專利名稱：一種綜合利用豬血的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從豬血中同時提取凝血酶和豬血水解蛋白的方法，屬生物活性物 質(zhì)的分離提取技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬血是一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，營養(yǎng)學家稱其為液體肉。豬血中含有人體所需要的幾乎 全部的營養(yǎng)成分蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、糖和鈉、鉀、鐵、鈣等人體不可缺少的微量元素。 其中蛋白質(zhì)18.9%、非蛋白有機體1.2%、礦物質(zhì)0.9%、水分79%，另外，其氨基酸組成平 衡，含人體所需的8種必需氨基酸的總量高于人乳和全蛋，特別是賴氨酸的含量高達9%， 符合聯(lián)合國糧農(nóng)組織、世界衛(wèi)生組織(FA0/WH0)專家組推薦模式。我國是豬血資源大國，但在豬血資源開發(fā)利用上卻落后于不少發(fā)達國家，由于經(jīng) 簡單加工的豬血蛋白不易被消化吸收且顏色較深、血腥味較重適口性差，所以很久以來，許 多豬血作為廢棄物倒進地溝，既造成巨大浪費，又污染環(huán)境。國外對動物血的開發(fā)始于上世紀初，初期主要用于飼料工業(yè)。隨著高新技術(shù)的發(fā) 展，國內(nèi)外許多研究部門尤其注重用生化技術(shù)加工豬血用于食品、制藥等方面的研究。目前 血液產(chǎn)品在保健品行業(yè)已經(jīng)形成了一定的規(guī)模，產(chǎn)業(yè)化前景良好。近年來，我國豬血深度開 發(fā)也取得了重要進展，豬血作為一個營養(yǎng)寶庫，已經(jīng)得到極其廣泛的研究，所提出的加工生 產(chǎn)工藝流程不下幾十種。從直接食用豬血豆腐，到酶解豬血粉，復合氨基酸粉的生產(chǎn)，已經(jīng) 取得了長足的進展，但是仍然不能滿足人類的需要。存在的問題是大多數(shù)工藝還不完善，如 有的工藝能耗大耗時長、有的工藝只能生產(chǎn)單一產(chǎn)品、有的工藝得率低、有的工藝使用大量 有機溶劑，存在環(huán)保缺陷等。而本發(fā)明方法克服了上述缺點，發(fā)明了零排放的利用豬血同時 生產(chǎn)凝血酶和豬血水解蛋白的綠色方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明屬生物活性物質(zhì)的分離提取技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及將新鮮豬血經(jīng)抗凝處理后 以血漿和血球為出發(fā)底物分別制備凝血酶和豬血水解蛋白的方法。血漿經(jīng)低溫冷凍、沉淀 收集凝血酶原、離子激活、酶液純化等步驟制得高活性的凝血酶；血球經(jīng)破壁、溶血、復合酶 分段酶解、過濾除菌等步驟制得高活性的豬血水解蛋白。該方法制得的豬血水解蛋白中氨 基酸含量占蛋白質(zhì)的80%以上，易于吸收利用。本發(fā)明方法充分利用了原料，一次投料可以 生產(chǎn)兩種高附加值產(chǎn)品。整個生產(chǎn)過程避免使用毒性大的有機溶劑，克服了產(chǎn)品單一、溶劑 殘留等缺陷，降低了生產(chǎn)成本。用本發(fā)明方法，IL豬血可制得凝血酶精品6000U以上、高活 性的豬血水解蛋白粉150g以上。具體來說，本發(fā)明的步驟由以下幾步構(gòu)成1、抗凝豬血的制備取檢疫合格的新鮮豬血放入容器1中，該容器中已事先加入 了 0. 5% -5% (w/v)溶于少量去離子水中的抗凝劑檸檬酸三鈉，充分攪拌均勻，低溫靜置備用。
2、血漿、血球分離低溫靜置后，抗凝豬血上層為無色透明液體為血漿，下層深紅 色粘稠液體為血球。用虹吸法將上層血漿吸到容器2中；余下的血球經(jīng)轉(zhuǎn)速為3000-35001·/ min離心后，將上層血漿合并到容器2中低溫冷凍備用，血球則冷凍貯藏至容器3中過夜待用。3、血漿沉淀收集凝血酶原容器2中的血漿解凍后，濾除上層漂浮的白色絮狀物 后，用2-8倍生理鹽水稀釋后再用2mol/L醋酸調(diào)pH至5. 1-5. 2，低溫靜置過夜，收集沉淀即 得凝血酶原。4、凝血粗酶液制備將收集的凝血酶原沉淀溶解于生理鹽水中，加熱保溫至 37°C，用1. 0% CaCl2溶液，低速攪拌(500-800r/min) 20-30分鐘，激活凝血酶原，過濾收集 濾液即得凝血酶粗酶液。5、凝血酶精品制備向凝血酶粗酶液中加入8-10倍冷生理鹽水，用截留相對分子 量(Mr)為60000的超濾膜處理，濃縮至原體積的1/20-1/25后收集截留液。該液體即為精 制凝血酶液，也可將截留液冷凍干燥，即得粉狀凝血酶精品。6、血球破壁、溶血向容器3中加入血球體積的適量生理鹽水(使液體中蛋白質(zhì)含 量為8% -10% )，升溫至10°C左右，高速攪拌(lOOOr/min以上)20-30分鐘。7、血球蛋白分段酶解用4. Omol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7. 5，將溫度升至37_40°C，加 入適量復合蛋白酶I，保溫2小時后，再升溫至55-60°C，保溫3小時；調(diào)節(jié)pH至9. 0，加入 適量復合蛋白酶II，保溫4小時使血球蛋白充分水解；8、豬血水解蛋白制備酶解結(jié)束后，冷卻至常溫，用0. 22um的濾膜過濾除菌即可 制成液體豬血水解蛋白，也可將該液體噴霧干燥后制成豬血水解蛋白粉。
具體實施例方式下面的實例將具體說明本發(fā)明的操作方法，但不能作為對本發(fā)明的限定。實例1向50L檢疫合格新鮮豬血中加入500g溶于少量去離子水的檸檬酸三鈉，充分攪拌 均勻，4°C以下靜置過夜。按上述發(fā)明方法的步驟2操作，得到血漿約35L、血球約15L。血 漿按上述發(fā)明方法的步驟3操作，用8倍生理鹽水稀釋后再用2mol/L醋酸調(diào)pH至5. 2，低 溫靜置過夜，收集沉淀得凝血酶原。凝血酶原沉淀按上述發(fā)明方法的步驟4、5操作，不冷凍 干燥，得精制凝血酶液1.8L。向冷凍過夜的20L血球中加入適量生理鹽水，使其底物濃度為8-10%，升溫至 10°C左右，高速攪拌20分鐘，按上述發(fā)明方法的步驟7、8操作，采用分段復合酶法水解血球 蛋白，用0. 22um的濾膜過濾除菌后得到豬血水解蛋白液體約150L。該液體可根據(jù)需要，進 一步濃縮制成復合氨基酸營養(yǎng)液，也可以噴霧干燥制成豬血水解蛋白粉。實例2凝血酶活力檢測、豬血水解蛋白組分分析試驗1)材料凝血酶標準品、纖維蛋白原、牛血清白蛋白(購自中國藥品生物制品檢定 所)；凝血酶樣品(按實例1方法自制)。2)檢測方法①凝血酶活力檢測按中華人民共和國藥典(二部)(2000版1056-1057頁)所示的方法；②蛋白質(zhì)含量測定采用福林_酚法。③水解氨基酸高效液相色譜法。3)結(jié)果連續(xù)取3批用上述發(fā)明方法制得的樣品各100ml，按上述檢測方法檢測結(jié) 果見表1、表2。表1樣品檢測數(shù)據(jù)
權(quán)利要求
一種綜合利用豬血的方法，該方法組成步驟如下1)抗凝豬血的制備取檢疫合格的新鮮豬血放入容器1中，該容器中已事先加入了0.5％ 5％(w/v)溶于少量去離子水中的抗凝劑檸檬酸三鈉，充分攪拌均勻，低溫靜置備用；2)血漿、血球分離低溫靜置后，抗凝豬血上層為無色透明液體為血漿，下層深紅色粘稠液體為血球，用虹吸法將上層血漿吸到容器2中；余下的血球經(jīng)轉(zhuǎn)速為3000 3500r/min離心后，將上層血漿合并到容器2中低溫冷凍備用，血球則冷凍貯藏至容器3中過夜待用；3)血漿沉淀收集凝血酶原容器2中的血漿解凍后，濾除上層漂浮的白色絮狀物后，用2 8倍生理鹽水稀釋后再用2mol/L醋酸調(diào)pH至5.1 5.2，低溫靜置過夜，收集沉淀即得凝血酶原；4)凝血粗酶液制備將收集的凝血酶原沉淀溶解于生理鹽水中，加熱保溫至37℃用1.0％CaCl2溶液，低速攪拌(500 800r/min)20 30分鐘，激活凝血酶原，過濾收集濾液即得凝血酶粗酶液。5)凝血酶精品制備向凝血酶粗酶液中加入8 10倍冷生理鹽水，用截留相對分子量(Mr)為60000的超濾膜處理，濃縮至原體積的1/20 1/25后收集截留液，該液體即為精制凝血酶液，也可將截留液冷凍干燥，即得粉狀凝血酶精品；6)血球破壁、溶血向容器3中加入血球體積的適量生理鹽水(使液體中蛋白質(zhì)含量為8％ 10％)，升溫至10℃左右，高速攪拌(1000r/min以上)20 30分鐘；7)血球蛋白分段酶解用4.0mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.5，將溫度升至37 40℃，加入適量復合蛋白酶I，保溫2小時后，再升溫至55 60℃，保溫3小時；調(diào)節(jié)pH至9.0，加入適量復合蛋白酶II，保溫4小時使血球蛋白充分水解；8)豬血水解蛋白制備酶解結(jié)束后，冷卻至常溫，用0.22um的濾膜過濾除菌即可制成液體豬血水解蛋白，也可將該液體噴霧干燥后制成豬血水解蛋白粉。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是復合蛋白酶I由胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋 白酶按一定比例混合而成。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是復合蛋白酶II由堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿 蛋白酶按一定比例混合而成。
全文摘要
本發(fā)明屬生物活性物質(zhì)的分離提取技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及將新鮮豬血經(jīng)抗凝處理后以血漿和血球為出發(fā)底物分別制備凝血酶和豬血水解蛋白的方法。血漿經(jīng)低溫冷凍、沉淀收集凝血酶原、離子激活、酶液純化等步驟制得高活性的凝血酶；血球經(jīng)破壁、溶血、復合酶分段酶解、過濾除菌等步驟制得高活性的豬血水解蛋白。該方法制得的豬血水解蛋白中氨基酸含量占蛋白質(zhì)的80％以上，易于吸收利用。本發(fā)明方法充分利用了原料，一次投料可以生產(chǎn)兩種高附加值產(chǎn)品。整個生產(chǎn)過程避免使用毒性大的有機溶劑，克服了產(chǎn)品單一、溶劑殘留等缺陷，降低了生產(chǎn)成本。用本發(fā)明方法，1L豬血可制得凝血酶精品6000U以上、高活性的豬血水解蛋白粉150g以上。
文檔編號C12N9/74GK101979532SQ20101050476
公開日2011年2月23日 申請日期2010年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月13日
發(fā)明者吳保承, 楊春霞 申請人:江蘇省江大綠康生物工程技術(shù)研究有限公司