專利名稱：一種從骨實(shí)質(zhì)中分離間充質(zhì)干/祖細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分離干細(xì)胞的方法，特別是涉及一種從骨實(shí)質(zhì)中分離間充質(zhì)干/祖細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)是骨髓中的非造血干細(xì)胞，具備向成骨、成軟骨和成脂肪細(xì)胞分化的能力，具有免疫調(diào)節(jié)和造血支持作用。因此，MSC不但是組織工程化骨和軟骨構(gòu)建中重要的種子細(xì)胞，而且由于MSC促進(jìn)造血重建和抑制移植物抗宿主反應(yīng)功能，在造血細(xì)胞移植中也具有廣泛的應(yīng)用前景。MSC具有體外貼壁生長(zhǎng)特性，利用細(xì)胞的貼壁性能，人們已經(jīng)從人、犬、兔、大鼠、雞、綿羊、山羊、豬和牛骨髓中，成功分離出MSC。
將人或牛等其他動(dòng)物骨髓細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)，貼壁的細(xì)胞群體中含有間充質(zhì)干/祖細(xì)胞(mesenchymal stem/progenitor cells，MSPC)、內(nèi)皮細(xì)胞和血細(xì)胞。由于培養(yǎng)體系中血清濃度較低，且經(jīng)過(guò)嚴(yán)格篩選，體系中未添加內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子或其他細(xì)胞因子，不利于內(nèi)皮細(xì)胞和血細(xì)胞增殖。因此，隨著培養(yǎng)傳代進(jìn)行，MSPC成為貼壁層中的主要成分，所占比例在90％以上。小鼠是開展有關(guān)MSPC細(xì)胞生物學(xué)研究的理想模型，然而，利用文獻(xiàn)方法進(jìn)行小鼠骨髓體外培養(yǎng)時(shí)，由于血細(xì)胞不易從貼壁層中去除，建立MSPC培養(yǎng)體系十分困難。最近的研究表明，人和小鼠骨實(shí)質(zhì)中存在MSPC，為分離培養(yǎng)小鼠MSPC提出了新的途徑。本發(fā)明發(fā)明人曾利用小鼠骨碎片和骨髓細(xì)胞共同培養(yǎng)的方法，以純化骨髓中的間充質(zhì)干/祖細(xì)胞，獲得了比較滿意的結(jié)果(Sun S，Guo Z，Xiao X，et al.Isolation of mouse marrow mesenchymal progenitors by a novel and reliablemethod.Stem Cells 2003；21527-35)。但是所獲得細(xì)胞中仍然含有相當(dāng)數(shù)量的CD45+細(xì)胞，而且，相當(dāng)數(shù)量為堿性磷酸酶陽(yáng)性的成骨細(xì)胞。因此可以認(rèn)為，采用上述方法所得到的貼壁細(xì)胞群中不但有血細(xì)胞的殘存，而且，部分細(xì)胞可能不是真正的干細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種實(shí)用簡(jiǎn)單的從骨實(shí)質(zhì)中分離間充質(zhì)干/祖細(xì)胞的方法。
本發(fā)明所提供的從骨實(shí)質(zhì)中分離間充質(zhì)干/祖細(xì)胞的方法，包括如下步驟1)用膠原蛋白酶溶液消化骨片；2)將消化后的骨片在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，去除非貼壁細(xì)胞，得到貼壁細(xì)胞，即為所述的間充質(zhì)干/祖細(xì)胞。
其中，步驟1)所述骨片大小為1-2mm，在消化前經(jīng)過(guò)含5-15％體積胎牛血清的PBS緩沖液沖洗。常用骨片為小鼠股骨片，此時(shí)得到的細(xì)胞為小鼠MSPC細(xì)胞。步驟1)常用的膠原蛋白酶為膠原蛋白酶II，其重量百分濃度為0.1-0.15％，溶劑為含有15-20％體積胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基。
步驟2)所述培養(yǎng)基為含有1-2mmol/L谷氨酰胺，10％體積胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基；培養(yǎng)條件為35-38℃、5％CO2，培養(yǎng)時(shí)間為2-3天。
將所得到的MSPC細(xì)胞利用低血清體系進(jìn)行傳代培養(yǎng)，細(xì)胞體外增殖旺盛，最終從每根股骨可獲得6×107以上細(xì)胞，可完全滿足一般細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)所需數(shù)量。
本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，方便實(shí)用，所得到間充質(zhì)干/祖細(xì)胞純度高，沒有血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞殘存；分化性能好，具有向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和成脂肪細(xì)胞等細(xì)胞分化的能力。本發(fā)明建立了穩(wěn)定實(shí)用的MSPC細(xì)胞純化培養(yǎng)技術(shù)體系，為開展MSPC細(xì)胞的研究奠定了基礎(chǔ)。


圖1為MSPC培養(yǎng)照片；圖2A-圖2I為消化骨片培養(yǎng)獲得的MSPC細(xì)胞的流式細(xì)胞分析結(jié)果；圖3A-圖3I為消化細(xì)胞培養(yǎng)獲得的細(xì)胞的流式細(xì)胞分析結(jié)果；圖4A-圖4F為誘導(dǎo)MSPC細(xì)胞組織化學(xué)染色照片；圖5A-圖5C為誘導(dǎo)MSPC細(xì)胞RT-PCR的電泳照片。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、小鼠間充質(zhì)干/祖細(xì)胞的分離和鑒定一、小鼠間充質(zhì)干/祖細(xì)胞(MSPC)的分離1、實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物2-4周齡雌性C57BL/6小鼠，購(gòu)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用符合軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物指南；實(shí)驗(yàn)試劑膠原蛋白酶II和α-MEM購(gòu)自GIBCO公司，胎牛血清(FCS)為加拿大Hyclone公司產(chǎn)品，經(jīng)篩選后使用；各種單克隆抗體購(gòu)于PharMingen公司；膠原蛋白酶II溶于含20％FCS(體積百分比)的α-MEM中，使用濃度為0.1％(重量百分比)。
2、實(shí)驗(yàn)方法
1)骨片消化及接種無(wú)菌條件下取小鼠股骨，剔除肌肉及肌腱組織，用含10％體積FCS的PBS緩沖液沖洗骨髓腔至骨轉(zhuǎn)為白色，然后將骨剪為大小2毫米的碎片，置入含0.1％膠原蛋白酶II中，37℃振蕩消化2小時(shí)，振蕩頻率為200rpm。去除消化下來(lái)的細(xì)胞懸液，洗滌骨碎片，將骨片置37℃、5％CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為含2mM谷氨酰胺，10％FCS(體積百分比)的α-MEM，骨片密度為每75cm2(細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)表面積)接種2根股骨碎片。3天后換液，去除非貼壁細(xì)胞，貼壁細(xì)胞即為小鼠MSPC細(xì)胞。
作為對(duì)比，將消化下來(lái)的細(xì)胞懸液也在相同條件下進(jìn)行培養(yǎng)，其接種密度為5×105/cm2(細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)表面積)。
2)細(xì)胞培養(yǎng)及傳代貼壁層形成后，用0.05％胰蛋白酶/2mM EDTA消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后按3000細(xì)胞/cm2進(jìn)行傳代培養(yǎng)；之后，細(xì)胞密度達(dá)50％左右時(shí)進(jìn)行消化傳代。
其他如人、犬、兔、大鼠、雞、綿羊、山羊、豬和牛等動(dòng)物的MSPC細(xì)胞可以采用以上相同的過(guò)程從其骨實(shí)質(zhì)中分離培養(yǎng)得到。
二、小鼠間充質(zhì)干/祖細(xì)胞(MSPC)的鑒定除特殊說(shuō)明的外，鑒定對(duì)象為本發(fā)明方法得到的細(xì)胞。
1、細(xì)胞生長(zhǎng)情況將骨碎片培養(yǎng)24小時(shí)后，即可在骨片周圍發(fā)現(xiàn)少許成纖維細(xì)胞樣貼壁細(xì)胞，48小時(shí)出現(xiàn)由數(shù)個(gè)細(xì)胞組成的小集落，72小時(shí)時(shí)集落由十?dāng)?shù)個(gè)細(xì)胞組成。培養(yǎng)約5天時(shí)細(xì)胞形成70-80％融合的貼壁層，結(jié)果如圖1。
2、流式細(xì)胞學(xué)分析將所得小鼠MSPC細(xì)胞和消化細(xì)胞培養(yǎng)獲得的細(xì)胞分別傳代培養(yǎng)3代后收集細(xì)胞，按0.5μg/1×106細(xì)胞分別加入PE或FITC標(biāo)記抗CD29、CD31、CD34、CD45、CD105、Sal-1等單克隆抗體，室溫反應(yīng)30分鐘，PBS洗滌兩次后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，每個(gè)反應(yīng)至少收集10000個(gè)點(diǎn)數(shù)據(jù)，以相應(yīng)同型抗體管為陰性對(duì)照。
圖2A-圖2I分別為用本發(fā)明方法消化骨片培養(yǎng)獲得的MSPC細(xì)胞與CTL-FITC(陰性對(duì)照)，CD45-FITC，Scal-1-FITC，H2b-FITC，CD31-FITC，CTL-PE(陰性對(duì)照)，CD34-PE，CD44-PE，CD29-PE的分析結(jié)果(縱坐標(biāo)細(xì)胞數(shù)；橫坐標(biāo)相對(duì)熒光強(qiáng)度)。由圖可見，通過(guò)消化骨片培養(yǎng)獲得的MSPC細(xì)胞均一表達(dá)CD29、CD44和Scal-1(圖2C、圖2H、圖2I)，提示為一群干/祖細(xì)胞；不表達(dá)CD31、CD34和CD45(圖2F、圖2D、圖2B)，表明細(xì)胞群體中沒有血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞殘存。
圖3A-圖3I分別為消化細(xì)胞培養(yǎng)獲得的細(xì)胞與CTL-FITC(陰性對(duì)照)，CD45-FITC，Scal-1-FITC，H2b-FITC，CD31-FITC，CTL-PE(陰性對(duì)照)，CD34-PE，CD44-PE，CD29-PE的分析結(jié)果，由圖3組可見，采用消化細(xì)胞懸液培養(yǎng)得到的細(xì)胞表面抗原譜與本發(fā)明方法通過(guò)消化骨片培養(yǎng)獲得的MSPC細(xì)胞類似，但是，與MSPC細(xì)胞不同的是，該細(xì)胞群體中有相當(dāng)比例細(xì)胞表達(dá)CD45(圖3B)，即使傳代5次后仍有部分細(xì)胞為CD45陽(yáng)性，說(shuō)明其中還含有部分血細(xì)胞。
3、MSPC細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及組織化學(xué)鑒定按文獻(xiàn)方法(Sun S，Guo Z，Xiao X，et al.Isolation of mouse marrow mesenchymalprogenitors by a novel and reliable method.Stem Cells 2003；21527-35)進(jìn)行所得小鼠MSPC細(xì)胞的誘導(dǎo)分化成骨分化體系包括抗壞血酸磷酸鹽、地塞米松和β磷酸甘油；應(yīng)用含轉(zhuǎn)化因子-β(TGF-β1)的無(wú)血清體系、微球培養(yǎng)法誘導(dǎo)向成軟骨細(xì)胞分化；脂肪分化體系包括地塞米松和胰島素。
1)組織化學(xué)染色鑒定以未加誘導(dǎo)體系的細(xì)胞為對(duì)照，利用堿性磷酸酶和von Kossa染色鑒定成骨細(xì)胞，阿爾辛藍(lán)染色顯示細(xì)胞外蛋白聚糖鑒定成軟骨細(xì)胞，油紅O染色鑒定脂肪細(xì)胞類型。圖4A-圖4F依次為成骨誘導(dǎo)前、成骨誘導(dǎo)后、軟骨誘導(dǎo)前、軟骨誘導(dǎo)后、脂肪誘導(dǎo)前、脂肪誘導(dǎo)后細(xì)胞的染色照片，結(jié)果表明，培養(yǎng)細(xì)胞具有體外成骨、成軟骨和成脂肪能力。
2)RT-PCR鑒定收集誘導(dǎo)細(xì)胞，應(yīng)用Trizol試劑(GIBICO/BRL)提取細(xì)胞總RNA，以之為模板進(jìn)行RT-PCR，反轉(zhuǎn)錄及cDNA擴(kuò)增按mRNA選擇性RT-PCR試劑盒(購(gòu)于Takarashuzo)說(shuō)明書進(jìn)行，引物序列如表1所示。
表1.RT-PCR引物序列及其特異性

圖5A-圖5C分別為小鼠MSPC細(xì)胞誘導(dǎo)為成脂肪細(xì)胞、誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞、誘導(dǎo)為成軟骨細(xì)胞的PR-PCT電泳照片，其中，泳道1為誘導(dǎo)前細(xì)胞，泳道2為誘導(dǎo)后細(xì)胞；結(jié)果表明，體外誘導(dǎo)后細(xì)胞能表達(dá)系列特異性mRNA成脂肪誘導(dǎo)后細(xì)胞表達(dá)PPAR-γ，成骨誘導(dǎo)后細(xì)胞表達(dá)骨鈣素，成軟骨誘導(dǎo)后細(xì)胞表達(dá)II型膠原蛋白，說(shuō)明所得到的MSPC細(xì)胞具有成骨、成軟骨和成脂肪能力，符合公認(rèn)的MSC標(biāo)準(zhǔn)。
應(yīng)用常規(guī)誘導(dǎo)體系培養(yǎng)本發(fā)明方法所獲得的MSPC細(xì)胞，經(jīng)組織化學(xué)染色和RT-PCR鑒定細(xì)胞類型，結(jié)果顯示，MSPC具有向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化的能力，證實(shí)本發(fā)明方法所得的MSPC具有干細(xì)胞特點(diǎn)。
權(quán)利要求
1.一種從骨實(shí)質(zhì)中分離間充質(zhì)干/祖細(xì)胞的方法，包括如下步驟1)用膠原蛋白酶溶液消化骨片；2)將消化后的骨片在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，去除非貼壁細(xì)胞，得到貼壁細(xì)胞即為所述的間充質(zhì)干/祖細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟1)所述骨片大小為1-2mm；所述骨片為小鼠股骨片。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟1)所述骨片在消化前還經(jīng)過(guò)含5-15％體積胎牛血清的PBS緩沖液沖洗。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟1)所述膠原蛋白酶為膠原蛋白酶II。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟1)所述膠原蛋白酶II溶液的重量百分濃度為0.1-0.15％，溶劑為含有15-20％體積胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的方法，其特征在于步驟2)所述培養(yǎng)基為含有1-2mmol/L谷氨酰胺，10％體積胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于步驟2)所述培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為35-38℃、5％CO2，培養(yǎng)時(shí)間為2-3天。
8.根據(jù)權(quán)利要求6述的方法，其特征在于步驟2)所述貼壁細(xì)胞還經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其特征在于步驟2)所述貼壁細(xì)胞還經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的方法，其特征在于步驟2)所述貼壁細(xì)胞還經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從骨實(shí)質(zhì)中分離間充質(zhì)干/祖細(xì)胞的方法。本發(fā)明所提供的從骨實(shí)質(zhì)中分離間充質(zhì)干/祖細(xì)胞的方法，包括如下步驟1)用膠原蛋白酶溶液消化骨片；2)將消化后的骨片在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，去除非貼壁細(xì)胞，得到貼壁細(xì)胞，即為所述的間充質(zhì)干/祖細(xì)胞。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，方便實(shí)用，所得到間充質(zhì)干/祖細(xì)胞純度高，沒有血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞殘存；分化性能好，具有向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和成脂肪細(xì)胞等細(xì)胞分化的能力。本發(fā)明建立了穩(wěn)定實(shí)用的小鼠MSPC細(xì)胞純化培養(yǎng)技術(shù)體系，為開展MSPC細(xì)胞的研究奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N5/06GK1673358SQ20051005526
公開日2005年9月28日 申請(qǐng)日期2005年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月17日
發(fā)明者李秀森, 李紅, 郭子寬, 于曉?shī)l, 毛寧 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所