專利名稱：一套檢測(cè)常見(jiàn)腸道致病菌的寡核苷酸探針及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物檢測(cè)技術(shù)、尤其是腸道致病菌的核酸檢測(cè)技術(shù)范疇。本發(fā)明涉及一套能夠檢測(cè)李氏菌屬、副溶血性弧菌、彎曲菌屬、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、耶爾森氏菌屬、金黃色葡萄球菌、肉毒梭菌、蠟樣芽孢菌屬、沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、志賀氏菌、痢疾桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、變形桿菌、布魯氏菌、腸出血性大腸桿菌O157:H7和霍亂弧菌的寡核苷酸探針，該套探針的序列及用途。
背景技術(shù)：
腸道致病菌是臨床上引起以腹瀉、嘔吐為癥狀傳染病的主要病原體。常見(jiàn)的致病菌有李氏菌屬、副溶血性弧菌、彎曲菌屬、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、耶爾森氏菌屬、金黃色葡萄球菌、肉毒梭菌、蠟樣芽孢菌屬、沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、志賀氏菌、痢疾桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、變形桿菌、布魯氏菌、腸出血性大腸桿菌O157:H7和霍亂弧菌等十七個(gè)種屬，其中蠟樣芽孢桿菌、炭疽桿菌等作為一類細(xì)菌進(jìn)行檢出；李氏菌屬主要以單增李氏菌最為常見(jiàn)；耶爾森氏菌屬主要以鼠疫耶爾森氏菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌為主；彎曲菌屬中最為常見(jiàn)的是空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌。這些細(xì)菌可通過(guò)食物和飲水等途徑導(dǎo)致大規(guī)模暴發(fā)，嚴(yán)重威脅人類的飲食安全和正常生活，并且給社會(huì)帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)不完全統(tǒng)計(jì)報(bào)告，2000年全球有210萬(wàn)人死于腹瀉，大部分歸因于食物和飲用水中致病菌的污染；而且尤其是近幾年腸道疾病的實(shí)際發(fā)病率要比報(bào)告的病例數(shù)多300-500倍，全世界的患病者以達(dá)數(shù)億，并且每年的統(tǒng)計(jì)數(shù)值都居高不下。美國(guó)每年約有7600萬(wàn)例腸道致病菌導(dǎo)致的疾病，其中有32500人住院治療，5000人死亡；細(xì)菌污染造成的腸道疾病(食物中毒)也是我國(guó)食品安全和臨床診斷中最突出的問(wèn)題。據(jù)國(guó)家衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì)，2000年共收到重大食物報(bào)告達(dá)150起，中毒6237人死亡135人；2001共發(fā)生重大食物中毒事件185起，15715人中毒，146人死亡。這些由于多種致病菌導(dǎo)致的腸道疾病影響的國(guó)家范圍之廣、危急健康人群之多都是其他原因引起疾病所不及的。
16S rRNA和23S rRNA在細(xì)菌的分類鑒定學(xué)上具有重要的生物學(xué)意義，在生物進(jìn)化過(guò)程中比其他基因演變得慢，真細(xì)菌的16S rRNA和23S rRNA保守性強(qiáng)，被稱之為“細(xì)菌進(jìn)化的活化石”。但是這種保守性也是相對(duì)的，也就是說(shuō)在16S rRNA和23S rRNA序列上存在著每種細(xì)菌特異性的片段。通過(guò)對(duì)各種細(xì)菌的16S rDNA和23S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)其上的序列可變區(qū)和恒定區(qū)是交錯(cuò)排布的。因此本專利中分別在16S rDNA和23S rDNA序列上選取的一對(duì)引物作為通用引物，在其間選取特異性序列作為探針，對(duì)上述十七個(gè)種屬的細(xì)菌進(jìn)行鑒別。
細(xì)菌性痢疾是由痢疾桿菌導(dǎo)致的一種疾病。在臨床上病歷較多，且傳染性強(qiáng)。ipaH是大質(zhì)粒上編碼侵襲質(zhì)?？乖璈的一段基因，其特異性的存在于痢疾桿菌中，包括志賀氏菌屬的四種致病菌和侵襲性大腸桿菌，因此針對(duì)ipaH設(shè)計(jì)引物和探針，可以對(duì)細(xì)菌性痢疾進(jìn)行鑒別。
沙門氏菌是一種在臨床上常見(jiàn)的腸道致病菌，根據(jù)臨床癥狀和生化特征分為傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌等。其中傷寒沙門氏菌是該菌屬中最具有代表性的，它可以導(dǎo)致傷寒熱，在臨床上癥狀不是很明顯，這就給診斷帶來(lái)一定的麻煩；而且它還是生物反恐任務(wù)中的重要項(xiàng)目。VipR是位于傷寒沙門氏菌染色體ViaB區(qū)域中的一種編碼調(diào)控Vi抗原表達(dá)的基因，與其他腸道致病菌中的序列進(jìn)行對(duì)比，具有很高的特異性。因此選取該基因作為檢測(cè)的目的片段，設(shè)計(jì)引物和探針，在經(jīng)過(guò)16S rDNA序列上的探針鑒定為沙門氏菌的前提下，進(jìn)一步對(duì)傷寒沙門氏菌進(jìn)行甄別。
長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)于腸道致病菌的實(shí)驗(yàn)室金標(biāo)準(zhǔn)鑒定手段還停留在培養(yǎng)、血清和生化方面等傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)檢測(cè)水平，步驟繁瑣且需要數(shù)天才能得到結(jié)果，在一定的程度上限制了對(duì)腸道致病菌的快速鑒定，也給臨床治療帶來(lái)諸多不便。免疫學(xué)方法的應(yīng)用縮短了實(shí)驗(yàn)操作的時(shí)間，但是該方法也存在其實(shí)驗(yàn)樣品的特殊性以及結(jié)果的假陽(yáng)性率偏高等問(wèn)題。近年來(lái)，PCR和核酸雜交技術(shù)的應(yīng)用以其操作簡(jiǎn)單、快速和結(jié)果直觀等特點(diǎn)極大地促進(jìn)了細(xì)菌檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展。對(duì)于將多數(shù)量的腸道致病菌同時(shí)進(jìn)行鑒定的要求，目前常用的方法都無(wú)法達(dá)到。因此DNA芯片技術(shù)以其特有的優(yōu)勢(shì)被應(yīng)用到了腸道致病菌的檢測(cè)鑒定中。
DNA芯片(DNA microarrays)是近年來(lái)發(fā)展成熟的一種高通量基因檢測(cè)技術(shù)，是分子生物學(xué)發(fā)展史上的又一重大技術(shù)突破，其特點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)操作和數(shù)據(jù)處理的集成化、微型化、自動(dòng)化。DNA芯片的一個(gè)主要用途是多基因平行檢測(cè)，是一種發(fā)展前景廣闊的多基因大規(guī)模檢測(cè)新技術(shù)。DNA芯片技術(shù)檢測(cè)的關(guān)鍵之處在于設(shè)計(jì)、篩選一系列高特異性、高靈敏度、高穩(wěn)定性的匹配探針，固定于玻璃片等固相載體上，利用樣品與探針的雜交反應(yīng)，經(jīng)掃描、分析后即可得出正確的結(jié)果。就本實(shí)驗(yàn)而言，通過(guò)一次實(shí)驗(yàn)操作就可確定樣品中腸道致病菌的種類，極大地提高了檢測(cè)效率，為臨床診斷及食品鑒定提供了簡(jiǎn)便、快捷的技術(shù)手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一套用于檢測(cè)常見(jiàn)腸道致病菌的寡核苷酸探針，包含以下各組探針的全部或?yàn)椴糠痔结樀慕M合，各部分的探針長(zhǎng)度在25-50堿基之間。
a.金黃色葡萄球菌的16S rDNA基因檢測(cè)探針b.李斯特氏菌屬的16S rDNA基因檢測(cè)探針c.腸出血性大腸桿菌O157:H7的23S rDNA基因檢測(cè)探針
d.霍亂弧菌的16S rDNA基因檢測(cè)探針e.耶爾森氏菌屬的16S rDNA基因檢測(cè)探針f.小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的16S rDNA基因檢測(cè)探針g.沙門氏菌屬的16S rDNA基因檢測(cè)探針h.傷寒沙門氏菌的對(duì)Vi抗原表達(dá)基因ViaB起到正調(diào)控作用的基因VipR檢測(cè)探針i.志賀氏菌屬的16S rDNA基因檢測(cè)探針j.痢疾桿菌的大質(zhì)粒上編碼侵襲質(zhì)?？乖璈基因ipaH檢測(cè)探針k.副溶血性弧菌的16S rDNA基因檢測(cè)探針l.副溶血性弧菌的23S rDNA基因檢測(cè)探針m.志賀氏菌屬、沙門氏菌屬和大腸桿菌共有的16S rDNA基因檢測(cè)探針n.產(chǎn)氣莢膜梭菌的16S rDNA基因檢測(cè)探針o.彎曲菌屬的16S rDNA基因檢測(cè)探針p.變形桿菌的16S rDNA基因檢測(cè)探針q.蠟樣芽孢菌屬的16S rDNA基因檢測(cè)探針r.肉毒梭菌的16S rDNA基因檢測(cè)探針s.真細(xì)菌通用的16S rDNA基因檢測(cè)探針t.布魯氏菌的16S rDNA基因檢測(cè)探針本發(fā)明還提供了各部分探針的核苷酸序列，詳見(jiàn)表1-1。還提供了一套可以同時(shí)檢測(cè)常見(jiàn)腸道致病菌的寡核苷酸探針，包含上述a～t二十個(gè)部分。
本發(fā)明通過(guò)優(yōu)選，進(jìn)一步提供了一套特異性好，靈敏度高的探針，其中a探針為SA5，b探針為L(zhǎng)I2和LI3，c探針為O157:H7-1和O157:H7-2，d探針為VC1，e探針為YE1，f探針為ye-2e，g探針為SHI1，h探針為V2和V3，i探針為SAL1，j探針為I-1和I-2，k探針為VP1，1探針為VP23，m探針為SS5，n探針為CP-new-1，o探針為Cam-5，p探針為PR-2，q探針為B-6，r探針為CB-1，s探針為common-2-1和common-3-1，t探針為Bru-2。
此外，本發(fā)明還提供了上述寡核苷酸探針的用途，利用一套探針可通過(guò)核酸雜交反應(yīng)對(duì)樣品中的常見(jiàn)腸道致病菌進(jìn)行檢測(cè)，尤其適用于基于基因芯片技術(shù)的檢測(cè)。利用探針還可以在鑒定出沙門氏菌和志賀氏菌的同時(shí)，進(jìn)一步確定出是否為傷寒沙門氏菌和痢疾桿菌。
具體的說(shuō)，本發(fā)明內(nèi)容是這樣實(shí)現(xiàn)的根據(jù)選取的近三十種腸道致病菌及其相關(guān)近源種屬的16S rDNA、23S rDNA的全序列(每種菌至少要三種不同的Genebank序列號(hào)，以免所選區(qū)域個(gè)別堿基出現(xiàn)差別)，使用clustalx1.8.msw Alignment程序?qū)腉enebank的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到的近三十種細(xì)菌的16S rDNA、23S rDNA基因序列進(jìn)行比對(duì)，得到堿基對(duì)齊圖和聚類分析的結(jié)果。根據(jù)堿基對(duì)齊圖可以劃分出16S rDNA、23S rDNA基因中的保守區(qū)和差異較大的變化區(qū)，然后再使用primer5.0軟件在保守區(qū)尋找通用引物，在變化區(qū)尋找特異性的探針，使得各個(gè)探針的Tm值及兩對(duì)引物間的Tm值基本相同。然后分別在痢疾桿菌(包括志賀氏菌屬內(nèi)的四種致病菌和侵襲性大腸桿菌)的大質(zhì)粒上編碼侵襲質(zhì)粒抗原H基因(ipaH)上和傷寒沙門氏菌的對(duì)Vi抗原表達(dá)基因ViaB起到正調(diào)控作用的基因(VipR)上設(shè)計(jì)引物和探針，共設(shè)計(jì)91條寡核苷酸探針，探針長(zhǎng)度在25-50堿基之間。寡核苷酸探針序列與上述基因特定區(qū)域DNA正鏈的堿基序列一致(探針序列見(jiàn)表1-1)。
利用上述的一套探針，可以通過(guò)雜交反應(yīng)對(duì)樣品中的相應(yīng)病原菌進(jìn)行檢測(cè)，尤其適用于基于DNA芯片原理的檢測(cè)，具有較高的靈敏度和特異性。在進(jìn)行基于DNA芯片原理的檢測(cè)時(shí)，需要把探針全部或其中一部分用適當(dāng)?shù)姆椒ü潭ㄓ诠滔蜉d體上(如玻璃片、硅基片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等)，成為M×N排布的探針陣列，即為DNA芯片。然后利用優(yōu)化的相應(yīng)的PCR引物擴(kuò)增待檢樣品中的致病菌，選擇引物的要求是能夠擴(kuò)增出所有細(xì)菌的包含探針?biāo)趨^(qū)域的片段。在擴(kuò)增的同時(shí)引入熒光標(biāo)記、生物素標(biāo)記或其他合適的標(biāo)記物。擴(kuò)增產(chǎn)物作為探針檢測(cè)的靶分子，在一定條件下與芯片共保溫30分鐘至數(shù)小時(shí)，利用熒光掃描儀或其他相應(yīng)的檢測(cè)設(shè)備即可以檢測(cè)到雜交信號(hào)。根據(jù)探針出現(xiàn)信號(hào)的位置可以判定出樣品中致病菌的種類。
除了基于DNA芯片原理的檢測(cè)外，這套探針也可以用于基于反相斑點(diǎn)雜交的檢測(cè)首先將探針固定于合適的載體上，提取待檢細(xì)菌核酸，并對(duì)細(xì)菌的核酸進(jìn)行標(biāo)記，然后，將標(biāo)記好的核酸與載體上的探針進(jìn)行雜交反應(yīng)，最后，提供合適的儀器設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)。
本發(fā)明提供的探針能夠快速、準(zhǔn)確、高效地檢測(cè)出樣品中的致病菌的種類。如果制備成相應(yīng)的試劑盒，可以廣泛用于臨床細(xì)菌感染性疾病的診斷、抗菌素篩選、環(huán)境監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)、衛(wèi)生監(jiān)督與食品檢疫、細(xì)菌學(xué)分類、流行病學(xué)調(diào)查等方面。


圖1為致病菌16S rDNA引物PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果。1DL2000 Marker，2單增李氏菌，3空腸彎曲菌，4小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，5霍亂弧菌，副溶血性弧菌，7變形桿菌，8金黃色葡萄球菌，9臘樣芽孢桿菌，10產(chǎn)氣莢膜梭菌，11志賀氏菌，12沙門氏菌。
圖2為致病菌23S rDNA引物PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果。1100bp DNA Ladder Marker，2單增李氏菌，3空腸彎曲菌，4小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，5霍亂弧菌，6副溶血性弧菌，7變形桿菌，8金黃色葡萄球菌，9臘樣芽孢桿菌，10產(chǎn)氣莢膜梭菌，11志賀氏菌，12沙門氏菌。
圖3為16S rDNA、ipaH和23S rDNA、vipR二重PCR結(jié)果。1傷寒沙門氏菌23S rDNA引物擴(kuò)增結(jié)果，2傷寒沙門氏菌vipR引物擴(kuò)增結(jié)果，3傷寒沙門氏菌23S rDNA和vipR引物二重PCR擴(kuò)增結(jié)果，4DL2000 Marker，5-9痢疾桿菌(志賀氏菌屬四種細(xì)菌和侵襲性大腸桿菌)16S rDNA、ipaH二重PCR擴(kuò)增結(jié)果，10痢疾桿菌ipaH引物擴(kuò)增結(jié)果，11痢疾桿菌16S rDNA引物擴(kuò)增結(jié)果。
圖4為十七種腸道致病菌檢測(cè)基因芯片探針排列位置。
圖5為基因芯片分別與十七種腸道致病菌及其他陰性細(xì)菌的熒光標(biāo)記PCR產(chǎn)物雜交結(jié)果。其中傷寒沙門氏菌和痢疾桿菌雜交圖均系二重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雜交結(jié)果。
具體實(shí)施例方式為了進(jìn)一步說(shuō)明一套用于同時(shí)檢測(cè)上述十七個(gè)種屬常見(jiàn)腸道致病菌寡核苷酸探針的實(shí)施方式和用途，參照以下實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明。實(shí)施例是為了解釋而不是以任何方式限制本發(fā)明的范圍，本領(lǐng)域技術(shù)人員在權(quán)利要求的范圍內(nèi)所做出的某些改變和調(diào)整也應(yīng)認(rèn)為屬于本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1.檢測(cè)十七個(gè)種屬腸道致病菌的寡核苷酸探針的篩選和優(yōu)化1.檢測(cè)十七個(gè)種屬腸道致病菌的寡核苷酸探針的設(shè)計(jì)探針?lè)謩e設(shè)計(jì)在細(xì)菌16S rRNA和23S rRNA以及痢疾桿菌中大質(zhì)粒上編碼侵襲質(zhì)粒抗原H(ipaH)和傷寒沙門氏菌調(diào)控Vi抗原表達(dá)等基因序列上，具有較高的靈敏度和特異性，寡核苷酸探針序列與上述基因特定區(qū)域DNA正鏈的堿基序列一致(探針序列見(jiàn)表1-1)。探針長(zhǎng)度在25-50堿基之間。探針合成時(shí)在其3’端氨基修飾，用于探針與載玻片表面的活性醛基發(fā)生反應(yīng)并固定到載體表面。
表1-1檢測(cè)常見(jiàn)腸道致病菌的寡核苷酸探針備選序列探針 探針序列 探針長(zhǎng)名稱 (5’-3’) 度(BP)SA1aac gga cga gga gct tgc ttc tct gat gtt agc33SA2caa aag tga aag acg gtc ttg ctg tca ctt ata ga 35SA3aaa ctc tgt tat tag gga aga aca tat gtg taa gta36SA4gtg cac atc ttg acg gta cct aat cag aaa gcc acg36
SA5 aca tat gtg taa gta act gtg cac atc ttg acg gta36SA-6 tga cta ctt gta agc aca cgg ttt cag gtt cta ttt36SA-7 aat att ttg aac cgc atg gtt caa aag tga aag33SA-8 tac gac caa ata cta aac18SA-9 caa taa tca tca ctt gag gc 20LI1 aac gga gga aga gct tgc tct tcc aaa gtt agt33LI2 tgt tgt tag aga aga aca agg ata aga gta act gct36LI3 tag aga aga aca agg ata aga gta act gct tgt ccc36Lis-23 gtg gca tgc gcc aca ctt tat c 22VP1 aaa cga gtt atc tga acc ttc ggg gaa cga taa cgg36VP23 ggt acg cag tca cag gac aaa gcc24VC1 cag cac aga gga act tgt tcc ttg ggt ggc gag33YE1 gcg gca gcg gga agt agt tta cta ctt tgc cgg33ye-3 agg ggt tga gtt taa tac gct caa tca ttg30ye-2ecat aaa ggt taa taa cct ttg tga ttg acg t 31SHI1 ggg agt aaa gtt aat acc ttt gct cat tga30V-1 ctg gcc tcc gaa tga tat cta ttt24V-2 ctt caa taa tgc cag cag ctc caa ccc cga aat aga ta 38V-3 aca ggc tgt agc gat tta ggt tca caa aca aat aat tt 38V-4 cgt tat cat ttc aag ttc gcg act a 25V-5 cgg caa cat cag tcc agg ata tta tca gaa atg33SAL1 ggt gtt gtg gtt aat aac cgc agc aat tga30I-1 gaa ggc ctt ttc gat aat gat acc ggc gct ctg ctc tcc c 40I-2 gga ccg tgt cgc gct cac atg gaa caa tct ccg gaa aac cct42I-3 agt ctt tcg ctg ttg ctg ctg atg cca c 28I-4 cct ctg cgg agc ttc gac agc agt ctt tcg ctg tt 35I-5 ata ccg tct ctg cac gca ata cct ccg gat tcc gt 35I-6 tcc gga ttc cgt gaa cag gtc gct gca tgg ct 32H7-1 gca gtc acc cca taa aag agg ct 23H7-2 tca ccc cat aaa aga ggc tcc cac tgc27Cam-1act cct gct taa cac aag ttg agt ag 26
Cam-2 tcg gtg tag gat gag act ata tag 24Cam-3 act cct gct taa cac aag ttg agt agg gaa agt ttt tcg g 40Cam-4 ggt ata gtt aat ctg ccc tac aca aga 27Cam-5 ctc ctt ttc tta ggg aag aat tct gac ggt acc taa gga at 41Cam-6 act cct gct taa cac aag ttg agt agg gaa ag 32Cam-7 gat ttg cct gta taa cct cct acg acc tta gac tag 36Cam-8 cgg agt aaa tcc taa tac aaa gct aac ca 29Cam-9 ttc tat cca tcc gaa gac ttc aaa aag cct t 31Cam-3-1act cct gct taa cac aag ttg agt agg gaa agt ttt tcg g 40B-1cat ttt gaa ccg cat ggt tcg aaa ttg aaa ggc 33B-2gga taa cat ttt gaa ccg cat ggt tcg aaa 30B-3ggc tgt cac tta tgg atg gac ccg cgt c 28B-4tgc tag ttg aat aag ctg gca cct 24B-5ggc ttc ggc tgt cac tta tgg atg gac ccg cgt c 34B-6tgc tag ttg aat aag ctg gca cct tga cg 29B-41 tgc gta gcc gac ctg aga ggg tgt 24CP-1 cga gct caa agt atg t 16CP-2 gcc gag ctc aaa gta tgt 18CP-3 gcc gag ctc aaa gta tgt ggc att 24CP-4 act act cat act cga cgc tag c 22CP-5 gtg ata agg ttc ggt aag cgc tat gcc 27CP-6 ggc ata gcg ctt acc gaa cct tat cac 27cp-16 aag atg gca tca tca ttc aac caa agg agc aat c 34CP-16-1aag atg gca tca tca ttc aac caa agg agc aat cgc tat g 40CP1gaa aga tgg cat cat cat tca acc aaa gga gca atc 36CP-new-1 atg gca tca tca ttc aac caa agg agc aat ccg cta tga gat gga ccc 48CP-new-2 atg gca tca tca ttc aac caa agg agc aat ccg cta tga gat gga 45common-1 cca gac tcc tac ggg agg cag cag t 25common-2 ctc cta cgg gag gca gca gta ggg aat 27common-3 cac act gga act gag aca cgg tc 23common21 act gag aca cgg tcc aga ctc cta cgg gag gca gca gta ggg aat attg49
Common31 cac act gga act gag aca cgg tcg aga ctc cta cgg ga 38SS3 tgt ctg gga aac tgc ctg atg gag g25SS4 cgt cgc aag acc aaa gag ggg gac ctt cgg g31SS5 ggt ttc agg ttc ttt ttc act ccc ctc gcc g31SS6 aac ctg ccc atg gct aga tca ccg ggt ttc ggg tct ata ccc t43SS7 aat ttt tca aca tta gtc ggt tcg gtc ctc cag tta gtg 39SS8 cct ctt gcc atc gga tgt gcc cag atg 27CB-1 tat aag aga atc gca tga ttt tct tat cca aag att tat 39CB-2 atg aag ctt cct tcg gga agt gga tta gcg gc 32CB-3 ggg ata gcc ttc cga aag gaa gat taa tac 30SAL，SHI1gaa cgg taa cag gaa gca gct tgc tgt ttg ctg 33SAL，SHI2aac gtc gca aga cca aag agg 21Bru-1gtg ccc ttc ggg gga aag att tat cgg caa atg atc ggc ccg cgt t46Bru-2cgt acc att tgc tac gga ata act cag gga aac ttg tg 38PR1 taa cag gag aaa gct tgc ttt ctt gct gac 30PR-2 cgt cga gtt cac aat aac agc atc ttc aga 30pr-2 cga gcg gta aca gga gaa agc ttg ctt tct tgc tga 36pr-3 cga gcg gta aca gga gaa agc ttg ctt t28pr-4 gta aca gga gaa agc ttg ctt tct tgc tga cga gc 35pr-5 gtc tac gga cca aag cag ggg ctc ttc gga cct tgc 36pr-6 gtg ata aag tta ata cct tta tca att g28pr-7 att gcg taa cag aga gaa agc ttg ctt tct tgc tga 36pr-8 att gcg taa cag aga gaa agc ttg ctt t28pr-9 taa cag aga gaa agc ttg ctt tct tgc tga ctg agc 36pr-10gtg ata aag tta ata cct ttg tca att g282.擴(kuò)增含有靶基因片斷的PCR引物的設(shè)計(jì)和優(yōu)化根據(jù)細(xì)菌16S rRNA和23S rRNA以及痢疾桿菌中大質(zhì)粒上編碼侵襲質(zhì)?？乖璈(ipaH)和傷寒沙門氏菌調(diào)控Vi抗原表達(dá)(VipR)基因序列設(shè)計(jì)引物，引物序列見(jiàn)表1-2。利用引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物序列中包含各靶基因片段上的探針序列。所有反向引物序列5’端用熒光素Cy3標(biāo)記，以保證PCR產(chǎn)物經(jīng)雜交反應(yīng)后，帶有熒光的反向互補(bǔ)鏈與核苷酸探針結(jié)合產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)。分別對(duì)16S rDNA、ipaH和23S rDNA、VipR引物進(jìn)行兩套二重PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化(優(yōu)化的PCR反應(yīng)電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)附圖3)。
表1-2用于擴(kuò)增含有探針序列靶基因片段的引物序列基因引物序列(5’---3’) 產(chǎn)物長(zhǎng)度 備注名稱 (bp)16S rDNAcgc tgg cgg cag gcc taa cac atg c500 正向引物cgc ggc tgc tgg cac gga gtt agc c反向引物23S rDNAtta aat gat ggc tgc ttc taa gcc 500 正向引物acc gat agt gaa cca gta ccg tga g反向引物ipaHgtt cct tga ccg cct ttc cga tac 330 正向引物gag agt tct gac ttt atc ccg 反向引物VipRggt ttc atc att tct ggc ctc cg 337 正向引物ctc tgc tcc gtc aag atc ttt tca cc 反向引物3.寡核苷酸基因芯片的制備和探針的篩選優(yōu)化將備選寡核苷酸探針純化、定量后，用基因芯片點(diǎn)樣儀點(diǎn)到醛基活化的載玻片上，制成探針微陣列。用熒光標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與基因芯片雜交，得到各探針的雜交圖。針對(duì)不同病原菌的基因片段，根據(jù)芯片雜交結(jié)果選擇各自特異性好，靈敏度高的探針。篩選得到的探針序列見(jiàn)表1-3。
表1-3檢測(cè)常見(jiàn)腸道致病菌的寡核苷酸探針優(yōu)化序列探針探針序列 探針長(zhǎng)度名稱 (BP)SA5 aca tat gtg taa gta act gtg cac atc ttg acg gta 36LI2 tgt tgt tag aga aga aca agg ata aga gta act gct 36LI3 tag aga aga aca agg ata aga gta act gct tgt ccc 36VC1 cag cac aga gga act tgt tcc ttg ggt ggc gag 33YE1 gcg gca gcg gga agt agt tta cta ctt tgc cgg 33ye-2ecat aaa ggt taa taa cct ttg tga ttg acg t 31SHI1 ggg agt aaa gtt aat acc ttt gct cat tga 30V-2 ctt caa taa tgc cag cag ctc caa ccc cga aat aga ta38
V-3aca ggc tgt agc gat tta ggt tca caa aca aat aat tt 38SAL1 ggt gtt gtg gtt aat aac cgc agc aat tga 30I-1gaa ggc ctt ttc gat aat gat acc ggc gct ctg ctc tcc c 40I-2gga ccg tgt cgc gct cac atg gaa caa tct ccg gaa aac cct 42VP1aaa cga gtt atc tga acc ttc ggg gaa cga taa cgg 36VP23 ggt acg cag tca cag gac aaa gcc 24H7-1 gca gtc acc cca taa aag agg ct 23H7-2 tca ccc cat aaa aga ggc tcc cac tgc 27SS5ggt ttc agg ttc ttt ttc act ccc ctc gcc g 31CP-new-1 atg gca tca tca ttc aac caa agg agc aat ccg cta tga gat gga 48cccCam-5 ctc ctt ttc tta ggg aag aat tct gac ggt acc taa gga at 41pr-2 cga gcg gta aca gga gaa agc ttg ctt tct tgc tga 36CB-1 tat aag aga atc gca tga ttt tct tat cca aag att tat 39com21 act gag aca cgg tcc aga ctc cta cgg gag gca gca gta ggg aat 49attgcom31 cac act gga act gag aca cgg tcg aga ctc cta cgg ga 38Bru-2 cgt acc att tgc tac gga ata act cag gga aac ttg tg 38B-6tgc tag ttg aat aag ctg gca cct tga cg 29實(shí)施例2.寡核苷酸探針的特異性和靈敏度評(píng)價(jià)1.基因芯片制備 將寡核苷酸探針用點(diǎn)樣液(6×SSC，0.1％SDS)稀釋至終濃度50μmol/L，取5ul轉(zhuǎn)移至384孔板。用Cartesian芯片制備儀將探針點(diǎn)到醛基片上(探針排列見(jiàn)附圖4，芯片分別與十七個(gè)種屬腸道致病菌的熒光標(biāo)記PCR產(chǎn)物雜交結(jié)果見(jiàn)附圖5)。在該探針微陣列中，以熒光引物的反向互補(bǔ)序列作為陽(yáng)性對(duì)照，以無(wú)關(guān)隨機(jī)序列作為陰性探針對(duì)照，以不含探針的空白點(diǎn)樣液做為陰性對(duì)照。探針序列見(jiàn)表2-1。
表2-1常見(jiàn)腸道致病菌的檢測(cè)基因芯片探針序列探針名稱 探針序列探針長(zhǎng)度(BP)SA5aca tat gtg taa gta act gtg cac atc ttg acg gta36LI2tgt tgt tag aga aga aca agg ata aga gta act gct36
LI3 tag aga aga aca agg ata aga gta act gct tgt ccc 36VC1 cag cac aga gga act tgt tcc ttg ggt ggc gag 33YE1 gcg gca gcg gga agt agt tta cta ctt tgc cgg 33ye-2e cat aaa ggt taa taa cct ttg tga ttg acg t 31SHI1 ggg agt aaa gtt aat acc ttt gct cat tga 30V-2 ctt caa taa tgc cag cag ctc caa ccc cga aat aga ta 38V-3 aca ggc tgt agc gat tta ggt tca caa aca aat aat tt 38SAL1 ggt gtt gtg gtt aat aac cgc agc aat tga 30I-1 gaa ggc ctt ttc gat aat gat acc ggc gct ctg ctc tcc c 40I-2 gga ccg tgt cgc gct cac atg gaa caa tct ccg gaa aac cct 42VP1 aaa cga gtt atc tga acc ttc ggg gaa cga taa cgg 36VP23 ggt acg cag tca cag gac aaa gcc 24H7-1 gca gtc acc cca taa aag agg ct 23H7-2 tca ccc cat aaa aga ggc tcc cac tgc 27SS5 ggt ttc agg ttc ttt ttc act ccc ctc gcc g 31CP-ncw-1 atg gca tca tca ttc aac caa agg agc aat ccg cta tga gat 48gga cccCam-5 ctc ctt ttc tta ggg aag aat tct gac ggt acc taa gga at 41pr-2 cga gcg gta aca gga gaa agc ttg ctt tct tgc tga 36CB-1 tat aag aga atc gca tga ttt tct tat cca aag att tat 39com21 act gag aca cgg tcc aga ctc cta cgg gag gca gca gta ggg 49aat attgcom31 cac act gga act gag aca cgg tcg aga ctc cta cgg ga 38Bru-2 cgt acc att tgc tac gga ata act cag gga aac ttg tg 38B-6 tgc tag ttg aat aag ctg gca cct tga cg 29陰性探針對(duì)照 ccg ctg tat cac aag ggc tgg tac c 25陣列探針對(duì)照 熒光引物反向互補(bǔ)序列253.腸道致病菌寡核苷酸芯片特異性檢測(cè)在優(yōu)化好的兩套二重PCR擴(kuò)增和雜交反應(yīng)條件下，檢測(cè)了146株不同血清型的標(biāo)準(zhǔn)腸道致病菌。其中所包括的常見(jiàn)腸道致病菌大腸桿菌O157H7W933、882364；侵襲性大腸桿菌48017、大腸桿菌、霍亂弧菌O139、O1型、金黃色葡萄球菌6538、沙門氏菌、耶爾森氏菌、蠟樣芽胞桿菌、志賀氏菌、李斯特氏菌、假單胞菌、變性桿菌、布魯氏菌、彎曲桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、副溶血性弧菌、枸櫞酸桿菌、愛(ài)德華氏菌、創(chuàng)傷弧菌、克雷伯氏菌、沙雷氏菌等共146株。以細(xì)菌DNA為模板進(jìn)行兩套二重PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物與芯片雜交。其中除陽(yáng)性對(duì)照探針common21和common31在全部細(xì)菌的雜交結(jié)果中出現(xiàn)信號(hào)外，其他出現(xiàn)信號(hào)的探針均與其雜交的細(xì)菌對(duì)應(yīng)，而一些陰性細(xì)菌的雜交則無(wú)任何信號(hào)產(chǎn)生(見(jiàn)表2-2)。這說(shuō)明所選取的用于鑒別上述十七種腸道致病菌的探針是特異的，也說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)建立在兩套二重PCR基礎(chǔ)上，同時(shí)定性檢測(cè)十七個(gè)種屬腸道致病菌的基因芯片是可靠的。
以上實(shí)施例的技術(shù)要點(diǎn)如下1.寡核苷酸合成寡核苷酸(引物或探針)采用標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)方法在自動(dòng)合成儀(ABI8909)上合成。所有熒光引物在合成中用Cy3亞磷?；噭┰?’端進(jìn)行標(biāo)記。所有寡核苷酸探針在3′端進(jìn)行氨基修飾，氨基與探針序列之間以間隔臂(聚乙二醇磷?；噭?相連。合成完畢用濃氨水55℃作用15小時(shí)脫保護(hù)/切割，OPC柱純化。紫外定量，凍存?zhèn)溆谩?br> 2.多重PCR擴(kuò)增20ul常規(guī)PCR反應(yīng)體系中，正、反向引物濃度均0.5μM，dNTP為100μM，1U Taq DNA聚合酶，1×PCR反應(yīng)緩沖液，50-100ng模板DNA；擴(kuò)增條件為預(yù)變性(94℃，5min)；35個(gè)循環(huán)變性(94℃，30sec)，退火(56℃，30sec)延伸(72℃，30sec)；延伸(72℃，5min)；4℃，∞。
多重不對(duì)稱PCR反應(yīng)中，四對(duì)引物之間濃度的改變對(duì)目的基因的擴(kuò)增效率有明顯的影響，每個(gè)基因的正向與反向熒光引物的比例和雜交信號(hào)的強(qiáng)弱密切相關(guān)。經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，使一個(gè)反應(yīng)管中四個(gè)產(chǎn)物均能達(dá)到相近而且較好的擴(kuò)增效率和雜交信號(hào)。優(yōu)化的結(jié)果為兩套二重PCR反應(yīng)中16S rDNA、ipaH和23S rDNA、vipR基因的正向引物濃度分別為0.25μM、0.25μM，反向熒光標(biāo)記引物濃度分別為0.75μM、0.75μM。20ul反應(yīng)體系中，dNTP為200μM，MgCl2為3mmol，2U TaqDNA聚合酶，1×PCR反應(yīng)緩沖液；擴(kuò)增條件為預(yù)變性(94℃，5min)；40個(gè)循環(huán)變性(94℃，30sec)，退火(56℃，30sec)延伸(72℃，30sec/)；延伸(72℃，5min/)。
3.常見(jiàn)腸道致病菌寡核苷酸芯片制備 寡核苷酸探針用點(diǎn)樣液(6×SSC，0.1％SDS)稀釋至終濃度50μmol/L，取5ul轉(zhuǎn)移至384孔板。用Cartesian芯片制備儀將探針點(diǎn)到醛基片(Telechem)上，點(diǎn)樣儀內(nèi)保持溫度為23℃，相對(duì)濕度大于85％。寡核苷酸芯片制備完畢后，置于載玻片盒內(nèi)室溫放置備用。點(diǎn)樣后的芯片在使用前至少在室溫放置24h。
4.常見(jiàn)腸道致病菌寡核苷酸芯片雜交與檢測(cè)4.1寡核苷酸基因芯片預(yù)處理 寡核苷酸芯片用0.2％SDS清洗2次，接著以水清洗2次，晾干后用于雜交。
4.2雜交和雜交后處理 熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物變性(98℃、5min，冰浴、5min)后與雜交液(5×SSC，5％甲酰胺，0.1％SDS)混勻，取12μ1轉(zhuǎn)移至芯片反應(yīng)區(qū)，芯片置于雜交盒內(nèi)，連同雜交盒浸入50℃水浴中反應(yīng)60分鐘，雜交后的芯片依次在洗液A(1×SSC，0.2％SDS)，洗液B(0.2×SSC)和洗液C(0.1×SSC)中于室溫各洗滌1min。置室溫晾干。
4.3掃描和結(jié)果判定 芯片用芯片掃描儀GenePix 4000B進(jìn)行掃描，用GenePix Pro 4.0軟件分析結(jié)果。
表2-2應(yīng)用基因芯片檢測(cè)146株腸道菌結(jié)果


序列表<110>中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所<120>一套用于檢測(cè)常見(jiàn)腸道致病菌的寡核苷酸探針及其用途<160>91<210>1<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>1aac gga cga gga gct tgc ttc tct gat gtt agc 33<210>2<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>2caa aag tga aag acg gtc ttg ctg tca ctt ata ga 35<210>3<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>3aaa ctc tgt tat tag gga aga aca tat gtg taa gta 36<210>4<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>4gtg cac atc ttg acg gta cct aat cag aaa gcc acg 36<210>5<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>5aca tat gtg taa gta act gtg cac atc ttg acg gta 36<210>6<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>6tga cta ctt gta agc aca cgg ttt cag gtt cta ttt 36
<210>7<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>7aat att ttg aac cgc atg gtt caa aag tga aag 33<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>8tac gac caa ata cta aac 18<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>9caa taa tca tca ctt gag gc 20<210>10<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>10aac gga gga aga gct tgc tct tcc aaa gtt agt 33<210>11<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>11tgt tgt tag aga aga aca agg ata aga gta act gct 36<210>12<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>12tag aga aga aca agg ata aga gta act gct tgt ccc 36<210>13<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>13
gtg gca tgc gcc aca ctt tat c 22<210>14<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>14aaa cga gtt atc tga acc ttc ggg gaa cga taa cgg 36<210>15<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>15ggt acg cag tca cag gac aaa gcc 24<210>16<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>16cag cac aga gga act tgt tcc ttg ggt ggc gag 33<210>17<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>17gcg gca gcg gga agt agt tta cta ctt tgc cgg 33<210>18<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>18agg ggt tga gtt taa tac gct caa tca ttg 30<210>19<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>19cat aaa ggt taa taa cct ttg tga ttg acg t 31<210>20<211>30
<212>DNA<213>人工序列<400>20ggg agt aaa gtt aat acc ttt gct cat tga 30<210>21<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>21ctg gcc tcc gaa tga tat cta ttt 24<210>22<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>22tat cta ttt cgg ggt tgg agc tgc tgg cat tat tga ag 38<210>23<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>23aca ggc tgt agc gat tta ggt tca caa aca aat aat tt 38<210>24<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>24cgt tat cat ttc aag ttc gcg act a 25<210>25<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>25cgg caa cat cag tcc agg ata tta tca gaa atg 33<210>26<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>26ggt gtt gtg gtt aat aac cgc agc aat tga 30
<210>27<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>27gaa ggc ctt ttc gat aat gat acc ggc gct ctg ctc tcc c 40<210>28<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>28gga ccg tgt cgc gct cac atg gaa caa tct ccg gaa aac cct 42<210>29<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>29agt ctt tcg ctg ttg ctg ctg atg cca c 28<210>30<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>30cct ctg cgg agc ttc gac agc agt ctt tcg ctg tt 35<210>31<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>31ata ccg tct ctg cac gca ata cct ccg gat tcc gt 35<210>32<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>32tcc gga ttc cgt gaa cag gtc gct gca tgg ct 32<210>33<211>23<212>DNA
<213>人工序列<400>33gca gtc acc cca taa aag agg ct 23<210>34<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>34tca ccc cat aaa aga ggc tcc cac tgc 27<210>35<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>35act cct gct taa cac aag ttg agt ag 26<210>36<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>36tcg gtg tag gat gag act ata tag 24<210>37<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>37act cct gct taa cac aag ttg agt agg gaa agt ttt tcg g 40<210>38<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>38ggt ata gtt aat ctg ccc tac aca aga 27<210>39<211>41<212>DNA<213>人工序列<400>39ctc ctt ttc tta ggg aag aat tct gac ggt acc taa gga at 41
<210>40<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>40act cct gct taa cac aag ttg agt agg gaa ag 32<210>41<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>41gat ttg cct gta taa cct cct acg acc tta gac tag 36<210>42<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>42cgg agt aaa tcc taa tac aaa gct aac ca 29<210>43<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>43ttc tat cca tcc gaa gac ttc aaa aag cct t 31<210>44<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>44act cct gct taa cac aag ttg agt agg gaa agt ttt tcg g 40<210>45<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>45cat ttt gaa ccg cat ggt tcg aaa ttg aaa ggc 33<210>46<211>30<212>DNA<213>人工序列
<400>46gga taa cat ttt gaa ccg cat ggt tcg aaa 30<210>47<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>47ggc tgt cac tta tgg atg gac ccg cgt c 28<210>48<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>48tgc tag ttg aat aag ctg gca cct 24<210>49<211>34<212>DNA<213>人工序列<400>49ggc ttc ggc tgt cac tta tgg atg gac ccg cgt c 34<210>50<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>50tgc tag ttg aat aag ctg gca cct tga cg 29<210>51<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>51tgc gta gcc gac ctg aga ggg tgt 24<210>52<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>52cga gct caa agt atg t 16<210>53
<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>53gcc gag ctc aaa gta tgt 18<210>54<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>54gcc gag ctc aaa gta tgt ggc att 24<210>55<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>55act act cat act cga cgc tag c 22<210>56<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>56gtg ata agg ttc ggt aag cgc tat gcc 27<210>57<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>57ggc ata gcg ctt acc gaa cct tat cgc 27<210>58<211>34<212>DNA<213>人工序列<400>58aag atg gca tca tca ttc aac caa agg agc aat c 34<210>59<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>59
aag atg gca tca tca ttc aac caa agg agc aat cgc tat g 40<210>60<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>60gaa aga tgg cat cat cat tca acc aaa gga gca atc 36<210>61<211>48<212>DNA<213>人工序列<400>61atg gca tca tca ttc aac caa agg agc aat ccg ctatga gat gga ccc 48<210>62<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>62atg gca tca tca ttc aac caa agg agc aat ccg cta tga gat gga 45<210>63<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>63cca gac tcc tac ggg agg cag cag t 25<210>64<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>64ctc cta cgg gag gca gca gta ggg aat 27<210>65<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>65cac act gga act gag aca cgg tc 23<210>66<211>49
<212>DNA<213>人工序列<400>66act gag aca cgg tcc aga ctc cta cgg gag gca gca gta ggg aat attg 49<210>67<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>67cac act gga act gag aca cgg tcg aga ctc cta cgg ga 38<210>68<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>68tgt ctg gga aac tgc ctg atg gag g 25<210>69<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>69cgt cgc aag acc aaa gag ggg gac ctt cgg g 31<210>70<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>70ggt ttc agg ttc ttt ttc act ccc ctc gcc g 31<210>71<211>43<212>DNA<213>人工序列<400>71aac ctg ccc atg gct aga tca ccg ggt ttc ggg tct ata ccc t 43<210>72<211>39<212>DNA<213>人工序列<400>72aat ttt tca aca tta gtc ggt tcg gtc ctc cag tta gtg 39
<210>73<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>73cct ctt gcc atc gga tgt gcc cag atg 27<210>74<211>39<212>DNA<213>人工序列<400>74tat aag aga atc gca tga ttt tct tat cca aag att tat 39<210>75<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>75atg aag ctt cct tcg gga agt gga tta gcg gc 32<210>76<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>76ggg ata gcc ttc cga aag gaa gat taa tac 30<210>77<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>77gaa cgg taa cag gaa gca gct tgc tgt ttg ctg 33<210>78<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>78aac gtc gca aga cca aag agg 21<210>79<211>46<212>DNA
<213>人工序列<400>79gtg ccc ttc ggg gga aag att tat cgg caa atg atc ggc ccg cgt t 46<210>80<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>80cgt acc att tgc tac gga ata act cag gga aac ttg tg 38<210>81<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>81taa cag gag aaa gct tgc ttt ctt gct gac 30<210>82<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>82cgt cga gtt cac aat aac agc atc ttc aga 30<210>83<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>83cga gcg gta aca gga gaa agc ttg ctt tct tgc tga 36<210>84<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>84cga gcg gta aca gga gaa agc ttg ctt t 28<210>85<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>85gta aca gga gaa agc ttg ctt tct tgc tga cga gc 35
<210>86<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>86gtc tac gga cca aag cag ggg ctc ttc gga cct tgc 36<210>87<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>87gtg ata aag tta ata cct tta tca att g 28<210>88<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>88att gcg taa cag aga gaa agc ttg ctt tct tgc tga 36<210>89<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>89att gcg taa cag aga gaa agc ttg ctt t 28<210>90<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>77taa cag aga gaa agc ttg ctt tct tgc tga ctg agc 36<210>91<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>91gtg ata aag tta ata cct ttg tca att g 28
權(quán)利要求
1.一套用于檢測(cè)常見(jiàn)腸道致病菌的寡核苷酸探針，其特征在于包含以下各組探針的全部或部分探針的組合，各部分的探針長(zhǎng)度在25-50堿基之間。a.金黃色葡萄球菌的16S rDNA基因檢測(cè)探針b.李斯特氏菌屬的16S rDNA基因檢測(cè)探針c.腸出血性大腸桿菌O157H7的23S rDNA基因檢測(cè)探針d.霍亂弧菌的16S rDNA基因檢測(cè)探針e.耶爾森氏菌屬的16S rDNA基因檢測(cè)探針f.小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的16S rDNA基因檢測(cè)探針g.沙門氏菌屬的16S rDNA基因檢測(cè)探針h.傷寒沙門氏菌的對(duì)Vi抗原表達(dá)基因ViaB起到正調(diào)控作用的基因VipR檢測(cè)探針i.志賀氏菌屬的16S rDNA基因檢測(cè)探針j.痢疾桿菌的大質(zhì)粒上編碼侵襲質(zhì)?？乖璈基因ipaH檢測(cè)探針k.副溶血性弧菌的16S rDNA基因檢測(cè)探針l.副溶血性弧菌的23S rDNA基因檢測(cè)探針m.志賀氏菌屬、沙門氏菌屬和大腸桿菌共有的16S rDNA基因檢測(cè)探針n.產(chǎn)氣莢膜梭菌的16S rDNA基因檢測(cè)探針o.彎曲菌屬的16S rDNA基因檢測(cè)探針p.變形桿菌的16S rDNA基因檢測(cè)探針q.蠟樣芽孢菌屬的16S rDNA基因檢測(cè)探針r.肉毒梭菌的16S rDNA基因檢測(cè)探針s.真細(xì)菌通用的16S rDNA基因檢測(cè)探針t.布魯氏菌的16S rDNA基因檢測(cè)探針。
2.如權(quán)利要求1所述的一套寡核苷酸探針，其中a探針選自下列寡核苷酸序列中的1條或數(shù)條SA1aac gga cga gga gct tgc ttc tct gat gtt agcSA2caa aag tga aag acg gtc ttg ctg tca ctt ata gaSA3aaa ctc tgt tat tag gga aga aca tat gtg taa gtaSA4gtg cac atc ttg acg gta cct aat cag aaa gcc acgSA5aca tat gtg taa gta act gtg cac atc ttg acg gtaSA-6 tga cta ctt gta agc aca cgg ttt cag gtt cta tttSA-7 aat att ttg aac cgc atg gtt caa aag tga aagSA-8tac gac caa ata cta aacSA-9caa taa tca tca ctt gag gcb探針選自下列寡核苷酸序列中的1條或數(shù)條LI1 aac gga gga aga gct tgc tct tcc aaa gtt agtLI2 tgt tgt tag aga aga aca agg ata aga gta act gctLI3 tag aga aga aca agg ata aga gta act gct tgt cccLis-23 gtg gca tgc gcc aca ctt tat cc探針選自下列寡核苷酸序列中的1條或數(shù)條H7-1gca gtc acc cca taa aag agg ctH7-2tca ccc cat aaa aga ggc tcc cac tgcd探針選自下列寡核苷酸序列中的1條或數(shù)條VC1 cag cac aga gga act tgt tcc ttg ggt ggc gage探針選自下列寡核苷酸序列中的1條或數(shù)條YE1 gcg gca gcg gga agt agt tta cta ctt tgc cggye-3agg ggt tga gtt taa tac gct caa tca ttgf探針選自下列寡核苷酸序列中的1條或數(shù)條ye-2e cat aaa ggt taa taa cct ttg tga ttg acg tg探針選自下列寡核苷酸序列中的1條或數(shù)條SHI1ggg agt aaa gtt aat acc ttt gct cat tgah探針選自下列寡核苷酸序列中的1條或數(shù)條V-1 aaa tag ata tca ttc gga ggc cagV-2 ctt caa taa tgc cag cag ctc caa ccc cga aat aga taV-3 aca ggc tgt agc gat tta ggt tca caa aca aat aat ttV-4 tag tcg cga act tga aat gat aac gV-5 cat ttc tga taa tat cct gga ctg atg ttg ccgi探針選自下列寡核苷酸序列中的1條或數(shù)條SAL1ggt gtt gtg gtt aat aac cgc agc aat tgaj探針選自下列寡核苷酸序列中的1條或數(shù)條I-1 gaa ggc ctt ttc gat aat gat acc ggc gct ctg ctc tcc cI-2 gga ccg tgt cgc gct cac atg gaa caa tct ccg gaa aac cctI-3 agt ctt tcg ctg ttg ctg ctg atg cca cI-4 cct ctg cgg agc ttc gac agc agt ctt tcg ctg ttI-5 ata ccg tct ctg cac gca ata cct ccg gat tcc gtI-6 tcc gga ttc cgt gaa cag gtc gct gca tgg ctk探針選自下列寡核苷酸序列中的1條或數(shù)條VP1 aaa cga gtt atc tga acc ttc ggg gaa cga taa cgg1探針選自下列寡核苷酸序列中的1條或數(shù)條VP23 ggt acg cag tca cag gac aaa gccm探針選自下列寡核苷酸序列中的1條或數(shù)條SS3 tgt ctg gga aac tgc ctg atg gag gSS4 cgt cgc aag acc aaa gag ggg gac ctt cgg gSS5 ggt ttc agg ttc ttt ttc act ccc ctc gcc gSS6 aac ctg ccc atg gct aga tca ccg ggt ttc ggg tct ata ccc tSS7 aat ttt tca aca tta gtc ggt tcg gtc ctc cag tta gtgSS8 cct ctt gcc atc gga tgt gcc cag atgn探針選自下列寡核苷酸序列中的1條或數(shù)條CP-1 cga gct caa agt atg tCP-2 gcc gag ctc aaa gta tgtCP-3 gcc gag ctc aaa gta tgt ggc attCP-4 act act cat act cga cgc tag cCP-5 gtg ata agg ttc ggt aag cgc tat gccCP-6 ggc ata gcg ctt acc gaa cct tat caccp-16aag atg gca tca tca ttc aac caa agg agc aat cCP-16-1 aag atg gca tca tca ttc aac caa agg agc aat cgc tat gCP1 gaa aga tgg cat cat cat tca acc aaa gga gca atcCP-new-1 atg gca tca tca ttc aac caa agg agc aat ccg cta tga gat gga cccCP-new-2 atg gca tca tca ttc aac caa agg agc aat ccg cta tga gat ggao探針選自下列寡核苷酸序列中的1條或數(shù)條Cam-1act cct gct taa cac aag ttg agt agCam-2tcg gtg tag gat gag act ata tagCam-3act cct gct taa cac aag ttg agt agg gaa agt ttt tcg gCam-4ggt ata gtt aat ctg ccc tac aca agaCam-5ctc ctt ttc tta ggg aag aat tct gac ggt acc taa gga atCam-6act cct gct taa cac aag ttg agt agg gaa agCam-7gat ttg cct gta taa cct cct acg acc tta gac tagCam-8cgg agt aaa tcc taa tac aaa gct aac caCam-9ttc tat cca tcc gaa gac ttc aaa aag cct tCam-3-1 act cct gct taa cac aag ttg agt agg gaa agt ttt tcg gCam-1act cct gct taa cac aag ttg agt agp探針選自下列寡核苷酸序列中的1條或數(shù)條PR1 taa cag gag aaa gct tgc ttt ctt gct gacPR-2 cgt cga gtt cac aat aac agc atc ttc agapr-2 cga gcg gta aca gga gaa agc ttg ctt tct tgc tgapr-3 cga gcg gta aca gga gaa agc ttg ctt tpr-4 gta aca gga gaa agc ttg ctt tct tgc tga cga gcpr-5 gtc tac gga cca aag cag ggg ctc ttc gga cct tgcpr-6 gtg ata aag tta ata cct tta tca att gpr-7 att gcg taa cag aga gaa agc ttg ctt tct tgc tgapr-8 att gcg taa cag aga gaa agc ttg ctt tpr-9 taa cag aga gaa agc ttg ctt tct tgc tga ctg agcpr-10gtg ata aag tta ata cct ttg tca att gq探針選自下列寡核苷酸序列中的1條或數(shù)條B-1 cat ttt gaa ccg cat ggt tcg aaa ttg aaa ggcB-2 gga taa cat ttt gaa ccg cat ggt tcg aaaB-3 ggc tgt cac tta tgg atg gac ccg cgt cB-4 tgc tag ttg aat aag ctg gca cctB-5 ggc ttc ggc tgt cac tta tgg atg gac ccg cgt cB-6 tgc tag ttg aat aag ctg gca cct tga cgB-41 tgc gta gcc gac ctg aga ggg tgtr探針選自下列寡核苷酸序列中的1條或數(shù)條CB-1 tat aag aga atc gca tga ttt tct tat cca aag att tatCB-2 atg aag ctt cct tcg gga agt gga tta gcg gcCB-3 ggg ata gcc ttc cga aag gaa gat taa tacs探針選自下列寡核苷酸序列中的1條或數(shù)條common-1 cca gac tcc tac ggg agg cag cag tcommon-2 ctc cta cgg gag gca gca gta ggg aatcommon-3 cac act gga act gag aca cgg tccommon-2-1 act gag aca cgg tcc aga ctc cta cgg gag gca gca gta ggg aat attgcommon-3-1 cac act gga act gag aca cgg tcg aga ctc cta cgg gat探針選自下列寡核苷酸序列中的1條或數(shù)條Bru-1 gtg ccc ttc ggg gga aag att tat cgg caa atg atc ggc ccg cgt tBru-2 cgt acc att tgc tac gga ata act cag gga aac ttg tg 。
3.如權(quán)利要求1所述的一套寡核苷酸探針，其特征在于同時(shí)包含a～t二十組探針。
4.如權(quán)利要求3所述的一套寡核苷酸探針，其中a探針為SA5，b探針為L(zhǎng)I2和LI3，c探針為O157H7-1和O157H7-2，d探針為VC1，e探針為YE1，f探針為ye-2e，g探針為SHI1，h探針為V2和V3，i探針為SAL1，j探針為I-1和I-2，k探針為VP1，l探針為VP23，m探針為SS5，n探針為CP-new-1，o探針為Cam-5，p探針為PR-2，q探針為B-6，r探針為CB-1，s探針為common-2-1和common-3-1，t探針為Bru-2。
5.權(quán)利要求1～4所述的任一寡核苷酸探針的用途，其特征在于利用探針可對(duì)樣品中的常見(jiàn)腸道致病菌的相應(yīng)基因進(jìn)行檢測(cè)，尤其適用于基于基因芯片技術(shù)的檢測(cè)。
6.權(quán)利要求5所述的寡核苷酸探針的用途，其特征在于利用探針可以檢測(cè)出十七種常見(jiàn)腸道致病菌以及對(duì)痢疾桿菌和傷寒沙門氏菌進(jìn)行區(qū)分。
7.權(quán)利要求5所述的寡核苷酸探針的用途，其特征在于該檢測(cè)可用于臨床疾病診斷、抗菌素篩選、環(huán)境監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)、衛(wèi)生監(jiān)督與進(jìn)出口食品檢疫、細(xì)菌學(xué)分類與流行病學(xué)調(diào)查、生物戰(zhàn)劑檢測(cè)等。
全文摘要
一套用于檢測(cè)常見(jiàn)腸道致病菌的寡核苷酸探針及其用途，屬于微生物檢測(cè)領(lǐng)域(生物工程類檢測(cè)產(chǎn)品)。探針?lè)謩e設(shè)計(jì)在細(xì)菌16S rRNA和23S rRNA以及痢疾桿菌中大質(zhì)粒上編碼侵襲質(zhì)?？乖璈(ipaH)和傷寒沙門氏菌調(diào)控Vi抗原表達(dá)(VipR)等基因序列上，探針長(zhǎng)度在25－50堿基之間，具有較高的靈敏度和特異性。適用于基于核酸雜交原理的檢測(cè)技術(shù)，尤其適用于基因芯片原理的檢測(cè)。在一定的使用條件下，能夠檢測(cè)出實(shí)驗(yàn)樣品中的李氏菌屬、副溶血性弧菌、彎曲菌屬、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、耶爾森氏菌屬、金黃色葡萄球菌、肉毒梭菌、蠟樣芽孢菌屬、沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、志賀氏菌、痢疾桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、變形桿菌、布魯氏菌、腸出血性大腸桿菌O157H7和霍亂弧菌。可用于多種方面，如疾病診斷、環(huán)境檢測(cè)、食物中毒檢測(cè)、進(jìn)出口食品檢疫、細(xì)菌學(xué)分類、流行病學(xué)調(diào)查、生物戰(zhàn)劑檢測(cè)等。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1683565SQ20051005520
公開(kāi)日2005年10月19日 申請(qǐng)日期2005年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月15日
發(fā)明者王升啟, 金大智, 文思遠(yuǎn), 陳蘇紅 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所