專利名稱：活細胞核質(zhì)成像的方法及其在活細胞核質(zhì)信號傳導(dǎo)通路監(jiān)測的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細胞分子生物學(xué)和非線性光學(xué)顯微成像領(lǐng)域，具體來說是一種活細胞
核質(zhì)成像的方法及其在活細胞核質(zhì)信號傳導(dǎo)通路監(jiān)測的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
多細胞生物是一個繁忙而有序的細胞社會，這種社會性的維持不僅依賴于細胞的物質(zhì)代謝與能量代謝，還有賴于細胞通訊與信號傳遞，從而以不同的方式協(xié)調(diào)它們的行為，諸如細胞生長、分裂、死亡、分化及其各種生理功能。 生物體細胞之間的信息轉(zhuǎn)導(dǎo)可通過相鄰細胞的直接接觸來實現(xiàn)，但更重要的也是更為普遍則是通過細胞分泌各種化學(xué)物質(zhì)來調(diào)節(jié)自身和其它細胞的代謝和功能。細胞接受外界信號，通過一整套特定的機制，將胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)為胞內(nèi)信號，最終調(diào)節(jié)特定基因的表達(細胞核內(nèi))，引起細胞的應(yīng)答反應(yīng)，這是細胞信號系統(tǒng)的主線，這種反應(yīng)系列稱之為細胞信號通路(Signaling Pathway)。因此，在人體中，信號傳導(dǎo)通路通常是由分泌釋放信號物質(zhì)的特定細胞、信息物質(zhì)(包含細胞間與細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、分子、離子等)以及靶細胞(包含特異受體等)等構(gòu)成。 信號傳導(dǎo)通常包括以下步驟特定的細胞釋放信息物質(zhì)一信息物質(zhì)經(jīng)擴散或血循環(huán)到達靶細胞一與靶細胞的受體特異性結(jié)合一受體對信號進行轉(zhuǎn)換并啟動細胞內(nèi)信使系統(tǒng)一靶細胞產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。 其中，轉(zhuǎn)錄因子在細胞內(nèi)信息傳遞中起著非常重要的作用，基因轉(zhuǎn)錄過程由這些調(diào)節(jié)蛋白所控制，它們的結(jié)構(gòu)中含有特異性區(qū)域，即DNA結(jié)合區(qū)域，能與靶基因調(diào)節(jié)區(qū)域(即啟動子和增強子)上的特定DNA序列結(jié)合。根據(jù)其DNA結(jié)合區(qū)域的不同，轉(zhuǎn)錄因子被分為不同家族，如核因子NF-k B(Nuclear factor ka卯a(chǎn) B)(張寧譯徐永健校核因子KB : —種新的治療途徑？德國醫(yī)學(xué)1999， 5 :261) 、 JAK/STAT、 DREB等。因此有效監(jiān)控這些轉(zhuǎn)錄因子在核質(zhì)間(細胞質(zhì)與細胞核之間)的轉(zhuǎn)運過程有助于增進了解細胞內(nèi)信號通路，從而對我們進一步理解腫瘤的產(chǎn)生機制以及藥物的作用機制具有重要的現(xiàn)實意義。
熒光標(biāo)定技術(shù)是將熒光標(biāo)記物與特異性目標(biāo)分子相結(jié)合，通過研究熒光標(biāo)記物的行為來示蹤目標(biāo)分子的行為。熒光標(biāo)記物包括所有具備熒光發(fā)射基團的物質(zhì)，如小分子的熒光染料(Fluorescein,Rhodamine，Texas Red等)、生物熒光大分子(GFP及其衍生物等)、量子點(Quantum Dots)熒光探針等。熒光標(biāo)記物與目標(biāo)分子的結(jié)合方式包括直接的特異性結(jié)合(DNA與溴化乙啶EB)、通過抗原抗體介導(dǎo)的間接結(jié)合(免疫熒光標(biāo)定技術(shù))、通過基因重組將生物熒光分子與特定的目標(biāo)分子相結(jié)合的標(biāo)定技術(shù)(如本發(fā)明所使用的GFP標(biāo)定NF-kB的方法)等。 目前研究轉(zhuǎn)錄因子(如核因子NF-k B)活細胞內(nèi)調(diào)控通路的單光子共焦顯微成像的研究中，要獲得熒光標(biāo)記的NF-k B激活前后在核質(zhì)間的動態(tài)分布的信息，首先需要明確細胞核的位置，這通常由下面的方法來實現(xiàn)(l)熒光標(biāo)記蛋白在細胞質(zhì)中大量聚集，而細胞核中濃度極低，以熒光分布的強弱大致判斷細胞核的位置；(2)利用其它熒光染料對細胞核進行標(biāo)定，通過圖像疊加確定目標(biāo)蛋白在細胞核位置的濃度變化；(3)轉(zhuǎn)換到明視場對細胞核成像等。但它們帶來相應(yīng)方法上的不足其中方法(1)實施的前提是篩選到熒光蛋白高表達的細胞株，而這種異常高表達一方面對細胞的正常生理活動會有潛在的影響，另一方面也給細胞株的篩選和維持帶來困難。方法(2)在樣品的準(zhǔn)備過程中增加了一道細胞核熒光染色的程序，外源性的熒光染料進入可能會對細胞的生理狀態(tài)造成一定的影響，并且如果使用在低表達細胞株的情況下(對細胞盡可能微小的外部干擾下)，對實驗數(shù)據(jù)的采集造成困難，從而無法實現(xiàn)對細胞盡可能造成微小外部干擾狀態(tài)下的動態(tài)研究；方法(3)頻繁的進行光路變化帶來繁瑣的操作。 隨著二十世紀(jì)九十年代飛秒激光技術(shù)的出現(xiàn)，近年來快速發(fā)展的非線性雙光子顯
微成像技術(shù)為活體細胞下分子水平的生物醫(yī)學(xué)研究提供了更加有力的工具。 與單光子共焦顯微成像相比，雙光子顯微成像具有以下優(yōu)勢 (1)由于依賴于兩個光子在焦平面的同時作用，非聚焦平面可能發(fā)生的概率極小，具有清晰的自動三維(3D)斷層能力，同時極大程度地降低了焦平面外的光漂白作用和光毒性，可實現(xiàn)樣品長時間的活體成像。 (2)同時由于較長近紅外波長的采用，降低了生物組織對光的吸收和散射效應(yīng)，成像深度大大增加。 非線性雙光子光學(xué)成像中的第 一 種成像模式為雙光子熒光(Two-PhotonFluorescence， TPF)成像模式。近來年由于意識到雙光子熒光成像(TPF)較單光子熒光成像突出的優(yōu)點，同時實際熒光探針技術(shù)等相應(yīng)技術(shù)的成熟，雙光子熒光顯微成像在活體生物組織及細胞中的成像都得到了廣泛的應(yīng)用。 非線性雙光子光學(xué)成像中存在另 一 種重要模式_ 二次諧波(Second-HarmonicGeneration， SHG) 。 SHG現(xiàn)象首度被Franken等于1961年發(fā)現(xiàn)當(dāng)兩個具有相同基頻的光子與具有非對稱結(jié)構(gòu)的樣品相互作用時，散射產(chǎn)生恰好雙倍于激發(fā)頻率的二次諧波光信號(半波長，雙倍能量)。 SHG與TPF—樣，是一種非線性光學(xué)現(xiàn)象，因為它的產(chǎn)生效率(p)與激發(fā)光(I)的強度成非線性平方依賴關(guān)系(P= al2)，因此它同樣具有形成高分辨率非線性光學(xué)成像的基礎(chǔ)，從而擁有雙光子激發(fā)熒光成像的所有優(yōu)點。但雙光子熒光信號與二次諧波信號在彼此特點上有所不同。由于與雙光子熒光產(chǎn)生所涉及的吸收和再發(fā)射過程不同，SHG為相干散射過程，因此與熒光成像相比，SHG還具有其特殊的優(yōu)勢由于不涉及能級的躍遷，SHG中沒有能量的損失，理論上完全消除了光致毒性和光漂白，可長時間作用于活體細胞而不損傷細胞的功能。同時，生物組織中存在大量的內(nèi)源性SHG成份，因此不需要添加外源性的標(biāo)定物，最大程度地降低了對生物組織的可能損傷及干擾。 需要說明的是，二次諧波在生物組織的大量應(yīng)用中(主要是膠原纖維)，與本發(fā)明最直接相關(guān)聯(lián)的是Sh印pard等在分散的DNA成份中得到了 SHG成像(如圖l所示)(鯡魚精細胞，購至Sigma公司)(R. Gauderson， P. B. Uikins， C. J. R. Sh印pard，Simultaneousmultichannel nonlinear imaging :combined two—photon excitedfluorescence andsecond—harmonic generation microscopy, Micron 32 :685-689(2001))。
在成像設(shè)備上，與單光子共焦顯微成像，雙光子熒光顯微成像使用不同的激光光源。由于需要滿足同時吸收兩個光子的能量與單光子時吸收一個光子的等效能量匹配，一般采用長波長(低能量)的近紅外(Near-Infrared)光代替單光子激發(fā)時具有較短波長(高能量)的藍紫色或紫外光激發(fā)。同時飛秒(Femtosecond, 10—15s)脈沖激光器產(chǎn)生的飛秒脈沖光源是近年來較為常見使用的雙光子激發(fā)光源。 在一套雙光子成像系統(tǒng)中，可同時實現(xiàn)雙光子熒光成像和二次諧波成像。
美國專利US2005/0259A1公開了一種雙光子熒光和二次諧波顯微成像系統(tǒng)。該系統(tǒng)可實現(xiàn)同一激發(fā)光源激發(fā)，同時記錄雙光子熒光和二次諧波信號(系統(tǒng)同時收集前向傳播的二次諧波信號和背向傳播的熒光信號)。系統(tǒng)的基本組成為Ti:S即pire(TS)激光器(激發(fā)波長為760-880nm)， 一個Berek偏振補償儀，掃描箱，和一個聚焦物鏡(0. 45 1. 3NA)。對于收集系統(tǒng)，TPF是共軛收集從樣品發(fā)出的熒光，由分光鏡和發(fā)射濾光片分成適合的波長通道后通過光電倍增管收集。占前向主導(dǎo)傳播的二次諧波通過物鏡(0.95NA)和平凸鏡，并通過使用帶通和藍光濾波片將二次諧波信號從激發(fā)光和熒光中分離。光電倍增管與計算機相連獲取數(shù)據(jù)。 美國專利US6208886B1公開了另一種可同時實現(xiàn)雙光子熒光信號和二次諧波信號探測的光學(xué)系統(tǒng)示意圖(同一激發(fā)光源激發(fā))，該系統(tǒng)中雙光子熒光信號和二次諧波信號同為背向收集方式，掃描實現(xiàn)為臺架移動方式。移動臺架實現(xiàn)樣品的3D移動掃描。激發(fā)光源經(jīng)反光鏡至分光鏡后，進入物鏡聚焦于樣品，樣品背向傳播的熒光和二次諧波信號透過分光鏡，經(jīng)透鏡聚焦后經(jīng)帶通濾波片由光電倍增管收集。圖2為使用該光學(xué)系統(tǒng)從雞肌纖維中得到的在100fs脈沖，625nm激發(fā)波長激發(fā)下的非線性光譜，同時獲得了 SHG信號和雙光子熒光信號。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種無需對細胞核進行額外染色的活細胞核質(zhì)成像的方法。 本發(fā)明的另一個目的是提供上述活細胞核質(zhì)成像的方法在活細胞核質(zhì)信號傳導(dǎo)通路監(jiān)測中的應(yīng)用。
—種活細胞核質(zhì)成像的方法包括如下步驟 (a)用經(jīng)顯微鏡聚焦的近紅外飛秒激光照射活細胞； (b)活細胞經(jīng)顯微鏡聚焦的近紅外飛秒激光的作用下產(chǎn)生雙光子熒光及二次諧波光； (c)同時對雙光子熒光及二次諧波光顯微成像，雙光子熒光顯微成像被熒光標(biāo)定的目標(biāo)分子，二次諧波光顯微成像細胞核。 進一步地，所述近紅外飛秒激光的波長為800 850nm。 上述活細胞核質(zhì)成像的方法在活細胞核質(zhì)信號傳導(dǎo)通路監(jiān)測的應(yīng)用，雙光子熒光顯微成像示蹤被熒光標(biāo)定的目標(biāo)分子的分布和遷移，二次諧波光顯微成像示蹤細胞核，從而監(jiān)測活細胞核質(zhì)信號傳導(dǎo)通路。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果 (1)用雙光子熒光顯微成像(TPF)示蹤目標(biāo)分子的活動，同時二次諧波顯微成像(SHG)定位細胞核(DNA)的位置，兩者的結(jié)合可以準(zhǔn)確地監(jiān)測剌激對目標(biāo)分子的誘導(dǎo)和調(diào)控過程。由于多光子的特性——特別是利用內(nèi)源性的細胞核(DNA)的SHG成像，理論上消除了光致毒性和光漂白——可以對活體細胞進行較長時間的觀察而不至影響細胞的活性、最大程度地維持了細胞的功能環(huán)境，從而真正實現(xiàn)動態(tài)地、清晰地、活體狀態(tài)下觀察目標(biāo)分子在微小外部干擾下在細胞質(zhì)與細胞核間轉(zhuǎn)運的過程。 (2)利用TPF和SHG同時成像，尤其是利用內(nèi)源性的細胞核SHG成像技術(shù)來探討目標(biāo)分子調(diào)控通路的研究，除在腫瘤產(chǎn)生機制的細胞分子水平層面研究中有廣闊作用外，在傳統(tǒng)中藥的藥效機制研究中也有頗具吸引力的應(yīng)用前景。


圖1為鯡魚精細胞細胞核中DNA的SHG成像。 圖2是從雞纖維中利用雙光子光學(xué)成像系統(tǒng)同時獲得的二次諧波信號(SHG)和雙光子熒光信號(TPF)。 圖3為HeLa癌細胞(倒掉培養(yǎng)液PBS，造成細胞膜破損后的細胞)在830nm的近紅外飛秒激光激發(fā)下的SHG成像(成像波譜范圍為405-425nm)。 圖4為HeLa癌細胞(倒掉培養(yǎng)液PBS，造成細胞膜破損后的細胞)透射光成像。
圖5為HeLa癌細胞(倒掉培養(yǎng)液PBS，造成細胞膜破損后的細胞)所在區(qū)域在830nm的近紅外飛秒激光激發(fā)下的光譜(376_550nm)。 圖6是本發(fā)明用于研究轉(zhuǎn)錄因子在核質(zhì)間轉(zhuǎn)運的雙光子熒光和二次諧波非線性光學(xué)顯微成像技術(shù)路線。 圖7是本發(fā)明用于監(jiān)測熒光標(biāo)定的轉(zhuǎn)錄因子在核質(zhì)間轉(zhuǎn)運時擬采用的雙光子熒
光和二次諧波顯微成像組合光學(xué)系統(tǒng)示意圖。 圖8NF-KB在細胞質(zhì)與細胞核間轉(zhuǎn)運示意圖。 圖9JAK/STAT信號通路示意圖。 圖IO類固醇受體信號通道示意圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步地描述。 圖1為鯡魚精細胞細胞核中DNA的SHG成像。購至Sigma公司的鯡魚精細胞DNA在蒸餾水中分散并固定。圖像大小為43x43um。激發(fā)波長為800nm，照射于樣品上的激光功率< 15mW。此

細胞核的DNA成份為內(nèi)源性(無需額外染色)SHG信號來源材料。
圖2使用實現(xiàn)雙光子熒光信號和二次諧波信號探測的光學(xué)成像系統(tǒng)(美國專利No. 6208886B1)從雞肌纖維中得到的非線性光譜(100fs脈沖，625nm激發(fā)波長下激發(fā))，同時獲得了二次諧波信號(SHG)和雙光子熒光信號(TPF)。需要說明的是，該圖例結(jié)果表明同一雙光子光學(xué)成像系統(tǒng)可以同時實現(xiàn)雙光子熒光信號和二次諧波信號的探測，但該二次諧波信號來自纖維組織，并非細胞核或DNA成份。 圖3為HeLa癌細胞(倒掉培養(yǎng)液PBS，造成細胞膜破損后的細胞)在830nm的近紅外飛秒激光激發(fā)下的SHG成像(成像波譜范圍為405-425nm)。對比圖4所示的細胞透射光成像以及圖5所示的光譜特性，我們可以看出圖2所得圖像為具有明顯輪廓的細胞核，同時確定形成該圖像的信號來源為SHG信號。 圖4為HeLa癌細胞(倒掉培養(yǎng)液PBS，造成細胞膜破損后的細胞)的透射光成像。
圖5為HeLa癌細胞(倒掉培養(yǎng)液PBS，造成細胞膜破損后的細胞)所在區(qū)域在830nm的近紅外飛秒激光激發(fā)下的光譜。根據(jù)SHG的光譜特性，其中的狹窄峰(415nm)為SHG信號表征。此圖例說明DNA形成的完整細胞核同樣可以作為內(nèi)源性SHG信號來源材料，進一步證實在本發(fā)明中希望借助于細胞核內(nèi)源性SHG信號定位細胞核位置，顯示細胞核輪廓，從而示蹤目標(biāo)分子在核質(zhì)間轉(zhuǎn)運的可行性。 圖6是本發(fā)明用于研究轉(zhuǎn)錄因子在核質(zhì)間轉(zhuǎn)運的雙光子熒光和二次諧波非線性光學(xué)顯微成像技術(shù)路線。在本發(fā)明中，能清楚地觀察轉(zhuǎn)錄因子(如核因子NF-kB)從細胞質(zhì)向細胞核的轉(zhuǎn)運，因此一方面能在活體細胞中示蹤轉(zhuǎn)錄因子的運動；同時有清晰的細胞核輪廓來顯示轉(zhuǎn)錄因子的運動位置。因此，二次諧波信號將結(jié)合雙光子熒光信號來共同實時跟蹤觀察轉(zhuǎn)錄因子在活體細胞中由細胞質(zhì)到細胞核調(diào)控通路的全過程。雙光子熒光信號示蹤熒光標(biāo)定的轉(zhuǎn)錄因子(如核因子NF- k B-GFP融合蛋白)的活動，SHG信號同時成像細胞核的位置及輪廓，因此組合的雙光子成像可以實時地監(jiān)控轉(zhuǎn)錄因子的活動，進而利用轉(zhuǎn)錄因子的活動通道探索與其相關(guān)的各類機制。 圖7是一種實現(xiàn)本發(fā)明的對于活細胞中特定蛋白、離子、分子等在細胞質(zhì)和細胞核之間轉(zhuǎn)運的雙光子熒光和二次諧波顯微成像組合光學(xué)系統(tǒng)示意圖。該光學(xué)系統(tǒng)可同時實現(xiàn)雙光子熒光TPF監(jiān)控特定蛋白、離子、分子，二次諧波顯微成像SHG顯示細胞核位置輪廓。雙光子熒光和二次諧波同為背向收集方式。光學(xué)系統(tǒng)由飛秒脈沖激光光源和雙光子顯微成像系統(tǒng)(Leica TCS SP2)共同組成。激光器為Ti : S即phire自鎖模飛秒激光器(波長可調(diào)范圍700 1100nm，脈沖寬度為110fs，脈沖重復(fù)頻率76MHz， Coherent Mira 900-F);激發(fā)光被分光鏡DBS反射后進入掃描物鏡(聚焦物鏡，水浸UplanApo/IR，60X ， NA = 1. 25，Olympus)，通過物鏡聚焦于樣品，樣品產(chǎn)生的背向傳播的雙光子熒光和二次諧波光通過同一物鏡收集，由濾波片(IR禁通，KP650，Zeiss)阻斷激發(fā)光后經(jīng)透鏡聚焦，通過棱鏡分光儀分光(可探測的光譜范圍為400-850nm)。通過狹縫的各單色光通過PMT采集，分別成像雙光子激發(fā)熒光和二次諧波光，從而實現(xiàn)高通量地觀察標(biāo)定目標(biāo)蛋白在細胞質(zhì)與細胞核間的活動過程。X、Y掃描為光掃描裝置，實現(xiàn)X、Y方向光束的移動掃描，Z方向的掃描通過移動臺架實現(xiàn)。 圖8是NF-kb在細胞質(zhì)與細胞核間轉(zhuǎn)運示意圖。核因子k b(多指p65、p50形成的異源二聚體)，通常與其抑制蛋白(NF-KBinhibitor，lKB)形成三聚體(NF-kB/IkB)，以失活(即無生物學(xué)活性)狀態(tài)存在于細胞質(zhì)中。在剌激作用下，I k B被I k B激酶(I k Bkinase, IKK)磷酸化后再被蛋白酶降解，核因子k B逐步從三聚體上釋放出來，迅速移位入細胞核(核易位存在于細胞漿中的蛋白被激活后，通過核膜進入細胞核內(nèi)發(fā)揮生物活性的過程)，與靶基因上啟動子區(qū)KB位點發(fā)生特異性結(jié)合，從而啟動和調(diào)控相應(yīng)基因(如各種細胞因子如TNF-a、粘附因子及極早蛋白等)的轉(zhuǎn)錄。利用基因重組技術(shù)標(biāo)定的NF-KB表達熒光蛋白GFP，因此利用雙光子熒光成像示蹤該目標(biāo)分子NF-KB的活動，在同一光學(xué)成像系統(tǒng)中同時成像同一細胞核的位置和輪廓，因此可精確監(jiān)控目標(biāo)分子NF- k B在核質(zhì)間的調(diào)節(jié)通路。 圖9是JAK/STAT信號通路示意圖。JAK(Ja皿s激酶)-STAT (信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子)信號通路是與細胞生長、增殖和分化關(guān)系十分密切的一條信號通路，其信號傳遞的基本過程可概括為細胞因子與其相應(yīng)受體結(jié)合；受體和JAKs發(fā)生聚集，臨近的JAKs相互磷酸化而被激活；JAKs的JH1結(jié)構(gòu)域催化STATs上相應(yīng)部位的酪氨酸殘基磷酸化，同時STATs的SH2功能區(qū)與受體中磷酸化的酪氨酸殘基作用而使STATs活化；STATs進入核內(nèi)同其他一些轉(zhuǎn)錄因子相互作用從而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。利用相應(yīng)的熒光技術(shù)標(biāo)定技術(shù)(基因重組技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、量子點標(biāo)記技術(shù))對STATs進行熒光標(biāo)記，獲得具有熒光特征的STATs目標(biāo)分子，在此基礎(chǔ)上結(jié)合本發(fā)明提供的成像方法追蹤目標(biāo)分子STATs的活動，可準(zhǔn)確地揭示STATs在活細胞狀態(tài)下穿越核膜啟動相應(yīng)基因表達的調(diào)控過程。STATs分子的跨膜轉(zhuǎn)運就是通過同一光學(xué)系統(tǒng)中TPF/SHG所確定的核質(zhì)邊界進行監(jiān)測的。
圖IO類固醇受體信號通道示意圖。圖中，H指配體(類固醇激素)，HSP90指熱休克蛋白(Heat Shock Protein) ，HRE指激素反應(yīng)元件(Hormone Response Element)。類固醇激素包括糖皮質(zhì)激素、鹽皮質(zhì)激素、雄激素、雌激素、黃體素。類固醇激素分子量小，不容于水而溶于脂溶劑中，易于通過簡單擴散而透過細胞膜的脂質(zhì)層進入細胞漿。進入細胞內(nèi)的類固醇激素先與細胞漿中的特異性受體激活形成類固醇-受體復(fù)合物，胞漿類固醇受體是蛋白質(zhì)，分子量介于50000 150000之間，具有高度特異性，可識別類固醇結(jié)構(gòu)上的微小差別，所以任意靶細胞的胞漿受體只能與相應(yīng)的類固醇激素結(jié)合，而對其他類固醇激素僅有輕微的親和力或完全不與之結(jié)合。類固醇激素與特異的受體蛋白結(jié)合后，受體蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化，由原來的非活性形式轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚孕问剑拍苻D(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)。已活化的受體均以二聚體的形式與靶基因中的激素反應(yīng)元件(HRE)結(jié)合，從而發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。該信
號通路中類固醇受體是信號傳遞的重要蛋白分子。為了描述該類固醇受體活化后核易位的過程，采用本發(fā)明提供的雙光子熒光成像技術(shù)結(jié)合二次諧波成像技術(shù)對類固醇受體的核質(zhì)
分布進行準(zhǔn)確的監(jiān)測，仍需對類固醇受體蛋白進行有效的熒光標(biāo)記，標(biāo)記的方法同樣可以是轉(zhuǎn)錄前的基因重組標(biāo)記或轉(zhuǎn)錄后的免疫熒光標(biāo)記等。通過在同一光學(xué)系統(tǒng)中對體外培養(yǎng)的特定細胞進行TPF/SHG成像，不需其他附加步驟，直接獲得細胞質(zhì)和細胞核的位置信息，也就相應(yīng)獲得了熒光標(biāo)記類固醇受體分子在核質(zhì)間分布情況，從而推斷標(biāo)記分子的轉(zhuǎn)移過程。 實施例1 本發(fā)明的第一個實施例為利用本發(fā)明方法觀察人肺腺癌細胞(ASTC-a-1)中通過基因重組技術(shù)GFP標(biāo)定的NF-KB在核質(zhì)間的轉(zhuǎn)運過程-腫瘤壞死因子(TumorNecrosisFactor， TNF)作為NF-kB信號通路的激活劑。 人肺腺癌細胞(ASTC-a-1)的培養(yǎng)細胞培養(yǎng)液為RPMI 1640，添加15%胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺(Glutamine) 、25mmol/L HEPES、 100IU/ml青霉素和100mg/mL鏈霉素。進行細胞轉(zhuǎn)染時，將30% 50%匯聚的人肺腺癌細胞與Lipofectin試劑和足量的重組質(zhì)粒載體(Vienna大學(xué)Schmid教授惠贈)的懸浮液共培養(yǎng)6h，之后補充適量新鮮培養(yǎng)液擴增培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染的過程就是對細胞內(nèi)特定分子進行標(biāo)記的過程，本專利采用基因重組的辦法對分子進行熒光標(biāo)定，將綠色熒光蛋白(GFP)基因與目標(biāo)分子的基因進行重組連接，將結(jié)合后的基因(外源基因)轉(zhuǎn)染導(dǎo)入宿主細胞，此外源基因在宿主細胞的表達產(chǎn)物就是NF-kB與GFP結(jié)合在一起的融合蛋白，該標(biāo)記方法對目的分子本身的功能及宿主細胞的生理狀態(tài)基本不會產(chǎn)生影響，通過監(jiān)測熒光分布的變化即可示蹤目標(biāo)分子的轉(zhuǎn)移過程。
上述轉(zhuǎn)染細胞(5ml培養(yǎng)皿)經(jīng)48h培養(yǎng)后，直接放在雙光子激光共焦顯微鏡載物臺(具備細胞工作站系統(tǒng)以維持培養(yǎng)環(huán)境)上，使用高倍率水鏡鏡頭(UplanApo/IR，60X，NA = 1. 25， Olympus)直接浸入培養(yǎng)液進行TPF和SHG觀測，近紅外飛秒激光的波長選用830nm。 首先對靜息狀態(tài)下培養(yǎng)細胞中熒光強度在核質(zhì)間的分布情況并進行實時記錄，之后馬上在培養(yǎng)液中添加終濃度為5ng/ml的腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor, TNF)作為NF-kB信號通路的激活劑，該剌激信號經(jīng)膜表面受體傳遞給NF-kB/I-kB復(fù)合物，導(dǎo)致I-kB磷酸化并降解，釋放NF-kB使其核轉(zhuǎn)移位點暴露進而易位到細胞核并啟動相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄并翻譯成蛋白質(zhì)，從而實現(xiàn)細胞對外界剌激的反應(yīng)(見圖6)。這一過程的變化是由與NF-kB所掛接的GFP熒光分子的位置變化所反映的，當(dāng)實驗所觀測到的細胞質(zhì)熒光強度減弱而細胞核熒光強度增加則反映出該信號通道被激活并發(fā)揮了相應(yīng)的反饋調(diào)節(jié)作用。
實施例2 本發(fā)明的第二個實施例為利用本發(fā)明觀察人淋巴細胞中通過基因重組技術(shù)GFP標(biāo)定的STAT在核質(zhì)間的轉(zhuǎn)運過程_干擾素(Interferon)作為信號通路STAT的激活劑。
使用淋巴細胞作為驗證JAK/STAT信號通路的宿主細胞系。全血來自血站的健康捐血者，肝素抗凝血液通過淋巴細胞分離液分離獲得淋巴細胞。淋巴細胞培養(yǎng)液使用RPMI1640，添加10%胎牛血清、HEPES、抗生素、白細胞介素_2 (IL_2)、植物凝集素(PHA)。轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建將STATs家族(STAT 1 6)的基因克隆到質(zhì)粒載體pEGFP-Cl (Catalog恥084-l，Clontech)的羧基末端。Lipofectin試劑和足量的重組質(zhì)粒載體與上述體外培養(yǎng)的淋巴細胞進行共培養(yǎng)6h。轉(zhuǎn)染的過程就是對細胞內(nèi)特定分子進行標(biāo)記的過程，將綠色熒光蛋白(GFP)基因與目標(biāo)分子的基因進行重組連接，將結(jié)合后的基因(外源基因)轉(zhuǎn)染導(dǎo)入宿主細胞，此外源基因在宿主細胞的表達產(chǎn)物就是STAT與GFP結(jié)合在一起的融合蛋白，通過監(jiān)測熒光分布的變化即可示蹤目標(biāo)分子的轉(zhuǎn)移過程。
上述轉(zhuǎn)染細胞(5ml培養(yǎng)皿)經(jīng)48h培養(yǎng)后，直接放在雙光子激光共焦顯微鏡載物臺(具備細胞工作站系統(tǒng)以維持培養(yǎng)環(huán)境)上，使用高倍率水鏡鏡頭(UplanApo/IR，60X，NA = 1. 25， Olympus)直接浸入培養(yǎng)液進行TPF和SHG觀測，近紅外飛秒激光的波長選用800nm。 本實施例采用干擾素(Interferon)作為信號通路剌激物。干擾素是病毒進入機體的誘導(dǎo)宿主細胞產(chǎn)生的反應(yīng)物，它從細胞釋放后可促使其他細胞抵抗病毒的感染。將微量(終濃度5ng/ml)的干擾素添加到經(jīng)轉(zhuǎn)染處理的體外培養(yǎng)淋巴細胞中后，干擾素與細胞表面的干擾素受體相結(jié)合，結(jié)合干擾素后受體亞基發(fā)生二聚化或多聚化，并影響與之耦聯(lián)的JAKs，激活JAKs的自磷酸化。這樣，JAKs成為了一個相互轉(zhuǎn)移磷酸基過程中的底物，它們的催化功能因為JH1結(jié)構(gòu)域活化環(huán)上的酪氨酸殘基的磷酸化而被激活，進而激活細胞質(zhì)中非活化形式的STATs單體使之磷酸化。活化的STAT形成二聚體，并且還結(jié)合有GFP熒光標(biāo)記，分子量較大，進入細胞核必須要經(jīng)過核孔復(fù)合體(NPC)，這種穿越核膜的方式必須借助輸入子(Importin)進行，而STAT與Improtin相互識別并發(fā)生作用的前提條件就是STAT的活化，因此干擾素信號經(jīng)過一系列的傳遞最終使活化的STAT進入細胞核，進而啟動相關(guān)基因的表達。表達的結(jié)果引起各類淋巴細胞的增殖，去對抗侵入體內(nèi)的細菌、病毒、異物，或?qū)δ[瘤細胞進行攻擊。
實施例3 人骨骼肌細胞的培養(yǎng)細胞培養(yǎng)液為DMEM，添加10 %胎牛血清、5uM生長因子(GrowthFactor) 、2mM谷氨酰胺(Glutamine) 、25mmol/L HEPES、 100IU/ml青霉素和lOOmg/mL鏈霉素。進行細胞轉(zhuǎn)染時，將30% 50%匯聚的人骨骼肌細胞與Lipofectin試劑和足量的重組質(zhì)粒載體的懸浮液共培養(yǎng)6h，之后補充適量新鮮培養(yǎng)液擴增培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的構(gòu)建將雄激素受體基因插入到商品化的EGFP質(zhì)粒載體氨基末端，將綠色熒光蛋白(GFP)基因與雄激素受體基因進行重組連接，將結(jié)合后的基因(質(zhì)粒載體)轉(zhuǎn)染導(dǎo)入骨骼肌細胞，此外源基因在骨骼肌細胞的表達產(chǎn)物就是雄激素受體與GFP結(jié)合在一起的融合蛋白。當(dāng)使用雄激素對上述體外培養(yǎng)的骨骼肌細胞進行剌激時，通過監(jiān)測熒光分布的變化即可示蹤目標(biāo)分子的轉(zhuǎn)移過程，由于雄激素對于骨骼肌細胞的生長有強烈的剌激作用，可使啟動該信號通路的體外培養(yǎng)的骨骼肌細胞的增殖水平相對于正常培養(yǎng)狀態(tài)下有明顯的增強。
上述轉(zhuǎn)染細胞(5ml培養(yǎng)皿)經(jīng)48h培養(yǎng)后，直接放在雙光子激光共焦顯微鏡載物臺(具備細胞工作站系統(tǒng)以維持培養(yǎng)環(huán)境)上，使用高倍率水鏡鏡頭(UplanApo/IR，60X，NA = 1. 25， Olympus)直接浸入培養(yǎng)液進行TPF和SHG觀測，近紅外飛秒激光的波長選用850nm。 培養(yǎng)細胞放入測試系統(tǒng)后，首先尋找表達質(zhì)粒載體的細胞(即通過熒光顯微鏡搜索具有熒光特征的細胞)，使用本專利提出的TPF/SHG組合的方法對核質(zhì)間的熒光分布進行實時記錄。之后在培養(yǎng)液中添加終濃度為10、20、50ng/ml的雄激素作為該類固醇受體信號通路的激活劑，該激活劑直接穿過質(zhì)膜進入胞漿，并特異性的與標(biāo)記了熒光蛋白的雄激素受體結(jié)合，引起受體變構(gòu)導(dǎo)致結(jié)合在雄激素受體上的熱休克蛋白二聚體脫離并暴露出其DNA結(jié)合區(qū)，使受體從無活性形式轉(zhuǎn)變?yōu)槟芘cDNA相互作用的活性形式，活化后的受體蛋白均以二聚體的形式與靶基因中的激素反應(yīng)元件(HRE)結(jié)合，HRE為一較短的特異性DNA序列，多位于啟動子附近， 一般在轉(zhuǎn)錄起始位點上游400bp內(nèi)，它示DNA與受體結(jié)合的關(guān)鍵部位，即DNA與受體的識別部位，HRE與雄激素受體的結(jié)合將導(dǎo)致一系列下游基因的表達，結(jié)果之一就是誘發(fā)骨骼肌細胞的生長、增殖。 從前面的討論中很清楚地看出，基于其它的生物學(xué)方法實現(xiàn)的熒光探針標(biāo)定，例如免疫熒光方法，而不是單純地基于基因重組的標(biāo)定方法，以及其它的熒光探針，例如近年來使用的"量子點(Quantum dots)"標(biāo)記；被標(biāo)記對象不局限于核因子NF-k B的其它蛋白、分子、離子；同時還包括其它剌激成分(如中藥)引起的蛋白、分子、離子的監(jiān)控，當(dāng)使用雙光子熒光來示蹤該標(biāo)記物，同時使用二次諧波成像細胞核，來觀察該標(biāo)記物在細胞質(zhì)與細胞核之間的轉(zhuǎn)運過程，也被本發(fā)明的范圍所涵蓋。
權(quán)利要求
一種活細胞核質(zhì)成像的方法，其特征在于包括如下步驟(a)用經(jīng)顯微鏡聚焦的近紅外飛秒激光照射活細胞；(b)活細胞經(jīng)顯微鏡聚焦的近紅外飛秒激光的作用下產(chǎn)生雙光子熒光及二次諧波光；(c)同時對雙光子熒光及二次諧波光顯微成像，雙光子熒光顯微成像被熒光標(biāo)定的目標(biāo)分子，二次諧波光顯微成像細胞核。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的活細胞核質(zhì)成像的方法，其特征在于所述近紅外飛秒激光的波長為800 850nm。
3. 權(quán)利要求1所述活細胞核質(zhì)成像的方法在活細胞核質(zhì)信號傳導(dǎo)通路監(jiān)測的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種活細胞核質(zhì)成像的方法，包括如下步驟(a)用經(jīng)顯微鏡聚焦的近紅外飛秒激光照射活細胞；(b)活細胞經(jīng)顯微鏡聚焦的近紅外飛秒激光的作用下產(chǎn)生雙光子熒光及二次諧波光；(c)同時對雙光子熒光及二次諧波光顯微成像，雙光子熒光顯微成像被熒光標(biāo)定的目標(biāo)分子，二次諧波光顯微成像細胞核。本發(fā)明還公開了上述活細胞核質(zhì)成像的方法在活細胞核質(zhì)信號傳導(dǎo)通路監(jiān)測的應(yīng)用。本發(fā)明消除了光致毒性和光漂白，可以對活體細胞進行較長時間的觀察而不至影響細胞的活性、最大程度地維持了細胞的功能環(huán)境。本發(fā)明可應(yīng)用于腫瘤產(chǎn)生機制的細胞分子水平層面研究，以及傳統(tǒng)中藥的藥效機制研究。
文檔編號G01N33/48GK101738462SQ20081021908
公開日2010年6月16日 申請日期2008年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月14日
發(fā)明者鄧小元, 金鷹 申請人:華南師范大學(xué)