專利名稱：一種異苯并呋喃酮類化合物及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種天然藥物，更具體地說，涉及一種從頭孢霉屬AL031真菌次生代 謝產(chǎn)物中分離得到的新的異苯并呋喃酮化合物。同時，本發(fā)明還涉及該化合物的制備方法 和在制藥領域中的應用。在自然界中現(xiàn)存的真菌大約有25萬種，我國至少有10萬余種，已報道8000種左 右，其中傳統(tǒng)藥用及試驗具有藥效的真菌達400余種。真菌代謝產(chǎn)物具有結構類型繁多，生 理活性多樣的特點。因而，跟蹤活性，對真菌化學成分進行研究，可為尋找新結構的活性天 然產(chǎn)物提供一個很好的研究方向。頭孢霉AL031菌株是從云南省哀牢山箭竹上分離篩選到的一種絲狀真菌株，經(jīng)云 南大學生物系楊發(fā)蓉教授鑒定為叢梗孢科、頭孢霉屬(C印halosporium Corde)真菌。據(jù)畢 韻梅等人對該真菌次生代謝產(chǎn)物的研究報道，從該真菌次生代謝產(chǎn)物中分離到的化合物， 發(fā)現(xiàn)具有廣譜的抗菌活性。因此，對該屬真菌次生代謝產(chǎn)物做進一步研究，具有很重要的意 義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于通過對頭孢霉屬真菌AL031次生代謝產(chǎn)物的化學成分進行深 入研究，從而提供一種新的有藥用價值的化合物。本發(fā)明的另一目的是提供一種所述新化合物的制備方法。本發(fā)明進一步的目的是提供所述新化合物在制備抗氧化及抗腫瘤藥物方面的用 途。本發(fā)明的目的通過下述技術方案予以實現(xiàn)。*除非另有說明，本發(fā)明中所采用的百分數(shù)均為質(zhì)量百分數(shù)。A.本發(fā)明從頭孢霉屬真菌AL031次生代謝產(chǎn)物中分離出了一種新化合物，該化合
物用下述結構式表示 該化合物被命名為4，6-二羥基-5-甲氧基-7-甲基-異苯并呋喃酮。其中，Me-表示甲基、MeO —表示甲氧基。
B.本發(fā)明提供了一種所述的異苯并呋喃酮的制備方法，該法采用下述步驟(1)以米飯，玉米粉，甘蔗渣，麥麩為原料，按12 2 3 3(ff/ff/ff/ff)比例混合 滅菌、冷卻；(2)將菌株分類命名為頭孢霉屬AL031真菌接種到混合物中，在37°C下發(fā)酵，發(fā)酵 7天；其菌株的保藏編號為CCTCC Na :M2010140 ；(3)用工業(yè)乙酸乙酯避光冷浸提7天，合并提取液、過濾、減壓濃縮提取液得乙酸 乙酯浸膏，避光保存；(4)浸膏再次用重蒸乙酸乙酯溶解萃取5次，合并萃取液減壓濃縮成浸膏，浸膏用 丙酮溶解后用200 300目硅膠拌樣；(5) 100 200目的硅膠用濕法裝柱進行粗分，先采用用純氯仿作流動相，然后加 甲醇，逐漸加大極性，直到氯仿甲醇的體積比例為9 1 ；梯度洗脫，收集各個部分的洗脫 液；洗脫液的20 1(體積比)部分反復硅膠、凝膠柱層析進行分離，即得到所需化合物。C.對該化合物進行了 DPPH抗氧化及抗腫瘤活性篩選，化合物顯示出較好的抗氧 化及抗腫瘤活性。其對DPPH自由基、HL-60細胞、M49肺癌細胞的半數(shù)清除濃度IC5tl測定 結果分別為 28. 7mg/L、12. 5mg/L、23mg/L。本發(fā)明的有益效果1.頭孢霉屬AL031真菌保持在實驗室中，可以批量發(fā)酵，原料來源簡單；而且本發(fā) 明化合物在該真菌次生代謝產(chǎn)物中含量較高，容易得到；2.采用了避光操作和常規(guī)柱層析制備方法，化合物制備操作流程簡單，所獲得的 本發(fā)明化合物純度高，隨后的工業(yè)化生產(chǎn)很容易實現(xiàn)；3.所述化合物展現(xiàn)出較強的抗氧化、抗腫瘤活性，可為醫(yī)藥工業(yè)提供有藥用價值 的新化合物或先導化合物，預示著很好的藥用前景。


圖1是本發(fā)明化合物高分辨質(zhì)譜(ESI-MS)；圖2是本發(fā)明化合物的核磁共振氫譜(1H NMR)；圖3是本發(fā)明化合物的核磁共振碳譜(13C NMR)；圖4是本發(fā)明化合物的DEPT譜；圖5是本發(fā)明化合物的HMBC相關譜；圖6是本發(fā)明化合物的HMBC相關譜。保藏生物材料的說明本發(fā)明所涉及的真菌菌株，已于2010年6月9日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心； 該中心地址中國.武漢.武漢大學。該菌株分類命名為頭孢霉屬AL031(C印halosporium Corda AL031)，保藏編號為 CCTCC :M2010140。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對 本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并 不用于限定本發(fā)明。
實施例1——化合物的制備1以米飯、玉米粉、甘蔗渣、麥麩為原料，按12 2 3 3 (ff/ff/ff/ff)比例混合滅菌、 冷卻。頭孢霉屬AL031真菌接種到混合物中，在37°C下發(fā)酵，發(fā)酵7天；用工業(yè)乙酸乙酯避 光冷浸提7天，提取1次，提取液過濾、減壓濃縮，得乙酸乙酯浸膏，避光保存；浸膏再次用重 蒸乙酸乙酯溶解萃取，萃取5次，合并萃取液減壓濃縮成浸膏，浸膏用丙酮溶解后用200 300目硅膠拌樣；100 200目的硅膠用濕法裝柱進行粗分，先采用純氯仿作流動相，然后加 甲醇，逐漸加大極性，直到氯仿甲醇的體積比例為9 1 ；收集各個部分的洗脫液；洗脫液 的20 1(體積比)部分反復硅膠、凝膠柱層析進行分離，即得到所需化合物。實施例2——化合物的制備2重復實施例1的過程，但有以下不同用工業(yè)乙酸乙酯避光冷浸提5天，提取2次， 合并提取液、過濾、減壓濃縮得乙酸乙酯浸膏避光保存。實施例3——化合物的制備3重復實施例1的過程，但有以下不同用工業(yè)乙酸乙酯避光冷浸提6天，提取2次， 合并提取液、過濾、減壓濃縮，得乙酸乙酯浸膏避光保存。實施例4——化合物的制備4重復實施例1的過程，但有以下不同浸膏用重蒸乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液 減壓濃縮成浸膏，浸膏用丙酮溶解后用200 300目硅膠拌樣；100 200目的硅膠用干 法裝柱進行粗分，用氯仿甲醇按一定比例梯度洗脫，收集各個部分的洗脫液；洗脫液的 20 1部分反復硅膠、凝膠柱層析進行分離，即得到所需化合物。實施例5——對本發(fā)明化合物的結構鑒定化合物1為無色針晶，mp 253 V ；ESI-MS給出準分子離子峰m/z 211. 0628 [M+H] + (計算值211. 0562)，結合1H NMR, 13C NMR推測分子式為CltlHltlO5,不飽和度為 6。λ max (MeOH) :217nm、255nm。紅外光譜(KBr)中3365，3164CHT1顯示可能有多個羥基存 在。1685CHT1顯示分子中可能有羰基存在，1611，1515cm—1顯示分子中可能存在苯環(huán)。從13C NMR (CD3OD, IOOMHz)中可以看出化合物有2個甲基，1個亞甲基和7個季碳。Sc172.7(C)等 信號確定了酯基的存在，而根據(jù)低場中剩下的6個季碳信號可確定有苯環(huán)存在。結合該化 合物的不飽和度可推測它屬于異苯并呋喃類。1H NMR(CD3OD,400MHz)中可以看出化合物中 存在一個甲基[、=2.42，(3H，s)]，一個甲氧基[δΗ = 3.87，(3Η，s)]。根據(jù)以上化合物 的分子式以及出現(xiàn)的碳譜數(shù)據(jù)和氫譜數(shù)據(jù)，并結合IR可推測分子中還有2個OH存在。從 HMBC譜中可以看出H-3與C-l，C-4，C_4a，C_7a相關，H_8與C_6，C_7a相關。根據(jù)HMBC譜， 甲氧基中的H與5位上的C相關，則推出化合物1中甲氧基連在5位上。通過譜圖綜合分 析，給出化合物的結構，并對其NMR數(shù)據(jù)進行了歸屬(見Tablel. 1)。Table 1. 1 1H NMR, 13C NMR and HMBC data for compound 1
實施例6
一一化合物抗氧化活性檢測
抗氧化活性以清除DPPH自由基能力的大小表示；6. 5 X IO-5Hiol · L-1DPPH溶液用 無水乙醇配制，樣品用甲醇溶解，以0. lmg/mL為初篩濃度，測定其清除自由基DPPH的活性。 在試管中依次加入2. 5mL 6. 5X l(T5mol · L^1DPPH溶液和1. 5mL甲醇，總體積為4. OmL,混勻 20min 后，于 Icm 比色皿中測定 A (517nm)，記為 Atl ；加入 2. 5mL 6. 5Xl(T5mol .Γ1 的 DPPH 溶 液和1. 5mL待測試樣溶液，測定值記為As ；加入2. 5mL甲醇和1. 5mL待測試樣溶液，測定值 記為Ar。樣品對自由基DPPH清除率按下式計算 計算半數(shù)清除濃度IC5tl，IC5tl測定結果為28. 7mg/L，表明本發(fā)明的化合物具有較好 的抗氧化活性。實施例7一一化合物抗腫瘤活性檢測采用改良MTT法評價化合物對腫瘤細胞的增值抑制作用取備用的腫瘤細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，90 μ L/孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h后加入不同 濃度的受試樣品， ο μ L/孔，使其終濃度為100、10、1、0. 1,0. 01 μ g/mL,每個濃度均設3個 復孔。順鉬(DDP)為陽性對照，等體積RPMI1640培養(yǎng)基為陰性對照。同時設化合物100、 10 μ g/mL時相應的DMSO濃度為溶媒對照，以消除DMSO對細胞生長的影響。加藥后繼續(xù)置 于37°C ,5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h，每孔加入MTT (5mg/mL) 20 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)4h，每孔加入三聯(lián) 液[10% SDS-5%異丁醇-0. 012mol/L HCl (W/V/V) ] 100 μ L 溶解甲臜。用酶標儀在 570nm 波長下測定各孔的OD值。按下列公式計算細胞增值抑制率 抑制率(％ ) = (0D值對照孔-OD值給藥孔)/OD值對照孔X 100 % 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用Microsoft Excel 2003計算抑制率，采用Iogit法，SPSS11. 5 軟件包計算半數(shù)抑制濃度IC5Q。計算半數(shù)抑制濃度IC5tl，對HL-60細胞、M49肺癌細胞IC5tl測定結果為12. 5mg/L, 23mg/L，表明本發(fā)明的化合物具有較好的抗腫瘤活性。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權利要求
一種具有下述結構式的化合物其中，1，3，4a，4，5，6，7，7a，8，9分別表示C1，C3，C4a，C4，C5，C6，C7，C7a，C8，C9。FSA00000180410500011.tif
2.—種權利要求1所述化合物的制備方法，其特征在于該方法采用以下步驟(1)以米飯，玉米粉，甘蔗渣，麥麩為原料，按12 2 3 3的質(zhì)量比例混合滅菌、冷卻；(2)將菌株分類命名為頭孢霉屬AL031的真菌接種到混合培養(yǎng)基中，在37°C下發(fā)酵，發(fā) 酵7天；其菌株的保藏編號為CCTCC Na :M2010140 ；(3)固體發(fā)酵產(chǎn)物用工業(yè)乙酸乙酯避光冷浸提7天，合并提取液、過濾、減壓濃縮提取 液得乙酸乙酯浸膏，避光保存；(4)浸膏再次用重蒸乙酸乙酯溶劑萃取5次，合并萃取液，減壓，再次濃縮成浸膏，浸膏 用丙酮溶解后用200 300目硅膠拌樣；(5)100 200目的硅膠用濕法裝柱進行粗分，先采用純氯仿作流動相，然后加甲醇，逐 漸加大極性，直到氯仿甲醇的體積比例為9 1 ；梯度洗脫，收集各個部分的洗脫液；洗脫 液的20 1部分反復硅膠、凝膠柱層析進行分離，即得到所需化合物。
3.權利要求1所述的化合物作為抗氧化劑的應用。
4.權利要求1所述的化合物在制備抗腫瘤藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有新的化學結構通式(I)的異苯并呋喃酮類化合物及其制備方法和應用；其中的1，3，4a，4，5，6，7，7a，8，9分別表示C1，C3，C4a，C4，C5，C6，C7，C7a，C8，C9；系從菌株分類命名為頭孢霉屬AL031的真菌中分離而得，其菌株的保藏編號為CCTCC№M2010140。對該化合物進行了抗抗氧化活性和抗腫瘤活性篩選，實驗結果顯示化合物顯示出較強的抗氧化和抗腫瘤活性，具有良好的藥物應用前景。
文檔編號C12R1/745GK101928270SQ20101022212
公開日2010年12月29日 申請日期2010年7月9日 優(yōu)先權日2010年7月9日
發(fā)明者關小麗, 戴云, 曾祥慧, 朱蕓, 梁輝, 程春梅, 郭俊明, 黃相中 申請人:云南民族大學