種含有東方伊薩酵母菌的釀酒菌劑組合物。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供制備釀酒菌劑組合物的方法。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供東方伊薩酵母菌株在白酒發(fā)酵中的應(yīng)用。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供釀酒菌劑組合物在白酒發(fā)酵中的應(yīng)用。本發(fā)明公開了一株新的東方伊薩酵母菌，其特征在于，該菌株為東方伊薩酵母Zl 株(Issatchenkia orientalis Zl)，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC M2010167，保藏日期是2010年7月2日。東方伊薩酵母Zl株從湖北白云邊酒池分離經(jīng)篩選獲得。該菌株有如下特征東方伊薩酵母Zl株可耐42°C高溫，液體發(fā)酵乙酸乙酯產(chǎn)量高 達(dá)229. 06毫克/升，液體發(fā)酵產(chǎn)物酒精度可達(dá)5. 2%。即東方伊薩酵母Zl株具有耐高溫， 高乙酸乙酯產(chǎn)力和較強(qiáng)的產(chǎn)酒精能力。東方伊薩酵母Zl株形態(tài)特征是菌落乳白色、形狀為規(guī)則圓形、表面較平坦、干 燥，培養(yǎng)較長時(shí)間后，芽生孢子延長呈梳妝交錯(cuò)，假菌絲分支分布，細(xì)胞呈圓形或橢圓形。東方伊薩酵母Zl株生化特征是可發(fā)酵利用果糖，蔗糖；不能發(fā)酵利用D-半乳 糖，纖維二糖，綿子糖，D-阿拉伯糖，L-阿拉伯糖，D-海藻糖，L-鼠李糖，L-山梨糖和D-木
糖。
東方伊薩酵母Zl株耐高溫及生長特征是YPD平板上劃線接種，分別在33°C至 42°C下培養(yǎng)均生長良好。在37°C培養(yǎng)時(shí)，菌株Zl在YPD培養(yǎng)基中延遲期明顯比生香產(chǎn)酯酵 母菌短，在早期的生長中具有明顯的優(yōu)勢(shì)，而市售生香產(chǎn)酯酵母菌——安琪生香活性干酵 母具有較長的延遲期。東方伊薩酵母Zl株耐酒精能力特征是接種菌種到酒精度0-14%的YPD液體培 養(yǎng)基中，30°C搖床培養(yǎng)24小時(shí)，OD630nm測(cè)定酵母菌的生長濃度，東方伊薩酵母Zl株最高耐 受酒精度為10%，表明酵母菌Zl的耐酒精能力好。東方伊薩酵母Zl株26S rDNA D1/D2區(qū)域基因序列分析顯示東方伊薩酵母Zl株 與東方伊薩酵母NRRL Y-5396株的同源性超過99%。本發(fā)明還公開了一種含東方伊薩酵母Zl株菌的釀酒菌劑組合物，該釀酒菌劑組 合物主要成份是東方伊薩酵母Zi株及胞外產(chǎn)物。優(yōu)先地，本發(fā)明還公開了一種含東方伊薩酵母Zl株釀酒菌劑組合物，其特征在于 它含有下列組份(活菌數(shù)比)東方伊薩酵母 50%酒精酵母50%其中東方伊薩酵母為CCTCC M2010167，酒精酵母為CCTCC AY92003。酒精酵母 CCTCC AY92003為常用普通微生物菌種，登載于中國典型培養(yǎng)物保藏中心目錄，處于公開狀 態(tài)，科學(xué)工作者可向中國典型培養(yǎng)物保藏中心索取。本發(fā)明公開的釀酒菌劑組合物為液態(tài)或固態(tài)。優(yōu)先的，本發(fā)明公開的釀酒菌劑組 合物為固態(tài)。本發(fā)明還公開了制備固態(tài)釀酒菌劑組合物的方法，包括如下步驟1)菌種活化分別接種東方伊薩酵母Zl株和酒精酵母CCTCC AY92003于滅菌的 糖度為12巴林的麥芽汁或米曲汁三角瓶培養(yǎng)基中，28 30°C搖床培養(yǎng)18-24天；2)固體培養(yǎng)固體培養(yǎng)的配料是麩皮70%、玉米面30%，用玉米糖化液潤料，力口 濃硫酸，蒸煮冷散后，將1)中活化培養(yǎng)的2種酵母菌液按1 1體積比混合接種后裝盒，
保持室溫20°C左右.品溫25°C左右，培養(yǎng)發(fā)酵2天；3)真空干燥對(duì)發(fā)酵后的固體樣品在45°C進(jìn)行真空干燥處理，樣品含水率低于 10%后真空包裝。本發(fā)明還公開了新的東方伊薩酵母菌Zl株在白酒釀造中的應(yīng)用。本發(fā)明還公開了釀酒菌劑組合物在白酒釀造中的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
1、本發(fā)明提供的東方伊薩酵母Zl株是一株新的菌株，該菌株可耐42°C高溫，液體 發(fā)酵乙酸乙酯產(chǎn)量高達(dá)229. 06毫克/升，液體發(fā)酵產(chǎn)物酒精度可達(dá)5. 2%。即東方伊薩酵 母Zl株具有耐高溫，高乙酸乙酯產(chǎn)力和較強(qiáng)的產(chǎn)酒精能力。其乙酸乙酯的產(chǎn)生能力遠(yuǎn)高于 一般酵母菌株。2、東方伊薩酵母Zl與酒精酵母混合制備的菌劑進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵制酒，乙酸乙酯含 量比安琪生香活性干酵母發(fā)酵樣品提高了 38. 3%，而產(chǎn)酒率相同。3、東方伊薩酵母Zl株與酒精酵母混合制備釀酒菌劑，在目前通用的白酒固態(tài) 發(fā)酵物料中添加釀酒菌劑進(jìn)行發(fā)酵制酒，與不添加釀酒菌劑的對(duì)照組相比出酒率提高了 2. 7 %，同時(shí)原酒中總酯的含量增加了 9. 6 %，對(duì)改善口感作用明顯。


圖1.東方伊薩酵母菌Zl株26S rDNADl/D2區(qū)序列系統(tǒng)發(fā)育樹圖2.東方伊薩酵母菌Zl株及對(duì)照菌株在0-14%酒精濃度下生長曲線Zl代表東方伊薩酵母菌Zl株；XG-I代表酒精酵母CCTCC AY92003 ；TRADY代表安 琪耐高溫釀酒酵母。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明 本發(fā)明，而不能限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例實(shí)施例1東方伊薩酵母Zl的分離與鑒定1. 1東方伊薩酵母Zl株的分離從白云邊酒廠堆積發(fā)酵料，包括堆積后高溫酒醅、 剛混合的酒醅和堆積后中等溫度的酒醅中取樣，將樣品活化后加入到PH4. 5-5. 0的YPD液 體培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速200rpm，溫度30°C時(shí)富集培養(yǎng)48小時(shí)，然后取100 μ 1經(jīng)過一定梯度稀釋 后的培養(yǎng)液涂布到Y(jié)PD培養(yǎng)基固體平板上，30°C培養(yǎng)48小時(shí)后，挑取典型酵母形態(tài)的單菌 落，再在相同培養(yǎng)基固體平板上重復(fù)劃線純化三次后，4°C保存。然后通過糧食水解液發(fā)酵 實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)這些分離出來的菌株在發(fā)酵過程中的乙醇產(chǎn)率、乙酸乙酯產(chǎn)率，最后根據(jù)發(fā)酵試 驗(yàn)結(jié)果篩選出產(chǎn)酒精能力和產(chǎn)酯率均較高的菌株。本發(fā)明人將分離的一株新的東方伊薩酵 母菌Zl株(Issatchenkia orientalis Zl)保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為 CCTCC M2010167。保藏日為2010年7月2日。1. 2東方伊薩酵母菌Zl株的鑒定通過形態(tài)特征觀察、生理生化測(cè)定及26SrDNA D1/D2區(qū)域基因序列分析結(jié)果對(duì)Zl進(jìn)行鑒定。在鑒定中，本實(shí)驗(yàn)選擇安琪耐高溫釀酒 酵母 TRADY、東方伊薩酵母 Issatchenkia orientalis NRRL Y-5396，和 Saccharomyces cerevisiae CCTCC AY92003菌株作為對(duì)照菌株。安琪耐高溫釀酒酵母TRADY為市場(chǎng)流通 商品；東方伊薩酵母 Issatchenkia orientalis NRRLY-5396 和釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae CCTCC AY92003為常用普通微生物菌種，分別登載于美國農(nóng)業(yè)部菌種保藏中心 和中國典型培養(yǎng)物保藏中心目錄，處于公開狀態(tài)，科學(xué)工作者可向保藏中心索取。 1. 2. 1東方伊薩酵母菌Zl株形態(tài)特征觀察菌落乳白色、形狀為規(guī)則圓形、表面較 平坦、干燥，培養(yǎng)較長時(shí)間后，芽生孢子延長呈梳妝交錯(cuò)，假菌絲分支分布，細(xì)胞呈圓形或橢圓形。1. 2. 2通過26S rDNA D1/D2區(qū)域序列分析進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育地位鑒定用酵母菌基因組DNA提取試劑盒(BioFlux杭州博日科技有限公司提供) 提取Zl的全DNA，然后以提取出來的全DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，正向引物NLl 5，-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3，，反向引物 NL4 5，-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3，。按以下 的反應(yīng)條件共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)94°C預(yù)變性5min，94°C變性lmin，59°C退火lmin，72°C延伸 lmin，30個(gè)循環(huán)后，72°C延伸5min。所得PCR產(chǎn)物由北京奧科生物技術(shù)公司進(jìn)行純化及序列 測(cè)定。將測(cè)定出來的Zl的26S rDNADl/D2區(qū)域與GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行 比對(duì)，采用ClustalX軟件進(jìn)行匹配排列(align)，用MEGA4. O軟件中的neighbor-joining 分析法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行1000次Bootstraps檢驗(yàn)，最后用TreeView軟件顯示系統(tǒng) 樹。實(shí)驗(yàn)得到571bp的基因序列，在Genbank核酸序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列搜索，Zl 與 Issatchenkia orientalis NRRL Y-5396 的同源性超過99%，符合Kuttzman&Robnett 所 定的同種內(nèi)不同菌株見差異不超過的標(biāo)準(zhǔn)。圖1是根據(jù)26S rDNA D1/D2區(qū)域序列所做 的系統(tǒng)發(fā)育樹。1. 2. 3 東方伊薩酵母菌Zl株的生理生化實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果(1)發(fā)酵試驗(yàn)
權(quán)利要求
1.一株東方伊薩酵母菌，其特征在于，該菌株為東方伊薩酵母Zl株(/sMideZ^ia oriental is Zl )，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC M2010167。
2.一種含權(quán)利要求1中所述菌株的釀酒菌劑組合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的釀酒菌劑組合物，其特征在于它含有下列組份(活菌數(shù) 比)東方伊薩酵母50%酒精酵母50%其中東方伊薩酵母為CCTCC M2010167，酒精酵母為CCTCC AY92003。
4.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的釀酒菌劑組合物，其特征在于所述的釀酒菌劑組合物為 固態(tài)菌劑。
5.制備權(quán)利要求4中所述的固態(tài)釀酒菌劑組合物的方法，包括如下步驟菌種活化分別接種東方伊薩酵母Zl株和酒精酵母CCTCC AY92003于滅菌的糖度為12 巴林的麥芽汁或米曲汁三角瓶培養(yǎng)基中，28 30°C搖床培養(yǎng)18-24天；固體培養(yǎng)固體培養(yǎng)的配料是麩皮70%、玉米面30%，用玉米糖化液潤料，加濃硫 酸，蒸煮冷散后，將活化培養(yǎng)2種酵母菌液按1 :1體積比混合接種后裝盒，保持室溫20°C左 右.品溫25°C左右，培養(yǎng)發(fā)酵2天；真空干燥對(duì)發(fā)酵后的固體樣品在45°C進(jìn)行真空干燥處理，樣品含水率低于10%后真 空包裝。
6 權(quán)利要求1所述的東方伊薩酵母Zl株在白酒釀造上的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求2或3或4中所述的任何一種釀酒菌劑組合物在白酒釀造上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株新的東方伊薩酵母菌，含該菌的釀酒菌劑組合物以及東方伊薩酵母菌及釀酒菌劑組合物在白酒釀造中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供制備釀酒菌劑組合物的方法。本發(fā)明提供的東方伊薩酵母菌耐高溫，且具有高產(chǎn)酯率和高酒精產(chǎn)率。采用該菌株發(fā)酵可形成白酒獨(dú)特風(fēng)味。
文檔編號(hào)C12G3/02GK102102084SQ20101052013
公開日2011年6月22日 申請(qǐng)日期2010年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月26日
發(fā)明者劉婷婷, 宋瑤, 張明春, 曾馳, 楊團(tuán)元, 熊小毛, 繆禮鴻 申請(qǐng)人:武漢工業(yè)學(xué)院, 湖北白云邊酒業(yè)股份有限公司