專利名稱：具有內(nèi)切葡聚糖酶/木聚糖酶活性的雙功能酶及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種新的具有內(nèi)切葡聚糖酶和木聚糖酶活性的 雙功能纖維素降解酶RuCelA及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著世界能源日益緊缺，開發(fā)可再生的生物能源越來越受到人們的關(guān)注。木質(zhì) 纖維素是自然界中儲量最豐富的可再生資源，利用纖維素酶及半纖維素酶等能夠?qū)⒅参?纖維降解成可發(fā)酵的糖，然而自然條件下的木質(zhì)纖維素難于降解，這與其化學(xué)組成和結(jié)構(gòu) 有關(guān)。木質(zhì)纖維素由半纖維素(約占20%-30%)、纖維素(約占40%))和木素(約占 20%-30%)組成(Wong et al. ,Microbiol. Rev, 1988,52 :305_317)，纖維素分子聚集成的 微纖維，包埋在半纖維素和木質(zhì)素間，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，造成纖維素不容易降解，從而難以被 充分轉(zhuǎn)化利用。纖維素分解菌可以通過兩種途徑降解木質(zhì)纖維素，其一是合成很多種降解 木質(zhì)纖維素的酶，其二是合成具有雙功能或多功能性的酶或酶復(fù)合體。其中，第二種方法已 經(jīng)越來越多的引起人們的重視。在纖維素的降解過程中，內(nèi)切纖維素酶作用于纖維素內(nèi)部 的非結(jié)晶區(qū)，隨機水解 β-1，4-糖苷鍵(Sun et al.，Bioresourse Technol，2002，83 (1) 1-11)，將長鏈纖維素分子截短，產(chǎn)生大量非還原性末端的小分子纖維素，因此內(nèi)切纖維素 酶作為纖維素降解過程中發(fā)生作用較早的酶，起著至關(guān)重要的作用。木聚糖酶是降解木聚 糖最主要的酶，它以內(nèi)切方式作用于木聚糖主鏈的糖苷鍵，生成木二糖和木三糖等寡糖，很 少生成木糖。因此，一種同時具有木聚糖酶及內(nèi)切葡聚糖酶活性的雙功能酶在木質(zhì)纖維素 的降解過程可發(fā)揮更大的作用。Flint等人第一次發(fā)現(xiàn)了具有此雙功能的單一酶，他們首次從生黃瘤胃球菌 (Ruminococcus flavefaciens)的 DNA 片段中發(fā)現(xiàn)了一個新型基因 XynD (Flint et al.， JBacteriol, 1993，175 =2943-2951)，它可以編碼木聚糖酶/內(nèi)切葡聚糖酶XYLD,具有兩 個獨立的催化結(jié)構(gòu)域，兩個結(jié)構(gòu)域之間由309個氨基酸連接，N端的糖基水解酶11家族 結(jié)構(gòu)域、C端的糖基水解酶16家族結(jié)構(gòu)域分別具有木聚糖酶和葡聚糖酶催化活性。Chen 等人從真菌黑曲霉(Aspergillus niger)也發(fā)現(xiàn)了木聚糖酶/內(nèi)切葡聚糖酶雙功能酶 XYNIlKChen et al, JMicrobiol Biotechnol，2006，16 :1132_1138)，這種雙功能酶能 夠水解樺樹木聚糖、地衣多糖、大麥葡聚糖等，但不能水解CMC、微晶纖維素及可溶性淀 粉，但從酶的最適溫度、PH、溫度及pH穩(wěn)定性、金屬離子的抑制或激活效應(yīng)等性質(zhì)類似， 可以推斷XYNIII的催化活性是由同一個活性中心催化的。Avalos等從一種產(chǎn)黃纖維單 胞菌(Cellulomonas flavigena)也發(fā)現(xiàn)此類型的雙功能酶(Avalos，et al.，Current Microbiol, 2008, 57 39-44)，這種酶可以將CMC分解成為纖維二糖、三糖、四糖，也可以將 木聚糖水解為木糖、阿拉伯糖及木二糖，與黑曲霉XYNIII不同的是，產(chǎn)黃纖維單胞菌木聚 糖酶/內(nèi)切葡聚糖酶水解這兩種底物的最適PH值是不同的。宏基因組技術(shù)的廣泛應(yīng)用大大拓寬了纖維素酶篩選與克隆的范圍，Kim等從土壤宏基因組文庫中篩選得到了一種新型雙功能木聚糖酶/內(nèi)切葡聚糖酶CelM2 (Kim et al, Biochemical and Biophysical Research Communications, 2009, 383 :183-186),CelM2可 以同時水解大麥葡聚糖及木聚糖，其晶體結(jié)構(gòu)的催化中心分別是N端的β-Sandwich結(jié)構(gòu) 域及C端的Tim-like barrel結(jié)構(gòu)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的是提供一種新型高效的雙功能內(nèi)切葡聚糖酶/木聚糖酶 RuCelA及其編碼基因。本發(fā)明的第二個目的是提供一種制備新型高效的雙功能內(nèi)切葡聚糖酶/木聚糖 酶RuCelA的方法。本發(fā)明的第三個目的是提供新型高效內(nèi)切葡聚糖酶/木聚糖酶RuCelA在纖維素 降解中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的內(nèi)切葡聚糖酶/木聚糖酶，命名為RuCelA，來源于中國牦牛瘤胃 未培養(yǎng)微生物，具有下述氨基酸殘基序列特征1)序列表中的SEQ ID NO. 2的氨基端的第1_551或22-551位氨基酸殘基序列，其 中第42-341位氨基酸殘基經(jīng)SMART預(yù)測為纖維素酶超家族的結(jié)構(gòu)域。2)將序列表中的SEQ ID N0. 2的氨基端的第1_551或22-551位氨基酸殘基序列 經(jīng)過一個或若干個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，具有內(nèi)切葡聚糖酶和/或木 聚糖酶活性的蛋白質(zhì)。3)與序列表中的SEQ ID N0. 2的氨基酸序列的同源性達到90%及以上的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供了內(nèi)切葡聚糖/木聚糖酶RuCelA的編碼基因(RuCelA)，具有下述核 苷酸序列特征1)序列表中SEQ ID NO. 1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID N0. 2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸序列；本發(fā)明的RuCelA核苷酸編碼序列也可以根據(jù)預(yù)測的RuCelA核苷酸編碼序列人工 合成獲得。本發(fā)明提供的制備重組酶RuCelA的方法，是將編碼基因RuCelA克隆入重組表達 載體，導(dǎo)入宿主細胞，獲得重組表達的雙功能酶。所述重組表達RuCelA的表達載體，是指大腸桿菌表達載體、酵母菌表達載體、枯 草桿菌表達載體、乳酸菌表達載體、絲狀真菌表達載體、昆蟲表達載體或哺乳動物細胞表達 載體等。重組表達RuCelA的重組菌或轉(zhuǎn)基因細胞系，可以是大腸桿菌(如Escherichia coliBL21、Ε. coli JM109、Ε. coli DH5 α 等)、酵母菌(如 Saccharomyces cerevisiae、 Pichia pastoris、Kluyveromyces lactis 等)、枯草桿菌(如 Bacillus subtilis R25、 Bacillus subtilis 9920 等)、乳酸菌(如 Lactic acid bacteria C0CC101 等)，絲狀真 菌(如 Trichoderma viride,Trichodermareesei,Aspergillus niger 等)、昆蟲細胞(如 Bombyx mori, Antharaea eucalypti)，哺乳動物細胞(如 CH0，CHL)等。本發(fā)明的RuCelA來源于中國牦牛瘤胃未培養(yǎng)微生物，通過對瘤胃宏基因組 cosmid文庫的活性篩選，獲得能夠水解羧甲基纖維素鈉(CMC)的陽性克隆，進一步通過構(gòu)建亞克隆、測序、同源比對的方法獲得內(nèi)切葡聚糖酶RuCelA的cds序列，該基因編碼區(qū)長 1656bp，編碼了 551個氨基酸，分子量約60kD，屬于纖維素酶超家族。大腸桿菌重組表達獲 得RuCelA，該酶能夠水解CMC底物，具有內(nèi)切葡聚糖酶活性，且在50°C、pH = 5. 0條件下內(nèi) 切葡聚糖酶的活性最高；該酶能夠水解木聚糖底物，具有木聚糖酶活性，且在65°C、pH6-9 時木聚糖酶活性最高。金屬陽離子Co+、Co2+可以明顯提高RuCelA內(nèi)切葡聚糖酶活性。 RuCelA對磷酸溶脹纖維素、濾紙等底物有水解活性，也能水解寡糖底物纖維三糖，產(chǎn)生葡萄 糖，此外，利用RuCelA可以實現(xiàn)對堿預(yù)處理的木質(zhì)纖維素的單酶降解。因此，本發(fā)明的雙功能酶RuCelA可廣泛應(yīng)用于纖維素的降解，包括纖維素生物轉(zhuǎn) 化、化工、紡織、食品、生物能源、飼料添加、醫(yī)藥工業(yè)方面應(yīng)用等。例如在制備生物乙醇、飼 料添加劑等多方面有廣泛的應(yīng)用，包括在飼料中添加，洗滌劑添加RuCelA，或者生物燃料如 乙醇制備過程中的原料處理等。本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶/木聚糖酶雙功能酶RuCelA，也可與其他纖維素降解酶按 照一定比例混合，在纖維素降解中應(yīng)用。


圖1.純化的重組雙功能酶RuCelA蛋白SDS-PAGE電泳圖。重組表達RuCelA的大 腸桿菌細胞經(jīng)超聲破碎收集上清液，結(jié)合M-NTA柱，用不同濃度的咪唑溶液洗脫純化。泳 道1 :100mmol的咪唑洗脫收集液；M 蛋白Marker。圖2.重組雙功能酶RuCelA的最適反應(yīng)pH曲線。RuCelA的最適反應(yīng)pH值，以羧甲 基纖維素鈉(CMC)為底物時，RuCelA在pH = 5時的內(nèi)切葡聚糖酶活性最高，定義為100%， 在其他PH下RuCelA的內(nèi)切葡聚糖酶活性以相對酶活表示；以木聚糖(xylan)為底物時， RuCelA在pH = 7時的木聚糖酶活性最高，定義為100%，RuCelA在其他pH下的木聚糖酶 活性以相對酶活表示。圖3. RuCelA的最適反應(yīng)溫度曲線。以CMC為底物時，pH = 5，反應(yīng)溫度50°C時 RuCelA的內(nèi)切葡聚糖酶活性最高，定義為100%，在其他溫度下RuCelA內(nèi)切葡聚糖酶活性 以相對酶活表示；以xylan為底物時，pH = 7，反應(yīng)溫度65°C時RuCelA的木聚糖酶活性最 高，定義為100 %，在其他溫度下RuCelA木聚糖酶活性以相對酶活表示。圖4. RuCelA的熱穩(wěn)定性。pH = 5，RuCelA在30°C _70°C下熱處理1小時后，以CMC 為底物測定RuCelA的殘余酶活。RuCelA在30°C熱處理1小時后殘余的活性定義為100%， 其他溫度下的殘余酶活以相對活性表示。圖5.金屬離子對RuCelA活性的影響。以CMC為底物，pH = 5，溫度50°C條件下， 測定不同金屬離子對RuCelA內(nèi)切葡聚糖酶活性的影響，反應(yīng)體系中只含有底物及RuCelA 時測定的活性設(shè)為100%;以xylan為底物時，pH = 7，溫度為50°C條件下，測定不同金屬離 子對RuCelA木聚糖酶活性的影響。反應(yīng)體系中只含有底物及RuCelA時測定的木聚糖酶活 性作為100%。圖6. RuCelA與木糖苷酶Xyll之間的協(xié)同作用。以xylan為底物，pH = 7，溫度 50°C條件下，分別測定在RuCelA單獨存在、以及RuCelA與木糖苷酶Xyll共同存在時反應(yīng) 體系中還原糖的量。圖7. RuCelA對堿預(yù)處理過稻草的單酶降解，以1 % NaOH處理過的稻草為底物，在
5PH = 5，溫度45 °C條件下，按時取樣測定體系內(nèi)還原糖的濃度。
具體實施例方式實施例1中國牦牛瘤胃微生物宏基因組DNA文庫的構(gòu)建采集西寧市中國青海牦牛的瘤胃，使用3層紗布過濾，濾液經(jīng)離心收集瘤胃微生 物菌體，凍存于_80°C待用。取100-200 μ 1菌體樣品，Iml PBS洗2 3次，加入650 μ 1 DNA 抽提緩沖液(Tris-HCl，IOOmM pH8. 0 ；Na2EDTA IOOmM pH8. 0 ；Na3PO4 Buffer IOOmM ρΗ8· 0 ； NaCl 1. 5Μ ；CTAB 1% ；ρΗ8. 0)，混勻后，置-80°C，然后放置在65°C水浴中融化，重復(fù)三次； 冷卻后加入3-4yL溶菌酶(100mg/L)于搖床中水平振蕩(37°C，225rpm)約30min ；加入 2_3“1^蛋白酶1((2011^/1^)后繼續(xù)振蕩約 30min ；加入 50_70μ 1 SDS (20% )，混勻后，65°C 保溫l_2h，每隔10 20min上下顛倒離心管混勻；12，OOOrpm室溫離心lOmin，收集上清液， 加入400-500 μ 1的酚氯仿異戊醇(25 24 1)抽提兩次；氯仿異戊醇(24 1) 抽提一次后加入0. 6倍體積的異丙醇，室溫放置15-20min后，12000rpm離心15min ；沉淀用 70%乙醇漂洗，干燥后用60-100 μ L TE (ρΗ8· 0)溶解，加入1 μ LRNAase去除RNA0構(gòu)建瘤胃未培養(yǎng)細菌宏基因組文庫的方法參照Epicentre公司pTOB::TNC CosmidCloning Kit試劑盒產(chǎn)品說明書。抽提的宏基因組DNA經(jīng)End-R印air Enzyme Mix 末端補平，和試劑盒中的去磷酸化載體pWEB: :TNC連接，連接產(chǎn)物用MaxPlax Lambda PackagingExtracts包裝后侵染宿主菌Ε. coli EP 1100，侵染產(chǎn)物涂平板，37°C培養(yǎng)12 16h長出菌落，即為該批樣品的宏基因組文庫。實施例2coSmid文庫內(nèi)切葡聚糖酶的篩選文庫的擴增及細胞裂解液的制備將96孔板格式化保存的文庫影印接種于含 200 μ ILB-Amp培養(yǎng)基/孔的96孔板，37°C培養(yǎng)12h后離心收集細胞。加入20 μ 1磷酸-檸 檬酸緩沖液(ΡΗ4. 8)/孔懸浮細胞，放置-80°C中15min，然后將細胞放置37°C水浴中融化，
重復(fù)三次。內(nèi)切葡聚糖酶的篩選采用羧甲基纖維素鈉(CMC)-剛果紅染色脫色法(Teather et al. , Appl Environ Microbiol, 1982,43 (4) :777_780)，取 10 μ 1 上述制備的細胞裂解液點 在含0. 5% CMC的瓊脂糖平板上，37°C放置Ih后用ddH20洗滌平板以除去殘留的菌液，用
的剛果紅溶液染色lOmin，然后用IMNaCl溶液脫色，在打點處出現(xiàn)水解透明圈的文庫克 隆中即含有降解葡聚糖的酶基因。實施例3RuCelA基因的克隆及其序列分析采用亞克隆的方法將上述含有內(nèi)切葡聚糖酶的基因克隆至pGEMllz載體上將此 陽性克隆的cosmid質(zhì)粒用Sau3A I部分酶切為2_5kb片段，連接入經(jīng)BamH I酶切并去磷 的pGEMllz載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，以實施例2中描述的方法對亞克隆文庫進行功能 篩選，得到的亞克隆以Τ7和SP6通用引物測序，通過同源比對確定該內(nèi)切葡聚糖酶基因的 編碼區(qū)序列，其基因核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，并命名為RuCelA。該基因cds編碼551個氨基酸，ORF序列如SEQ ID NO 2所示，理論分子量約為 60kD。用SMART分析結(jié)構(gòu)域，顯示N端開始21個氨基酸是信號肽序列，屬于纖維素酶超家 族。通過NCBI的blast分析，內(nèi)切葡聚糖酶RuCelA基因與來源于奶牛瘤胃(cow rumen) 未培養(yǎng)微生物的糖基水解酶家族5(GenBank :EU282863. 1)同源性達79%。
實施例4 RuCelA在大腸桿菌中的重組表達利用合成的特異寡聚核苷酸引物來構(gòu)建重組表達質(zhì)粒，其中正向引物RuCelAF :( GAATTCATGTGTATGAAGAAAACTCTACTTT)，反向引物 RuCelAR (CTCGAGTTTGGCAATGTGCGTTTTAC CGTCT)，下劃線標(biāo)注的是限制性內(nèi)酶序列，通過PCR反應(yīng)擴增出RuCelA基因片段，經(jīng)過膠回 收后用EcoR I和Xho I雙酶切，回收片段后，與同樣用EcoR I和Xho I酶切的pET_21a載 體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO，得到的轉(zhuǎn)化子利用上述引物進行PCR鑒定，將含有 1. 6kb擴增片段的轉(zhuǎn)化子進行測序測定，測序正確的重組載體命名為pET21a-RUCelA，將其 接入3ml LB-Amp培養(yǎng)液中，37 °C，220rpm培養(yǎng)過夜，次日，取Iml過夜菌至50ml LB-Amp培 養(yǎng)液中，37°C，220rpm培養(yǎng)至菌液0D600為0. 4-0. 6左右在終濃度為lmmol/L的IPTG溶液 中于30°C誘導(dǎo)表達，用破菌緩沖液(20mMTr i s-HCl，50mMNaCl)懸浮收集的菌體，超聲破碎 細胞后收集上清液，過M-NTA柱而后用不同濃度的咪唑溶液洗脫，用SDS-PAGE檢測純化蛋 白結(jié)果如圖1所示，可以看出RuCelA的分子量約為60kD。實施例5RuCelA的最適pH分析以羧甲基纖維素鈉(CMC)或木聚糖(xylan)為底物測定該酶的活性，以每分鐘催 化1 % CMC或木聚糖生成1 μ mol還原糖定義為一個酶活單位(U)，參照Miller的方法來測 定還原糖的濃度(Miller et al，Anal. Chem，1959，31 :426_428)。為測定 RuCelA 的最適pH， 在40°C下反應(yīng)15min，pH處于3. 5-8時所用的緩沖液為磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，pH處 于8. 5-10時所用的緩沖液為甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，反應(yīng)體系為50μ 1 羧甲基纖維 素鈉(CMC)或木聚糖(xylan)，45 μ 1上述不同pH緩沖液，5 μ 1的酶液，以CMC為底物時，以 酶活最高者為100 %計，在其他pH下RuCelA的內(nèi)切葡聚糖酶活性以相對酶活表示，pH在處 于3. 5-5時酶活隨pH的升高而增大，在pH > 5時，酶活隨pH的升高而減小，在pH = 9時 酶活降至最低；以xylan為底物時，以酶活最高者為100%計，在其他pH下RuCelA的木聚 糖酶活性以相對酶活表示，PH在處于3. 5-6時酶活隨pH的升高而增大，在pH處于6_9時， 酶活均達到穩(wěn)定峰值，在pH = 7時最高，在pH > 9時酶活隨pH的升高而急劇減小，在pH =10時酶活降至最低。因此，RuCelA內(nèi)切葡聚糖酶活性的最適pH = 5，RuCelA木聚糖酶 活性的最適PH= 7，結(jié)果如圖2。實施例6RuCelA的最適溫度分析以CMC為底物時，反應(yīng)15min，反應(yīng)體系為50 μ 1 1% CMC, 45 μ 1 pH = 5磷酸氫二 鈉-檸檬酸緩沖液，5 μ 1酶液，以酶活最高者為100%計，在其他溫度下RuCelA的內(nèi)切葡聚 糖酶活性以相對酶活表示，溫度處于30°C -50°C時酶活隨溫度的升高而增大，在溫度高于 50°C時，酶活隨溫度的升高而減小；以xylan為底物時，反應(yīng)lOmin，反應(yīng)體系為50μ 1 1% xylan, 45 μ 1 pH = 7磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，5 μ 1酶液，以酶活最高者為100%計，在 其他溫度下RuCelA的木聚糖酶活性以相對酶活表示，溫度在處于40°C _65°C時酶活隨溫度 的升高而增大，在溫度高于65°C時，酶活隨溫度的升高而減小。因此，RuCelA內(nèi)切葡聚糖酶 活性的最適溫度為50°C，RuCelA木聚糖酶活性的最適溫度為65°C，結(jié)果如圖3。實施例7RuCelA的熱穩(wěn)定性分析在pH = 5時，RuCelA在30°C _70°C下熱處理1小時后，恢復(fù)到室溫，在最適條件 下(pH = 5，50°C )反應(yīng)15min，反應(yīng)體系為50 μ 1 1% CMC, 45 μ IpH = 5磷酸氫二鈉-檸 檬酸緩沖液，5 μ 1熱處理后的酶液，以CMC為底物測定RuCelA的殘余酶活，將RuCelA在最適條件下未熱處理的酶活定義為100%，其他溫度下的殘余酶活以相對活性表示，結(jié)果表明 RuCelA在低于50°C具有較好的熱穩(wěn)定性，溫度高于50°C時酶的熱穩(wěn)定性隨溫度的升高而 下降(如圖4)。實施例8RuCelA的比活分析以CMC為底物時，體系pH = 5，反應(yīng)15min，在50°C下測定RuCelA的比活，結(jié)果表 明重組RuCelA對CMC的比活為54. 3U/mg ；以xylan為底物時，體系pH = 7，反應(yīng)lOmin，在 65°C下測定RuCelA的比活，結(jié)果表明對RuCelA對xylan的比活為264. lU/mg，在已報道的 纖維素酶及半纖維素酶中均屬于比較高的比活。實施例9RuCelA的底物特異性分析為分析RuCelA的底物特異性，利用了下列的底物羧甲基纖維素鈉CMC ( β _1，4糖 苷鍵)，大麥葡聚糖barley glucan ( β -1，3/4糖苷鍵)，海藻多糖Laminarin ( β _1，3/6糖 苷鍵)，地衣多糖1 ichenen ( β -1，3/4糖苷鍵)，羥乙基纖維素(β _1，4糖苷鍵)，微晶纖維 素Avicel (β-1，4糖苷鍵)，木聚糖xylan (β-1，4糖苷鍵)，Whatman NO. 1濾紙，熒光底 物4-甲基傘形酮β-D-I，4-纖維二糖，對硝基酚i3-D-l，4-木糖苷(pNPX)。反應(yīng)體系為 50 μ 1 底物，45 μ IpH= 5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，5 μ 1酶液，在50°C下反應(yīng)，對 CMC、xylan、大麥葡聚糖、海藻多糖、地衣多糖、羥乙基纖維素反應(yīng)時間為lOmin，對濾紙、微 晶纖維素、熒光底物4-甲基傘形酮β- -1，4-纖維二糖、對硝基酚β- -1，4-木糖苷反應(yīng) 時間為24h，以RuCelA對CMC的活性為100%計，RuCelA對其他底物的活性以相對酶活表 示。結(jié)果表明，RuCelA能水解濾紙產(chǎn)生還原糖，同樣也能水解4-甲基傘形酮i3-D-l，4-纖 維二糖，而且對barleyglucan、Iichenen的水解活性優(yōu)于對CMC、xylan的水解活性，但對 Laminarin, Avicel、對硝基酚β _D_1，4_木糖苷等底物沒有活性，這說明RuCelA對含有 β -1，3/β -1，4糖苷鍵的底物比單獨含有β -1，4糖苷鍵的底物有更好的水解能力，但不能 水解不含β-1，4糖苷鍵的底物，如Laminarin，結(jié)果見表一。表一、RuCelA的底物特異性 實施例10金屬離子對RuCelA活性的影響以CMC為底物時，溫度為50°C，反應(yīng)15min，反應(yīng)體系為50μ 1 1% CMC, 45 μ IpH =5磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，lOmmol/L的金屬離子1 μ 1，4 μ 1酶液，反應(yīng)體系中只含有底物及RuCelA時測定的內(nèi)切葡聚糖酶活性作為100%，測定不同金屬離子對內(nèi)切葡聚 糖酶活性的影響；以xylan為底物時，溫度為50°C，反應(yīng)lOmin，反應(yīng)體系中只含有底物及 RuCelA時測定的木聚糖酶活性作為100%，測定不同金屬離子對RuCelA木聚糖酶活性的影 響。反應(yīng)體系為50μ1 xylan，45 μ IpH = 7磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，10mmol/L的 金屬離子1μ 1，4μ 1酶液，結(jié)果顯示C02+、C0+、Ca2+可以提高內(nèi)切葡聚糖酶活性，Co2+可以提 高約60%的內(nèi)切葡聚糖酶活性，而Cu2+、Mg2+、Zn2+則對內(nèi)切葡聚糖酶活性有一定的抑制作 用；幾乎所有的金屬離子對木聚糖酶活性都有一定的抑制作用，Co+對木聚糖酶活性的抑制 作用最顯著，使RuCelA的酶活僅為不含Co+時的20%左右，結(jié)果如圖5所示。實施例IlRuCelA與木糖苷酶Xyll的協(xié)同作用本實施例研究了 RuCelA與木糖苷酶Xyll間的協(xié)同作用，其中木糖苷酶Xyll同 樣來源于中國牦牛瘤胃未培養(yǎng)微生物，Gene bank序列號為⑶573895，反應(yīng)體系為50μ 1
xylan，45 μ IpH = 7.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，5 μ 1 RuCelA與Xyll的混合酶液，混 合酶液中RuCelA與Xyll的酶活單位比為1 1，在45°C下反應(yīng)，以xylan為底物，每IOmin 取一次樣，分別測定在RuCelA單獨存在、以及RuCelA與木糖苷酶Xyll共同存在時反應(yīng)體 系中還原糖的量。結(jié)果表明，兩種酶之間的協(xié)同作用明顯，兩種酶同時作用得到的還原糖量 在不同時間段均高于RuCelA單獨作用所產(chǎn)生的還原糖量，在20min左右時兩種酶同時作用 得到的還原糖量大約為RuCelA單獨作用所產(chǎn)生的還原糖量的2倍，結(jié)果見圖6。實施例12RuCelA對堿預(yù)處理過稻草的單酶降解木質(zhì)纖維素的降解通常涉及到一系列的酶參與反應(yīng)，而在我們的研究中，單獨利 用RuCelA進行預(yù)處理過稻草的酶解反應(yīng)被證明是可行且有效的。稻草的預(yù)處理參照Badal 的方法(Badal et al，New biotechnology, 2009, 27 (1) 10-16)，稻草的秸稈在攪拌機內(nèi)混 勻粉碎后，在121°C時利用(w/v)的NaOH溶液預(yù)處理Ih后離心，棄掉上清，蒸餾水洗三 遍后烘干待用。稱取0. 5g稻草預(yù)處理后的樣品，加入一定體積RuCelA后用pH = 5的磷 酸-檸檬酸緩沖液定容至5ml，在45°C反應(yīng)2周，按時取樣測定體系內(nèi)還原糖的濃度。反應(yīng) 體系中RuCelA在體系中的酶的用量如下內(nèi)切葡聚糖酶活性為1.9U/g干物質(zhì)，木聚糖酶活 性為4. lU/g干物質(zhì)，兩種酶活均在該反應(yīng)條件下測定。結(jié)果顯示，在0-6天內(nèi)體系內(nèi)還原糖 濃度隨時間延長而逐漸增大，而在8-14天內(nèi)體系內(nèi)還原糖濃度增速放緩而逐漸保持不變， 結(jié)果如圖7。
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權(quán)利要求
一種具有內(nèi)切葡聚糖酶/木聚糖酶活性的雙功能酶，命名為RuCelA，其特征在于來源于瘤胃未培養(yǎng)微生物，其氨基酸序列具有如下特征1)SEQ ID NO.2的氨基端的第1 551或22 551位氨基酸殘基序列；2)將SEQ ID NO.2的氨基端的第1 551或第22 551位氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有內(nèi)切葡聚糖酶/木聚糖酶活性的蛋白質(zhì)。
2.—種權(quán)利要求1所述的具有內(nèi)切葡聚糖酶/木聚糖酶活性的雙功能酶的編碼基因， 其特征在于DNA序列具有如下特征1)具有SEQID NO. 1的DNA序列；2)編碼SEQID NO. 2蛋白質(zhì)序列的DNA序列。
3.—種如權(quán)利要求1所述的具有內(nèi)切葡聚糖酶/木聚糖酶活性的雙功能酶的制備方 法，其特征在于將含有權(quán)利要求1或2所述的內(nèi)切葡聚糖酶/木聚糖酶雙功能酶RuCelA編 碼基因克隆入重組表達載體，導(dǎo)入宿主細胞，獲得重組表達的雙功能酶RuCelA。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制 備方法，其特征在于所述的重組表達載體為大腸桿菌表達 載體、酵母表達載體、枯草桿菌表達載體、乳酸菌表達載體、絲狀真菌表達載體、昆蟲表達載 體或哺乳動物細胞表達載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述的重組表達基因的重組菌或轉(zhuǎn)基 因細胞系為大腸桿菌宿主細胞、酵母菌宿主細胞、枯草桿菌宿主細胞、乳酸菌宿主細胞、絲 狀真菌宿主細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞。
6.如權(quán)利要求1所述的具有內(nèi)切葡聚糖酶/木聚糖酶活性的雙功能酶在纖維素降解中 的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種具有內(nèi)切葡聚糖酶/木聚糖酶活性的雙功能酶(RuCelA)及其制備方法與應(yīng)用。RuCelA來源于中國牦牛瘤胃未培養(yǎng)微生物，RuCelA對磷酸纖維素、濾紙具有一定的活性。RuCelA不僅可以水解多聚糖，也可以水解三糖得到單糖；同時RuCelA與木糖苷酶具有協(xié)同降解木聚糖的協(xié)同作用；利用RuCelA還可以實現(xiàn)對預(yù)處理過的木質(zhì)纖維素的單酶降解。本發(fā)明的雙功能酶RuCelA可廣泛應(yīng)用于纖維素的降解，包括纖維素生物轉(zhuǎn)化、化工、紡織、食品、生物能源、飼料添加、醫(yī)藥工業(yè)方面應(yīng)用等。
文檔編號C12N9/42GK101906406SQ20101020894
公開日2010年12月8日 申請日期2010年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月24日
發(fā)明者呂紅, 周峻崗, 常磊 申請人:復(fù)旦大學(xué)