專利名稱：豬rosa26啟動子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種豬啟動子及其應(yīng)用，尤其涉及R0SA26啟動子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近十年來，轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到迅猛的發(fā)展和廣泛的應(yīng)用，其與克隆技術(shù)的結(jié)合使轉(zhuǎn) 基因動物的生產(chǎn)從基礎(chǔ)研究向產(chǎn)業(yè)化邁進成為可能，而轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)業(yè)化成功的關(guān)鍵就在 于使外源基因在轉(zhuǎn)基因動物中穩(wěn)定、高效和廣泛的表達，目前研究表明，這主要與外源基因 啟動子的活性相關(guān)，因此，得到能使外源基因在轉(zhuǎn)基因動物中穩(wěn)定高效表達的啟動子是十 分重要的。在小鼠中，現(xiàn)已證明，R0SA26啟動子無論是在各個胚胎發(fā)育時期還是在成體各 種組織器官中，即幾乎所有的細胞中都具有廣泛且高效的活性，而且目前已有多個R0SA26 轉(zhuǎn)基因小鼠品系(Zambrowicz BP, Imamoto A, Fiering S, et al. (1997)Disruption of overlappingtranscripts in the ROSA beta geo 26 gene trap strain leads to widespread expressionof beta-galactosidase in mouse embryos and hematopoietic cells.Proc Natl Acad SciUSA，94(8) 3789-3794 ；Kisseberth WC，Brettingen NT,Lohse JK, et al. (1999)Ubiquitous expression of marker transgenes in mice and rats. Dev Biol,214(1) =128-138) 0此外，最近人R0SA26啟動子也以成功克隆，并也驗證了其驅(qū) 動外源基因在各種細胞類型中表達的廣泛性(Stefan Irion,Herve Luche，Paul Gadue，et al. (2007)Identification and targeting of the R0SA26 locus in human embryonic stem cells. NatBiotechnol, 25 1477-1482) 雖然R0SA26啟動子在轉(zhuǎn)基因小鼠中得到廣 泛應(yīng)用，但在轉(zhuǎn)基因大家畜中還未見報通。目前，轉(zhuǎn)基因豬的生產(chǎn)多使用低等真核生物子或 小鼠等其它物種來源的啟動子，由于其異源性，容易受到免疫介導的排斥和表觀遺傳修飾， 導致外源基因沉默，所以不利于外源基因在轉(zhuǎn)基因豬中穩(wěn)定、高效和廣泛的表達。因此豬內(nèi) 源R0SA26啟動子的鑒定與應(yīng)用在轉(zhuǎn)基因豬的生產(chǎn)和研究領(lǐng)域具有實際應(yīng)用價值。本發(fā)明應(yīng)用的啟動子是豬內(nèi)源啟動子，因此在豬或高等哺乳動物基因組中不會受 到免疫介導的排斥和表觀遺傳修飾，能介導外源基因穩(wěn)定高效的表達。另外，豬R0SA26啟 動子能介導外源基因在各個胚胎發(fā)育時期和成體各種組織器官中表達，即在幾乎所有的細 胞中都具有活性，能介導外源基因廣泛的表達。因此本發(fā)明即獲得了一個能介導外源基因 在高等哺乳動物中廣泛、高效和穩(wěn)定表達的啟動子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種豬R0SA26啟動子，用以解決轉(zhuǎn)基因豬外 源基因表達的不穩(wěn)定性以及位置效應(yīng)的不可預(yù)知性。所述啟動子的DNA序列如以下1)或2)或3)所示1)其DNA序列為SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列；2)在嚴格條件下與2)限定的DNA序列能夠雜交且能促進目的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的DNA序列；3)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且能促進目的基因轉(zhuǎn)錄和翻 譯的DNA序列。所述啟動子的克隆方法包括將人，鼠，牛中R0SA26位點的序列進行比對找到同 源的保守序列；設(shè)計引物；以豬基因組為模板，克隆R0SA26啟動子。本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供所述豬R0SA26啟動子的應(yīng)用。所述啟動子的應(yīng)用，其特征在于用于豬外源或內(nèi)源基因的表達。 所述啟動子的應(yīng)用，其特征在于用于豬外源基因或內(nèi)源基因的穩(wěn)定表達。本發(fā)明獲得的豬內(nèi)源啟動子，因此在豬或高等哺乳動物基因組中不會受到免疫介 導的排斥和表觀遺傳修飾，能介導外源基因穩(wěn)定高效的表達。另外，豬R0SA26啟動子能介 導外源基因在各個胚胎發(fā)育時期和成體各種組織器官中表達，即在幾乎所有的細胞中都具 有活性，能介導外源基因廣泛的表達。因此本發(fā)明即獲得了一個能介導外源基因在高等哺 乳動物中廣泛、高效和穩(wěn)定表達的啟動子，為今后相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。


圖1豬內(nèi)源R0SA26啟動子的克隆A 通過PCR克隆得到的豬R0SA26啟動子與豬基因組序列的Blast比對結(jié)果；B PR0SA26啟動子定位；C 豬R0SA26啟動子和小鼠R0SA26啟動子的比對結(jié)果；D 豬R0SA26 啟動子的PCR克隆結(jié)果，紅箭頭所指為目的片段，大小為513bp。圖2第一外顯子的表達檢測圖3轉(zhuǎn)基因陽性細胞的篩選結(jié)果A 流式細胞儀對轉(zhuǎn)基因陽性細胞的篩選；B 轉(zhuǎn)基因陽性細胞在熒光鏡下的照片。圖4GFP轉(zhuǎn)基因胚胎的熒光照片A-F:分別為1-細胞、2-細胞、3-細胞、4-細胞、8-細胞和囊胚期胚胎的照片； Al-Fl為細胞核；A2-F2為GFP蛋白；A3-F3為1和2的合成圖。結(jié)果表明，在胚胎發(fā)育的各 個時期pR0SA26啟動子都能介導外源基因的廣泛表達。圖5第一外顯子及GFP基因在轉(zhuǎn)基因胚胎中的表達A =Q-PCR檢測第一外顯子(Exonl)和GFP基因在各時期克隆胚胎和轉(zhuǎn)基因供體細 胞(donor cell)中的表達；B :RT_PCR檢測第一外顯子(Exonl)和GFP基因在各時期克隆胚 胎和轉(zhuǎn)基因供體細胞(donor cell)中的表達。Tg+為轉(zhuǎn)基因陽性，Tg-為轉(zhuǎn)基因陰性；RT+ 為加入反轉(zhuǎn)錄酶，RT-為沒加反轉(zhuǎn)錄酶。
具體實施例方式實施例1豬R0SA26啟動子R0SA26啟動子如SEQ ID NO. 1所示，或在嚴格條件下(Tm_10 15°C )與SEQ ID NO. 1限定的DNA序列能夠雜交且能促進目的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的DNA序列，或與SEQ ID NO. 1 限定的DNA序列高于90%同源性且能促進目的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的DNA序列。實施例2豬R0SA26啟動子的克隆根據(jù)堿基互補配對原則在序列SEQ ID N0. 15’和3’兩側(cè)設(shè)計克隆全長序列的上、下游引物，并在上、下游引物序列5’端分別加入AseI和NheI酶切位點，用于載體構(gòu)建，最 后通過Oligo 6. 0軟件校驗Tm值和GC含量等各項參數(shù)。引物序列為5’ GCATTAATCTCGAG TTAGGCCCAACGCGGC3，(上游)和 5，CGGCTAGCCCGCGGCCGCCCATCCC3，(下游)。PCR 反應(yīng)體系 為(20ul)試劑體積rTaq0. 1 μ 1dNTP2. 5ulBuffer(IOX)2ul上游引物(5μ Μ)1μ 1下游引物(5μ Μ)1μ 1
DNA 模板0· 4 μ 1蒸餾水13 μ 1PCR 反應(yīng)條件為94 "C 3min ；94 V 30sec，60 V 30sec, 72 V Imin (30cycles)； 72°C IOmin ；4°C lh。通過PCR克隆得到的豬R0SA26啟動子與豬基因組序列的Blast比對結(jié)果。結(jié)果 表明克隆得到的PR0SA26與豬基因組序列100%匹配，沒有任何突變(圖1A)；通過Blast 比對發(fā)現(xiàn)PR0SA26位于豬第13號染色體上(圖1B)；豬R0SA26啟動子和小鼠R0SA26啟動 子的比對結(jié)果。結(jié)果表明兩個啟動子的同源率達到92% (圖1C)；豬R0SA26啟動子的PCR 克隆結(jié)果。紅箭頭所指為目的片段，大小為513bp (圖1D)。實施例3R0SA26基因第一外顯子在豬各種組織中的表達根據(jù)第一外顯子的DNA序列，使用Primer Premier 5. 0軟件設(shè)計，并通過Oligo 6. 0軟件校驗各項參數(shù)，篩選引物對。引物序列為5，CGCCTAGAGAAGAGGCTGTGCTCTG3，(上 游)和 5，CAGAGTCCCGCTCCCCTACCTAGC3，(下游)。Q-PCR 反應(yīng)體系為(20ul)試劑體積SYBR Premix Ex Taq (2X)10 μ 1上游引物(5μ Μ)1μ 1下游引物(5μ Μ)1μ 1cDNA 模板0· 2 μ 1蒸餾水7· 8 μ 1Q-PCR 反應(yīng)條件為95°C IOsec ；95°C 5sec，60°C 31sec(40cycl es) ；95°C 15sec, 60°C 30sec，95°C 15sec。通過Q-PCR檢測第一外顯子在豬各種組織中的表達情況。檢測結(jié)果表明，PR0SA26 可以介導第一外顯子在豬各種組織中廣泛表達，見圖2。實施例4豬轉(zhuǎn)基因胚胎的獲得構(gòu)建質(zhì)粒pEGFP_Cl/pR26，轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細胞；流式細胞儀對轉(zhuǎn)基因陽性細 胞的篩選，轉(zhuǎn)然后24h，陽性率為27. 2 %，第4天陽性率為4. 9 %，進行流式細胞儀分選，分選 后陽性細胞率為57. (圖3-A)；轉(zhuǎn)基因陽性細胞在熒光鏡下的照片。綠色為綠色熒光蛋 白，藍色為細胞核(圖3-B)。
PFF為對照細胞，tPFF為轉(zhuǎn)基因陽性細胞，以這兩種為核供體，構(gòu)建重構(gòu)胚，囊胚 率分別為27. 33%和24. 56%，沒有顯著差異，囊胚細胞數(shù)分別為28. 92和25. 18，也沒有顯 著差異，而且我們檢測了 13個以轉(zhuǎn)基因陽性細胞為核供體構(gòu)建的重構(gòu)胚，在這13個胚胎中 都檢測到GFP的表達，胚胎陽性率達到100%，上述結(jié)果表明pR0SA26啟動子能介導外源基 因在胚胎中高效表達，并對胚胎的發(fā)育沒有顯著影響(表1)。轉(zhuǎn)基因胚胎的熒光照片見圖 4.表1轉(zhuǎn)基因胚胎的體外發(fā)育
供體細胞囊胚率囊胚細胞數(shù)陽性囊胚率PFF27. 33 ±8. 64 “28. 92±7. 4Γ—tPFF24. 56±9. 26 丨25. 18 土 9. 13a100. 00(13/13)相同的上標代表差異不顯著，P > 0. 05分別用AseI和NheI (Takara)酶切質(zhì)粒pEGFP-Cl (clontech)，酶切產(chǎn)物電泳，采 用凝膠回收試劑盒TIANgel Midi Purification Kit (北京天根生化科技有限公司)回收 CMV啟動子去除后的質(zhì)粒片斷，PMD18-T載體(Takara) 16°C過夜連接，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細 胞，涂在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37°C培養(yǎng)10 15h，挑取單克隆，接種于 含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)10 15h，4°C條件下8000r/min離心lmin，收集 菌液，采用質(zhì)粒大提試劑盒Endofree Plasmid Kit(TIANGEN)提取pEGFP_Cl/pR26質(zhì)粒。豬胎兒成纖維細胞的轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24h，將培養(yǎng)的細胞消化稀釋到一定密度(2X105)，接種于大平皿中， 38. 5°C、飽和濕度、5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)至70 90%匯合。將0. 8 μ g質(zhì)粒DNA溶于50 μ 1 無血清的DMEM中，輕輕混勻；將2 μ 1脂質(zhì)體(用前輕輕搖勻)溶于50 μ 1無血清的DMEM 中，輕輕混勻，然后在5min之內(nèi)將兩者混合，用移液器輕輕混勻，室溫靜置孵育20min，使 DNA-脂質(zhì)體復合物形成。之后補加400 μ 1無血清的DMEM，輕輕混勻。用PBS洗待轉(zhuǎn)染的 細胞兩次，再用無血清的DMEM洗待轉(zhuǎn)染的細胞一次，然后將上述混合液加入細胞中，6h后， 倒出轉(zhuǎn)染液，用含20%血清的DMEM取代轉(zhuǎn)染液，38. 5°C、飽和濕度、5% C02繼續(xù)培養(yǎng)。24h 后，熒光顯微鏡觀察。流式細胞儀分選胰酶消化轉(zhuǎn)基因豬成纖維細胞，PBS清洗、懸浮，用于流式細胞儀 (Becton-Dickinson)檢測。細胞檢測時，激發(fā)波長設(shè)為488nm，接受波長設(shè)為525nm，并通 過對野生型豬成纖維細胞(對照)的檢測，確定測量點(排除陰性細胞的自發(fā)熒光)、檢測 門(排除細胞碎片和死細胞)和檢測速度(保證細胞的生物活性)，然后對陽性細胞進行分選。實施例5第一外顯子及GFP基因在轉(zhuǎn)基因胚胎中的表達通過Q-PCR檢測第一外顯子(Exonl)和GFP基因在各時期克隆胚胎和轉(zhuǎn)基因供體 細胞(donor cell)中的表達(圖5A)，結(jié)果表明在胚胎發(fā)育的各個時期pR0SA26啟動子都 能介導第一外顯子和外源基因的廣泛、高效和穩(wěn)定的表達。通過RT-PCR檢測第一外顯子(Exonl)和GFP基因在各時期克隆胚胎和轉(zhuǎn)基因供體細胞(donor cell)中的表達(圖5B)。結(jié)果表明，在胚胎發(fā)育的各個時期pR0SA26啟動 子都能介導第一外顯子和外源基因的廣泛、高效和穩(wěn)定的表達。Q-PCR對第一外顯子和GFP基因表達的檢測相對定量PCR反應(yīng)采用SYBR Green I熒光染料法，應(yīng)用SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)試劑盒。20 μ 1反應(yīng)體系如下試劑體積SYBR Premix Ex Taq (2Χ) 10 μ 1上游引物(5μ Μ)1μ 1 下游引物(5μ Μ)1μ 1cDNA 模板0· 2 μ g蒸餾水7·8μ1反應(yīng)體系在MicroAmp Optical 96-ffell Reaction Plate 中混勻并用 MicroAmp OpticalAdhesiveFilm(美國 ABI 公司)封口。反應(yīng)條件按 ABI 7500 儀器使 用說明書設(shè)置，95 °C IOsec ；95 °C 5sec,60°C 31sec (40cycles) ；95 °C 15sec，60°C 30sec, 95"C 15sec,最后進行融解反應(yīng)(dissociation stage)。反應(yīng)結(jié)果使用 Sequence Detection System software 收集、分析?；虮磉_量分析采用2_δ Δετ法。擴增的熒光信號進入相對穩(wěn)定的對數(shù)增長期時的 熒光值定義為閾值，而PCR擴增反應(yīng)在到達閾值時，發(fā)生的循環(huán)數(shù)定義為CT值。根據(jù)擴增 曲線設(shè)定閾值，然后得到CT值。以18S rRNA作為內(nèi)參，靶基因在實驗組中相對于對照組的Δ Δ CT值通過以下公 式計算Δ ACT = (CT■因-CT18sr醒)實驗組-(CT■因-CT18sr匪)對照組靶基因在實驗組中相對表達水平通過以下公式求出靶基因相對表達水平=2_δ Δετ每組實時定量PCR實驗都獨立重復至少三次。所得數(shù)據(jù)使用SPSS13. 0進行單因 素方差分析(One-Way AN0VA)，當P < 0. 05時即認為差異顯著。實時定量PCR結(jié)果按照“平 均值士標準差”的形式進行繪圖處理。
權(quán)利要求
豬ROSA26啟動子，其特征在于其DNA序列如以下1)或2)或3)所示1)其DNA序列為SEQ ID NO.1所示核苷酸序列；2)在嚴格條件下與2)限定的DNA序列能夠雜交且能促進目的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的DNA序列；3)與1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且能促進目的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的DNA序列。
2.權(quán)利要求1所述啟動子的應(yīng)用，其特征在于用于豬外源或內(nèi)源基因的表達。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的啟動子的應(yīng)用，其特征在于用于豬外源基因或內(nèi)源基因的穩(wěn)定表達。
全文摘要
本發(fā)明公布了豬ROSA26啟動子序列及其應(yīng)用，根據(jù)鼠，牛，人中ROSA26位點的序列比對得到保守序列，根據(jù)保守序列設(shè)計引物擴增得到豬內(nèi)源ROSA26啟動子；得到的ROSA26啟動子用于外源基因的GFP的表達，GFP蛋白在豬中得到廣泛穩(wěn)定的表達，可解決轉(zhuǎn)基因豬外源基因表達的不穩(wěn)定性以及位置效應(yīng)的不可預(yù)知性，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了可能。
文檔編號C12N15/09GK101886075SQ20101021552
公開日2010年11月17日 申請日期2010年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月2日
發(fā)明者劉忠華, 孔慶然, 武美玲 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學