專利名稱：一種從組織中高效分離間充質(zhì)干細胞的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于細胞培養(yǎng)技術領域，具體地說，涉及一種從組織中高效獲取間充質(zhì)干細胞或其它細胞的方法。
背景技術：
組織是獲取干細胞和其它多種細胞的重要來源，這些從組織中分離獲得的干細胞和其它原代細胞可廣泛應用于科學研究和臨床治療。組織貼壁培養(yǎng)法是從組織中獲取細胞的傳統(tǒng)方法，如用于從皮膚組織中獲取成纖維細胞，以及從臍帶組織獲取間充質(zhì)干細胞等。 但長期以來，組織貼壁培養(yǎng)法的關鍵技術環(huán)節(jié)難以掌控，以致細胞分離失敗，或獲取細胞量低，不僅造成寶貴組織資源的浪費，而且使相關的科學研究及臨床應用受阻。解決此法中的技術缺陷，提高獲取原代細胞的成功率和產(chǎn)量具有重大的應用價值。傳統(tǒng)的組織貼壁培養(yǎng)法的具體操作步驟一般是先將組織切成塊狀或片狀，貼在細胞培養(yǎng)皿上(塑料或玻璃細胞培養(yǎng)皿)，含待分離細胞的一面朝下，然后加入細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)數(shù)天，中間更換培養(yǎng)液。但此方法常遇到的一個問題是組織在加入培養(yǎng)液后浮起，使組織內(nèi)的細胞無法貼壁生長，導致細胞分離失敗或細胞產(chǎn)量低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是在傳統(tǒng)組織貼壁培養(yǎng)法的基礎上，解決了貼壁組織加入培養(yǎng)液后的上浮的問題。具體方法是，當組織片或塊貼在細胞培養(yǎng)皿上(塑料或玻璃細胞培養(yǎng)皿，含待分離細胞的一面朝下)后，在組織上面壓一個帶孔的玻璃板或類似物，再加入細胞培養(yǎng)液。這樣既借助玻璃板或類似物的重力有效防止組織上浮，又通過玻璃板或類似物上面的孔保證組織內(nèi)、外營養(yǎng)物質(zhì)及氣體的交換，從而顯著提高從組織中分離細胞的效率和產(chǎn)量。本發(fā)明的組織貼壁培養(yǎng)法可使從臍帶組織分離間充質(zhì)干細胞的產(chǎn)量較傳統(tǒng)方法提高50%以上，長出間充質(zhì)干細胞的時間提前3天以上。這不但提高了細胞分離的效率，而且保證了干細胞等稀缺細胞的有效分離。本發(fā)明解決了用傳統(tǒng)組織貼壁培養(yǎng)法分離細胞的過程中經(jīng)常遇到的易失敗、產(chǎn)量低等缺陷，是一種高效、可靠、高細胞質(zhì)量的從組織中分離細胞的方法。


為直觀形象地說明本發(fā)明的內(nèi)容，在說明書附圖部分附3個圖，分別作如下說明圖1.有孔玻璃板，從左向右分別適用于150mm、IOOmm和6孔板細胞培養(yǎng)皿。圖2.有孔玻璃板的使用方法先將組織塊貼在培養(yǎng)皿上，再將有孔玻璃板壓到組織塊上面，最后加入細胞培養(yǎng)液。圖3.用有帶孔的玻璃板壓在培養(yǎng)的臍帶組織上面，分離臍帶組織中的間充質(zhì)干細胞。
具體實施例方式
實施例1制備有孔玻璃板或類似物玻璃板所用材料應對細胞無毒；玻璃板以透明為宜，以便于觀察；玻璃板大小不限，一般以少小于細胞培養(yǎng)皿大小為宜；玻璃板上有大小適當、數(shù)量足夠的貫通孔，以保證營養(yǎng)及氣體的交換?？椎拇笮〔幌蓿话阋苑奖阃ㄟ^其換培養(yǎng)液為宜；玻璃板厚度適當，使帶孔玻璃板在培養(yǎng)液中有一定的下沉力，但又不過度擠壓組織，影響組織內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的交換。舉例從臍帶組織中分離間充質(zhì)干細胞，可用下列有孔玻璃板。150mm細胞培養(yǎng)皿，可用直徑130mm、厚2mm的圓形玻璃板，上有直徑為4mm的圓孔80個；IOOmm細胞培養(yǎng)皿，可用直徑80mm、厚2mm的圓形玻璃板，上有直徑為4mm的圓孔30個；6孔板細胞培養(yǎng)皿， 可用直徑35mm、厚2mm的圓形玻璃板，上有直徑為4mm的圓孔11個(見圖1)。以上有孔玻璃板也可用于從皮膚組織中分離成纖維細胞。玻璃板的厚度和所含孔的大小和數(shù)量可變化，以更適合從不同組織中分離細胞的要求。實施例2從臍帶分離間充質(zhì)干細胞將新鮮人臍帶切成0. 5-2cm的段，從中間剖開，可去掉或不去掉血管，用刀在暴露面上多次劃痕，使Wharton膠充分暴露。將組織貼在培養(yǎng)皿上(塑料或玻璃細胞培養(yǎng)皿)， Wharton膠暴露面與培養(yǎng)皿緊密接觸，各組織塊間距離適當。然后再將帶孔玻璃板壓在組織切片上方。最后加入細胞培養(yǎng)液(如含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液)至沒過組織(見圖 2和圖幻。小心將培養(yǎng)皿移至細胞培養(yǎng)箱內(nèi)，在37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)，每3天更換80% 的培養(yǎng)液。換液時，通過玻璃板上的孔，小心將培養(yǎng)液吸出，避免移動玻璃板。數(shù)日后顯微鏡下可見細胞從組織周邊長出。收集貼壁細胞時，可先取出組織上方的玻璃板，再進行胰蛋白酶消化，也可在胰蛋白酶消化后，再取出玻璃板，后者細胞收獲量稍高。鑒定間充質(zhì)干細胞的特征，包括細胞表面特征性蛋白的表達和向脂肪細胞、成骨細胞和軟骨細胞分化的能力。 運用免疫磁珠等方法純化間充質(zhì)干細胞。本方法較傳統(tǒng)方法(無帶孔玻璃板加蓋，其它步驟相同)分離間充質(zhì)干細胞的產(chǎn)量提高50%以上，長出間充質(zhì)干細胞的時間提前3天以上。實施例3從皮膚組織分離成纖維細胞人或鼠皮膚在去毛后酒精消毒，人皮膚需刮去皮膚脂肪層。將新鮮皮膚切成小塊， 用分散酶(dispase)消化去除表皮層(可省略)，將皮膚貼在培養(yǎng)皿上(塑料或玻璃細胞培養(yǎng)皿)，真皮面朝下，組織間距離適當。然后再將帶孔玻璃板壓在組織切片上方。最后加入細胞培養(yǎng)液(如含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液)至沒過組織。小心將培養(yǎng)皿移至細胞培養(yǎng)箱內(nèi)，在37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)，每3天更換80%的培養(yǎng)液。換液時，通過玻璃板上的孔，小心將培養(yǎng)液吸出，避免移動玻璃板。數(shù)日后顯微鏡下可見細胞從組織周邊長出。收集細胞時，可先取出組織上方的玻璃板，再進行胰蛋白酶消化，也可在胰蛋白酶消化后，再取出玻璃板，后者細胞收獲量稍高。以上實施實例旨在說明有孔玻璃板(或類似物)在細胞分離過程中的使用方法， 某些操作步驟可根據(jù)需要靈活變化。
權利要求
1.一種從組織中高效獲取間充質(zhì)干細胞細胞或其它細胞的方法，其特征是在貼壁培養(yǎng)的組織的上方壓帶孔的玻璃板或類似物，大大提高細胞分離成功率及細胞的產(chǎn)量，縮短培養(yǎng)時間。
2.根據(jù)權利要求1所述，其特征在于，在貼壁培養(yǎng)的組織的上方壓帶有一個或多個孔的玻璃板或類似物。
3.根據(jù)權利要求1所述，其特征在于，壓在培養(yǎng)組織塊上的有孔玻璃板或類似物可以是一片或多片。
4.根據(jù)權利要求1所述，其特征在于，壓在培養(yǎng)組織塊上的帶孔的玻璃板或類似物可因培養(yǎng)皿或其它培養(yǎng)體系的形狀而呈圓、方或其它任意形狀。
5.根據(jù)權利要求1所述，其特征在于，可使用于從臍帶組織或其它組織(如皮膚、胎盤等)中獲取間充質(zhì)干細胞或其它一種或多種細胞貼壁生長的細胞。
6.根據(jù)權利要求1所述，其特征在于，本技術適用于組織及組織工程產(chǎn)品的培養(yǎng)。
7.根據(jù)權利要求1所述，本方法其特征包括但不限于以下部分或全部操作步驟(1)制備有孔玻璃板或類似物，其比重大于培養(yǎng)液，使之在培養(yǎng)液中能下沉；玻璃板或類似物可以帶有一個或多個孔，可以是一片或多片，可以是圓形、方形或其它任意形狀；(2)組織切塊(含待分離細胞的面朝下)貼在細胞培養(yǎng)皿(塑料或玻璃細胞培養(yǎng)皿) 上后，再將帶孔玻璃板或類似物壓在組織上方，然后加入細胞培養(yǎng)液；(3)更換培養(yǎng)液的方法為，通過玻璃板上的孔，小心將培養(yǎng)液吸出，避免移動玻璃板；(4)收集細胞的方法為，當一定量的細胞從組織周邊長出后，用胰蛋白酶消化，收獲貼壁的細胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從組織中高效分離間充質(zhì)干細胞的方法，屬于細胞培養(yǎng)技術領域。本發(fā)明旨在解決傳統(tǒng)組織貼壁培養(yǎng)法分離間充質(zhì)干細胞中，貼壁組織塊在加入培養(yǎng)液后上浮，使組織內(nèi)的細胞無法貼壁生長，導致分離失敗或細胞產(chǎn)量低的問題。該改良的組織貼壁培養(yǎng)法在傳統(tǒng)組織貼壁培養(yǎng)法的基礎上，增加一個帶孔玻璃板或類似物壓在貼壁的組織塊上，即有效防止組織上浮，又保證組織內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)及氣體的交換，從而顯著提高從組織中分離間充質(zhì)細胞的成功率和產(chǎn)量。本發(fā)明中的技術方法可廣泛用于從多種組織中獲取干細胞及其它多種細胞，簡單實用，易于操作，將廣泛應用于細胞研究、細胞及組織工程產(chǎn)品的研發(fā)和生產(chǎn)。
文檔編號C12N5/07GK102311939SQ20101021572
公開日2012年1月11日 申請日期2010年6月30日 優(yōu)先權日2010年6月30日
發(fā)明者劉陳雄, 吳耀炯, 李智龍 申請人:吳耀炯