專利名稱：鴨病毒性腸炎病毒感染性重組克隆系統(tǒng)及構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒疫苗株感染性克隆領(lǐng)域，具體地，涉及鴨病毒性腸炎病毒疫苗株感染性克隆領(lǐng)域，更具體地涉及鴨病毒性腸炎病毒疫苗株感染性重組克隆系統(tǒng)，及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鴨病毒性腸炎病毒(duck enteritis virus，DEV)，又稱鴨瘟病毒。能引起鴨、鵝和其它雁形目禽類發(fā)生急性、熱性、敗血性為特征的烈性傳染病。但對DEV的研究相對于其它皰疹病毒而言相對比較少。故第八次國際病毒學(xué)分類委員會報告將其分類為皰疹病毒[1]， 而未能進(jìn)一步將其進(jìn)行分類。直到最近，其全序列才被全部測通[2] (GeneBank EU082088)。自上世紀(jì)80年代開始用痘病毒作為活疫苗載體研究以來，用痘病毒、腺病毒和皰疹病毒等作為活疫苗載體的研究已有大量報道。皰疹病毒基因組巨大，非必須基因多，可容納較大片段的外源基因的插入。但鴨病毒性腸炎病毒復(fù)制非必須區(qū)的研究到目前仍是空白。

發(fā)明內(nèi)容
將皰疹病毒的基因組分段克隆到粘?；蛸|(zhì)粒中，并用這些含有相互重疊區(qū)的基因組DNA片段轉(zhuǎn)染相應(yīng)細(xì)胞拯救出病毒是研究皰疹病毒的幾種途徑之一，且已有大量報道。 本研究成功在DEV疫苗株基因組中篩選出3個復(fù)制非必須區(qū)。具體內(nèi)容如下1.構(gòu)建鴨病毒性腸炎病毒感染性重組克隆系統(tǒng)或試劑盒的方法，所述方法包括1)切斷所述鴨病毒性腸炎病毒的DNA，2)將切斷后的鴨病毒性腸炎病毒DNA片段連接到粘粒上，3)選擇多個粘粒組成所述鴨病毒性腸炎病毒感染性克隆系統(tǒng)，其中每個粘粒中克隆有鴨病毒性腸炎病毒疫苗株基因片段，所述鴨病毒性腸炎病毒疫苗株基因片段含有相互重疊的區(qū)域，并拼接覆蓋鴨病毒性腸炎病毒疫苗株全基因組，和4)將外源基因插入至少一個所述粘粒中的復(fù)制非必須區(qū)。2.以上1所述的構(gòu)建鴨病毒性腸炎病毒感染性重組克隆系統(tǒng)或試劑盒的方法，其特征在于所述粘粒是i^osmid，優(yōu)選為pCCl Fos03.以上1或2所述的構(gòu)建鴨病毒性腸炎病毒感染性重組克隆系統(tǒng)的方法，其特征在于在所述鴨病毒性腸炎病毒是鴨病毒性腸炎病毒CVCCAV1222 (GeneBank EU082088)。4.以上1-3中任一項所述的構(gòu)建鴨病毒性腸炎病毒感染性重組克隆系統(tǒng)或試劑盒的方法，其特征在于所述多個粘粒是5個粘粒，優(yōu)選地，所述5個粘粒分別為pFOSl、 pF0S2、pF0S3、pF0S4和pF0S5，其中克隆的鴨病毒性腸炎病毒疫苗株基因片段的序列分別為鴨病毒性腸炎病毒 CVCCAV1222 (GeneBank EU082088)的 1-44551 位、36852-75346 位、 69314-109887 位、98197-129146 位和 119308-158091 位。
5.以上1-4中任一項所述的構(gòu)建鴨病毒性腸炎病毒感染性重組克隆系統(tǒng)或試劑盒的方法，其特征在于所述復(fù)制非必須區(qū)位于PFOSl中的UL45和UL46基因之間，pFOSl中的UL41基因內(nèi)，或pF0S5中的US7和US8基因之間。6.根據(jù)以上1-5中任一項所述方法構(gòu)建的鴨病毒性腸炎病毒感染性重組克隆系統(tǒng)或試劑盒。7. 一種鴨病毒性腸炎病毒感染性重組克隆系統(tǒng)或試劑盒，其特征在于所述系統(tǒng)或試劑盒包括多個粘粒，每個粘粒中克隆有鴨病毒性腸炎病毒疫苗株基因片段，所述鴨病毒性腸炎病毒疫苗株基因片段含有相互重疊的區(qū)域，并拼接覆蓋鴨病毒性腸炎病毒疫苗株全基因組，其中至少一個所述粘粒的復(fù)制非必須區(qū)中插入有外源基因。8.以上6或7的鴨病毒性腸炎病毒感染性重組克隆系統(tǒng)或試劑盒用于構(gòu)建重組鴨病毒性腸炎病毒的應(yīng)用。9.利用以上1-5中任一項的方法或利用以上6或7的系統(tǒng)或試劑盒獲得的重組鴨病毒性腸炎病毒株，例如rDEVul4M6，其保藏號為CCTCCV201012 ；rDEVus78，其保藏號為 CCTCC V201010 ；和 rDEVul41，其保藏號為 CCTCC V201011。10.以上9的重組鴨病毒性腸炎病毒株在制備用于預(yù)防所述鴨病毒性腸炎病毒感染所引起的疾病的藥物中的應(yīng)用。在以上1中所述的方法中，步驟2)中的切斷后的鴨病毒性腸炎病毒DNA片段可以通過在兩端連接所述鴨病毒性腸炎病毒中所不含或只含有少數(shù)幾個酶切位點的內(nèi)切酶序列，諸如Fse I-Sbf I-Pme I接頭而連接到粘粒上。在以上7中所述的鴨病毒性腸炎病毒感染性重組克隆系統(tǒng)或試劑盒中，所述鴨病毒性腸炎病毒基因片段兩端可以連接有所述鴨病毒性腸炎病毒中所不含或只含有少數(shù)幾個酶切位點的內(nèi)切酶序列，諸如Fse I-SbfI-Pme I接頭；所述粘?？梢允荝)Smid，優(yōu)選為pCCl ；所述鴨病毒性腸炎病毒可以是鴨病毒性腸炎病毒CVCC AV1222 (GeneBank EU082088)；所述多個粘?？梢允?個粘粒，優(yōu)選地，所述5個粘粒中克隆的鴨病毒性腸炎病毒疫苗株基因片段的序列分別為鴨病毒性腸炎病毒CVCCAV1222 (GeneBank EU082088)的 1-44551 位、36852-75346 位、69314-109887 位、98197-129146 位和 119308-158091 位；所述外源基因可以是eGFP-Kan表達(dá)框架。通過對三株重組病毒在體內(nèi)和體外生長特性的檢測來看，在DEV基因組中的這三個位點插入外源基因?qū)ζ溆绊懹行┎煌?。用其對鴨進(jìn)行一次免疫后均能提供與原疫苗株 DEV相當(dāng)?shù)拿庖咝Ч?。rDEVul4546,即在DEV基因組的UL45和UL46之間插入eGFP-Kan表達(dá)框架構(gòu)建成功的重組病毒。此重組病毒在體外的生長滴度相對于原DEV有些降低，但其最高生長滴度 Log TCID5(1/ml仍能達(dá)到7。完全能滿足以IO5免疫鴨的效果，且用其免疫的SPF(無特定病原動物)鴨保護(hù)率達(dá)到90%。所以在DEV中的這一位點是將來構(gòu)建重組病毒，制備以DEV為載體的弱毒活疫苗的理想位點之一。rDEVus78，即在DEV基因組的US7和US8之間插入eGFP-Kan表達(dá)框架構(gòu)建成功的重組病毒。DEV的US區(qū)由IRS-US-TRS構(gòu)成，與其他α皰疹病毒的US區(qū)的構(gòu)成有一些不同。至今為止，未見有在皰疹病毒US7和US8中插入外源基因構(gòu)建重組病毒的報道。本研究中構(gòu)建的rDEVus78，一次免疫后，能給SPF鴨提供100%的免疫保護(hù)。且其在次代雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)中的生長滴度Log TCID50/ml能達(dá)到7. 05，所以，US7和US8基因之間是DEV 構(gòu)建表達(dá)外源基因重組病毒的理想位點之一。rDEVul41，即在DEV基因組的UL41中插入eGFP_Kan表達(dá)框架構(gòu)建成功的重組病毒。UL41編碼宿主關(guān)閉蛋白(virion host shutoff (vhs)) 0此蛋白有核酸酶活性，可特異性的降解宿主細(xì)胞的mRNA。rDEVul41在CEF上的復(fù)制滴度比原DEV高3. 16倍，其Log TCID50/ ml達(dá)到7.8。用其免疫SPF鴨，其免疫效率與DEV疫苗株相當(dāng)，均為100%。所以，UL41是 DEV構(gòu)建表達(dá)外源基因重組病毒的理想位點之一。本研究用DEV感染性克隆的方法成功構(gòu)建三株重組病毒，在DEV疫苗株基因組中篩選出三個復(fù)制非必須區(qū)，三個位點均可作為DEV插入外源抗原的位點。在國內(nèi)外尚屬首次。


圖1 :DEV DNA片段電泳圖譜，其中Ml λ -Hind III消化分子標(biāo)記(digest Marker)，M2 =DNA MWM XV分子標(biāo)記，1和2 :38_48Kb DNA，左圖普通電泳；右圖脈沖電泳；圖 2 :pCClFosl 圖譜；圖3 :DEV感染性克隆及突變粘粒示意圖。A，DEV基因組結(jié)構(gòu)及突變區(qū)域相應(yīng)基因結(jié)構(gòu)示意圖；B，感染性克隆粘粒在基因組中相應(yīng)位置示意圖；C、D、E，eGFP-Kan表達(dá)框架在相應(yīng)粘粒中插入位置示意圖；圖4 拯救毒dDEV與原DEV疫苗株病毒基因組分別用BamH I,EcoRI,BbvC I酶切后的脈沖電泳圖譜，其中DEV 原DEV疫苗株，dDEV 拯救出的三株病毒，Ml 低范圍PTO分子標(biāo)記(Low Range PFG Marker) ；M2 :DL15000 分子標(biāo)記；M3 λ-Hind III 消化分子標(biāo)記 (λ -Hind III digest Marker)；圖 5 質(zhì)粒圖譜，其中 A, pSI-eGFP ；B, pMOD-6 ；禾口 C, pMeGFP ；圖6 重組病毒熒光圖片及第十代重組病毒與原DEV比較PCR檢測電泳圖，其中 DNA Marker 為 DL15000 ；圖 7 :rDEVul4546, rDEVul41 和 rDEVus78 與原 DEV 生長曲線結(jié)果圖；圖 8 :rDEVul4546,rDEVul41 和 rDEVus78 與原 DEV 對 30 日齡 SPF 鴨免疫保護(hù)結(jié)果圖。生物保藏鴨病毒性腸炎病毒株(Anatidherpesvirus l)rDEVus78、rDEVul41 和 rDEVul4546于2010年5月19日保藏于位于中國武漢的武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號分別為 CCTCC V201010, CCTCC V201011 和 CCTCC V201012。
具體實施例方式實施例1. DEV疫苗株基因組R)smid文庫的構(gòu)建按EPICENTRE 公司"CopyControl Fosmid Library Production Kit，，試劑盒說明書構(gòu)建DEV基因組的R)smid文庫。方法如下，將DEV疫苗株病毒(CVCC AV1222) (GeneBank EU082088)(中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心，目錄編號AV1222 ；購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)DNA用物理方法即用25號針頭(購自上海治宇醫(yī)療器械有限公司)抽吸多次進(jìn)行切斷處理，用T4DNA聚合酶(T4DNA Polymerase)(購自New England Biolabs及堿性磷酸酶 (Alkaline Phosphatase)(購自 New England Biolabs)對 DNA 片段進(jìn)行末端平滑化及去磷酸化處理，脈沖電泳(用Bio-Rad公司CHEF Mapper XA Pulsed Field系統(tǒng)進(jìn)行脈沖電泳，脈沖電泳的條件為電泳緩沖液位0. &TBE，膠濃度為1%，程序為I-80K。)，回收 38kbp-48kbp之間的DNA片段(圖1)。將回收后的DEV DNA片斷兩端加上Fse I-SbfI-Pme I接頭，精制后連接到PCCl (購自EPICENTRE，圖譜見圖2~)載體上，4°C過夜連接。對混和液進(jìn)行包裝，轉(zhuǎn)染大腸桿菌EPI300 (購自EPICENTRE)。對文庫滴度進(jìn)行確認(rèn)，其試驗過程如下將包裝好的混和液進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別取10_2，ΙΟ"4, ΙΟ"5,10_6四個稀釋度的稀釋液10 μ 1感染100 μ 1 ΕΡΙ300菌株，將此菌涂于含12. 5 μ g/ml氯霉素的LB平板，37°C過夜培養(yǎng)，統(tǒng)計菌落數(shù)量，并計算其滴度，結(jié)果為3. 8xl05cfU/lib。即成功構(gòu)建DEV的fosmid 文庫。實施例2.用于拯救DEV病毒粘粒的選擇文庫構(gòu)建成功后，挑取286個克隆提取粘粒，用堿裂解法[5]提取粘粒，送大連寶生物公司對插入PCCl Fos中的DEV DNA片段末端進(jìn)行測序，測序引物序列如下Primer 1 TAATACGACTCACTATAGGGPrimer 2 GCCAAGCTATTTAGGTGAGA經(jīng)過末端測序的分析，共得到插入片段兩端都連接有完整Fse I-SbfI-Pme I接頭的克隆250個。從這250個克隆中選取多組5粘粒組合。其中每組中克隆的DEV DNA片段兩端都含有Fse I-Sbf I-Pme I接頭，能相互重疊，且能拼接覆蓋全DEV基因組。實施例3.病毒拯救用Qiagen公司的中量提取試劑盒提取所選擇的粘粒的DNA。用Fse I、Sbf I或 Pme I內(nèi)切酶(均購自New England Biolabs)對所選擇的粘粒進(jìn)行線性化處理，反應(yīng)條件如下Sbf I內(nèi)切酶20U (也可以使用Fse I或Rne I內(nèi)切酶)，粘粒10 μ g，37°C作用1小時，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀制備轉(zhuǎn)染用DEV DNA。參照Reddy SM (2002)的磷酸鈣方法將5段DEV DNA共轉(zhuǎn)染次代雞胚成纖維細(xì)胞 (CEF)[3]，經(jīng)多次重復(fù)，其中有3組5粘粒組合轉(zhuǎn)染4-6天后可見CEF出現(xiàn)DEV病毒典型病變，選取重復(fù)性較好的一組5粘粒組合進(jìn)行后續(xù)實驗。該粘粒組合相對于DEV基因組的位置如圖:3B所示。收獲此組5粘粒共轉(zhuǎn)染拯救的病毒，命名為dDEV，用此dDEV與原DEV病毒分別接種次代CEF。CEF的制備方法如下取9-10日齡SPF雞胚，用酒精棉球消毒后，用碘酊擦拭氣室部位，脫碘后無菌取出雞胚，放置到盛有Hank’ s液(購自HyClone)的平皿中洗滌，并去除頭、四肢和內(nèi)臟，用剪刀剪碎。用0.25%的胰酶(4mL/胚)在37°C水浴中消化 4-5min，棄去胰酶，用Hank's液洗滌2次。加入適量的含血清與雙抗(青霉素100u/mL，鏈霉素100mg/mL)的M199營養(yǎng)液(購自HyClone)，吹打使細(xì)胞分散，用四層紗布過濾后制成 IO6-IO7細(xì)胞/毫升的細(xì)胞懸液，最后分裝于培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶中37°C培養(yǎng)。于轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)；待細(xì)胞病變達(dá)到100%時，收集培養(yǎng)液；4°C 6000g離心lOmin，去除細(xì)胞碎片；取上清50000g離心
富集病毒；然后經(jīng)20%和60%蔗糖密度梯度離心，50000g離心池，回收20%和60%中間層；之后經(jīng)50000g離心池超速離心脫糖處理獲得純化好的病毒。提取病毒全基因組DNA M，分別用 BamH I、EcoR I 和 BbvC I (均購自 New England Biolabs)對原疫苗株 DEV 和 dDEV進(jìn)行酶切。反應(yīng)條件如下分別取BamH I、EcoR I和KdvC I各20U，分別與DEV基因組 DNA8 μ g 混和，于 50 μ 1 體系中 37°C 作用 Ih。用 Bio-Rad 公司 CHEF Mapper XAPulsed Field系統(tǒng)進(jìn)行脈沖電泳，脈沖電泳的條件為電泳緩沖液位0. &TBE，膠濃度為1%，程序為觀-701(。拯獲的病毒酶切圖譜和原病毒相同，如圖4所示。說明所選擇的5粘粒組成功拯救DEV病毒。實施例4.突變粘粒的構(gòu)建在本研究室已建立的5粘粒感染性克隆的平臺上，分別在pFOSl中UL45、UL46基因間及UL41中，pF0S5中US7、US8基因間插入eGFP-Kan表達(dá)框架，構(gòu)建3個突變粘粒， pF0Slul4546gfp, pFOS lul41gfp 和 pF0S5us78gfp。過程簡述如下用弓I物 Pegfpl (5，-CGA TCT AGA GGG CGG AGC CTA TGG AAA A-3，)和 Pegfp2 (5，-CGA TCT AGA CAG CCC GGA TCC TTA TCG A-3，)從 pSI-eGFP (如圖 5A 所示) (購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所)中擴(kuò)增eGFP表達(dá)框架，用加在引物兩端的)(ba I 位點將其克隆入PM0D-6 (如圖5B所示)(購自Epicentre公司)中，獲得pMeGFP質(zhì)粒(如圖5C所示)。然后用帶有相應(yīng)同源臂的引物擴(kuò)增eGFP-Kan表達(dá)框架，引物如下Pul4546ml (5，-MT TGG TM TM TTG ATT TAG TTT TM ATA ATMAC AAT AAA CAA
TCT GGCGTT TCG GTGATGACG GTG AA-3，)，
Pul4546m2(5''-ACT TGT TAT TTGi TATGCGTGTTTCTACCCA TCTTMTM MTTACTAC AAGCGA GTC AGTGAGCGA GGA A-3，)，
PusTSmKS'-■CATCCA AAT ATATTTGTACATGAGGTAATA GGCTATGGGTGGAGCGCG TTTCGG TGA TGACGGTGAA-3，)，
Pus78m2(5'--CGCATA ATA CAGTTAACCAGGCTGCACACT TAAATTAGTACAGATCAG CGAGTC AGT GAGCGAGGAA-3，)，
Ril41ml(5，--CTAGAC GAT GAGGATGAAGCATTAGAAACTGCA TGTAAAGATGAAGGA GCGTTT CGG TGATGACGG TGA A-3，)，
Pul41m2(5'--TATAAT ACT CATGCATATTCCGTGGTTTAA TTTGGGCATGTCAGG
TCT AGC GAG TCA GTG AGC GAG GAA-3')。下劃線部分為同源臂。并用Gene Bridges公司的Counter-Selection BACModification Kit試劑盒將所擴(kuò)增的片段克隆入相應(yīng)粘粒的相應(yīng)位置，如圖3所示。實施例5.重組病毒的拯救用Qiagen公司的中量提試劑盒提取上述獲得粘粒的DNA。用Fse I或SbfI內(nèi)切酶(分別購自New England Biolabs)將所用粘粒線性化處理，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀制備轉(zhuǎn)染用 DEV DNA0 參照 Reddy SMQ002)的方法分別用 pF0Slul4546gfp，pF0Slul41gfp 和pF0S5uS78gfp三個突變的粘粒之一與5粘粒組中的另外四個粘粒共轉(zhuǎn)染次代CEF[3]， (CEF制備方法如實施例3中所述。)轉(zhuǎn)染4-7天后可觀察到GFP的表達(dá)，之后可見CEF出現(xiàn)DEV病毒病變。分別拯救出rDEVul4M6，rDEVul41和rDEVus78表達(dá)綠色熒光的三株重組DEV(圖幻 。將以上三株重組病毒連續(xù)傳代，直至第十代未見綠色熒光表達(dá)異常。提取第十代重組病毒DNA，用如下鑒定引物，以PCR方法進(jìn)行鑒定，未見有缺失發(fā)生(圖6)。引物如下Pul4546Dl(5，-GAT GGT TTG GCG TTT GGT-3，)，Pul4546D2(5，-CAC TTG GCT CTG TGG CTG-3，)，
Pus78Dl(5，-ACG CAAATTATG TCG TTG TT-3，)，Pus78D2(5，-TTG AGG TTC CGTAGT CTG G_3，)Pul41Dl(5，-CGG CTT GGT AGA TTT GAG G_3，)，Pul41D2(5，-TTC GCT AGAAAC GTA GCA TAG TC-3，)實施例6.重組病毒生長曲線滴定將DEV和三株拯救的重組病毒以MOI 0. 01接種次代CEF，每M小時收集上清和細(xì)胞。-80°C凍存。待收集完全后凍融一次，4°C，IOOOg離心10分鐘。取上清于96孔板中滴定其 TCID50。其生長曲線如圖7所示。從結(jié)果可見，重組毒rDEVul4M6、rDEVul41、rDEVus78 和原DEV的生長趨勢均相似，在感染后72小時達(dá)到最高滴度。在最高滴度時，DEV、 rDEVul4546、rDEVul41 和 rDEVus78 的生長滴度 Log TCID50/ml 分別是 7. 3、7、7. 8、7. 05，可見 rDEVul4546和rDEVus78的生長滴度有4倍和17倍的降低。但這是整個生長曲線測定過程中最大的差別。而rDEVul41生長滴度比原DEV高3倍左右，這是研究者們之間未能預(yù)料到的。實施例7.動物實驗將原DEV病毒與3株重組病毒分別以IO5PFU免疫4周齡SPF鴨，每組10只。2周后用100DLD50的DEV強(qiáng)毒攻擊，觀察重組病毒對DEV強(qiáng)毒的保護(hù)效果。其結(jié)果如圖8所示。DEV疫苗株、rDEVul41和rDEVus78能提供100%保護(hù)。 rDEVul4546對DEV強(qiáng)毒的保護(hù)率為90%。參考文獻(xiàn)1. Fauquet CM,Mayo MA,ManiIoff J, et al. Virus Taxonomy :Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses(Elsevier Academic Press, California,2005)，p.2082. Li Y. , Huang B. b, Ma X. , Wu J. , et al. Molecular characterization of the genome of duck enteritis virus.Virology,2009,391 (2) :151-161.3. Reddy SM. ,Lupiani B.,Gimeno IM. ,et al. Rescue of a patho genie Marek's disease virus with overlapping cosmid DNAs :use of a pp38 mutant to validate the technology for the study of gene function. Proc. Natl. Acad. Sci. ,2002,99 7054-7059.4. Morgan RB, John L. Cantello ；Caroline H.McDermott. 1990. Transfection of Chicken Embryo Fibroblasts with Marek' s Disease Virus DNA. Avian Diseases, Vol. 34，No. 2. (Apr. -Jun.，1990)，pp. 345—351.5. Sambrook J, Russel Dff. Plasmids and their usefulness in molecular cloning. Molecular cloning(3rd ed). Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2002,pp 26-3權(quán)利要求
1.構(gòu)建鴨病毒性腸炎病毒感染性重組克隆系統(tǒng)的方法，所述方法包括1)切斷所述鴨病毒性腸炎病毒的DNA，2)將切斷后的鴨病毒性腸炎病毒DNA片段連接到粘粒上，3)選擇多個粘粒組成所述鴨病毒性腸炎病毒感染性克隆系統(tǒng)，其中每個粘粒中克隆有鴨病毒性腸炎病毒疫苗株基因片段，所述鴨病毒性腸炎病毒疫苗株基因片段含有相互重疊的區(qū)域，并拼接覆蓋鴨病毒性腸炎病毒疫苗株全基因組，和4)將外源基因插入至少一個所述粘粒中的復(fù)制非必須區(qū)。
2.權(quán)利要求1所述的構(gòu)建鴨病毒性腸炎病毒感染性重組克隆系統(tǒng)的方法，其特征在于所述粘粒是i^osmid，優(yōu)選為pCCl Fos。
3.權(quán)利要求1所述的構(gòu)建鴨病毒性腸炎病毒感染性重組克隆系統(tǒng)的方法，其特征在于在所述鴨病毒性腸炎病毒是鴨病毒性腸炎病毒CVCCAV1222。
4.權(quán)利要求1所述的構(gòu)建鴨病毒性腸炎病毒感染性重組克隆系統(tǒng)的方法，其特征在于所述多個粘粒是5個粘粒，優(yōu)選地，所述5個粘粒分別為pFOSl、pF0S2、pF0S3、pF0S4 和pF0S5，其中克隆的鴨病毒性腸炎病毒疫苗株基因片段的序列分別為鴨病毒性腸炎病毒 CVCC AV1222 的 1-44551 位、36852-75346 位、69314-109887 位、98197-129146 位和 119308-158091 位。
5.權(quán)利要求1所述的構(gòu)建鴨病毒性腸炎病毒感染性重組克隆系統(tǒng)的方法，其特征在于所述復(fù)制非必須區(qū)位于PFOSl中的UL45和UL46基因之間，pFOSl中的UL41基因內(nèi)，或 PF0S5中的US7和US8基因之間。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述方法構(gòu)建的鴨病毒性腸炎病毒感染性重組克隆系統(tǒng)。
7.一種鴨病毒性腸炎病毒感染性重組克隆系統(tǒng)，其特征在于所述系統(tǒng)包括多個粘粒， 每個粘粒中克隆有鴨病毒性腸炎病毒疫苗株基因片段，所述鴨病毒性腸炎病毒疫苗株基因片段含有相互重疊的區(qū)域，并拼接覆蓋鴨病毒性腸炎病毒疫苗株全基因組，其中至少一個所述粘粒的復(fù)制非必須區(qū)中插入有外源基因。
8.權(quán)利要求6或7的鴨病毒性腸炎病毒感染性重組克隆系統(tǒng)用于構(gòu)建重組鴨病毒性腸炎病毒的應(yīng)用。
9.利用權(quán)利要求6或7的方法獲得的重組鴨病毒性腸炎病毒株，例如rDEVul4M6，其保藏號為CCTCC V201012 ；rDEVus78，其保藏號為CCTCCV201010 ；和rDEVul41，其保藏號為 CCTCC V201011。
10.權(quán)利要求9的重組鴨病毒性腸炎病毒株在制備用于預(yù)防所述鴨病毒性腸炎病毒感染所引起的疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鴨病毒性腸炎病毒感染性重組克隆系統(tǒng)，其特征在于所述系統(tǒng)包括多個粘粒，每個粘粒中克隆有鴨病毒性腸炎病毒疫苗株基因片段，所述鴨病毒性腸炎病毒疫苗株基因片段含有相互重疊的區(qū)域，并拼接覆蓋鴨病毒性腸炎病毒疫苗株全基因組，其中至少一個所述粘粒的復(fù)制非必須區(qū)中插入有外源基因。本發(fā)明還涉及鴨病毒性腸炎病毒感染性重組克隆系統(tǒng)的構(gòu)建方法和應(yīng)用。
文檔編號C12N7/01GK102277368SQ201010208250
公開日2011年12月14日 申請日期2010年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月13日
發(fā)明者姜永萍, 柳金雄, 步志高, 陳化蘭 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所