專利名稱：癌癥發(fā)生或轉移的診斷試劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域；更具體地，本發(fā)明涉及癌癥發(fā)生或轉移的診斷試劑。
背景技術：
肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病和致死率近年有明顯上升趨勢，由于肺癌的高轉移性，絕大多數臨床上確診的肺癌患者通常已是晚期，往往出現(xiàn)了腫瘤轉移以及擴散，手術治療的可能性極低。因此早期發(fā)現(xiàn)、早期治療至關重要。近年來，隨著分子生物學、免疫學及生物化學等相關學科的飛速發(fā)展，血清中腫瘤標記物檢測逐漸用于腫瘤早期診斷、評估預后及觀察療效、復發(fā)及轉移等方面。與肺癌相關的腫瘤標志物的檢測對肺癌的早期診斷具有重要的臨床意義。轉移是目前導致癌癥患者死亡的最主要原因，研究表明超過90%的癌癥患者死于腫瘤的轉移和擴散。癌癥轉移不是腫瘤細胞的獨奏，而是一個涉及與腫瘤細胞和腫瘤間質包括細胞外基質(ECM)親密互動的過程。細胞外基質的改造和重建，可以調節(jié)細胞與細胞以及細胞和胞外基質的相互作用，進而導致細胞所處的微環(huán)境改變和細胞自身行為變化， 是腫瘤轉移過程中的一個很重要的事件。因此參與細胞外基質重建的酶越來越受到廣泛關注，它們在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著至關重要的作用，也極有可能為肺癌的轉移治療提供診斷標記和分子靶點。賴氨酸氧化酶(LOX)是膠原纖維通過共價交聯(lián)取得穩(wěn)定性和發(fā)育成熟的關鍵酶， 可以賦予細胞外基質適宜的強度和彈性，這對于維持結締組織的韌性起到了至關重要的作用。LOX作為一個胺基氧化酶，對胞外基質中的最重要的組分膠原蛋白和彈性蛋白進行交聯(lián)，其前蛋白原(pr印roLOX)為48KD，在其N-端含有21個氨基酸的信號肽，經高爾基體糖基化修飾后被分泌到胞外，為50KD的前蛋白，再經過骨形態(tài)發(fā)生蛋白-I(BMP-I)的剪切產生32KD的具催化活性的酶和18KD的前肽(L0X-PP)，介導膠原和彈性蛋白的交聯(lián)。此外，LOX還參與細胞運動、信號轉導和基因表達調控等許多至關重要的生物學過程。盡管以往本領域對于LOX與腫瘤相關性有一定的研究，然而前期均是針對于LOX 在腫瘤中表達量的研究。例如，生物芯片分析的數據顯示多種腫瘤細胞株以及人腫瘤組織包括肺癌和乳腺癌具有 LOX 的高表達(Kirschmann, D. A.，E. A. Seftor, et al. (2002) · “ A molecular role for lysyl oxidase in breast cancer invasion. " Cancer Res 62(15) :4478-83 ；Kirschmann, D. A. ， Ε.A.Seftor, et al. (1999). “ Differentially expressed genes associated with the metastatic phenotype in breast cancer. “ Breast Cancer Res Treat 55(2) :127-36)。然而，也有研究指出在部分腫瘤如支氣管肺癌、膀胱癌以及漿液性卵巢癌中LOX及其家族成員呈下調表達(Hough， C. D. , C. A. Sherman-Baust, et al. (2000). “ Large-scale serial analysis of gene expression reveals genes differentially expressed in ovarian cancer. “ Cancer Res 60(22) :6281-7 ；Woznick, A. R. ， A. L. Braddock, et al. (2005). “ Lysyl oxidaseexpression in bronchogenic carcinoma. “ Am J Surg 189(3) :297-301 ；ffu, G. , Ζ. Guo, et al. (2007). " LOXLl and L0XL4 are epigenetically silenced and can inhibit ras/extracellular signal-regulated kinase signaling pathway in human bladder cancer. “ Cancer Res 67(9) :4123-9)?？梢姡煌[瘤的細胞起源不同、分化程度不同而導致了 LOX的差異表達。因此，對于LOX的腫瘤相關性不可一概而論，還需要針對不同的腫瘤進行有針對性地區(qū)別研究。此外，本領域人員均了解，單單研究蛋白表達量的高低并不能代表其蛋白生物活性的高低。而目前現(xiàn)有技術的研究均限于蛋白的組織表達層面，依賴于組織標本或細胞系， 臨床應用具有一定限制；還沒有針對LOX酶活性高低與腫瘤相關性進行研究。更沒有針對 LOX酶活性高低與肺癌及其臨床分期進行相關性研究。

發(fā)明內容
本發(fā)明的另一目的在于提供肺癌發(fā)生或轉移的診斷試劑。在本發(fā)明的第一方面，提供一種賴氨酸氧化酶(LOX)用作檢測癌癥的血清標志物的用途。在一個優(yōu)選例中，所述的癌癥是肺癌。在另一優(yōu)選例中，所述的賴氨酸氧化酶(LOX)用作肺癌臨床分期的血清標志物。在另一優(yōu)選例中，所述的用作檢測癌癥的血清標志物是檢測血清中賴氨酸氧化酶的活性。較佳地，檢測血清中賴氨酸氧化酶的活性是否提高。在本發(fā)明的另一方面，提供一種試劑組合，所述的組合含有安普萊紅(Amplex red)，二氨基戊烷，過氧化氫酶，賴氨酸氧化酶專一性抑制劑。在一個優(yōu)選例中，所述的試劑組合還含有選自下組的一種或多種試劑尿素，四硼酸鈉。在另一優(yōu)選例中，當所述試劑混合時，安普萊紅、二氨基戊烷、尿素和四硼酸鈉按照摩爾比是1 (150-250) (20000-30000) (500-1500)；較佳地是 1 200 24000 1000。在另一優(yōu)選例中，當所述試劑混合時，尿素終濃度1.2士0. IM ；四硼酸鈉終濃度 0. 05 士 0. 005M ；安普萊紅終濃度50 士 5 μ M ；二氨基戊烷終濃度10 士 ImM。在另一優(yōu)選例中，當所述試劑混合時，過氧化氫酶終濃度0. 1 士0. 01U/ml。在另一優(yōu)選例中，當所述試劑混合時，賴氨酸氧化酶專一性抑制劑終濃度 500 + 50 μ M0在另一優(yōu)選例中，所述的二氨基戊烷是1，5_ 二氨基戊烷；或所述的過氧化氫酶是辣根過氧化物酶；或所述的賴氨酸氧化酶專一性抑制劑是氨基丙腈(BAPN)。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的試劑組合在制備診斷癌癥的試劑盒中的用途。在一個優(yōu)選例中，所述的癌癥是肺癌。在本發(fā)明的另一方面，提供一種試劑盒，含有所述的試劑組合。在本發(fā)明的另一方面，提供一種(體外非診斷性地)測定賴氨酸氧化酶活性的方法，包括(1)將所述的試劑組合中安普萊紅；二氨基戊烷，過氧化氫酶混合，形成混合液1 ；
(2)將所述的試劑組合中安普萊紅；二氨基戊烷，過氧化氫酶，賴氨酸氧化酶專一性抑制劑混合，形成混合液2 ；(3)分別檢測混合液1和混合液2的混合液的酶活，混合液1的酶活減去混合液2 的酶活的結果即是賴氨酸氧化酶的酶活。在另一優(yōu)選例中，通過激發(fā)波長560nm和發(fā)射波長590nm檢測兩種混合液的熒光值，從而確定酶活。在本發(fā)明的另一方面，提供一種確定癌癥或癌癥易感性的方法，包括檢測待測對象血清中的賴氨酸氧化酶的酶活；若待測對象血清中的賴氨酸氧化酶的酶活顯著高于(如高20% ；較佳地高40% ； 更佳地高60% )正常人群血清中的賴氨酸氧化酶的酶活；則該待測對象是癌癥患者或癌癥易感性患者。在一個優(yōu)選例中，所述的癌癥是肺癌。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1顯示了正常對照和腫瘤患者血清中LOX的活性比較。
具體實施例方式本發(fā)明人經過深入的研究，首次將賴氨酸氧化酶(LOX)的活性情況與癌癥(特別是肺癌)的發(fā)生、發(fā)展、轉移、分期相關聯(lián)。從而第一次將檢測LOX活性的試劑應用于制備診斷癌癥的試劑盒；第一次將檢測LOX活性的方法應用于診斷癌癥。LOX活性與癌癥相關本領域人員均了解，盡管蛋白在組織中的表達量檢測可以反映疾病的發(fā)生或發(fā)展狀況，然而要獲得組織切片或細胞樣本，必需要獲得受試者的身體組織，這在臨床上并非上一個簡單的過程；并且，獲得的身體組織樣品后，還需要通過Western Blot、免疫組化等方法進行檢測，操作復雜不易控制，從而一定程度限制了這方面的臨床應用。而如果可以通過檢測體液樣本，如血清、唾液等來實現(xiàn)檢測，則取樣過程的復雜程度大大降低。此外，單單研究蛋白表達量的高低并不能代表其蛋白生物活性的高低，而從研究蛋白的生物活性高低來判斷疾病的嚴重程度或易感性則更加準確和直觀。本發(fā)明首次在肺癌患者中對血清LOX水平進行了檢測，取材方便、操作簡單、便于復查，患者易于接受，并可以通過動態(tài)觀察指標變化判斷療效，評估預后，指導治療。通過檢測肺癌患者血清中的LOX活性，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，與正常人相比肺癌患者血清中的LOX活性顯著增高，說明LOX是肺癌發(fā)生的早期事件。而且，與早期的肺癌患者相比， 晚期轉移的病人血清中LOX的活性也顯著增高。同樣，有淋巴結轉移組高于無淋巴結轉移組。以上均說明血清中LOX的活性與 M分期、轉移正相關。提示LOX可以作為臨床上肺癌診斷和預后的重要生物學標記物之一。這些發(fā)現(xiàn)為肺癌在臨床上的診斷或治療提供了理論基礎和新的藥靶和策略。血清LOX活性對肺癌的診斷、轉移復發(fā)的監(jiān)測有比較重要的臨床意義。
因此，基于本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)，提供了一種LOX的用途，用于作為癌癥的血清標志物。較佳地，所述的癌癥是肺癌。更佳地，所述的LOX用于作為肺癌臨床分期的血清標志物。也即可以利用LOX蛋白(i)進行癌癥的分型、鑒別診斷、和/或易感性分析； (ii)評估相關人群的癌癥治療藥物、藥物療效、預后，以及選擇合適的治療方法；(iii)早期評估相關人群癌癥患病風險，早期監(jiān)測早期預防。通過收集人肺癌臨床樣本進行血清中LOX活性的檢測，還可以分析LOX的活性與肺癌發(fā)生發(fā)展以及轉移的相關性，并為肺癌的轉移治療提供新的診斷標記和分子靶點。LOX活性檢測關于LOX活性檢測，主要原理是對LOX在催化膠原共價交聯(lián)過程中會產生的H2A 進行測定來間接反映LOX的活性。早期的研究主要應用了氚標記法和高香草酸熒光檢測法兩種檢測方法。前者用氚標記前膠原蛋白底物中的賴氨酸，經賴氨酸氧化酶LOX催化膠原共價交聯(lián)，在此過程中釋放氚標記的H2O2，然后采用專門設計的真空蒸餾裝置收集氚標記的H2O2，再用液體閃爍光譜定量。這種方法的優(yōu)點為敏感性和特異性高，但需要特制的裝備，還涉及到放射性元素帶來的安全問題(Bedell-Hogan，D.，P. Trackman，et al. (1993). “ Oxidation, cross-linking, and insolubilization of recombinant tropoelastin by purified lysyl oxidase. " J Biol Chem 268(14) :10345-50)。而高香草酸熒光檢測法基于H2O2和高香草酸能在辣根過氧化物酶的催化下按1 1的摩爾數之比發(fā)生氧化反應，產生的熒光物質在317nm激發(fā)光作用下產生熒光，通過測定在421nm處的熒光強度間接測定H2A的含量。該方法相對簡單易行，但由于該熒光物質的光譜學特性決定了在檢測生物樣本的過程中很難避免自體熒光干擾，導致其敏感性較低(Trackman，P. C.，C. G. hski，et al. (1981). “ Development of a peroxidase-coupled fluorometric assay for lysyl oxidase. " Anal Biochem 113 (2) 336-42)。本發(fā)明采用安普萊紅(Amplex red)熒光法檢測LOX的濃度。利用Amplex red 和H2O2在辣根過氧化物酶的催化下按1 1的摩爾數之比發(fā)生氧化反應，產生熒光物質試鹵靈。試鹵靈在560nm激發(fā)光作用下產生熒光，通過檢測發(fā)射波長590nm的熒光值對H2A 進行定量，間接反映培養(yǎng)基中LOX的濃度。試鹵靈的光學特性很好地避免了生物學樣本譬如細胞培養(yǎng)上清中自發(fā)熒光所帶來的干擾，靈敏度較高香草酸熒光檢測法高。氨基丙腈(BAPN)作為LOX的特異性抑制劑，在體系中加入適量的BAPN可以完全抑制其中LOX的活性，此時用熒光分光光度儀記錄到的熒光值就是體系中除LOX以外其它物質產生的熒光值?？鄢@部分熒光值就是樣品中LOX的熒光值。試劑組合本發(fā)明還提供了一種試劑組合，所述的試劑組合含有安普萊紅；二氨基戊烷，過氧化氫酶，賴氨酸氧化酶專一性抑制劑(優(yōu)選ΒΑΡΝ)。所述的二氨基戊烷可以與LOX發(fā)生反應，被LOX氧化生成過氧化氫；所述的過氧化氫在過氧化氫酶催化的條件下可以與Amplex red發(fā)生反應生成熒光信號物質(試鹵靈)， 從而可通過檢測熒光信號物質來定性或定量地確定LOX的酶活。由于二氨基戊烷與LOX的反應是非特異性的，也可能與其它種類的酶發(fā)生反應。 因此，較佳地，設置另一組試驗，其中加入LOX活性抑制劑來抑制LOX的活性。從而，通過將不加入LOX活性抑制劑的試驗組的酶活測定結果減去加入LOX活性抑制劑組的酶活測定結果來得到準確的LOX活性測定結果。在進行反應時，還可加入一些使LOX酶穩(wěn)定的物質。較佳地，所述的試劑組合還含有選自下組的一種或多種試劑尿素，四硼酸鈉。所述試劑的加入可以使得LOX更穩(wěn)定，而使得LOX以外的其它酶不穩(wěn)定；并且，還提供了一個良好的化學環(huán)境，使得LOX蛋白保持較為松散的結構，從而更有利于化學反應的進行。較佳地，當所述試劑混合用于反應時，Amplex red、二氨基戊烷、尿素和四硼酸鈉按照摩爾比是1 (150-250) (20000-30000) (500-1500)；較佳地是 1 200 24000 1000。較佳地，當所述試劑混合時，尿素終濃度1. 2士0. IM ；四硼酸鈉終濃度 0. 05 士0. 005M. ；Amplex red 終濃度 50 士 5 μ M ；二氨基戊烷終濃度 10 士 ImM。較佳地，當所述試劑混合時，過氧化氫酶終濃度0. 1 士0. 01U/ml。較佳地，當所述試劑混合時，賴氨酸氧化酶專一性抑制劑終濃度500士50 μ Μ。本發(fā)明還提供了所述試劑組合的應用，用于制備診斷癌癥(特別是肺癌)的試劑
品.ο以上的試劑組合可以分別置于容器中，或按照適當配比混合后，置于容器中，從而制成一種試劑盒。所述的試劑盒用于診斷癌癥，特別是肺癌。較佳地，所述的試劑盒中還包含有使用說明書。下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆實驗室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。I.材料和方法血清樣本的收集在獲得了當地倫理委員會的批準和患者知情同意的前提下，本發(fā)明人在2007年7 月至2009年3月間從上海復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院收集了 1 例肺癌患者的血清，對照組觀例由該院健康查體中心提供，其性別、年齡與肺癌組差異無統(tǒng)計學意義。將血液樣本收集在促凝管中，室溫下2小時內凝血，4000轉5分鐘取上清分裝凍存在-80°C待測。所有參與這項研究的患者均為初步診斷為肺癌，前期沒有接受任何化療或放療。本發(fā)明人還收集到了患者的一些臨床基本資料，包括性別，吸煙史，既往病史和臨床病理學分型和病理分期。Amplex red熒光法檢測LOX的濃度本發(fā)明人將收集到的肺癌病人血清取出20 μ 1，加入熒光試劑(1.2Μ尿素，0.05Μ 四硼酸鈉(pH 8. 2),0.川/1111辣根過氧化物酶，5(^11 Amplex red和IOmM 1，5_ 二氨基戊烷 (diaminopentane))，組成總體積為2ml的溶液，分為各Iml的2等份。其中1等份為A組， 即LOX樣本組溶液；對應的另一等份為B組，并在其中加入500 μ M ΒΑΡΝ，然后將Α、Β兩組溶液均放入37°C金屬浴中孵育30min后置于冰上，立即用熒光分光光度儀以激發(fā)波長560nm 和發(fā)射波長590nm檢測其熒光值。用A組溶液的熒光值分別減去對應的B組溶液的熒光值， 即為血清樣品中中LOX的熒光值。統(tǒng)計學分析本發(fā)明人利用SPSS軟件對收集的臨床資料和對應血清中LOX的熒光值進行了統(tǒng)計分析。所有數據采用均數士標準差表示，組間比較采用t檢驗和單因素方差分析，確定 P<0. 05為差異有顯著性。II.實施例自2007年7月至2009年3月，本發(fā)明人對1 位臨床上初次診斷為非小細胞肺癌病人的血清樣本中LOX的活性進行了檢測，并與觀名正常健康人作比較(見圖1)，發(fā)現(xiàn)肺癌患者血清中LOX的活性顯著地高于正常人組(P = 0. 0067)，提示LOX活性檢測可以作為肺癌的早期發(fā)現(xiàn)和早期診斷的一種方法，LOX可以作為血清學標記。通過T檢驗和單因素方差分析不同臨床病理特征的肺癌患者血清中LOX的活性， 發(fā)現(xiàn)LOX的活性與腫瘤的轉移密切相關(P = 0. 015)。晚期或是已經發(fā)現(xiàn)轉移的病人血清中LOX的活性普遍升高(P = 0. 014)。而在具有不同臨床分期、組織學分型、性別以及吸煙史的病人中LOX的活性沒有顯著的統(tǒng)計學差異，見表1。表1.肺癌患者血清中LOX的活性
權利要求
1.一種賴氨酸氧化酶用作檢測癌癥的血清標志物的用途。
2.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的癌癥是肺癌。
3.如權利要求2所述的用途，其特征在于，用作肺癌臨床分期的血清標志物。
4.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的用作檢測癌癥的血清標志物是檢測血清中賴氨酸氧化酶的活性。
5.一種試劑組合，所述的組合含有安普萊紅，二氨基戊烷，過氧化氫酶，賴氨酸氧化酶專一性抑制劑。
6.如權利要求5所述的試劑組合，其特征在于，還含有選自下組的一種或多種試劑 尿素，四硼酸鈉。
7.如權利要求5或6所述的試劑組合，其特征在于，所述的二氨基戊烷是1，5-二氨基戊烷；或所述的過氧化氫酶是辣根過氧化物酶；或所述的賴氨酸氧化酶專一性抑制劑是β -氨基丙月青。
8.權利要求5-7任一所述的試劑組合在制備診斷癌癥的試劑盒中的用途。
9.如權利要求8所述的用途，其特征在于，所述的癌癥是肺癌。
10.一種試劑盒，含有權利要求5-7任一所述的試劑組合。
11.一種測定賴氨酸氧化酶活性的方法，包括(1)將權利要求5的試劑組合中安普萊紅；二氨基戊烷，過氧化氫酶混合，形成混合液1 ；(2)將權利要求5的試劑組合中安普萊紅；二氨基戊烷，過氧化氫酶，賴氨酸氧化酶專一性抑制劑混合，形成混合液2 ；(3)分別檢測混合液1和混合液2的混合液的酶活，混合液1的酶活減去混合液2的酶活的結果即是賴氨酸氧化酶的酶活。
12.一種確定癌癥或癌癥易感性的方法，包括 檢測待測對象血清中的賴氨酸氧化酶的酶活；若待測對象血清中的賴氨酸氧化酶的酶活顯著高正常人群血清中的賴氨酸氧化酶的酶活；則該待測對象是癌癥患者或癌癥易感性患者。
全文摘要
本發(fā)明涉及癌癥發(fā)生或轉移的診斷試劑。提供了一種賴氨酸氧化酶(LOX)的用途，用于作為癌癥的血清標志物；還提供了一種檢測賴氨酸氧化酶活性的試劑組合及其在診斷癌癥方面的用途；還提供了基于所述試劑組合的試劑盒。本發(fā)明第一次將檢測LOX活性的方法應用于診斷癌癥(如肺癌)，第一次將檢測LOX活性的試劑應用于制備診斷癌癥的試劑盒，從而為癌癥的臨床檢測提供了更為簡易的途徑。
文檔編號C12Q1/28GK102296104SQ20101020839
公開日2011年12月28日 申請日期2010年6月24日 優(yōu)先權日2010年6月24日
發(fā)明者季紅斌, 葛高翔 申請人:中國科學院上海生命科學研究院