專利名稱：一種草魚(yú)白細(xì)胞介素1β基因和蛋白及其重組表達(dá)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種草魚(yú)白細(xì)胞介素1 β基因的重組表達(dá)和 純化技術(shù)。
背景技術(shù)：
細(xì)胞因子是由多種細(xì)胞產(chǎn)生的一類非抗體非補(bǔ)體能調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)分化，調(diào)節(jié)免疫 功能，參與炎癥發(fā)生及創(chuàng)傷愈合的激素樣(微量而高效)可溶性小分子多肽類物質(zhì)。白細(xì)胞 介素1 β (IL-1 β，Interleukin-I β )是白細(xì)胞介素1細(xì)胞因子家族的成員之一，除IL-1 β 外該家族還包括白細(xì)胞介素-Ια、白細(xì)胞介素-1受體拮抗物(IL-IRa)和白細(xì)胞介素_18 以及新發(fā)現(xiàn)的一些成員。白細(xì)胞介素-ι β是一種重要的炎癥介質(zhì)和免疫因子，在機(jī)體的免 疫應(yīng)答中發(fā)揮著廣泛的調(diào)節(jié)作用，如激活T細(xì)胞、B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的活性，刺激巨噬 細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和前列腺素等炎癥介質(zhì)，此外還可充當(dāng)神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)間的傳導(dǎo)信 號(hào)，以監(jiān)視生理失調(diào)和病原入侵。作為潛在的炎癥介質(zhì)和共刺激信號(hào)分子，白細(xì)胞介素-1 β 可以促進(jìn)前列腺素(PG)的合成和誘導(dǎo)發(fā)熱，提高巨噬細(xì)胞的吞噬活性，并可調(diào)節(jié)其它細(xì)胞 因子的表達(dá)。在哺乳動(dòng)物中白細(xì)胞介素-ι β的前體肽沒(méi)有生物學(xué)活性，需經(jīng)過(guò)白細(xì)胞介 素轉(zhuǎn)換酶(ICE)酶切后成為有活性的成熟肽。在魚(yú)類中白細(xì)胞介素-1 β的前體肽同 樣需要酶切后才能成為有活性的成熟肽，但是在魚(yú)類白細(xì)胞介素-1 β氨基酸序列中卻沒(méi) 有發(fā)現(xiàn)ICE的酶切位點(diǎn)。自從利用同源克隆的方法從虹鱒中克隆出IL-I β基因的全長(zhǎng)cDNA 序列開(kāi)始，白細(xì)胞介素-1 β基因在魚(yú)類中的研究開(kāi)始受到重視。在魚(yú)類白細(xì)胞介素-ι β 的研究中發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞介素-1 β也具有明顯的免疫學(xué)活性，可以活化淋巴細(xì)胞，提高頭腎 白細(xì)胞的吞噬、趨化活性，促進(jìn)免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，提高抗體滴度，并且具有免疫佐劑的 功能。草魚(yú)(Ctenopharyngodon idellus)屬鯉形目鯉科雅羅魚(yú)亞科草魚(yú)屬，俗稱有 鯇、油鯇、草鯇、白鯇、草魚(yú)、草根(東北)、混子、黑青魚(yú)等。英文名=Grass carp。因其生長(zhǎng) 迅速，飼料來(lái)源廣，是中國(guó)淡水養(yǎng)殖的四大家魚(yú)之一，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但草魚(yú)抗病力 和成活率較低，易患出血病、爛鰓病、赤皮病和腸炎病等。各種病害頻繁爆發(fā)，已成為草魚(yú)養(yǎng) 殖業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展的主要瓶頸。而各類獸藥、抗生素盲目無(wú)序的頻繁使用，不僅沒(méi)有明顯 起到預(yù)防與治療病害的作用，而且，這些藥物的大量使用嚴(yán)重破壞了自然生態(tài)環(huán)境，藥品的 殘留還直接威脅到人類的健康，因此，從草魚(yú)本身的免疫防御因子入手研究其抗病機(jī)制和 制定新的疾病防治措施，成為人們迫切需要解決的問(wèn)題。由于白細(xì)胞介素在魚(yú)類炎癥 反應(yīng)中具有廣泛生物學(xué)活性及其在免疫調(diào)控中的重要性，必將使其在草魚(yú)病害防治中非常 重要的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了提供草魚(yú)白細(xì)胞介素1 β基因的重組表達(dá)方法，為草魚(yú)白細(xì) 胞介素Ιβ蛋白的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供可能。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案具體如下草魚(yú)白細(xì)胞介素1β基因，其特征在于，該基因的堿基序列是序列表中的SEQ ID No. 1?；蚓幋a的草魚(yú)白細(xì)胞介素1β蛋白，其特征在于，該蛋白的氨基酸序列是序列 表中的 SEQ ID No. 2。草魚(yú)白細(xì)胞介素1β基因的重組表達(dá)方法，其特征在于，利用同源克隆技術(shù)克隆 得到草魚(yú)白細(xì)胞介素1 β基因的CDNA全序列，利用草魚(yú)白細(xì)胞介素1 β基因的成熟肽序列 構(gòu)建原核表達(dá)載體，篩選出一種用于高效表達(dá)草魚(yú)白細(xì)胞介素1 β基因的重組表達(dá)體系， 通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)和純化從而獲得有活性的重組草魚(yú)白細(xì)胞介素1β蛋白；其具體步驟為步驟1基因克隆利用同源克隆技術(shù)從草魚(yú)頭腎組織中克隆得到草魚(yú)白細(xì)胞介素 1β基因的cDNA部分序列，再由RACE技術(shù)進(jìn)一步得到草魚(yú)白細(xì)胞介素1 β的cDNA全序列；步驟2重組表達(dá)載體的構(gòu)建與篩選根據(jù)草魚(yú)白細(xì)胞介素1 β基因的成熟肽序列， 利用一對(duì)特異性引物rILF 5'-CCG GAA TTC TCT TAC TAT AAG ACC AGCAAG ACCHPrILR 5，-CCG CTC GAG ATC ACT TGT TCT CCA GTG TGA AG-3，在成熟肽序列的兩端引入 EcoRI 和XhoI兩個(gè)不同的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，將該成熟肽序列亞克隆到pET30a(+)表達(dá)載體上， 完成原核表達(dá)載體的構(gòu)建；將構(gòu)建得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，進(jìn) 行篩選鑒定后，將獲得的陽(yáng)性克隆作為工程菌株；步驟3重組蛋白的表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的分離純化將篩選所得的工程菌株，以異丙 基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)為誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；誘導(dǎo)表達(dá)完成后，菌液經(jīng)超聲裂解 并離心得到融合表達(dá)的裂解液，用含6XHis單克隆抗體或鎳離子的親和柱進(jìn)行親和層析， 再以凝膠層析純化，獲得有活性的重組草魚(yú)白細(xì)胞介素1 β蛋白。本發(fā)明的有益效果通過(guò)本發(fā)明的技術(shù)方案可以工業(yè)化生產(chǎn)重組草魚(yú)白細(xì)胞介 素Ιβ，重組草魚(yú)白細(xì)胞介素Ιβ可用于魚(yú)類免疫機(jī)制的理論研究，也可用于制作飼料添加 劑、疫苗的免疫增強(qiáng)劑以及病害防治藥物以及其它醫(yī)藥產(chǎn)品。


圖1是重組草魚(yú)白細(xì)胞介素1 β的SDS-PAGE和用抗His標(biāo)簽抗體進(jìn)行的蛋白免 疫印跡圖。圖2草魚(yú)IL-I β重組蛋白活性鑒定結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面，結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)的說(shuō)明。若未特別指明，實(shí)施例中所 用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。本實(shí)施例中，一種草魚(yú)白細(xì)胞介素1β基因的重組表達(dá)方法，利用同源克隆技術(shù) 克隆得到草魚(yú)白細(xì)胞介素1 β基因的CDNA全序列，利用草魚(yú)白細(xì)胞介素1 β的成熟肽的基 因序列構(gòu)建原核表達(dá)載體，篩選出一種用于高效表達(dá)草魚(yú)白細(xì)胞介素1 β基因的重組表達(dá) 體系，通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)和純化從而獲得具有活性的重組草魚(yú)白細(xì)胞介素1β蛋白；其具體步 驟為步驟1基因克隆利用同源克隆技術(shù)從草魚(yú)頭腎組織中克隆得到草魚(yú)白細(xì)胞介素1β基因的cDNA部分序列，再由RACE技術(shù)進(jìn)一步得到草魚(yú)白細(xì)胞介素1 β基因的cDNA全 序列； 根據(jù)魚(yú)類白細(xì)胞介素1β基因同源比較的結(jié)果，從保守序列中設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物 IL-IbF 5，-CTG ACA GTG C(T/C)G(G/A)CT TTG ATGHPIL-lbR 5，-(T/G)CC A(G/T)T CAT CAA AAG CTG TGC-3’。由草魚(yú)頭腎組織制備cDNA，從中克隆得到草魚(yú)白細(xì)胞介素1 β基因 的cDNA部分序列。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)簡(jiǎn)稱PCR (英文全稱Polymerase Chain Reaction)，本 步驟的PCR反應(yīng)體系如下草魚(yú)頭腎組織cDNA0.31^(微升)
5XPCR Buffer2yL(微升)
25mM MgCL20.81^(微升)
IOmM dNTP0.21^(微升)
10 μ M IL-IbF0.21^(微升)
10 μ M IL-IbR0.21^(微升)
5U/1 Taq 酶0.11^(微升)
加水補(bǔ)到總體積為IOyL(微升)
本步驟的PCR反應(yīng)條件1個(gè)循環(huán)94°C 3min ；30個(gè)循環(huán)94°C 30s, 55 °C 30s，
720C 30s ；1 個(gè)循環(huán):72°C 10min，4°C保存。根據(jù)草魚(yú)白細(xì)胞介素1 β基因的cDNA部分序列設(shè)計(jì)巢式PCR引物，通過(guò)RACE技術(shù) 進(jìn)一步得到草魚(yú)白細(xì)胞介素1 β基因的cDNA全序列，RACE (rapid-amplification ofcDNA ends)技術(shù)是通過(guò)PCR進(jìn)行cDNA末端快速克隆的技術(shù)，由于其為現(xiàn)有技術(shù)，因此不再詳細(xì)描 述。本步驟成功進(jìn)行后，得到一種草魚(yú)白細(xì)胞介素1 β基因，該基因的堿基序列是序 列表中的SEQ ID No. 1。得到草魚(yú)白細(xì)胞介素1β基因后，并由該基因翻譯得到草魚(yú)白細(xì)胞介素1 β蛋白， 該蛋白的氨基酸序列是序列表中的SEQ ID No. 2。步驟2重組表達(dá)載體的構(gòu)建與篩選根據(jù)草魚(yú)白細(xì)胞介素1 β的成熟肽的基因序 列，利用一對(duì)特異性引物 rILF 5’ -CCG GAA TTC TCT TAC TAT AAG ACCAGC AAG ACC-3’ 和 rILR 5，-CCG CTC GAG ATC ACT TGT TCT CCA GTG TGA AG-3，在成熟肽基因序列的兩端引 入EcoRI和XhoI兩個(gè)不同的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，將該成熟肽基因序列亞克隆到pET30a(+) 表達(dá)載體上，完成原核表達(dá)載體的構(gòu)建；將構(gòu)建得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 BL2KDE3)中，進(jìn)行篩選鑒定后，將獲得的陽(yáng)性克隆作為工程菌株；由于在魚(yú)類白細(xì)胞介素1 β氨基酸序列中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)ICE的酶切位點(diǎn)，在與其它魚(yú) 類和哺乳動(dòng)物白細(xì)胞介素-1 β成熟肽的氨基酸序列相似性比較后，確定草魚(yú)白細(xì)胞介素 1β成熟肽氨基酸序列(Ser111-Lys27tl)tj根據(jù)草魚(yú)白細(xì)胞介素1 β成熟肽的cDNA基因序列， 利用一對(duì)特異性引物rILF 5'-CCG GAA TTCTCT TAC TAT AAG ACC AGC AAG ACCHPrILR 5，-CCG CTC GAG ATC ACT TGTTCT CCA GTG TGA AG-3，在成熟肽基因序列兩端引入 EcoRI 和XhoI兩個(gè)不同的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增獲得具有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的草魚(yú)白細(xì)胞 介素1β成熟肽基因序列，將PCR產(chǎn)物與表達(dá)載體pET30a(+)雙酶切后，將草魚(yú)白細(xì)胞介素 1β成熟肽基因序列連接到pET30a(+)上，完成原核系統(tǒng)表達(dá)載體的構(gòu)建，pET30a(+)是購(gòu)
5自Novagen公司的商品化原核表達(dá)載體，通過(guò)公共的商業(yè)途徑獲取。本步驟的PCR反應(yīng)體系如下草魚(yú)頭腎組織cDNA 0. 3 μ L (微升)5 X PCR Buffer4 μ L (微升)25mM MgCL20. 6 μ L (微升)IOmM dNTP0· 4 μ L (微升)10 μ M rILF0· 4 μ L (微升)10 μ M rILR0· 4 μ L (微升)5U/ μ 1高保真酶 0· 4 μ L (微升)
加水補(bǔ)到總體積為20 μ 1本步驟的PCR反應(yīng)條件1個(gè)循環(huán)98°C 30s ；5個(gè)循環(huán)98°C 10s，64°C 30s， 72°C 20s ；30 個(gè)循環(huán)98°C 10s，69°C 30s, 72°C 20s ；1 個(gè)循環(huán)72°C 10min，4°C保存。本步驟的限制性內(nèi)切酶消化體系如下DNA0. 5 μ g10XEcoRI Buffer 2μ 1100 X BSA0. 2 μ 1EcoRI (NEB)0. 5 μ 1XhoI(NEB)0. 5 μ 1加水補(bǔ)到總體積為25 μ 1將上述限制性內(nèi)切酶消化體系，于37°C孵育3小時(shí)。將PCR酶切產(chǎn)物和質(zhì)粒酶切 產(chǎn)物按摩爾比8 1混合純化后連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，分別以載體 引物和基因特異性引物進(jìn)行PCR雙向篩選。篩選出的陽(yáng)性克隆，并經(jīng)序列測(cè)定鑒定后所作 為工程菌株。步驟3 重組蛋白的表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的分離純化將篩選所得的工程菌株，以異丙 基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)為誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；誘導(dǎo)表達(dá)完成后，菌液經(jīng)超聲裂解 并離心得到融合表達(dá)的裂解液，用含6XHis單克隆抗體或鎳離子的親和柱進(jìn)行親和層析， 再以凝膠層析純化，獲得有活性的重組草魚(yú)白細(xì)胞介素1 β蛋白。將篩選所得的陽(yáng)性重組菌BL21(DE3)/pET30a-gcIL-li3單菌落，接種到LB培養(yǎng)基 中，37°C振蕩培養(yǎng)16h。然后按5%比例轉(zhuǎn)接到新鮮LB培養(yǎng)基中，37°C繼續(xù)培養(yǎng)至0D_值 為0. 6 0. 8時(shí)，加入ImM IPTG在30°C誘導(dǎo)4h后，超聲波(200w，超聲3秒，間隔10秒) 破菌10分鐘，4°C IOOOOrpm離心30分鐘取上清。可溶性表達(dá)的目的蛋白可占菌體總目的 蛋白的30%以上。從而完成誘導(dǎo)表達(dá)。按照上述的蛋白表達(dá)條件，擴(kuò)大培養(yǎng)體積，誘導(dǎo)表達(dá)后收集菌體，破碎后離心收集 上清，利用GE公司HisTrap HP柱進(jìn)行親和層析，用結(jié)合緩沖液(20mmol/L Na2HPO4,0. 5mol/ L NaCl，20mmol/L咪唑，pH = 8.0)平衡，將裂解液以0. 45 μ m濾膜過(guò)濾后引流到平衡好的 柱中，上樣完畢后用洗脫緩沖液(20mmol/L Na2HPO4,0. 5mol/L NaCl，500mmol/L咪唑，pH = 8.0)進(jìn)行洗滌，收集洗脫峰組分。為進(jìn)一步純化并脫鹽，利用GE公司SuperdeX75進(jìn)行純 化，以緩沖液(20mmol/L Na2HPO4, pH = 8. 0)洗脫，收集主峰，并經(jīng)SDS-PAGE及抗His標(biāo)簽 抗體進(jìn)行蛋白免疫印跡鑒定。從而完成蛋白質(zhì)純化。如圖1所示，圖中左側(cè)為重組草魚(yú)白細(xì)胞介素1β的SDS-PAGE，圖中右側(cè)為用抗His標(biāo)簽抗體進(jìn)行的蛋白免疫印跡圖。M為Mark， 1為誘導(dǎo)表達(dá)前的工程菌總蛋白，2誘導(dǎo)表達(dá)后的工程菌總蛋白，3純化后的蛋白，由左右兩 側(cè)的圖片可知，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后所得的工程菌株大量表達(dá)分子量為23KDa(千道爾頓)的重組 蛋白，經(jīng)純化后得到高純度的重組草魚(yú)白細(xì)胞介素1 β蛋白。經(jīng)過(guò)上述步驟，從而完成草魚(yú)白細(xì)胞介素1 β基因的重組表達(dá)。進(jìn)一步的，還可以對(duì)獲得的重組草魚(yú)白細(xì)胞介素1β蛋白進(jìn)行活性鑒定。分離 得到草魚(yú)頭腎淋巴細(xì)胞，按6Χ IO5/孔接種到24孔板中，用含10%小牛血清的RPMIl 640 培養(yǎng)液于27°C，5%C02濃度下培養(yǎng)過(guò)夜。分別加入不同濃度的重組草魚(yú)白細(xì)胞介素-1 β 蛋白刺激4小時(shí)后，提取細(xì)胞的RNA，利用反轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)，檢測(cè)草魚(yú)白細(xì)胞介 素-1β基因在mRNA上的表達(dá)(見(jiàn)附圖2)。結(jié)果表明草魚(yú)白細(xì)胞介素1 β蛋白能夠刺激 草魚(yú)頭腎淋巴細(xì)胞草魚(yú)白細(xì)胞介素1 β基因的高表達(dá)，因而具有明顯的生物學(xué)活性。如圖 2所示，Control代表不加入重組草魚(yú)白細(xì)胞介素1 β (IL-1 β )的對(duì)照組，與對(duì)照組相比隨 著用于刺激草魚(yú)頭腎淋巴細(xì)胞的重組草魚(yú)白細(xì)胞介素1 β蛋白濃度(單位為ng/ml)的增 加，草魚(yú)頭腎淋巴細(xì)胞中草魚(yú)白細(xì)胞介素1 β基因的表達(dá)量(IL-1 β expression relative to β -action)也隨之增高。通過(guò)上述實(shí)施例獲得的重組草魚(yú)白細(xì)胞介素1 β蛋白具有以下應(yīng)用前景1.重組草魚(yú)白細(xì)胞介素1 β蛋白用作免疫增強(qiáng)劑。純化的重組產(chǎn)物與各種疫苗合 用，增強(qiáng)疫苗的免疫效價(jià)和免疫保護(hù)力。如與魚(yú)的各種菌苗和疫苗合用，增加疫苗對(duì)魚(yú)的 保護(hù)；與各種畜禽疫苗合用，增加疫苗對(duì)畜禽產(chǎn)品的保護(hù)。2.重組草魚(yú)白細(xì)胞介素1β蛋白用作病害防治藥物。在病害發(fā)生時(shí)，直接使用重 組草魚(yú)白細(xì)胞介素1 β蛋白作為多種防治病害的預(yù)防或治療藥物，對(duì)魚(yú)類和其它動(dòng)物病害 進(jìn)行治療。3.重組草魚(yú)白細(xì)胞介素1 β蛋白用于魚(yú)類免疫機(jī)制的研究。直接使用重組草魚(yú)白 細(xì)胞介素1 β蛋白或該蛋白制備的的單克隆抗體或多克隆抗體，進(jìn)行魚(yú)類及其它動(dòng)物免疫 機(jī)制的研究。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到，這里所述的實(shí)施例是為了幫助讀者理解本發(fā) 明的原理，應(yīng)被理解為本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于這樣的特別陳述和實(shí)施例。本領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)的這些技術(shù)啟示做出各種不脫離本發(fā)明實(shí)質(zhì)的其它各 種具體變形和組合，這些變形和組合仍然在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
一種草魚(yú)白細(xì)胞介素1β基因，其特征在于，該基因的堿基序列是序列表中的SEQ ID No.1。
2.按照權(quán)利要求1所述基因翻譯得到的草魚(yú)白細(xì)胞介素1β蛋白，其特征在于，該蛋白 的氨基酸序列是序列表中的SEQ ID No. 2。
3.一種對(duì)權(quán)利要求1所述基因的重組表達(dá)方法，其特征在于，利用同源克隆技術(shù)克隆 得到草魚(yú)白細(xì)胞介素1β基因的cDNA全序列，利用草魚(yú)白細(xì)胞介素1β的成熟肽的基因 序列構(gòu)建原核表達(dá)載體，篩選出一種用于高效表達(dá)草魚(yú)白細(xì)胞介素1 β基因的重組表達(dá)體 系，通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)和純化從而獲得具有活性的重組草魚(yú)白細(xì)胞介素1 β蛋白；其具體步驟 為步驟1基因克隆利用同源克隆技術(shù)從草魚(yú)頭腎組織中克隆得到草魚(yú)白細(xì)胞介素1 β 基因的cDNA部分序列，再由RACE技術(shù)進(jìn)一步得到草魚(yú)白細(xì)胞介素1 β基因的cDNA全序 列；步驟2重組表達(dá)載體的構(gòu)建與篩選根據(jù)草魚(yú)白細(xì)胞介素1β的成熟肽的基因序列，利 用一對(duì)特異性引物 rILF 5’ -CCG GAA TTC TCT TAC TAT AAG ACCAGC AAG ACC—3’ 禾口 rILR 5，-CCG CTC GAG ATC ACT TGT TCT CCA GTG TGA AG-3，在成熟肽基因序列的兩端引入EcoRI 和XhoI兩個(gè)不同的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，將該成熟肽基因序列亞克隆到pET30a(+)表達(dá)載體 上，完成原核表達(dá)載體的構(gòu)建；將構(gòu)建得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中， 進(jìn)行篩選鑒定后，將獲得的陽(yáng)性克隆作為工程菌株；步驟3重組蛋白的表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的分離純化將篩選所得的工程菌株，以異丙 基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)為誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；誘導(dǎo)表達(dá)完成后，菌液經(jīng)超聲裂解 并離心得到融合表達(dá)的裂解液，用含6XHis單克隆抗體或鎳離子的親和柱進(jìn)行親和層析， 再以凝膠層析純化，獲得有活性的重組草魚(yú)白細(xì)胞介素1 β蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種草魚(yú)白細(xì)胞介素1β基因和蛋白及其重組表達(dá)方法。本發(fā)明提供了草魚(yú)白細(xì)胞介素1β基因和基因編碼的草魚(yú)白細(xì)胞介素1β蛋白。草魚(yú)白細(xì)胞介素1β基因的重組表達(dá)方法，利用同源克隆技術(shù)克隆得到草魚(yú)白細(xì)胞介素1β基因的cDNA全序列，利用草魚(yú)白細(xì)胞介素1β基因的成熟肽序列構(gòu)建原核表達(dá)載體，篩選出一種用于高效表達(dá)草魚(yú)白細(xì)胞介素1β基因的重組表達(dá)體系；其具體步驟為步驟1基因克?。徊襟E2重組表達(dá)載體的構(gòu)建與篩選；步驟3重組蛋白的表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的分離純化。本發(fā)明的有益效果通過(guò)本發(fā)明的技術(shù)方案可以工業(yè)化生產(chǎn)重組草魚(yú)白細(xì)胞介素1β，重組草魚(yú)白細(xì)胞介素1β可用于魚(yú)類免疫機(jī)制的理論研究。
文檔編號(hào)C12N15/70GK101892241SQ20101022174
公開(kāi)日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2010年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月9日
發(fā)明者周紅, 楊瀟, 汪新艷 申請(qǐng)人:電子科技大學(xué)